第 卷第 期 色 谱 N

年 月 N JO RN L O ROM T OI R P Y S J

色 谱峰 纯 度 的 定 性 方 法

黄 芳 康继宏 郁 建 胡育筑
中 国药 科 大 学 南京

提要 较 系 统地 介绍 了 近 年 来 国 内 外 文 献 中有 关 色谱 峰 纯 度 的 定 性 方 法 仪 器 方法 和 化学 计 量 学 方 法
器 方 法 重 点 介 绍 了归 一 化 比 较 光谱 吸 收 比 法 光 谱 抑 制 法 及 导 数 技 术
、 、 。
—
化学
仪
计 量方 法 介 绍 了 主 成 分 分 析 法 和
。 。

渐 近 因子 分 析 法 通 过 对 文 献方 法 和 应 用 的 简 单 介 绍 比 较 了各 种 方 法 的 特 点 及 优 缺 点 总 结 了规 律
, ,

色 谱 峰 纯 度 仪 器 方法 化 学 计 量 学 方法 色谱 法
, , ,

关链 词
。

在 9 90 以上 这 种 鉴 定方 法 的灵 敏度 主要 取 决 于 物
前言 、

质 和 杂质 的光 谱 区 别 相 对 吸 收 度 及 保 留 时间 的差
。
e
等 人 汉 通 过 直 接计算 吸 收 光谱 对 之
r :
在 应 用 色谱 法分离复杂物质时 色 谱 峰 的 纯 度
, ,
别 最近 iS ve
。

间 的 相 关 系数 有效 地 鉴 定 了多 吠的 重 叠 峰
,

即 一 个 色 谱峰 究 竟是 由 一 种 组 分构 成 还 是包 含 了 两 .
r ,
n e e r a t
, 。
2 2 吸 收比 法 ( A b s o ba io
简称 AR )
种 或 两 种 以 L 的 成 分 成 为 人 们首 先 关 心 的 问 题
_

Da i s 二 ,士
, .
对 于 任 河 在 紫 外 可 见 光 区 有 吸 收 的纯 物 质在
曾统 计 过 实 际 色 谱 图 中仅 有 20 % 为纯 组 分
v

两 个 选 定 波 长 下 的 吸收 比 为 一 常数 且 与 浓 度 无 关
,
。
,
峰 重 叠 峰 占绝 对 多 数 色 谱峰 纯 度 的 鉴 别 已 成 为 色
。

在 组 分 的 洗 脱 过 程 中 吸 收 比应 恒 定 以 这 一 比 值 K
,
。

谱分 析 的 中心 问 题 之 一 色 谱 峰纯 度 的 定 性 方法 国
。

对 分析 时 间 作 图 纯 物 质 应 是 恒 定 K 值 的 方 波 形
,
。
,
内 外 已 有 不 少 报道 归 纳起 来 这 些 方 法 可 分 为 两
。
: 。
杂 质存 在 将 使 其 产 生 扭 曲 比值 图不 仅 可 以 用 于 估
类 一 类是 仪 器 方 法 一 类 是 化 学计 量 学 方 法
,

。
, 二`一 日〕
计 峰 纯 度 而 且 还 可 确 定 峰 种类 吸 收 比 法的可
2 仪器 方 法 靠性 依赖于 波长的选择 及吸收值的差别
〔 9一 ” 〕 ,
波长
。
〔龙
, 、 应 尽 量 选 择 在 具 有最 大 吸收 差 别 处
从 原 理 上 分 仪 器 方 法 可 分为 比较 法 吸 收 比 u a o r
、
。 了
在 多波 长 吸收 比 法 ( M l t i p l
e
bs ba n c e r a t o
i )
法 光 谱抑 制 法 和 导 数技 术 等 在单 通道 U V v 1s ·

