以 HPLC 分析市售飲品中咖啡因之含量

組員 :

林棋凱。國立新化高級工業職業學校。化工科三年甲班
林煒宸。國立新化高級工業職業學校。化工科三年甲班
邱一恆。國立新化高級工業職業學校。化工科三年甲班
 

指導老師 : 林世明老師、何惠陵老師
 高效液相層析儀

壹、實驗目的 :
學會使用高效液相層析儀，並測定與比較市售無糖茶飲中與現泡茶葉的咖啡因含量。

貳、實驗原理 :
1. 層析原理
高效液相層析儀以移動相與固定相的極性差異造成的作用力，使樣品的不同成分在不同的
時間被分離出來，並使用高壓幫浦加壓，使移動相溶劑沖提溶於固定相中的試樣。由於試
樣中各成分與固定相溶解度不同，造成滯留時間的差異使得試樣分離，再經偵檢器而產生
訊號生成圖譜。

2. 液 - 液層析法分類 3. 儀器流程
表 ( 一 ) 正 / 逆相層析法差異

適用
層析法 移動相極性 固定相極性 於
難溶於水的
有機化合物
正相層析法 非極性 極性

逆向層析法 極性 非極性 有機酸 / 鹼

圖 ( 一 ) HPLC 流程圖
圖片來源 : https://zh.wikipedia.org/wiki/File:HPLC_apparatus_(zh-cn).svg

4. 偵檢器原理
(1) 紫外光 / 可見光吸收偵檢器 : 靈敏度高且 (2) 螢光偵測器 : 一種高靈敏度，對試樣成分
普遍的偵檢器，可分析大部分的有機物質。 具選擇性的偵檢器，其原理是利用一強光
基本原理是利用溶劑與試樣吸收紫外光之 照射試樣，使試樣發出螢光，再用光電管
能力差異，由光電管轉換成電流訊號而檢 測出其強度，以偵檢出試樣成分。
測出試樣成分。定量分析原理係利用 (3) 折射率偵檢器 :  其原理是利用溶劑與試樣
Lambert-Beer 定律，由成分之波鋒面積做 對光的折射率不同，折射到光電管的光線
為定量依據，試樣對特定波長的吸收度與 強度產生差異，進而偵檢出試樣成分。其
溶質質量成正比，計算出試樣含量。為本 靈敏度較差故不常用於定量分析，且對試
次實驗使用的偵檢器。 樣成分較沒選擇性。
定性則通過檢測器不同的波峰滯留時間作
為定性的依據。

參、藥品與器材 :

1. 藥品
純甲醇 (LC 級 )×1 罐、去離子水 (LC 級 ) ×1 桶、純咖啡因 ×1 瓶、市售無糖茶飲 ×1 罐、茶
葉 ×1 罐
2. 器材
500mL 燒杯 ×1 、 250mL 燒杯 ×3 、 150mL 燒杯 ×2 、 100mL 量瓶 ×8 、血清瓶 500mL×4 、
100mL 量筒 ×1 、樣品瓶 10mL×10 、針筒 ( 大 ) ×2 、針筒 ( 小 ) ×2 、 0.2µm 濾膜數個、濾
紙 110mm 數張、微量注射針 20µL×1 、移液器 ×1
2
3. 儀器設備 肆、實驗流程
高效液相層析 層析管柱 1.HPLC 操作條件
儀 (1) 移動相 : 30% 甲醇 /70% 去離
廠牌 YOUNG LIN Thermo Fisher Scientific 子水之混合液 ( 採等位沖
提)。
型號 Acme 9000 Hypersil  ODS C18 (2) 移動相流速 : 0.8mL/min
HPLC Columns (3) 恆溫爐設定溫度 : 40℃
表 ( 二 ) 設備型號 (4) 試樣注入體積 : 20 µmL
(5) 偵檢器檢測波長 : 270nm
(6) 分析時間 :20min
2. 咖啡因檢量線制作
吸取
2 、 4 、 6 、 8 、 10 分別貼上
精秤 0.1g 咖 定容至 各定量容至
mL 的咖啡因標準品 20 、 40 、 60 、 80
啡因標準品 100mL 100mL 、 100ppm 的標籤

3. 現泡茶葉製作 4. 咖啡因樣品前處理
以 150mL 熱
秤取市售茶葉 檢量線溶液、現泡茶 以 0.2µm 濾膜過 各過濾約 2mL
RO 水浸泡 5
3g 葉、市售無糖飲品 濾 的濾液備用
分鐘

