Exp2.

蛋白質的特性分析-預報
生二乙 生化實驗
第九組
杜紫瑄
40843234S
一、目的：利用蛋白質正、負電荷與溶解度差異分離及鑑定蛋白質。
二、原理：
蛋白質特質：

1. 兩性離子(zwitterion): 總電荷為 0，電中性的化合物。雖然兩性離子是電中性分

子，但它卻同時帶有正負兩種電荷，且帶正電和負電的原子不同。兩性離子為極性，
通常易溶於水，難溶於大部分有機溶劑。

2. 兩性電解質: 是具有酸性與鹼性基團的分子（因此具備兩性的特性），在特定 pH
值環境多半以兩性離子存在。平均電荷為 0 的 pH 值稱為該分子的等電點。

3. 可逆變性反應：蛋白質的嚴密結構在某些物理或化學因素（如加入强酸/强堿）作
用下，其特定的空間結構被破壞，從而導致理化性質改變和生物學活性的喪失，如
酶失去催化活力，激素喪失活性稱之為蛋白質的變性作用(denaturation)。這些只
破壞 2 級及 3 級結構而非破壞 1 級結構的變形因素，當去除之時，蛋白質又會恢復
活性變成 native protein（renaturation）

4. 非可逆變性反應：當蛋白質的内部構象及空間結構被破壞時（如加入有機溶劑/重
金屬離子），即使去除變形因素之後也無法蛋白質活性，使 denatured protein
恢復到 native protein。

(一) 極端 pH 值沉澱法 (強酸與強鹼沉澱法)

原理：當蛋白質溶液加入强酸/強鹼時，胺基/羧基會相應的質子化而帶正電荷（或去質子
化而不帶電荷），是蛋白質的離子鍵及氫鍵被破壞而沉澱。當環境 pH 值等於蛋白質等電
點（pI）時，其溶解度最小。所以可以藉由加入强酸/強鹼調整溶液 pH 值，當達到該蛋白
質等電點時就會有沉澱產生。

1. 蛋白質為兩性分子，可帶正或負電荷，當溶液之淨電荷是零時，因電中性使蛋白質溶
解度降低，此時的 pH 值即為等電點 ( pI )。
2. 一般蛋白質之 pI 值約 4－6，加入強酸易達 pI 值而沈澱。
3. 加入過量酸則使蛋白質變性 ( denature )，再度溶解。
4. 加入鹼通常不沈澱 ( 視 pI 值而定 )，但蛋白質會被變性，若加酸中和鹼
可再使蛋白質復性 ( renature )。
**此方法之沉澱可重新溶於非等電點的新 pH 值溶液中。

(二) 生物鹼沈澱法

原理：蛋白質的胺基可與生物鹼試劑(如苦味酸)以及某些酸(如三氯醋酸、過氯酸、硝酸)
的酸根結合成難溶的鹽沉澱，沉澱的條件應當是 pH 小於等電點，這樣蛋白質帶正電荷易
於與酸根負離子結合成鹽。若反應 pH 值在 pI 值附近，更為明顯。
1. 生物鹼（alkaloid）：a class of basic, naturally occurring organic compounds
that contain mostly nitrogen atoms. This group also includes some related
compounds with neutral and even weakly acidic properties.
2.臨床血液化學分析時常利用此原理除去血液中的蛋白質，此類沉澱反應也可用於檢驗尿
中蛋白質。
3. 若加入鹼，則抑制生物鹼酸根之解離，會使沈澱減少。( 若原溶液酸性不
足，則不生成-NH3＋，亦會使沈澱生成少 )。

4. 生物鹼易使蛋白質變性，不適於純化用。

5. 三氯醋酸 ( TCA Trichloroacetic acid ） ：very effective protein-

precipitating agent and the most efficient for precipitating proteins from
dilute solutions.TCA 會使蛋白質沈澱 ( 溶液中有 5 % TCA 效果就很顯著)，因會失去
蛋白質活性，是很好的反應終止劑。