二` ” 一 ’ ` 〕 ,

, 〔 2〕 〔 3二 , 中 用 多 个 波 长 代替 双 波 长 可使 吸 收 比 法 的
检 测 中 常 应 用 峰向 量分 析 或者导 数色 谱 方法 。 C 〔 `苏〕
选 择性 和 灵 敏 度 都 会 提 高
s
197 4
年o ot ij 首 先从
通 过 比 较 标 准 品 和 被 测 物 质 的 峰 形 来 判 断是 否 有 杂
。 , 理 论 上 认 识 到 多 重 数 组 散使 色 谱 峰 的 鉴 定 变 得 容
质存 在 由于 色 谱 峰形 常受多 个 因 素 影 响 所 以 用 峰 。

。 易 仪 器 重 复搜 索 找到 光 谱 最 大 吸 收 波 长 并 给 出信
形 判 断 杂质 很 不 可靠 双 波长 检 测 器 及 多 通 道 检测 , ,
号 其 它 波长 信 号 比 值 沿 色 谱 图 给 出 可 直 观 显 示 所
方 法 的 出 现 使 吸 收 比 法 和 各种峰抑 制 技术迅 速 发 展
。

。 有峰 的 纯 度
了起 来
二 6二 -

提 出 的 多 吸 收 比 相关性 理 论 ( M
a r r
·
r
m pa r in g
M 等人 l
u
2 l 归 一 化 比 较 光谱 ( N o m a l五z i n g a n d e o
,
t : s o r n e e r a t
ple a
ba io e o r r e
l a t io n
是
s P ee tr a r o v a r
io u s
pe s ec tio n
b 简称 M ARC )
f m ak ) ,

、 一 种新的 检 验色 谱 峰 纯 度 的 方 法 此 法 可通过 计 算
分别 取 色 谱 峰 的 前 沿 峰 顶 和 峰 尾 处 的 光 谱 图
,
色 谱 峰 上 连 续多点的 光谱 和 参 比 光 谱 的 五 点 吸 收 比
进 行 比 较 如果色 谱 峰是 纯 净物形成 的 那 么 在 色 谱
,

,
矢 量 之 间的相关 性 来 鉴 定峰 纯 度 根 据参 比 光 谱 的
峰各 点 所 得 的 光 谱 仅 在 振 幅 响 应 上 有 差 别 用 归 一 , 。

, 一 , 不 同 M A R C 法 又 可 分 为 IM A R C 和 E M A R C
化 方法 所 得 的 紫外 可 见 光 谱 应 完 全 一 致 用 匹 配
以峰 顶 的 光 谱 作 参 比 它 能 提 供 峰 纯 度 信
,
IM A R C
`
)〔 〕
e t o r , 。

因子 ( m 来 衡 量 其值 应 接 近 于
a te h fa 1000
,
;
, 息 E M A R c 以 标 准 品 的光 谱 作为参 比 不 仅 提供 峰
若在 色 谱 峰 的 不 同 部 位 得 到 的 吸 收 光 谱 中 吸 收 最 。 ,
纯 度 信 息 而 且 提 供可 能 的 峰种 类 和 A R 法相 比
,

大值或 最 小值 发 生 了 位 移 则 证 明该 色 谱 峰 中 有 杂 ,
。
, M A R C 法 对 波 长 的 选 择 不 敏 感 对 光谱相 似性 无要
质存 在 要 使 杂质 含 量 低 于 5 % 则 纯 度匹 配 因 子应

: :
本 文 收 稿 日期 月 月
,
1993 年 12 27 日 修回 日期 19 9 4 年 2 8 日
 谱 卷

求 灵敏 度 也 不 依 赖 于 色 谱 的 分 辨 率 光 谱 差 别 不大 时 导 数 色 谱 能 提 供 足 够 的 信 息 鉴 定
, a r :
等 人测
,
M
。
二3 , 二
这类重叠峰 洲 讨论 了 导 数色 谱在
二
el 等 IP 无
.

