Exp.2.

聚丙醯胺膠體電泳 SDS polyacrylamide gel electrophoresis

(SDS-PAGE)
一、實驗目的
利用聚丙醯胺膠體電泳分析未知蛋白質的分子量。

二、實驗目標
1. 學習聚丙醯胺膠體電泳的製作流程。
2. 利用聚丙醯胺膠體電泳分離不同分子量之蛋白質。

三、實驗原理
蛋白質分子在酸鹼不同的環境影響下有不同的淨電荷。蛋白質分子所
帶的淨電荷由環境 pH 值所決定。當環境 pH 值大於蛋白質等電點（pI）值
時，蛋白質分子帶負電。當環境 pH 值小於蛋白質 pI 值，蛋白質分子帶正
電。環境 pH 與蛋白分子的 pI 值相同時，此分子的淨電荷為零。一般電泳
系統中帶負電的分子將往正極跑，帶正電的分子將往負極跑，不帶電者則
不動，大部分電泳的 pH 條件為 8.3，在此 pH 環境中，凡是 pI 值小於 8.3
的分子均帶負電荷，可以往正極跑。
SDS-PAGE 為一種常使用的蛋白質表現分析技術，透過檢體蛋白質分
子量不同，使其在聚丙醯胺凝膠內移動。SDS 是一種界面活性劑（俗稱的
清潔劑），SDS 分子具有極性的親水頭端與非極性的疏水尾端。非極性尾端
可鑲入蛋白質三級構造的內部，而以極性頭部與外界的水分子結合，使得
蛋白質變性。因此整個 SDS-PAGE 過程，除了電泳溶液含有 0.1％ SDS 以
外，樣品本身在一開始也須加入 SDS 使蛋白質變性，同時使用還原劑 -
mercaptoethanol 打斷蛋白質分子間的雙硫鍵。最後會把樣本加熱處理使蛋
白質結構變成直鏈狀並吸附帶有負電荷的 SDS 分子。由於 SDS 在蛋白質
上的分佈非常均勻，因此在電場的作用下，帶負電荷的蛋白質向正極移
動，稱為泳動。其泳動的程度稱為泳動率(mobility)。
製膠時，上膠的 Stacking gel，pH 值就滴定在 6.8; 而下膠的
Separating gel，pH 值則滴定成 8.8。當 Sample 滴入膠片且加上電場後，
Running buffer 中的 Glycine (其 pI = 6.8) 在 Stacking gel 中為中性不帶
電，帶負電的氯離子因外加電壓而快速向下移動，Glycine 和氯離子之間
產生離子空乏區，此區域會被 Sample 取代 (形成 band) ，當 Glycine 緩
慢離開 Stacking gel，之前和氯離子形成的離子空乏區瞬時瓦解，而
Sample 也離開 Stacking gel，到達 Separating gel (其 pI = 8.8)。當在
Separating gel 區域，此時蛋白質在膠體內的泳動率取決於蛋白分子所帶的
電荷多寡。電泳設備提供的電壓強度也會影響泳動率，當電壓越大則蛋白
質泳動率越快。此外，膠體的孔篩之阻礙程度也會影響蛋白質泳動率。當
 膠體濃度愈高(ployacrylamide 百分比)，則孔徑愈小，蛋白質分子在電場中
泳動率就愈慢。理論上 SDS 是很均勻的吸附到蛋白質上，因此不管原來蛋
白質分子的大小，每種蛋白質分子上所吸附的負電荷密度均相同。當待測
蛋白皆帶有均勻負電荷時，其泳動取決於分子量的大小。因此最終蛋白質
會依照分子量大小排列在凝膠內，跑完的蛋白質膠體可利用 Coomassie
blue 染色方式染出所有在膠體上的蛋白質，染色原理為利用 Coomassie blue
與蛋白質中的 arginine 及 lysine 結合。讓蛋白質呈現肉眼可見的藍色。含
量較多的蛋白質則凝膠內的藍色紋路(band)較粗。若要以 SDS-PAGE 來測
定分子量，則需要有已知分子量的標準品同時進行電泳分析，再透過
Coomassie blue 染色比較標準品與未知蛋白質樣本分布相對位置比較，即
可推出樣本蛋白質的約略分子量。

