·1218· 中国生物制品学杂志 2016 年 11 月第 29 卷第 11 期 Chin J Biologicals November 2016，Vol. 29 No.

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· 技术方法 ·

方差随机效应模型分析凯氏定氮法蛋白质含量
测定的中间精密度
李黎，吴凡，涂晶，杨邦玲
武汉生物制品研究所有限责任公司质量控制室，湖北 武汉 430207

摘要： 目的 利用方差随机效应模型分析本实验室凯氏定氮法蛋白质含量检测过程中变异来源及各种来源变异在
总变异中所占比例。方法 将凯氏定氮法蛋白质含量检测过程中，检测人员、检测仪器、检测时间 3 个主要影响因素
纳入方差随机效应模型进行方差成分分析，并计算中间精密度（intermediate precision，IP）和组内相关系数（intra-class
correlation coefficient，ICC）。结果 本实验室凯氏定氮法蛋白质含量检测过程中，49. 20%的变异来源于检测人员因
素，其次为检测仪器和检测时间；本实验室凯氏定氮法蛋白质含量检测 IP 和 ICC 分别为 2. 58%和 0. 59。结论 在
本实验室中，检测人员是凯氏定氮法蛋白质含量检测主要的变异来源；本实验室凯氏定氮法蛋白质含量检测的变异
度较小，检测结果准确度较高；应用方差随机效应模型能有效分析检测过程中的随机影响因素。
关键词： 中间精密度；凯氏定氮法；随机效应模型；方差分量
中图分类号： Q-332 O656. 33 文献标识码： A 文章编号：1004-5503（2016）11-1218-03
DOI:10.13200/j.cnki.cjb.001512

Application of variance analysis to random-effect model in assessment

of intermediate precision of Kjeldahl method
LI Li, WU Fan, TU Jing, YANG Bang-ling
The Division of Quality Control, Wuhan Institute of Biological Products Co.Ltd.,
Wuhan 430207, Hubei Province, China
Corresponding author: YANG Bang-ling, E-mail: ybl6566217@163.com
Abstract： Objective To assess the source and proportion of variability in Kjeldahl method by using random-effect model
in analysis of variance（ANOVN）. Methods Three variables during determination of protein content by Kjeldahl method,
date, measurement instrument and operators, were included in ANOVN, based on which the intermediate precision （IP）
and intra-class correlation coefficient（ICC）of the method were calculated. Results During determination of protein con－
tent by Kjeldahl method, 49. 20% of total variability was due to operators, followed by measurement instrument and date.
The IP and ICC of the method were 2. 58% and 0. 59 respectively. Conclusion In the process of determination of pro－
tein by Kjeldahl method, a majority of the variability might be due to the operators. The determination result of protein
content was reliable with high accuracy and good precision in this laboratory. The random-effect of variance analysis may
be applied to the analysis of randomly influencing factors during determination.
Key words： Intermediate precision; Kjeldahl method; Random-effect model; Variance analysis

1883 年，丹麦化学家 Johan Kjeldahl 建立了凯 究和实验结果的评价中，应用重复性、中间精密度

氏 定 氮 法 测 定 有 机 物 中 氮 的 含 量 。 经 Vickery、 （intermediate precision，IP）和再现性表达不同实验
Reitmair 和 Stutzer 等研究者改良后，凯氏定氮法现 条件下的精密度［2-4］。相对于重复性和再现性， IP 更
已成为国际、国内公认的蛋白定量标准方法，并广泛 能专注反映同一实验室检测过程中多项因素造成的
应用于生物医药、农业、 食品等领域［1］。《中国药典》 变异总和。因此，本实验利用方差随机效应模型对
三部（2015 版）规定利用凯氏定氮法对人血白蛋白、 本实验室定氮检测中检测人员、检测仪器、检测时间
各种免疫球蛋白等多种生物制剂进行蛋白质含量检 3 个因素对蛋白质含量检测结果的影响进行方差分
测。在实际检测过程中， 多种因素会影响凯氏定氮法 析，并对 IP 进行计算及分解，以明确上述因素在检
蛋白质检测结果的准确性。ISO3534-2 规定在方法研 测变异中的比例， 从而明确主要变异来源，为确保检
通讯作者：杨邦玲，E-mail：ybl6566217@163.com 测结果的准确性提供数据支持。
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1 材料与方法 2. 2 利用随机效应模型分析各方差分量的结果 在
本实验室中，由检测时间、检测仪器及检测人员 3 种
1. 1 主要试剂及仪器 硫酸、硼酸、氢氧化钠、硫酸 因素引起的变异分别为 0. 029 2、 0. 050 7 和 0. 456 3。
铜和无水硫酸钠购自国药集团化学试剂有限公司； 在总体变异中， 检测人员因素的变异所占比例较高，
0. 005 0 mol ／ L 标准硫酸滴定液由本公司质量控制 约为 49. 20%，其次为检测仪器和检测时间，所占比
室生化检定组制备并标化；人血白蛋白工作参考品 例分别为 6. 42%和 3. 21%，见表 2 和表 3。
由本公司制备；BUCHI-K370 全自动凯氏定氮仪购
自瑞士 BUCHI 公司。 表 2 方差分析表
1. 2 方法 Tab 2. Variance analysis

