生物化學-重要物質分析方法

一、 醣類 Carbohydrate
二、 脂質 Lipid
三、 蛋白質 Protein
1. 純化蛋白質的方法
A. 打破細胞釋放內含蛋白質-Crude extract
B. Fractionation（基於蛋白質大小、帶電等性質做分離）
 鹽析（salting out）：加入鹽（通常用 ammonium sulfate）讓蛋白質沈澱下來
 比較 Salting in

 Dialysis：基於蛋白質具有較大分子量，使其與較小分子量的溶質分離，讓溶液通過一個半透膜，蛋白
質因為有較大分子量所以不通過。常用此法分離掉 ammonium sulfate
 Gel filtration（大分子優先析出）

 Chromatography
組成：有孔的固體材料-固定相、緩衝溶液-一動向
Ion Chromatography Size-exclusion Affinity
Chromatography Chromatography
分離原理 pH、[salt]影響析出速率 Protein size。越小的蛋白 管住內的 bead 共價結合
質越會滯留在固定相。 ligand（可以結合蛋
白），蛋白質與 ligand 的
親和性決定析出順序
分離順序 Cation-exchange:固相帶 蛋白質大到小 親和性低到高
負電，正電荷越多越滯留 目標蛋白以 ligand sol 沖
Anion-exchange：相反 出
Ex:DEAE
備註 管住越長，分析力越高 析出 ligand binding
（但是流速會降低） protein： Salt 干擾 ion
interaction、Free ligand
competition

HPLC：加壓幫浦加速蛋白質溶液通過管住，減少管柱內滯留時間並且限制擴散性蛋白質條帶出現，
 大幅增加解析能力
C. 純化蛋白質的概念：由邏輯、經驗推斷而來，認識各個方法能做到的程度很重要

2. 分析蛋白質的定性方法：電泳
A. 電泳的 General concept
 觀察蛋白質重要的性質如：等電點、分子量
 Polyacrylamide gel 扮演分子篩，讓蛋白質依照其荷質比移動（形狀也會影響在膠上的移動）
 定義出蛋白電泳移動力：electrical potential, E. The electrophoretic mobility, 􏱄, of a molecule is
the ratio of its velocity, V, to the electrical potential. Electrophoretic mobility is also equal to the
net charge, Z, of the molecule divided by the frictional coefficient, f, which reflects in part a
protein’s shape. Thus:

B. SDS-PAGE
 是評估蛋白質純度、分子量常用的物質 SDS。可以抓緊每個 AA（1*SDS 帶一個 AA）、讓蛋白質都帶
有負電荷（由負電跑向正電）、讓蛋白質部分 unfold，所以 SDS 加入電泳膠，使蛋白質基於重量分離，
重量小位移快，另外加入 Coomassie blue 可以讓 protein band 可見(結合蛋白本身但不結合膠)。透過
跟 Standard 對比我們可以去得知未知蛋白質分子量（分子量對相對位移作圖）

C. Isoelectric focusing
 用來分析蛋白質等電點
 創造 pH 梯度(-到+，pH 大時蛋白質普遍帶負電，所以 pH 梯度是 pH 大到小)，在電場中蛋白質會跑到
自己的等電點位置才停下來
 D. 2D 電泳：結合 SDS-PAGE 還有 ISE

 解析複雜的蛋白質
3. 分析蛋白質的活性、功能
 每單位的酵素活性定義為：多少量的酵素讓 1umol substrate 在 25 度Ｃ下轉為產物
 Activity：溶液內酵素活性總和
 Specific activity：enzyme unit/ totol protein(mg)酵素純度
4. 分析蛋白質的序列
 傳統方法學：標定 N-terminal AA（marker: 1-fluoro-2,4-dinitro- benzene (FDNB), dansyl chloride, or
dabsyl chloride）
 化學定序（約 40AA）edaman degradation

 定序較大蛋白質：
 處理掉 S-S bond：DTT 還原作用、或是 Performic acid 氧化作用
  利用 protease（或化學試劑），先切割成較小片段

(Trypsin 用在已知蛋白質有多少 Lys, Arg)

 上述方法現今很少用來定序但依然有他的價值
 Break S-S
 Label amino-terminalarryay of reagent(label primary-amine of Lys )
 Modified Sulfhydryl group on Cys

 現代定序法：Mass spectrometry
 MALDI MS：蛋白質放置在光吸收的 martrix，高壓雷射照射，蛋白質離子化脫離基質進入真空系統。
可以得到 protein 的分子量（透過分析 m/z ratio：離子在電場的加速度取決於 m/z ，透過分析飛行時
間可得到 m/z）
 ESI MS：大分子溶液由 liquid phasegas phase，通過一個針狀管其內電壓很高，溶劑很快蒸發，剩
下帶電的大分子可被偵測
 Tandem MS：分析物先以 protease 處理，將蛋白質切成小片段。進入 MS 後會通過兩個 filter：第一，
不同片段彼此分離collision cell：He, Ar 等氣體在 peptide bond 產生切口。第二，測量通過 AA 的
m/z 分析 peak 可以得到 AA seq.
 人工合成 peptide：由 C terminal 合成向 N terminal
  Fmoc: amino group protector
 AA1-第一個 AA，被 Fomc 保護
 AA2-第二個加入的 AA
 AA1 與 resin 上的 postyrene bead 作用透過弱鹼洗掉 fmoc

被 Fmoc 保護的 AA2 與 DCC 作用

AA1 的 amino group 攻擊 AA2 上的 DCC，DCC 離開

繼續合成或是選擇終止

5. pH>pI 蛋白質帶負電、pH<pI 蛋白質帶正電