四、實驗試劑
1. 30 % acrylamide: 0.8 % bis-acrylamide
2. 1.5 M Tris pH=8.8
3. 1 M Tris pH=6.8
4. 10 % SDS
5. 10 % APS
6. TEMED
7. Protein standards
8. 5X Sample Buffer
9. 1X-SDS Electrophoresis Running Buffer (Tris-Glycine + SDS)
10. Coomassie Staining Solution

五、實驗步驟
SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)

※請勿打破玻璃片，打破要賠償。
(一) 組裝鑄膠系統之操作步驟（全程請戴上手套）
1. 戴上手套持噴灑器，噴灑 75％酒精於短玻璃片其中一面及長玻璃片之
有 spacer 的那一面，長、短玻璃片都放置在實驗桌面之吸水紙上，用
拭鏡紙擦拭乾淨（拿在手上擦拭容易因用力過度弄破玻璃片），先擦拭
長玻璃，拭淨後置於乾淨拭鏡紙上，有 spacer 的那一面朝上，再擦拭
短玻璃，拭淨後乾淨面朝下，覆蓋於長玻璃 spacer 上。
2. 小心將兩片玻璃組合拿起，短玻璃在前長玻璃在後，輕輕放入綠色鑄膠
框架（Casting frame）
，請確認兩片玻璃片底部要齊平，以免鑄膠溶液倒
入後漏失。
3. 在鑄膠支架座（Casting stand）底，鋪上一灰色長條狀之止漏墊，再將
綠色鑄膠框架（Casting frame）置中擺放，以上方夾子夾住。

4. 測漏：取 4.5 ml ddH2O 倒入兩片玻璃片之夾層中，以馬克筆在玻璃上標
註此液面高度，靜置 2~3 分鐘，觀察液面是否下降，若下降（表示會漏）
則重新組裝。確認不會漏之後將水倒掉，以吸水紙吸乾殘水。
5. 取一 50ml 燒杯，洗淨並用拭鏡紙擦拭乾淨，準備配置 10% Separating
gel，配方如下：{配置 10% Separating gel (for 1 gel) ( 4.5 ml for one gel )}
30 % acrylamide: 0.8 % bis-acrylamide 2 ml
1.5 M Tris pH=8.8 1.5 ml
ddH2O 2.38 ml （依順序配置並混勻）
10 % SDS 60 μl
10 % APS (Add the last) 60 μl （先加，加入後混勻）
TEMED (Add the last) 4.8 μl （後加，加入後混勻）
Total 6 ml
6. 進行下一步驟前，請先準備塑膠吸管 1 支、已插上 blue tip 之 p1000 的
pipetman 及 ddH2O 一小杯（至少 2ml）。
7. 上表括弧內 4 項共 5.94 ml 自行配置於 50ml 燒杯中，再加入 60 μl 之
10 % APS，輕輕搖動燒杯混勻（儘量避免造成太多泡泡） ，最後加入 4.8
μl TEMED，儘速混勻後，用塑膠吸管吸取混合液後再插上 yellow tip，
將溶液加入兩片玻璃片之夾層中，液面上升到馬克筆標註之高度即停止，
立即取 p1000 的 pipetman 吸取 1ml 之 ddH2O 延 spacer 緩緩加入於 gel
液面上，以隔絕空氣中阻礙 gel 聚合之氧（02），靜置 30mins.（上課）。