1. 2. 1 凯氏定氮法检测蛋白质含量 依据《中国药 变异来源 方差 自由度 均方差 F值

典》三部（2015 版）通则 0731 第一法［5］，由本实验室 时间 0. 029 2 1 0. 029 20 0. 20

3 位检测人员，在 2 台 BUCHI-K370 全自动凯氏定氮 仪器 0. 050 7 1 0. 050 67 0. 27

仪上，在 2 个不同时间段对人血白蛋白工作参考品 人员 0. 456 3 2 0. 228 15 1. 07

进行检测，按下式计算蛋白质含量。 误差 0. 516 9 67 0. 007 71

蛋白质含量 =（总氮量 - 非蛋白氮量）× 6. 25 总体 1. 053 1 71

1. 2. 2 数据处理 应用 Stata 11. 0 软件进行多因素
方差分析，以 P ＜ 0. 05 为差异有统计学意义。按下 表 3 总体方差分布比例
式计算 IP［6 ］和组内相关系数（intra-class correlation Tab 3. Proportional allocation of total variance
coefficient，ICC）［7］。 变异来源 方差分量值 比例

IP（%）= 姨σ 2
+σ 2
／ X × 100%； 检测时间 0. 000 6 0. 000 6∕0. 018 7 = 0. 032 1
组内变异 组间变异

