福建农业大学学报

DOI : 10. 13323 /j . cnki27(

. j .2): nat～ . sci
f af u(191 195,. ) .1998
1998. 02. 013
Jo urnal of Fujian Ag ricultural U nive rsity

香蕉炭疽病生防拮抗菌筛选及其作用机制*
赵志颖　张居念* * 　王宝华　王宗华　鲁国东　胡方平
(福建农业大学植物保护系 ,福州 350002)

摘要　用 含炭疽病菌的 PD AY 平板上分离 香蕉组织表面的 拮抗菌株 ,经离体 和活体测 定对香蕉炭 疽病的防

效 ,筛选 到 96003、 96120、 96206、 95040、 96201、 95019、 95042及 96004等 8个 有显 著拮抗 作用 的菌 株 ,其中
95019是酵母菌 ,其它为细菌 . 96003防效最佳 ,达 67% .供试菌株的拮抗作用机制可分为抑菌和竞争两类 .
关键词　香蕉炭疽病 ; 生物防治 ; 拮抗机制
中图分类号　 S432.44

Screening and inhibitory mechanisms of antagonists for biological control

of banana anthracnose fungus
Zhao Zhi yi ng　 Zhang Juni an　 Wang Baohua　 W ang Zo nghua　 Lu Guodo ng　 Hu Fa ng pi ng
( Depa rtment o f Plant Pr o tection , F AU , Fuzho u 350002)

Abstract　 Th e a ntag o nistic micro bes w ere iso la ted fr om bana na peel tissues on medium o f PD A Y mix ed with
spo r es o f Colletotrichum musae. Eight iso la tes with go od a nta go nistic effec t w er e selec ted . Amo ng them , o ne
w as yeast, the other s wer e bacte ria. The antago nistic mecha nisms could be div ided into fung us-inhibition and
competitio n. The inhibito ry a ctivity and anti-fung us metabolites o f antag o nistic iso lates w er e analyzed. The
r esults show ed tha t so me iso la tes inhibited the a nth racno se fungus by secr eting anti-fung us pro tein with the r-
mostability. The iso lat e 96003 could decr ea se bana na anthra cno se disease by 67% constantly a nd steadily ,
showing g oo d a pplica ble pro spect .
Key words　 banana anthracnose; biological co ntro l; antag onistic mechanism

炭疽病 ( Colletotrichum musae )是香蕉果实上最主要的病害之一 ,严重影响果品的质量与

商品价值 .目前多采用多菌灵、特克多等化学药剂浸果防治以延长货架期 (刘朝祯等 1990) ,但
是长期使用化学农药一是使炭疽病菌产生抗药性 (杨宏仁等 1991) ,二是污染环境并对人体造
成毒害 .因而研究无公害防治措施势在必行 ,其中生物防治可能是最有应用前景的措施之一 .
由于果、蔬采后所处的环境比较恒定且容易控制 ,使用生防菌较易见效 ,所以果、蔬贮藏期病害
的生物防治更展示出良好前景 . 从 1953年以色列 Gut t er et al 首次报道了枯草杆菌 ( Bacillus
subt ilis)对柑桔果实病原菌有拮抗作用 ,至 1977年 Tro nsmo et al 报道了用拟康木霉菌 ( Tricho-
derma pseudokoningii ) 防治草莓果实灰霉腐烂病以来 ,果、蔬贮藏期病害生物防治研究与应
用已取得很大进展 ,特别是拮抗菌的研究取得了令人瞩目的成果 ,许多生防制剂得到注册并商
品化 (王宗华 1995,罗闰良 1993) . 综合有关报道可以看出 ,利用细菌、酵母以及其它丝状真菌
等拮抗菌之活菌制剂或发酵产物是生物防治的主要途径 . Chua ng et al ( 1993)首先开展了香
蕉炭疽病生物防治的研究 ,指出其具有良好的前景 . 本文就拮抗菌分离筛选、防效测定及其作
用机制进行了初步研究 ,现将结果报道如下 .
　　收稿日期: 1998- 02- 13
　　赵志颖 ,女 , 1976年出生 .研究方向: 植物病理学 .
　　* 福建省教委资助项目 ( K94025) .
　　* * 现在福建农业科学院稻麦研究所工作 .
 · 192· 福建农业大学学报　 1998年第 27卷