※殘餘在燒杯中之 gel 可倒入 15ml 之離心管中另加 1ml 之 ddH2O 覆蓋，
若離心管中之 gel 會凝結，代表玻璃片中之 gel 也會凝結。
8. 先將 Separating gel 上覆蓋之 ddH2O 倒掉，以吸水紙吸乾殘水。將齒梳
Comb 插入玻璃片中，呈傾斜狀。
9. 取一 50ml 燒杯，洗淨並用拭鏡紙擦拭乾淨，準備配置 5% Stacking gel，
配方如下：{配置 5% Stacking gel (for 1 gel) ( 3 ml for one gel )}
30 % acrylamide: 0.8 % bis-acrylamide 500 μl
1 M Tris pH=6.8 375 μl
ddH2O 2.065 ml （依順序配置並混勻）
10 % SDS 30 μl
10 % APS 30 μl （先加，加入後混勻）
TEMED (Add the last) 4.8 μl （後加，加入後混勻）
Total 6 ml

10. 每兩組領取助教已事先配置之前 4 項混合液（上表括弧內 4 項），自行

量取 2.97 ml 混合液倒入 50ml 燒杯中，再加入 30 μl 之 10 % APS，輕
輕搖動燒杯混勻（儘量避免造成太多泡泡） ，最後加入 2.5 μl TEMED，
儘速混勻後，用塑膠吸管吸取混合液加入兩片玻璃片之夾層中，加到短
玻璃片上緣，將 Comb 壓入直到與短玻璃片貼合，立即取 p1000 的
pipetman 吸取 1ml 之 ddH20 緩緩加入於 gel 液面上，靜置 30mins.待 gel
凝結，殘餘在燒杯中之 gel 也可倒入 1.5ml 之 eppendroff 加 0.2ml 之水覆
蓋，若燒杯中之 gel 會凝結，代表玻璃片中之 gel 也會凝結。
11. 確認 gel 已凝結後，將綠色鑄膠框架（Casting frame）含玻璃片一併取
下(玻璃片不可從綠色鑄膠框架中抽出來)，取數張吸水紙覆蓋，置水龍
頭下緩緩沖水，讓吸水紙全部飽含水分後，按組別順序標明（貼紙標明）
後放入含有 Running buffer 之夾鏈袋保存。
將綠色鑄膠框架（Casting frame）含玻璃片一併取下(玻璃片不可從綠
色鑄膠框架中抽出來)之示意圖(借用鑄膠前之狀況，上下膠配置完成後
應該含齒梳(Comb))


























 SDS-PAGE-2 第二週
(二) 組裝膠體電泳系統之操作步驟（全程請戴上手套）
1. 先 將 綠 色 鑄 膠 框 架 （ Casting
frame）固定玻璃片之門夾如箭
頭方向扳開，手握長、短玻璃片
上端，將玻璃片組自綠色鑄膠
框架（Casting frame）中小心取
出。

2. 先將電泳模組兩側之扣夾打
開。





3. 每一電泳槽可跑兩片 gel，其電
極裝置（Electrode Assembly）
前、後可以各裝置一片 gel，將
玻璃片組與電極裝置貼合固定，
注意（1）短玻璃朝內，（2）將
玻璃片組跨架於電極裝置底部
箭號指定之位置上。



4. 將電泳模組兩側之扣夾緩慢以
同時且同角度夾合前後兩組玻
璃片組。
＊注意：請確認前後兩組玻璃片
組是否卡進扣夾之內，尚未卡入
扣夾前，兩手之收合動作需輕
緩，確認後才可用平穩速度收合
至扣夾與桌面垂直。