定 了 一 个 二 组 分 光 谱 性 质极 其 相 似 (7 > 。 99) 的二 F H
。

中的 应 用
n e
加 二提 出 了 三维 导 数 技 术 并 成
. 。

元样 品 检测限为 1佑
,

比 AR 法的 5一 0 环低 得 多
1 aF sa m ad
。

两 波 长 的 吸 光 度 之 比 可 用 两 波 长 下色 谱峰 的 积 功 地 鉴 定 了 乙 快 基 幽二 醇 和 诺塞 幽酮 的 重 叠 峰
其它 方法
。
’ ’ 丁二 .2 5
一

t。
一

分 面 积 比代 替 小 W hi 等 发 现 用峰 高 之 比 更
。

并 列 检 测 器 也 可 用 于 测 定 有 重 叠峰 的样 品
。
二“ 二
准确 C a s t e
l di n e
等 发 现 用 峰 面 积 之 比能 克 服 噪 灭
。
二 。

音 及 峰前 沿 和 尾 部 吸 收 比 的 不 准 确性带来的 影 响 个 重 叠 组 分 至 少需 要 N 个 不 同的检 测 器 :33 n k

lB a
万3 ’ 二 ,

等 曾利 用 重 叠 组 分 的 氧 化 电位 不 同 采 用 双 重 电
.
e e r a s u r e ss
光 谱 抑制 法 ( s p t ,
2 3 l pp io n 55 )
简称
。

光 谱抑 制 法 是 吸 收 比 法 的 进 一 步 发 展 本 法 测 化学 检 测 器 分 析 了 重叠峰
,
H PL C

定二 波 长 的 信 号 差 △A 并以 对 分析 时 间 作图
,
OA t

。
,
3 化 学 计 t 学方 法
得到 差示 色 谱 纯 物 质应 为 零 信号 杂 质 则将 产 生 非
二̀ 二 。
零 偏差 法 至 少 要 知 道 一 个 洗脱 组 分的
,

应用 55
随 着 二 极 管 阵 列 检 测 器 的 应 用 增 加 了 洗 脱组
,

, 。

光 谱 而 且光 谱差 异 要 大 分 的 数据维数 借 助 于 计 算 机 进 行 数 据 处 理 使 得 多
,

二 二 ’ ,
19 79
年 iL 等 首 先 用 双 波 长 检 测 器 通 过 55 种 化学计量学方法迅速地 发展 起来 包括前面 提到
,

法 成 功 地 解释 了 两 种 重 叠 的 药物 色谱 峰 o w io 。

n ,
to r、 、 二, 3 二
的M 首次
a
SS 和 M ARC 法 1 97 1
年 L w
等)
。
2。
一
r e s s o n
首 次 把 这 一 技 术 命 名为
e `r a
等 S pe l s u
p p i
对 二 元 体 系 的 光 谱 提 出 了 自模 拟 曲 线分 辨 法
、
S o
lf

他 们 还 成 功 地 检 测 了 杂质 含 量 少 于 % 的 两 种生 物
。
1 入I o d e l i n g C u r v e s o
lu t io n
Re ) 此 法 把 几 个波 长下 测
。
e r 二
碱重叠峰 C a rt 等 比 介 绍 了应 用 时 优 选波 长
.

55 得 的吸 收 数据 构 成 矩 阵 通 过 矩 阵 转 换 确 定 组 分总
。

的方法 为 了获 得 高 的 灵 敏 度 法 必 须 选 择两 光
,
55 数 及 显著 本 征 矢 量
。

此 后 各 种 因子 分 析 方 法 被 迅 速
。

谱 产 生 最 大差 值 的 波 长 对 在 药 物 的 质量 控制
二
纸 用 于 处理 二 维数据
二3
卜 3七 二
。

二, , 一 ’ 二二
.

法应用甚广 但大 多 局 限 于 两 组分 体
,
55
中
.

3一
主成 分 分 析法 (p r in c ip a . e o m po n e n t a n a
一y s i s
。
二
系 等黔 把 法 扩 展 到 多组 分 体系 称 作
: ,

M ar 55 PC A)
简称
,
法 该 法 能 很 方 便地 分 析 多 重 重 叠 峰 并 报 道
,
s S
M 主 成 分 分 析 是 确 定体 系 中 组 分 数 目 的 常 用 方
。

了 他 们 处理 四 重 峰 的 结 果
。

法 二 维 数 据 矩 阵 y 由 D A D 在 W 个 不 同波 长 下 测
.