ICC = σ2组间变异 ／（σ2组内变异 + σ2组间变异） 检测仪器 0. 001 2 0. 001 2∕0. 018 7 = 0. 064 2

检测人员 0. 009 2 0. 009 2∕0. 018 7 = 0. 492 0

误差 0. 007 7 0. 007 7∕0. 018 7 = 0. 411 2

2 结果
总值 0. 018 7 1

2. 1 蛋白质含量检测结果 在 2 个不同时间段，3
位检测人员在 2 台凯氏定氮仪上检测人血白蛋白 2. 3 ＩＰ 和 ＩＣＣ 经计算， IP = 姨0. 018 7 ／ 5. 31 ×
蛋白质含量的结果见表 1。 100% = 2. 58%；ICC =（0. 000 597 + 0. 001 19 +
0. 009 183）／ 0. 018 7 = 0. 59。
表 1 凯氏定氮法检测蛋白质含量结果（%）
Tab 1. Determination of protein content by Kjeldahl method（%） 3 讨 论
仪器 1 仪器 2
时间 检测次数
人员 1 人员 2 人员 3 人员 1 人员 2 人员 3 相对于固定效应模型比较各研究因素的效应
1 1 5. 40 5. 40 5. 38 5. 44 5. 35 5. 39 差异，随机效应假定研究因素为随机效应，其目的是
2 5. 54 5. 43 5. 40 5. 36 5. 40 5. 32
分析研究因素代表的总体水平的随机变动状况［ 8 ］。
本实验纳入检测时间、检测仪器和检测人员 3 个研
3 5. 31 5. 42 5. 47 5. 37 5. 45 5. 37
究因素，目的是分析在凯氏定氮法蛋白质含量检测
4 5. 40 5. 35 5. 50 5. 41 5. 40 5. 40
中的变异来源及所占比例，从而加强关注，有针对性
5 5. 41 5. 47 5. 35 5. 32 5. 37 5. 45
地进行检测质量过程控制。
6 5. 38 5. 45 5. 39 5. 42 5. 47 5. 51
本实验采用随机效应模型对本实验室的检测人
2 1 5. 50 5. 38 5. 51 5. 42 5. 35 5. 40
员、检测仪器和检测时间 3 个因素对凯氏定氮法测
2 5. 43 5. 41 5. 41 5. 35 5. 41 5. 30 定白蛋白蛋白质含量的结果进行了方差分析，结果
3 5. 30 5. 40 5. 37 5. 36 5. 46 5. 36 显示，在总体变异中，49. 20%的变异源为检测人员，
4 5. 43 5. 35 5. 33 5. 33 5. 51 5. 39 41. 12%来源于检测过程中出现的难以避免的随机
5 5. 40 5. 46 5. 42 5. 42 5. 37 5. 45 误差。因此，为了减少凯氏定氮法测定白蛋白中蛋
6 5. 35 5. 32 5. 52 5. 40 5. 39 5. 52 白质含量过程的变异，可通过加强检测人员的岗前
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及岗位培训，制定统一、详细规范的操作规程，以降 112-118.
［2］ International Standard Organization. Statistics-vocabulary and
低检测人员之间的变异。本实验计算了 ICC，其又
symbols-Part 2：applied statistics［S ／ OL］.（2006-09-15）
［2016-
被称为信度指标，ICC 取值位于 0 ～ 1 之间，ICC 值
01-06］. http：／ ／ www. iso. org ／ iso ／ catalogue_detail. htm?csnu-
越大，表明检测结果的可信度越高，测量结果误差越 mber=40147. ISO 3534-2，2006.
小。本实验结果显示，本实验室凯氏定氮法测定白 ［3］ ICH Harmonised Tripartite Guideline. Q2 （R1） -Validation of
蛋白中蛋白质含量检测误差较小，检测结果可信度 analytical procedures：text and methodology ［EB ／ OL］. （2014-
06-02）
［2016-01-06］. http：／ ／ www.gmp-compliance.org ／ guide-
较高。为了进一步减小检测结果的误差，除对上述
mgr ／ files ／ Q2（R1）. PDF.
检测人员因素进行控制以外，定期对检测仪器性能
［4］ EURACHEM Guide. The fitness for purpose of analytical meth－
进行核查及增加重复检测次数也是控制仪器本身测 ods：a laboratory guide to method validation and related topics
量误差和随机误差的有效措施。 ［EB ／ OL］.（2013-07-28）. http：／ ／ www.eurachem.org ／ index.
目前， 国内研究者多利用方差、变异系数或相对 php ／ working-groups ／ inactive-working-groups ／ 3-publications ／

标准偏差等指标的数值来体现不同检测条件下的重 images ／ stories ／ Guides ／ pdf ／ rdguide. pdf. 1998

［5］ Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of People's
复性，但对影响重复性的效应因素分析较少。通过
Repubic of China（Vol Ⅲ）
［S］. Beijing：China Med Sci Press，
随机效应模型对中间精密度中 3 个方面的变异来源 2015：50.（in Chinese）
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不同因素的变异，有针对性地进行控制，降低测量误 中国医药科技出版社，2015：50.

差，从而确保了检测结果的准确性及可靠性。 ［6］ YAN H，XU Y Y. Medical Statistics［M］.（3rd ed）. Beijing：

People's Medical Publishing House，2015：218-219.（in Chinese）
本 实 验 仅 应 用 凯 氏 定 氮 方 法 检 测 了 5%（g ／
颜虹，徐勇勇. 医学统计学 ［M］. 3 版. 北京：人民卫生出版
100 ml）水平的蛋白含量，在今后的研究中，还可在 社，2015：218-219.
不同浓度水平下分析影响测量结果的各种变异因 ［7］ LYMAN OTT R，LONGNECKER M. An introduction to statis－
素及其在总体变异中所占比例。 tical methods and data analysis （6th ed）［M］. Texas A&M Uni－
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收稿日期：
2016-04-13 编辑：
何巍