主題五：醣類的定性與定量分析 2020.10.

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生二乙 第九組 杜紫瑄 40843234S

一、目的：
利用生化呈色方法進行測試，以檢定各種具不同特性之醣類分子。

二、原理：

1. Molish 測試：—是否為醣類
醣類分子經無機酸脫水反應後會產生夫喃醛 ( furfural ) 或其衍生物，此類脫水產物在
與 α-奈酚 (α-naphthol ) 作用後可產生紅紫色物質。在醣液和濃硫酸的液面間形成紫
環，因此又稱紫環反應。自由存在和結合存在的醣均呈陽性反應。此外，各種糠醛衍生
物、葡萄醣醛酸以及丙酮、甲酸和乳酸均呈顏色近似的陽性反應。此測試常用以區分醣類
與非醣類物質。

＊適用測試所有可溶性碳水化合物，不溶性醣類於特殊情況下也會展現類似顏色於表層。
＊無機酸可用硫酸兼做催化和脫水反應，18-20％鹽酸也可以，但是硝酸因會繼續氧化
furfural 所以不適用。
2. Bial 測試：區分五碳醣與六碳醣
五碳醣及六碳醣經脫水反應後所生成之 furfural 物質可與地衣酚( orcinol ) 反應成生
不同顏色之化合物，此特性可被用以區分五碳醣與
六碳醣。顔色的差異是因爲有 orcinol 和 FeCl3 的存在。五碳醣的 Furfural 會呈現藍綠
色。六碳醣的 hydroxymethylfurfural 會呈現黃棕色，黃色或灰色。

＊若無干擾物質存在下，可以用於五碳糖的定量（或用於RNA的定量）
＊五碳糖呈現綠色為陽性反應，其他顏色皆為陰性反應

3. Seliwanoff 測試：區分酮醣與醛醣
六碳醣經 HCl 及加熱處理後會脫水得到 4-hydroxymethyl furfural 的產物，而 4-
hydroxymethyl furfural 則可與樹脂酚( resorcinol ) 反應產生紅色物質。由於六碳酮
醣經 HCl 及加熱處理後產生 4-hydroxymethyl furfural 的速率及數量較六碳醛醣為快
且大，利用加入 resorcinol 後生成紅色物質之速率及濃度的差異可以區別酮醣與醛醣。
酮醣：反應迅速(20~30 秒)，果糖檢出濃度可達 0.001%
醛醣：反應較慢，須在醣濃度較高之環境或較長時間煮沸，才有微弱的陽性反應
4. 還原醣定量法：
還原醣在鹼性溶液中可將 3,5-dinitrosalicylic acid ( DNS )還原，並使其顏色由黃色
轉變成橙紅色。藉此還原呈色之特性，還原醣的濃度可以測得。

*還原醣：含自由醛基或酮基的單醣和雙醣
*還原醣在鹼性溶液中能將金屬離子（銅、鉍、汞、銀等）還原，醣本身被氧化成酸類。

三、藥品和器材
1. 光譜儀 ( spectrophotometer )
2. 試管振盪器( vortex )
3. 水浴槽
4. 玻璃試管
5. 試管架
6. 錫箔紙
7. 滴管
8. 醣類溶液 ( 10 mg/ml ): ribose, xylose, fructose, glucose, sucrose, maltose,
starch
9. α-naphthol試劑〔 5 % (w/v) 於95 % EtOH中 〕
10. Conc. H2SO4
11. Orcinol試劑〔 1.5 g orcinol＋500 ml HCl＋1 ml 10 % (w/v) FeCl3 〕
12. Seliwanoff 試劑 ( 0.25 g resorcinol ＋500 ml 3 N HCl )
13. DNS試劑：
 Na-K-tartrate ( 30 g溶於50 ml H2O )
 3,5-dinitrosalicylic acid溶液 ( 1g 溶於20 ml 2 N NaOH )
 混合及並加水至最後體積為100 ml，過濾得之
14. Glucose stock ( 500 μg/ ml )
四、實驗步驟和注意事項
A. Molish 測試：
1. 取1 ml各醣類溶液 ( ribose, xylose, fructose, glucose, sucrose, maltose 及
starch ) 置於不同試管中，再各別加入1 ml H2O於其中。
2. 各試管中分別加入2滴α-naphthol試劑。
3. 傾斜試管，緩緩且小心沿管壁加入1 ml H2SO4，使在醣液下方形成層狀液。(可用滴
管以小體積逐滴加入)
＊以避免放出大量熱而濺出，且易焦化醣類而呈現紅色，所以可稀溶液代之
4. 觀察兩層交界面有無紫色環。
＊膠澱粉、肝糖：分枝鏈，呈現紅色
＊直鏈澱粉：深藍色
＊兼具分枝和直鏈：紫色