导数技术
。
2 4
得 洗 脱过 程 中 S 个 吸 收 光 谱 组 成 单 个 光 谱 代表 y
, 。
,
在 色 谱 仪 信号 输 出 部 分 安 装 上 导 数 装 置 可 得 的 一 个 行 矢 量 它 相 当 于 W 维 空 间 的点 同一 光谱
。

到 导 数色 谱 图 在 普 通 色 谱 图 完 全 看 不 出 有峰 重 叠
。

应 重 合 在 同 一 点 或 者仅是 矢 量 长 度 不 同 线 性 独 立
,

,
的 情 况 下 导 数色 谱 图 可 反 映 出 峰 的 不纯 因 而 可 以
, 。

的 矢 量 数 就 是 体系 中的 组 分 数 Y 可表示成具有 5

比 较 标 准 品 和 样 品 的 导 数色 谱 图 鉴 定 色 谱 峰 纯
.

个 行 矢 量 ( 光 谱的 ) 和 W 个 列 矢 量 ( 色 谱的 ) 矩 阵 其
一 。 。

度 纵 2龙 当 纯 品 在 溶剂 系统 中或 者 受检 测 光 照 射 时 秩为 对应物种数 N 淤
二
主 成 分 分析 的 目 标 就 是
二 , ,

俄 和 本 征 值分解 法 : “
一
, ,
产 生 的 转 化物 同 原 物 质 能 形 成 重 叠 峰 将 对 色 谱峰 分解 奇 异 值分解 法 都能 把
;
Y
。 。
I
,
几
乙 (S X S ( l\’
,
n :
的 量 测 产 生 误差 G ar 等 :28 提 出 零 值 导数 光 谱 技 Y 分解成 N ) X N )和 V (N X W )的积
e t r a
术 (S pe e r
iv ti v e n u t ee u e
通 过 观 察分 析 通 过 分解 提 供 本 征 矢量 矩 阵 ( 对 应 数据 的 因 子 空 间 )
a ,
l d ll h iq )
。

物 和 可 能 杂质 的 导 数 光 谱 图 从 图 中 找 到 一 个 杂 质 和 本 征 值 的对 角矩 阵 ( 提 供秩 数 ) 法除 了提 供
,
PC A
, , 二` 2 二。
导 数值较大 而 分析物 的导 数值 为零 的 波 长 在 此 波 组 分数 还 能获 得 纯 的 光谱
,

, o n t r e :`3 ,`二
长 下监 测 洗 脱 液 的 导 数 色 谱 图 就 可 以 对 色 谱 峰 进 首 先将 法用
e r n a n a
w im 和 K k PC A
。 。
。

行 纯 度的鉴 定 显 然 本 法 要 求 杂 质 已 知 当 杂质未 知 于 确 定 色 谱 组 分数 该 法 还 被 用到 停 流 扫 描 得 到 的
一
` 5二
的 出现 促进 了 法在 色 谱 中的
一 .

时可 应 用 G
r a n t
等 提 出 的 零 交点 波 长 法 (
z e r o e r o s s
光谱中
-
DA D PC A
。

应用 法 还 可 用 本 征 值 的 显 著 性 检 验决 定偏 差
。

in g w
该 法 通 过 导 数 光 谱 图上 分 析 物 和
a v e
le n g t h ) PC A
。
二 。

杂 质 的零交点 波 长 不 同 进 行 色 谱 峰纯 度的 定性 是 由实 际 成分 还 是 由 实验 误 差 产 生 侧 E b el 和
一a ,
二 极管 阵列 检测 器 ( n io d e r r a
y de t e e t io n
简 Mu
e ck :39 用 统 计 方 法 证 实 了 用 P C A 法 处 理 两 组 分
二

维色 谱 图 ( 八 峰 的 效 率 与 组 分的 光 谱 性 质 吸 收 比 及 色 谱分 辨 率
, , 。
D A D ) 的 出 现 提 供 了三 几 t
三维 色
称 )
。 n 二̀ 下口
谱 图 对重 叠 组 分的光谱有 显 著 差 别的谱 图 能通 过 绕 等 因 素有关 G e m p e r l in e a
和 H m i lt
o
提 出 一种 确
。
2蛇
一
, ,