(三) 金屬離子沈澱法

原理：蛋白質可以與重金屬離子如汞、鉛、銅、銀等結合成鹽沉澱，沉澱的條件以 pH 稍
大於等電點為宜。因為此時蛋白質分子有較多的負離子易與重金屬離子結合成鹽。重金屬
沉澱的蛋白質常是變性的，但若在低溫條件下，並控制重金屬離子濃度，也可用於分離製
備不變性的蛋白質。

1. 蛋白質在鹼性溶液中多帶負電，帶正電的離子易中和其電性而沈澱，此
沈澱稱蛋白化重金屬。
2. 金屬離子加入太多，沈澱消失故反應劑不可加太多。
3. 溶液之 pH 值不可太高，否則易生成重金屬氫氧化物沈澱，例如
Ag (OH）、Ag2(OH)。
4. 重金屬易使蛋白質、酵素變質，不適於純化。

5. 輕金屬離子 ( 如鈉離子、鉀離子 ) 用於純化。

6.鹽溶 ( salting-in ) 是以中性鹽的離子與蛋白質的電性吸引，減少蛋白質分子間之靜

電作用促進結合（增加蛋白質的溶解度）。
When low concentrations of salt is added to a protein solution, the solubility
increases.
7.鹽析 ( salting-out ) 加入過量中性鹽離子，與蛋白質分子競爭溶
劑分子的親和力，引起沈澱。如實驗室中最常使用者是硫酸銨即是根據
此原理。
When high concentrations of salt is added to a protein solution, the
solubility decreases.

8.硫酸銨最常被使用的原因：
-large solubility in water.
-relative freedom from temperature effects.
-no harmful effects on most of the proteins.

(四) 有機溶劑沈澱法

原理：可與水混合的有機溶劑，如酒精、甲醇、丙酮等，對水的親和力很大，能破壞蛋白
質顆粒的水化膜（破壞蛋白質分子的水解狀態，使蛋白質與水親和
力減低而沈澱），在等電點時使蛋白質沉澱。在常溫下，有機溶劑沉澱蛋白質往往引起變
性。例如酒精消毒滅菌就是如此，但若在低溫條件下，則變性進行較緩慢，可用於分離製
備各種血漿蛋白質。

2. 蛋白質分子間之作用力

（水>酒精、丙酮）

3. pH ＝ pI 時，蛋白質沈澱效果最好。由上可見 pH 值是蛋白質沈澱的重
要因子。

4.用酒精生成的蛋白質沈澱，若立刻將之分離，溶於水或 HCl 中仍可復性，

若已生成不可逆膠結體，則不再溶解。此法常用以固定組織。
**此方法的优点是有机溶剂易分离，能使蛋白快速脱盐与浓缩
**此方法的缺點是水溶液混合有機溶劑多屬放熱，應在極低溫下操作防蛋白質變性

(五) 用滴定法求胺基酸的等電點 ( pI )
原理：
1. pH = pKa＋log ( [A- ]/[HA] )，當[A- ] = [HA]，即 HA 解離一半時， pKa = pH
2. 胺基酸功能基解離順序
-COOH ＞ R-COOH ＞-NH3＋＞ R-NH3＋
4. 中性胺基酸 pI = ( pKa1 +pKa2 ) / 2，一般可用下列方式計算得：
a. 列出 pKa1 , pKa2
b. 相乘，帶入條件 [HA] = [A－]
c. 取 log 即得。
d. 求 pI：由滴定曲線求取 pKa ( pKa 是 buffer capacity 最大處，即滴定曲線上
水平區域的反曲點；pI 不一定是緩衝能力最差之處 )。

