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生物化学与分子生物学实验教学中心
Expertimental Teaching Center of Biochemistry and Molecular Biology
质粒 DNA 的提取、
定量、酶切与 PCR 鉴定
http://jpkc.fimmu.com/sfzx/
实验目的
掌握 PCR 基因扩增的原理和操作方法
掌握碱裂解法提取质粒的方法
学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作
实验流程
PCR 质粒DNA的提取
上
午
质粒DNA的酶切
下
午
琼脂糖凝胶电泳 质粒DNA的定量
(紫外检测)
上课安排
简述实验内容流程, PCR 操作步骤
↓
煮菌, PCR( PCR 程序最后设 4℃ 保温)
↓PCR 仪运行约 2 小时
↓ 学习 PCR 原理、质粒 DNA 提取和酶切原理
质粒DNA提取(约 1 小时)
↓
酶切操作
↓ 保温约 1~2 小时
↓ 学习紫外检测定量原理、琼脂糖电泳原理
紫外检测定量
↓
电泳上样(样品:质粒 DNA , PCR 产物,酶切产
物, Marker )
↓ 电泳仪运行约 30 分钟
观察电泳结果、记录、拍照、保存
第一部分 聚合酶链式反应
Taq 酶作用
下,以 dNTP
95˚C
为原料,引物
为复制起点,
模板 DNA 的一 降低溶液温
条单链在解链 度,使合成
和退火之后延 引物在低温
伸为一条双链 ( 35 -
70℃,
延伸 退火 一般低于模
板 Tm 值的
5℃
72˚C Tm-5˚C 左右),与
模板 DNA 互
补退火形成
部分双链
原理示意图
Template DNA
5 5 Primer 1
5 5 Primer 2
Cycle 1
5
5
5
5
Cycle 2
5 5
5 5
5 5
5 5
Cycle 3
5 5
5 5
5 5
5 5
5 5
5 5
5 5
5 5
目的片段
400bp
实验材料
2. 引物: 正向: 5’ GTA AAA CGA CGG CCA GT 3’
反向 : 5’ CAG GAA ACA GCT ATG AC 3’
3. 2×Premix Taq :
Taq 酶: 5U/μl
4×dNTP: 各 10mmol/L
10× 缓冲液( buffer ) : 500mmol/L KCl , 100mmol/L Tris-
HCl(PH=8.3 ), MgCl2: 25mM
4. 灭菌去离子水
实验方法
1 、菌液煮沸 10min, 冷冻,室温解冻后离心取上清
2 、取 0.2 ml PCR 反应管一只,用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂
( 注意每换一种试剂换一个新吸头 )
灭菌去离子水 4.5 l
实验过程约 1 小时 30 分钟
实验方法
1 2 3
高温变性 低温退火 适温延伸 重复 1~3 步
94 25~30 轮
温度
72
形成 2 条单链
目的 DNA 片段
(℃)
DNA 变性
扩增 100 万倍以
55 子链延伸 上
DNA 加倍
DNA 单链
22 与引物复性
DNA 双螺旋
1 2 3 4 5
时间( min )
结果分析
用 1% 的琼脂糖凝胶电泳鉴定 ;
加 5μl PCR 产物进行电泳 ;
预期 PCR 产物大小约 400bp;
第二部分 质粒 DNA 提取与定量
Extraction and Quantitation of Plasmid DNA
定 义
质粒(P lasmid ) • 独立于细菌染色体外,能
独立自主复制的闭合环状
DNA 分子;
• 存在于细菌,放线菌,真
菌以及一些动植物细胞中,
在细菌细胞中最多.
方 法
碱裂解法 • 选择哪一种方法主要取决以下
煮沸裂解 几个因素:
羟基磷灰石柱层析法 质粒的大小
质粒 DNA 释放法 大肠杆菌菌株
酸酚法等 裂解后用于纯化的技术和实验要求
基本步骤
当以高盐缓冲液调节其 pH 值至中性时,变性的质粒
DNA 复性并保存在溶液中,染色体 DNA 不能复性而形成缠
连的网状结构,通过离心形成沉沉淀去除;
基本原理
2 、离心层析
柱
硅基质膜在高盐、低 pH 值状态下
选择性地结合溶液中的质粒
DNA ,不吸附蛋白质、多糖等物质;
通过去蛋白液和漂洗液将杂质和
其它细菌成分去除;
低盐,高 pH 值的洗脱缓冲液将纯
净质粒 DNA 从硅基质膜上洗脱;
☆ 原理示意图
仪器材料
(一)仪器:恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅
(二)材料:含 pMD18-T 质粒的大肠杆菌 DH5α
(三)试剂:
LB 培养基(液体、固体)
AXYGEN 试剂盒质粒提取试剂盒(爱思进,中国)
• 溶液 P1 ( S1)
• 溶液 P2 (S2 )
• 溶液 P3 ( S3 )
• 去蛋白液
PE ( W1)
• 漂洗液 WB(W2 )
• 洗脱液
EB ( Eluent)
提取质粒 DNA 操作步骤
1. 取 1.5ml 培养物加入 Eppendorf 管中
2. 13000rpm×1min ,弃上清
3. 加入 250μl 溶液 S1 ,吹打,使细菌沉淀分散,彻底悬浮。
4. 加入 250μl 溶液 S2 ,颠倒 4 ~ 6 次混匀(不要剧烈振荡),
直到溶液变得清亮 .