轴旋 转 观 察重 叠 组 分峰 当被 分 析 物 和 杂 质的 定重 叠 峰中 最 小组分 信号 的 方 法 这 种 方 法 不 需 要
 1 期 芳 等 色 谱峰纯 度 的 定性 方 法
:
黄

借 助 实 验结 果 就能判断 在 适 当 条件 ( 峰 高 分辨 率 和
。

扩 展 的 渐进 因 子 分 析 ( E E F A ) 应 用 于 重 叠 峰 分 解
。

光 谱 相 似 性 ) 下 可靠检 测 的 最 小 组 分 量
a 一

v ns l y ek 梁 逸 曾 等 斌 利 用 迭 代 目标 转 移 因 子 分 析 ( I T T FA )
。
二` 8 二 。 a n
利 用 平行 卡 尔 曼 滤 波 网 ( P 实 现 了完 全未 知混 合 体 系的纯 物 种的 光谱 辨 析
a r a a -

等 ll 1 K l m F il
e r r 二5 , 二
s ) 实 时 P C A 进 行峰 纯 度分 析 能 够 迅 速 应 用 一 般 秩 消 因 子分 析 ( G R A F 八 ) 和
r e t s e n
N G it
te w or k 等
, 。

得到 前 两 组 分 的 本 征 矢量 减 少 时 间 引 起 的误 差 迭 代 目标 转 移 因 子 分 析 ( I T T F A )成功地 进行 了定
·
v o v a c 。 二
渐 进因 子 分析 法 ( E to r a n a 一y s i s r
量分 析 等 叭 提 出 固 定 移 动 窗 因子 分 析
,
3 2 l in g f
简 K 日le
,
W M ) 此 法 无 需 假 定峰 形 和 吸 收 特性 所 得 的本
,
E FA )
称 (F S
。
二` ” 乙 一 一 。

因子 分析 的 第 一 步 是 进 行 主 成 分分 析 经典 征 值 时 间 ( 即 fo g Ev )t 曲线 为 铃 形 曲 线 ( 图 2 ) 与
,
的 分 解 方 法 是 非 线 性 最 小 二乘 法 (适用于 已 知 化学 EF A 相比 其 突 出优点是 FS w M 法 更 容易 在 很 小
〔 ,
模 型 的 洗 脱 曲 线 ) 50: 建立 在 PC A 基 础 上 的 自由 模 的 分 离 度 下 检 测 出 隐 藏 在 主 峰 下 的 少 量 杂质 ( 小 于
一 。 。
〔5 , 苏2
·

型 曲 线分 辨 法 也 能 实现 这 一 目 的 经 典的因子 而 且 能 准 确 定 出杂质 的 位 置 另 外 当 杂 质浓 度
,
1% )
,

分析计 算 组 分 数 N 一 等 于 矩 阵 的 秩 其 秩和 较 小时 用 法 对 杂 质和 噪 音的 本 征 值 很难 分
, ,
Y Y EF A
, ,
的行 顺 序 无 关 而 在 色 谱 中 量 测 的 光 谱 是 按 一 定 顺 辨 而在 w M 中 杂质信 号 显 示 先增 加 后 减 少 因
, ,
F S
。 .
, 、

序排 列 的 包 含 了除 秩 以 外 的 其它 信息 经 典 的 因 子 而 容 易测 出 w M 法 确 定 了 脱氢
e e r
K l 等川 曾用 FS
。
二5 , 二
分 析 反 映 不 出 这些 信息 年
a
1 985 G m pp 等 提出
, ,

可 的 松在 氢 化 可的 松 中的 险 测 限 从 图 3
可见 在 R
。

一 。 5 以上能
. .

一 种 可 以 半 定 量地 给 出因 子 消涨 状 况 的 渐进 因 子 分 检测 出 。 5 件 的杂质
析 法 检 测 器 中 每一 个 新 组 分 的 出现 前 个组分 的
: ,
i

子矩阵 Y 的 秩 都增 加 1 ;
反之后 i
个光 谱形 成 的 子
.