三、器材與藥品：
1. 鹽酸 ( HCl , concentrated )
2. 小牛血清蛋白 ( bovine serum albumin , BSA , 0.5% )
3. 雞蛋白蛋白 ( ovalbumin , OVA , 0.5% )
4. 氫氧化鈉 ( NaOH , 1 N ＆ 0.1 N )
5. 苦味酸 ( picric acid , saturated )
6. 單寧酸 ( tannic acid , 10% )
7. 三氯醋酸 ( trichloroacetic acid , TCA , 20% )
8. 氯化鈉 ( NaCl , saturated )
9. 硫酸汞 ( HgSO4 , saturated )
10. 硫酸銨〔(NH4)2SO4 , saturated〕
11. 酒精 ( EtOH , 95% )
12. alanine ( 0.1 N )
13. 酸鹼值測定儀 ( pH meter )
14. 適用滴定容器
15. 塑膠滴管；膠帶；剪刀；簽字筆
16. 滴定管
17. 滴定管架
18. 安全吸球

四、步驟和注意事項

以下實驗每次定量 100 µL

（一）極端 pH 值沉澱法：
1. 取 1 ml 之 sample ( BSA or OVA ) 於玻璃試管中，逐滴加入濃鹽酸，觀察有任何變
化。
＊加入過量酸則使蛋白質變性而再度溶解，因此加酸時需適量
2. 取 1 ml 之 sample 於玻璃試管中，加入 1 N 氫氧化鈉，觀察有任何變化。

（二）有機酸試劑測試法：
1. 取 1 ml 之 sample 於玻璃試管中逐滴加入苦味酸，觀察有任何變化。再逐滴加入 1 N
氫氧化鈉(約 1-2 滴)，則會如何？(不易觀察)

2. 取 1 ml 之 sample 於玻璃試管中逐滴加入單寧酸，觀察有任何變化。再逐滴加入 1 N
氫氧化鈉(約 1-2 滴)，則會如何？(不易觀察)

3. 取 1 ml 之 sample 於玻璃試管中逐滴加入三氯醋酸，觀察有任何變化。再逐滴加入 1
N 氫氧化鈉(約 5-6 滴)，則會如何？
（三）金屬離子沉澱法：
＊金屬離子加入太多，沈澱消失故反應劑不可加太多。
＊溶液之 pH 值不可太高，否則易生成重金屬氫氧化物沈澱
1. 取 1 ml 之 sample 於玻璃試管中逐滴(約 5-6 滴)加入硫酸汞 (廢液桶)，觀察有任何
變化。
2. 取 1 ml 之 sample 於玻璃試管中逐滴(約 5-6 滴)加入氯化鈉，觀察有任何變化。
(不易觀察)
3. 取 1 ml 之 sample 於玻璃試管中逐滴(約 2ml)加入硫酸銨，觀察有任何變化。

（四）有機溶劑沉澱法：
1. 取 1 ml 之 sample 於玻璃試管中，先加入數滴氯化鈉，再加入 1 ml 酒精，觀察有
任何變化。(粉末在上層，不易成功)

（五）利用滴定法測定胺基酸之等定點：
1. 清洗 pH meter 之電極，並校正其電極 pH 值。
2. 取試管，盛裝 10 ml 0.1 N 胺基酸 (alanine ) ，再逐漸加入 0.2N 鹽酸，讀取 pH
值至 pH 2。
3. 另取試管，盛裝 10 ml 0.1 N 胺基酸 (alanine) ，再逐漸加入 0.2 N 氫氧化鈉，讀
取 pH 值至 pH 12。
4. 繪製滴定曲線，計算 pKa，並計算出 pI 值。(課堂方格紙 check out ，作業
Excel。)
五、預期結果
極端 pH 值沉澱法 BSA OVA
1.sample +濃鹽酸 等電點 4.7，沉澱 等電點 4.5，沉澱

2.sample +NaOH 蛋白質變性但不沉澱 蛋白質變性但不沉澱

兩者皆在一般蛋白質的範圍之內，因此加酸都可達 pI 值而沉澱
有機酸試劑測試法： BSA OVA
Sample+苦味酸 沉澱 沉澱
Sample+苦味酸+NaOH 不沉澱 不沉澱
Sample+單寧酸 沉澱 沉澱
Sample+單寧酸+NaOH 不沉澱 不沉澱
Sample+三氯醋酸 沉澱 沉澱
Sample+三氯醋酸+NaOH 不沉澱 不沉澱