B. Bial 測試：
1. 取0.1 ml ribose, xylose, fructose及 glucose溶液分別加入不同之長試管中。
2. 於各試管分別加入4 ml orcinol試劑，並以錫箔紙封口。
3. 於通風櫃中，將各試管置於100℃水浴中加熱。
4. 觀察並記錄各試管內反應顏色隨時間之變化及各管反應所需時間之差異。
＊反應的產物（聚合物）可以溶於戊醇中
＊若顏色不明顯時可以用三倍體積的水加1ml的證物醇來並震搖，綠色物質會出現醇層
（有時只用水稀釋即可）
＊加入orcinol試劑並混勻
C. Seliwanoff 測試：
1. 取0.1 ml 的 ribose, xylose, fructose, glucose, sucrose, maltose 及starch溶
液，分別加入於不同之試管中。
2. 於各試管中，分別加2 ml Seliwanoff 試劑，並以錫箔紙封口。
3. 於通風櫃中，將各試管置於 100℃ 水浴中加熱 30 分鐘，過程中每 5 分鐘觀察一次，
並記錄各試管內反應顏色隨時間之變化及各管反應所需時間之差異。

D. 還原醣定量法：
1. 將葡萄糖溶液 ( 500 μg/ ml ) 以蒸餾水稀釋成 0, 100, 200, 300, 400, 500
µg/ml等標準濃度。
稀釋法 (參考)：

2. 取 750 μl各標準濃度及未知濃度之葡萄糖溶液X分別加入不同之試管中。
3. 於各試管中分別加入250 μl DNS試劑，並以錫箔紙封口。
4. 將各試管於100℃水浴中加熱5分鐘，隨後取出並使冷卻至室溫。
5. 利用光譜儀測定各試管溶液於540 nm 波長的吸光度。
6. 以各標準濃度葡萄糖溶液所獲得之吸光度值做一標準曲線，並藉此求出未知葡萄糖溶
液之濃度。
五、預期結果

不同糖類的分類
英文名稱 ribose xylose fructose glucose sucrose maltose starch
中文名稱 核糖 木糖 果糖 葡萄糖 蔗糖 麥芽糖 澱粉
五碳/六碳 五碳糖 五碳糖 六碳糖 六碳糖 （6+6） （6+6） 6n
酮/醛糖 醛糖 醛糖 酮糖 醛糖 醛+酮 醛糖 （醛）

試劑和式樣的產生結果
ribose xylose fructose glucose sucrose maltose starch
Molish + + + + + + +
test 紫環 紫環 紫環 紫環 紫環 紫環 紫環
Bial test + + - - - - -
藍綠 藍綠 黃棕色 黃棕色 黃棕色 黃棕色 黃棕色
Seliwanoff - - + - + - -
test 無色 無色 紅色 無色 紅色 無色 無色

+：陽性反應 ， -：陰性反應
六、藥性
α-naphthol 試劑
配置：5 % (w/v) 於 95 % EtOH 中
性質 毒性
C 10 H 7 OH 吞嚥或經皮膚吸收都能引起中毒，對
白色固體 眼和黏膜有刺激性，能使人體接觸部
2-萘酚的異構體，只是萘環上羥基的位置不同 位發疹。其症狀是嘔吐、腹瀉、腹
可溶於簡單的醇，醚和氯仿 痛、貧血、虛脫，能使蛋白質沉澱。

不同糖類的性質
核糖 木醣 果糖
Ribose Xylose Fructose
英文名稱

化學式 C5H10O5 C5H10O5 C6H12O6

180.16 g·mol⁻¹
分子量 150.13 g·mol⁻¹
150.13 g·mol⁻¹

結構式

白色固體 白色細針狀結晶或結晶性 無色晶體

顏色
粉末
99 °C（372 K） 144～145 °C 103 °C
熔點

比重 1.681g/cm3 1.525 g/cm

3
1.758 g/cm3
RNA 的組成物之一 人體無法消化和利用木 現在醫學認為果糖可能導
ATP 及 NADH 等生化代謝所 糖，木糖不能為消化酶分 致新陳代謝紊亂，使人罹
需分子的原料。 解，而是直接經空腸黏膜 患心臟病、糖尿病及痛風
吸收，不在體內代謝，從 的機率增加。指出高果糖
用途
腎排出。因此木糖被用作 漿的化學結構會刺激食
無熱量的甜味劑，以滿足 慾，並可能使肝臟將更多
糖尿病患者和愛吃甜食卻 的威脅心臟安全的甘油三
又擔心發胖者的需求。 酯輸出到血液中。
 葡萄糖 蔗糖 麥芽糖 澱粉