5. 加入 350μl 溶液 S3 ,立即温和混匀 6~8 次。 13000rpm 离心
10min ,小心取上清液( 700μl )。
6. 将吸附柱放于收集管中,将上一步所得上清液加入吸附柱中,
13000rpm 离心 3min ,弃滤液。
7. 加入 500μl 去蛋白液 (W1) , 13000rpm 离心 1min ,弃滤液,
8. 向吸附柱中加入 700μl 漂洗液 W2 , 13000rpm 离心
1min ,弃滤液。
9. 重复步骤 8 一次。
10.空柱 13000rpm 离心 1min ,然后室温放置 3min ,使残留乙
醇挥发。
11.取出吸附柱,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间加
50μl 洗脱缓冲液 (Eluent) ,室温放置 1min , 13000rpm 离心
1min 洗脱质粒 DNA , 保留备用。
结果分析
用 1% 的琼脂糖凝胶电泳鉴定 ;
加 5μl 质粒 DNA 进行电泳 ;
预期质粒 DNA 大小约
3000~5000bp;
常见问题
问题一:未提出质粒或质粒得率较低,如何解决?
原 1. 请涂布平板培养后,重新挑选
新菌落进行液体培养
因
2. 可减少菌体用量或增加溶液的
1. 菌体老化 用量
2. 碱裂解不充分 3. 不要频繁转接,每次接种时应
对 接种单菌落。检查抗生素使用
3. 菌体中无质粒
策 浓度是否正确。
4. 溶液使用不当
4. 溶液Ⅱ在温度较低时可能出现
浑浊,置于 37℃ 保温片刻直
至溶解为清亮的溶液。
常见问题
问题二:质粒纯度不高,如何解决?
原因 1. 不要使用过多菌体。重新纯化
DNA ,去除蛋白、多糖、多酚
等杂质
1. 混有蛋白
2. 加入 RNaseA 室温放置一段时
2. 混有 RNA 对 间
3. 混有基因组 DNA 策 3. 加入溶液 II 和 III 后防止剧
烈振荡,可能把基因组 DNA 剪
切成碎片从而混杂在质粒中。
细菌培养时间过长会导致细胞
和 DNA 的降解,培养时间不要
超过 16 小时。
紫外光吸收法定量检测
原理:
1. 物质在光的照射下会产生对光的吸收效应
2. 物质对光的吸收是具有选择性的
3. 各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱
因此不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被
不同程度的吸收,光能量被吸收的程度和物质的浓度
有一定的比例关系 .
计算方法
比色杯
数据处理
平均值
定量检测
第三部分 酶切鉴定
在识别顺序的中心对称轴处切割
5’ G-G-T-A-C-C 3’ G-G-T-A-C 3’ C
Kpn I
3’ C-C-A-T-G-G 5’ C 3’ C-A-T-G-G
限制性内切酶
★5’ 端粘性末端
双酶切限制酶的选择非常重要,尽量选择粘端酶切和那些酶切
效率高的限制酶,提前看好各公司的双切酶所用公用的 BUFFER
目的片段
酶切片段大小为 ? 酶切位点
400bp
反应体系
在一个洁净的 1.5mlEP 管中按顺序依次加入下述试剂
试剂名称 体积 (µl)
无菌水 9.0
10×R+BSA 酶切缓冲液 2.0
质粒 DNA 7.0( 约 500ng)
Hind III (15U/ul) 1.0
EcoR I (12U/ul) 1.0
总体积 20.0
用 1% 的琼脂糖凝胶电泳鉴定 ;
加 5μl 酶切产物进行电泳 ;
预期酶切产物有大小两片段,小片
段约 400bp;
第四部分 琼脂糖凝胶电泳
DNA Agarose Gel Electrophoresis
实验原理
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,可以形成具有刚性的
滤孔,凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度
DNA 分子在碱性环境中带负电荷,在外加电场作用下向正
极泳动 .
DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效
应。不同的 DNA ,分子量大小及构型不同,电泳时的泳动
率就不同,从而分出不同的区带 ( 迁移速度与分子量的对
数值成反比关系 ).
影响迁移速率因素
1 、 DNA 的分子大小
2 、 琼脂糖浓度
3 、 DNA 分子的构象
4 、 电源电压
5 、 嵌入染料的存在
6 、 离子强度影响
琼脂糖水平电泳槽( DYCP-31BN
型)
电泳仪( DYY - 6C 型)
凝胶成像系统( Tanon 1600 )
实验材料
1. 琼脂糖
2 . Gelview ( 核酸染料 )
3 . TBE
4 .电泳缓冲液: 0.5×TBE
常用核酸染料
0.5×TBE
实验材料
6×loading buffer
电泳指示剂:
1. 溴酚蓝,电泳中呈现蓝色
条带,位置大约相当于
甘油 300bp 的 DNA 。
二甲苯青 2. 二甲苯青,电泳中呈现绿
溴酚蓝 色条带,它携带的电荷量比
溴酚蓝少,相当于 4000bp
左右大小 DNA 的位置。
实验材料
DNA Marker
是分子量不同的 DNA 片段,主要用途就是 DNA 分子凝胶电
泳时,加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题。
应选择在目标片段大小
附 近 ladder 较密的
marker ,这样对目标片段大
小的估计较准确。
实验步骤 电压: 80~120V
时间: 15~30 分钟
凝胶准备 胶床准备 铺胶 静置
电泳 取出凝胶 凝胶成像系统观察结果
注意事项
5000 bp
3000 bp 酶切长片段
2000 bp
1500 bp
1000 bp
750 bp
500 bp 含目的 DNA 片
250 bp
100 bp 段的酶切短片
段
上交实验报告网址:
http://192.168.176.250/rar/