金屬離子沉澱法： BSA OVA

Sample+硫酸汞(Hg2+) 沉澱 沉澱
Sample+氯化鈉(Na+) 產生鹽溶不沉澱 產生鹽溶不沉澱
Sample+硫酸銨(NH4+) 沉澱 沉澱

有機溶劑沉澱法： BSA OVA

Sample+氯化鈉+酒精 沉澱 沉澱

利用滴定法測定胺基酸之等定點：
α-COOH α-NH3 pI (at 25。C)
Alanine 2.35 9.87 6.11

六、藥性
※各胺基酸的 pI 數值

藥品 特性 注意事項
鹽酸 ( HCl ) 鹽酸為無色透明液體，有強 濃鹽酸（發煙鹽酸）會揮發
烈的刺鼻味，具有較高的腐 出酸霧。鹽酸本身和酸霧都
蝕性。 會腐蝕人體組織，可能會不
可逆地損傷呼吸器官、眼
部、皮膚和胃腸等。
牛血清蛋白 ( bovine serum 牛血清中的簡單蛋白，是 無
albumin , BSA , 0.5% ) 血液的主要成分。牛血清
中的一種球蛋白，包含
583 個胺基酸殘基，分子
量為 66.5 kDa，等電點為
4.7。
血液中的白蛋白主要起維
持滲透壓作用、PH 緩衝作
用、載體作用和營養作
用。在動物細胞無血清培
中，添加白蛋白可起到生
理和機械保護作用和載體
作用。
雞蛋白蛋白 ( ovalbumin , 等電點 4.5，其本質是含 無
OVA , 0.5% ) 磷糖蛋白。是蛋清中的主
要蛋白組分，其結構與性
質會顯著影響蛋清蛋白在
食品加工過程中的功能性
質。
氫氧化鈉 ( NaOH ) 具有高腐蝕性的強鹼，一 氫氧化鈉固體或其溶液皆
般為白色片狀或顆粒，能 能灼傷皮膚，對無防護措
溶於水生成鹼性溶液，另 施者可造成永久性傷害
也能溶解於甲醇及乙醇。 （如疤痕）。倘若讓氫氧
此鹼性物具有潮解性，會 化鈉直接接觸眼睛的話，
吸收空氣裡的水蒸氣，亦 嚴重者甚至可造成失明。
會吸取二氧化硫等酸性氣
體。
苦味酸 ( picric acid , 無色至黃色針狀結晶或大 但是某些苦味酸鹽的感度
C6H3N3O7) 塊固體微溶於二硫化碳， 較高，因此儲存苦味酸必
易溶於丙酮、苯等有機溶 須用非金屬容器，裝於彈
劑，溶於熱水、乙醇、乙 體中的苦味酸必須經過嚴
醚。它是苯酚的三硝基取 格的乾燥，以阻止苦味酸
代物，受硝基吸電子效應 腐蝕金屬，生成高感度的
的影響而有很強的酸性。 鹽。

分子：229.10 g·mol⁻¹
密度：1.763 g/cm³ (固)

單寧酸 ( tannic acid 是丹寧的一種特殊形式， 口服對胃粘膜有刺激性，

C76H52O46) 是一種多酚。它具有弱酸 可引起噁心、嘔吐；用於
性，pKa≈6，這來自它的 局部破損處，如大面積燒
很多酚羥基。 傷或加於硫酸鋇灌腸劑灌
它是多聚賴氨酸葡萄糖或 腸時，易吸收中毒，引起
多聚棓醯奎尼酸酯的混合 肝臟嚴重毒性，甚至死亡
物，每個分子個體的數目
為 2 至 12，這取決於用於
提取鞣酸的植物來源。
分子量：1701.2 g·mol−1
密度：2.12g/cm3
三氯醋酸 無色固體，是乙酸的甲基 三氯乙酸經還原得到二氯
( trichloroacetic acid , 被三氯甲基替代後形成的 乙酸，具潛在的致癌效
TCA , 20% ) 化合物，化學式為 果。
CCl3COOH。受氯的吸電子
效應的影響，三氯乙酸的
酸性比乙酸更強。