英文 Glucose Sucrose Maltose

Starch
名稱
化學式 C6H12O6 C12H22O11 C12H22O11 (C6H10O5)n
342.30 g/mol 342.30 g·mol⁻¹
分子量 180.16 g·mol⁻¹ 100 萬-600 萬
g·mol⁻¹

結構式

葡萄糖對腦部正常功 蔗糖伴隨著單糖 麥芽糖屬雙醣， 在食品工業中，可以

能極為重要，高循環 果糖在許多食用 白色針狀統晶， 利用高直鏈玉米澱粉
血糖濃度可產生葡萄 植物中天然存 易溶於水，甜味 生產減肥食品和煎炸
糖強記效應，並促進 在。在許多水 比蔗糖弱。一種 食品，也是糖尿病人
記憶力和認表現。 若 果，如菠蘿和 還原糖，與酵母 的理想食品，被稱為
血液中之葡萄糖濃度 杏，蔗糖是主要 發酵變為酒精， 「功能性食品」；此
過高，將可能導致肥 的糖。在其他情 和稀硫酸共熱， 外，高直鏈澱粉還是
用途 膽結石及高血壓病人
胖和糖尿病。若濃度 況如葡萄、梨、 變為葡萄糖，常
過低可能為低血糖症 果糖是主要的 被入藥。普遍的 的理想食品，具有防
或胰島素休克之徵 糖。 麥芽糖則是烹調 止膽結石形成及降低
兆。 時加入了蔗糖， 血液膽固醇的作用；
才由白色變為金
黃，可增其色香
味。
顏色 白色或透明粉末 白色固體 白色針狀統晶 白色粉末
α-D-葡萄糖: 146℃ 無，因為在 186 102-103 °C
β-D-葡萄糖: 150℃ °C (367 °F;
熔點 分解
459 K)時會發生
反應分解
參考資料：
1. 糖的呈色反应（color reaction）和定性鉴定(1)。2020 年 9 月 7 日。
網址：https://m.antpedia.com/news/2439386.html

2.Molisch's test-Wikipedia.(2020.10.09), retrieved from https://en.wikipedia.org/wiki/Molisch%27s_test

3. Bial's test-Wikipedia (2020.02.29), retrieved from https://en.wikipedia.org/wiki/Bial%27s_test

4. Rajan Katoch, 17 June 2011. Carbohydrate Estimations-Springer Link，retrieved from
https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-1-4419-9785-2_5

5.Ribose-Wikipedia (2020.10.15), retrieved from

https://en.wikipedia.org/wiki/Ribose#:~:text=detected%20in%20meteorites.-,Structure,aldehyde%20group)%20to
%20C5'.

6.Xylose-Wikipedia (2020.06.18), retrieved from

https://en.wikipedia.org/wiki/Xylose#:~:text=Greek%3A%20%CE%BE%CF%8D%CE%BB%CE%BF%CE%BD%2C%20xyl
on%2C%20%22,the%20main%20constituents%20of%20biomass.

7.Fructose-Wikipedia (2020.10.11) , retrieved from https://en.wikipedia.org/wiki/Fructose

8.Glucose-Wikipedia (2020.10.09), retrieved from

https://en.wikipedia.org/wiki/Glucose#:~:text=Infobox%20references,monosaccharide%2C%20a%20subcategory%
20of%20carbohydrates.

9.Sucrose-Wikipedia (2020.10.05) , retrieved from

https://en.wikipedia.org/wiki/Sucrose#:~:text=Sucrose%20is%20common%20sugar.,12H22O11.

10.Maltose (2020.10.03) -Wikipedia, retrieved from

https://en.wikipedia.org/wiki/Maltose#:~:text=Maltose%20(%2F%CB%88m%C9%94%CB%90l,(1%E2%86%926)%20
bond.

11.Starch-Wikipedia (2020.10.13), retrieved from

https://en.wikipedia.org/wiki/Starch#:~:text=Starch%20or%20amylum%20is%20a,green%20plants%20as%20energ
y%20storage.

12.α-naphthol-Wikipedia (2020.02.09), retrieved from https://en.wikipedia.org/wiki/1-Naphthol