表格 1 PCR 常见问题及解决方案

问题 可能原因 解决方案
（1）假阴性 ① 模板 纯度：模板中含有蛋 纯化模板或采用优质试剂盒提
（不出现目的 白质杂质，特别是染 取模板 DNA
条带） 色体中组蛋白；模板
中 含 有 Taq 酶 抑 制
剂；含酚或 SDS 等抑
制剂
浓度：过高或过低 调整模板浓度
质量：反复冻融或长 重新提取模板 DNA
期存放导致降解
② 引物 引物设计不合理 重新设计合成引物
引物降解 引物应高浓度小剂量分装保
存，防止多次冻融或长期放置
冰箱冷藏，导致引物降解失效
引物浓度过高或过 调整浓度
低，两引物浓度差异
过多
③Taq 酶 反复冻融导致失活 更换酶
未加 补加酶
浓度过高或过低 调整浓度
④PCR 程序 变性不充分（变性温 调整变性温度和时间
度低或变性时间短）
退火温度过高 降低退火温度
循环次数过少 增加循环次数
⑤Mg2+ 浓度过低 调整浓度
（2）假阳性 ① 引物 引物设计不合适，与 重新设计
（阴性或空白 非目的扩增序列有同
对照出现目的 源性
扩增产物） 长度太短
靶序列长度太短
② 模板或扩增引物的交叉污染 ① 开管轻柔，防止形成气溶
胶；防止模板吸入加样器内或
溅出离心管外；②更换试剂、
耗材；③试剂分装；④用巢式
PCR 扩增
（3）假阳性 ① 引物 与靶序列不完全互补 重新设计引物
（出现非特异
扩增产物） 形成引物二聚体
长度过短
浓度过高 降低引物浓度
②Taq 酶 浓度过高 适当降低酶量
质量 更换高质量的酶
问题 可能原因 解决方案
③Mg2+ 浓度过高 调整浓度
④PCR 程序 退火温度过低 提高退火温度
循环数过多 减少循环次数
（4）出现片状 ①Taq 酶 浓度过高 适当降低酶量
拖带或涂抹带 质量 更换高质量的酶
②dNTP 浓度过高 调整浓度
③Mg2+
④PCR 程序 退火温度过低 提高退火温度
循环次数过多 减少循环次数