分子量：163.4 g·mol⁻¹
密度：1.63 g/cm³ (固)
氯化鈉 ( NaCl ) 氯化鈉的晶體主要有帶正 應儲存於陰涼、常溫避
電荷的 Na+和帶負電荷的 光、通風乾燥處，可以垛
Cl−組成，Na+和 Cl−在相互 放，防止雨淋、不得與酸
垂直的 3 個方向上的平面 鹼混存、垛底要鋪放木
上以 1:1 的比例均勻分 板，用以防潮，垛放高度
布，每個方向上的平面上 不超過兩米。
電荷的代數和為 0，稱為
分子量：58.44277 g·mol⁻¹ 「電性中和面」。
密度：2.17 g/cm³ (固)
硫酸汞 ( HgSO4 ) 一種無機化合物。硫酸汞 密閉操作，局部排風。建
為白色粉末，遇水水解， 議操作人員佩戴自吸過濾
產生黃色的鹼式硫酸鹽和 式防塵口罩，戴化學安全
硫酸。 防護眼鏡，穿防毒物滲透
工作服，戴乳膠手套。避
免產生粉塵。避免與氧化
分子量：296.653 g/mol 劑接觸。配備洩漏應急處
g·mol⁻¹ 理設備。倒空的容器可能
密度：6.47 g/cm3（固體） 殘留有害物。

硫酸銨〔(NH4)2SO4〕 化學式為(NH4)2SO4，無色 受熱分解產生有毒的煙

斜方晶體，易溶於水，水 氣。
溶液為酸性。 有害燃燒產物： 氮氧化
物、硫化物。
分子量：132.14 g/mol
g·mol⁻¹
密度：1.77 g/cm3
酒精 ( EtOH , 95% ) 乙醇的物理性質主要與其 高濃度的乙醇會刺激皮膚
低碳直鏈醇的性質有關。 和眼球，若食用過量則導
分子中的羥基可以形成氫 致嘔吐及噁心。長期食用
鍵，因此乙醇黏度很大， 則會損害肝臟。
也不及相近相對分子質量
的有機化合物極性大。室
分子量：46g/mol g·mol⁻¹
溫下，乙醇是無色，且有
密度：0.789 g/cm3 特殊味道的揮發性液體。
alanine (C3H7NO2 ，0.1 N ) 它含有胺基和羧酸，二者 無
都與中心碳原子相連，中
心碳原子也帶有甲基側
鏈。因此，它的 IUPAC 系
統命名為 2-氨基丙酸，並
且它屬於非極性胺基酸

分子量：89.09 g/mol g·mol⁻¹

密度：1.424 g/cm3

參考資料：
1. Felix Haurowitz and Daniel E. Koshland. August 20, 2020. Protein-
Encyclopædia Britannica, retrieved from
https://www.britannica.com/science/protein

2.等電點-Wikipedia（26 Feb 2019）, retrieved from

https://zh.wikipedia.org/wiki/等電點

3.兩性離子-Wikipedia（24 Aug 2018）, retrieved from

https://zh.wikipedia.org/wiki/兩性離子

4.Alkaloid-Wikipedia（13 Sep 2020），retrieved from

https://en.wikipedia.org/wiki/Alkaloid

5. 蛋白质分离纯化之沉淀分离法-生物探索，retrieved from
http://www.biodiscover.com/news/research/730915.html

6. 生物化學與分子生物學/蛋白質的理化性質-醫學百科（29 Jul 2013），retrieved

from http://cht.a-hospital.com/生物化学与分子生物学/蛋白质的理化性质

7. Tsutomu Arakawa and Serge N. Timasheff.(1984). Mechanism of Protein Salting

In and Salting Out by Divalent Cation Salts: Balance between Hydration and
Salt Binding-Biochemistry, page:5912-5923