 5. 將玻璃片組固定完成。










1X Running Buffer

6. 將電泳模組連同電極裝置一起
提起來，將之卡進電泳槽(tank)
中。於兩片 gel(或兩組玻璃片
組)中倒入 1X Running Buffer 至
長玻璃片上緣（倒滿） ，觀察
2~3 分鐘，若液面下降，則需
拆掉玻璃重新組裝（拆除裝置
前，Running Buffer 找一大燒杯
回收，不可倒棄於水槽，1X
Running Buffer 可用數次後才廢
棄）
7. 電泳樣本之置備，每管加入 5ul 5X sample buffer，用 pipetting 或 votex
的方式將沉澱物完全打散。每管皆套上防爆夾（防止 95℃加熱時，
eppendorf 爆開，內容物溢散漏失），將樣本放置於試管加熱器中，95
℃加熱 5 分鐘，加熱結束後，立即 votex，1min.。
8. 每一排準備一冰桶，內置八分滿之碎冰，votex 完成之樣本，立刻插入
冰中，使之急速冷卻 5 分鐘，冷卻完成之樣本，置於離心機作 spin
down（13000rpm ，5 min.）動作，將上清液移置新的 eppendorff 中。
9. Loading sample：各樣本皆取 20 ul loading 到 gel 之 well 中。剩餘樣本
助教回收冰存於-20℃冰箱保存(留待做 western 時使用)，依下列圖示位
置，各樣本皆取 20ul loading 到 gel 之 well 中，若體積不足 20ul，則全
部 loading 到 gel 之 well 中，吸取樣本時，吸管尖端若有空氣，應先在
tip 未進入液面之前將空氣先壓出，作法是將 pipetman 往降低刻度（比
原數字小）方向緩慢轉動，將空氣趕走，tip 內液體一到達 tip 最尖端
時即停止轉動，再將 tip 伸入液面，tip 尖端到達 well 上緣，pipetman
保持垂直，將 tip 內液體壓入 well 中。（樣本因比重較重，會自動沉降
至 well 底部，故 tip 不要深入到 well 下緣，以免樣本溢出，流到相鄰
的 well 內），樣本 Loading 完成後，請助教 Loading marker。


M 10 20 20 40 40 60 60 80 M

M 10 20 20 40 40 60 60 80 M Stacking gel

第1組 第2組 第3組 第4組

Separating gel

10. 倒 1X Running Buffer 至兩組玻璃片組外側之電泳槽(tank)中，使 Buffer
液面到達電泳槽(tank)外標示之 2 Gels 標線之高度，將綠色上蓋蓋
好。※上蓋之紅色電線與電極裝置（Electrode Assembly）之標有紅色
圈之銅棒電極連接（紅接紅，黑接黑，千萬不可接錯），上蓋之紅色電
線另一端插入電源供應器之紅色插孔中（紅接紅，黑接黑，不可接
錯）。
11. 開啟電源供應器之電源，設定電壓 120V（右鍵，V 燈亮），設定完成
後，按中間 run 按鈕(run 燈亮)，Stacking gel 用 120V 跑，約需 20 分
鐘。
12. 當 sample 移動越過 Stacking gel 與 Separating gel 之界線後，將電壓調
高至 180V，Separating gel 用 180V 跑，約需 30~40 分鐘，直到 dye
front 到達 gel 底(但要注意不要讓 dye front 跑出玻璃片底部)，立即關閉
電源（按 stop 鍵）。
13. Running Buffer 回收倒入 5L 量筒中，將玻璃拆卸下來，短玻璃片朝
上，在水龍頭沖水狀況下，以綠色裁剪片小心撬開兩片玻璃片，移開
短玻璃片，使 gel 留在長玻璃片上，再用綠色裁剪片之裁刀端，將
Stacking gel 裁開剔除， 1 片 gel 用一塑膠盒（染色及褪染用），將
Separating gel 推入已裝有自來水塑膠盒中並標記組別。
14. 14、將 Separating gel 用自來水洗 3 次，每次 5 分鐘，塑膠盒置於
shaker 上搖動，轉速 80 轉/分鐘。
15. 15、將水倒乾，倒水時以戴手套之手擋住 gel，以免 gel 掉出塑膠盒而
 破裂，倒乾水後，再倒 Staining solution 直到蓋過 gel 即可，染 10~15
分鐘，置於 shaker 上搖動。
16. 16、回收 Staining solution，將 Staining solution 倒回保存瓶中，儘量倒
乾，用自來水褪染 3～4 次，每次 5 分鐘，褪染之廢液倒入燒杯，不可
任意倒入水槽，褪染完成後背景 gel 應呈透明無色。
17. 照相並討論結果圖片

牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA），又稱第五組分，是牛血
清中的一種球蛋白，包含 583 個胺基酸殘基，分子量為 66.5 kDa，等
電點為 4.7。