5.HPLC 操作步驟
暖機 30 分鐘
注入各濃度的咖啡因
將偵檢器、加溫爐、高 設定好操作條件並開啟 待壓力穩定
使用針筒排除管線氣泡 標準品、現泡茶葉樣
壓幫浦、電腦開機 加溫爐及高壓幫浦 品以及市售茶飲樣品

個別紀錄樣品層析圖以
及波峰面積、滯留時間 市售茶飲、現泡茶葉樣品的吸
製作咖啡因標準品檢量線 收峰積分面積代入檢量線
以濃度 (Y 軸 ) 與積分面積 (X 軸 ) 作 計算咖啡因含量
圖

伍、實驗數據
1. 咖啡因標準品層析圖

20ppm
滯留時間 :16.7833

40ppm
滯留時間 :16.6167

60ppm
滯留時間 :16.600

80ppm
滯留時間 :16.4667

100ppm
滯留時間 :16.4833

圖 ( 四 ) 咖啡因標準品層析圖
2. 各波峰積分面積與吸收度 3. 咖啡因標準品檢量線
表 ( 三 ) 咖啡因標準品濃度與積分面積 120
濃度 ppm 100
(Y 軸 ) 積分面積 f(x) = 0.0130894916708972 x + 0.8654
R² = 0.999736621211211
80
20 1558.693

濃度 ppm
60
40 2893.487 40
60 4523.0093 20
80 5958.083 0
1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000
100 7655.3047 積分面積
圖 ( 三 ) 咖啡因檢量線

4. 市售及現泡茶葉層析圖

現泡茶葉 市售茶葉
滯留時間 : 滯留時間 :
17.3333 16.5833

圖 ( 四 ) 現泡茶葉層析圖 圖 ( 五 ) 市售茶葉層析圖
表 ( 四 ) 試樣濃度與積分面積
市售茶飲 現泡茶葉
積分面積 4461.0522 6411.1958
濃度 ppm 59.31 84.85
換算含量 mg/150mL 的茶 8.897 12.73

陸、結果與討論
1. 由各層析圖可得知，咖啡因的滯留時間在 16.6 分時取得。
2. 以不同濃度的咖啡因製得積分面積與濃度的檢量線為 y( 濃度 ) = 0.0131x( 積分面積 ) +
0.8654 ，相關係數 R² = 0.9986 。
3. 由實驗結果得知，市售的茶飲咖啡因與現泡茶葉的咖啡因濃度分別為 54.31 與
84.85ppm 。
換算成每杯咖啡因攝取量分別為 8.897 與 12.73mg 。
4. 根據衛生福利部飲料類衛生標準第三條，茶及可可飲料，咖啡因含量不得超過 500
mg/L ，而市售茶飲咖啡因含量 59.31 mg/L 、現泡茶飲咖啡因含量 84.87 mg/L ，每公升
咖啡因含量皆未超過規定含量。
柒、參考資料
1 、江孟玲、蔡永昌 (2011) 。分析化學Ⅱ   台科大圖書
2 、蔡永昌 (2012) 。分析化學與分析化學實驗 台科大圖書
3 、紫外線 / 可見光分光光譜儀檢測使用及使用方法
取自 :https://myweb.ntut.edu.tw/~wwwemo/instrument_manual/ultraviolet.htm
4 、高效液相色譜儀工作原理 维基百科，自由的百科全書  
取自 :https://zh.wikipedia.org/wiki/File:HPLC_apparatus_(zh-cn).svg
5 、飲料衛生類標準。食品衛生標準查詢。 2007 年 7 月 5 日。
取自  : https://sites.google.com/site/foodstandard1692/yin-liao-lei-wei-sheng-biao-zhun
6. 第十一章 高效能液 相層析儀。取自
http://www.seafood.nkmu.edu.tw/readimage.php?file=file/7509%E8%B3%87%E6%96%99%E5%A4%BE/%E7%A0%94%E7%
A9%B6%E6%89%80%E4%B8%8A%E8%AA%B2%E8%B3%87%E6%96%99/%E7%AC%AC%E5%8D%81%E4%B8%80%
E7%AB%A0HPLC-101-10-161.pdf

7. 極性 , 可溶性與可溶混性。
取自 :http://www.hlis.hlc.edu.tw/~d03/web/jack/0196/Ga5/52.htm