矩 阵 提 供 了 组 分 消 失 的 信息 这 样 就 形 成 了 第 i 个 _
` .

厂几一…
。 r 二3 3 二
组 分 的 浓 度窗 M ca ed 曾 对一 个 严 重 重 叠 的 四 元
。

组分 进 行 了 E F A 分 析 ( 图 1)

广一一
一

,. ,
_

一
ó

三
ù
é二
,竹
工̀
江
二J
口二 { 图 2 两组分
1 1 1l l C

F S卜 M 图

}仆 )二 !
卜
.

ó
l|1
l
!
` { 卜 ō工
少 沪
二一
L
￡
一
尸
I e [ C 11 t 一 ` j n t l n 飞`
t

图 l 四 组分 E F A 图 e
w

!|Lwe
( 上 半部 分 为 四 组 分 的 典 型 浓 度图 )
, :
不 需 任何假 设 E F A 就 能 给 出 ( 1) 吸 收 物 种 数
`
, { l
上 .
~ . .
1
~ 一一
一一
.
,
( 像P CA ) (2
) 每个 物 种的存 在 范 围 ( P C A 不 能给 ,。
2
。
11 i 门
.

-
、
万
、
.

「` `、 L! t l ;
·
, 、

出 ) ( 3 ) 非 迭 代 法 计 算 各 组 分 的 浓 度 ( 4) 归 一 化法
,
{

计 算 各 自的光 谱 在 EF A 基 础 上 各种 改 良方 法 层 出 图 3 脱扭 可 的松 在 扭 化可 的 松 中 的 检 测限
5`
·
5 5二
·
。

不 穷 用 光 谱 因 子分 析 ( S P F
a u e r
T l 等 AC ) 对
,
D AD 检 测 数 据 进 行 处 理 成 功 地 解 析 了严 重 重 叠 峰
并 实现 了 未 分 离 化 合 物 的定 量 分 析
。
二
潘 忠 孝 等 56; 利
4 结柬 语
、

用 目 标 因 子 分 析 ( T E F A ) 确 定 重 叠 峰 中的 组 分 数 。

色 潜峰 纯 度 的每种定性 方 法 各 有其优缺点 随
。
〔 5月
组 分 种类 以及 各 组 分 的 含量 潘 李宜 基 等 提 出了 、

着 新的 仪器 方 法 及 软 件的 推 出 色谱峰的 纯 度 鉴 定
,
 色 谱 卷

·
。 , o r v at , a ,

方法 将会 日臻 完 善 下 一 代 的 光 二 极管 阵列 检 测 系 25 Ma r J G D H h P C l a r k B J et l A n a
l Pr o e

统 将 包括 化学 计 量学 方 法 以 帮助 分 析 工作者 鉴 定 色 1986; 23 2 54
.
r ,
Z elt D T
, e n , r o a t o
。 26 o w J A M a r ks G 5 J Ch m g
谱峰 的 纯 度
, :
19 8 0 1 8 9 2 0 9

考
:

参 献
.
,

文 宁 高 国强 陈 玉 英 中 国 药科 大 学学 报 19 91
, , ,
27 吉 2

2 95
·
, :
An 1983; 55 418
,
a
i G i d d in g s
J C a
l C he m ·
1
a n t tt a e to ,
1985;
,
28 Gr A B ha ha r y y a
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:
34 7 2 1 9
:
1 9 7 0 ; 42 21 s te n
.
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l C he m 1984 56 99 1
ru s , o n a e e
.
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3 G hka E M l li G C A n a
l C hem 19 7 2 44 484 .
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30
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19 8 0 ;
17 5 12
· ·
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4 H u
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.

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r u e e r a a r o ,
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:
1 9 8 2 ; 16 6 9
1989 .
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1986.
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187 23 3
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1990 499 221 .
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1 9 9 3 ; 6 5 1 0 23
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1989; 223 175 .
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37 4 6 3
282 123
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n 胡 育筑 康 继 宏 郁
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建等 中 国 药 科 大 学 学 报
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1 56
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(上 接 第 3 2 页)

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