1　材料与方法
1. 1　香蕉炭疽病菌的分离、培养及其致病性的确定
用组织分离法从表现典型症状的香蕉上分离香蕉炭疽病菌 ,在 PDA培养基上 28℃恒温
培养 ,待长出孢子后镜检观察其形态特征 ,并经人工接种证实其致病性 ,以确定所分离的病原
菌是香蕉炭疽病菌 (Colletot richum m usae ) (方中达 1977) .
1. 2　拮抗菌的分离
从漳州、泉州、福州等地采集香蕉根、叶、果 ,室内分离 . 用解剖刀将待分离组织切成小块 ,
先用无菌水冲洗 ,去除表面杂菌 ,留下吸附其表面的微生物 ,然后置于含 20 m L无菌水的三角
瓶中 ,振荡数分钟 .在灭菌培养皿中各加 100μL 炭疽病菌孢子悬浮液 ,再分别加 1000、 100、 20
和 10 μL 不同菌量的香蕉组织洗出菌液 ,以得到最适的菌落密度 ,然后倒入 PDAY 培养基 (即
- 1
PDA+ 1 g L 酵母浸膏 )摇匀 (以下简称带菌平板法 ) ,置 28℃下让炭疽病菌和拟筛选的拮抗
菌共同培养 24 h ,挑取具有拮抗作用且形态特征不同的单菌落纯化培养 ,并用纸碟法初筛拮抗
效果好的菌株 ,编号保存 .
1. 3　拮抗菌株的筛选
1. 3. 1　纸碟法测定拮抗圈大小　取炭疽病菌孢子悬浮液 2 m L于培养皿中 ,加 PDAY培养基
摇匀 ,用灭菌纸碟沾取拮抗菌液后置于带菌平板上 ,设置多菌灵及无菌水对照 .每个处理 3个重
复 , 28℃下培养 48 h后 ,观察分析拮抗类型并测量拮抗圈大小 .
1. 3.2　拮抗作用的蕉皮测定　对纸碟法测定中有一定拮抗圈的菌株用蕉皮测定 . 方法为: 挑取
2
成熟一致无发黑、刮伤的香蕉 ,剥取蕉皮 ,切成 4 cm 左右的方块 ,针刺伤后 ,用拮抗菌液处理 ,
使蕉皮内外都沾上菌液 ,待凉干后用大小基本一致的棉球沾取炭疽病菌孢子悬浮液 (每视野 50
～ 100个孢子 )于伤口处 ,再置于垫有滤纸保湿的培养皿中 ,以多菌灵、 NYDB为对照 ,每处理
重复 3次 . 28℃下培养 48 h观察发病结果 ,测量病斑大小 .
1. 3. 3　拮抗菌对香蕉炭疽病的防效测定　选拮抗圈和蕉皮测定表现较好的 26个菌株 ,用于防
效测定 . 先后 3次到漳州龙海蕉园中选取长势良好、成熟度较一致的香蕉 ,未经任何药剂处理带
回实验室作防效测定 . 将香蕉切成单指 ,用棉球沾取培养好的拮抗菌液 (内加少许乙烯利以催
熟 )涂于果皮表面 ,稍风干后用塑料袋包裹 , 28℃恒温培养让其自然发病 . 每批每个拮抗菌处
理 5个蕉指 ,处理间香蕉尽可能用同一蕉串的香蕉 ,无菌水为对照 . 1周后待香蕉成熟 ,炭疽病
症状充分表现时 ,目测计算炭疽病病斑数 (每个蕉指随机取 2 cm2 )记载病情 ,计算防效并进行
比较测验 .
1. 4　拮抗菌无细胞培养液的抑菌作用
将培养好的拮抗菌液盛装于小离心管中 , 8 000 r mi n- 1离心 20 mi n ,离心 2次 ,去菌体取
上清液 . 设上清液、上清液 100℃水浴 5 mi n、上清液 100℃水浴 10 min等 3个处理 .将各处理上
清液加入含炭疽病菌的 PDA平板孔穴 (直径 8 mm )中 ,观察其代谢产物的抑菌作用及其热稳
定性 . 28℃下培养 48 h,观察并记录试验结果 .
1. 5　拮抗菌蛋白粗提液的抑菌作用
对有抑菌作用的上清液加固体硫酸铵至 70% 饱和度 , 4℃静置过夜 , 8 500 r min- 1离心
- 1
30 mi n,弃上清液 ,用少量 20 m mol L Na H2 PO4 -Na2 HPO4 ( pH 6.5)缓冲液溶解 ,置透析袋中
用同一种缓冲液透析去盐 ,得到抗菌蛋白粗提液 (截留分子量约为 8× 103 D) (刘伊强等 1994) .
用上述相同的平板测定法测定蛋白粗提液的抑菌效果 .
 第 2期　　赵志颖等: 香蕉炭疽病生防拮抗菌筛选及其作用机制 · 193·

2　结果与分析
2. 1　带菌平板法分离拮抗菌的效果
本试验把分离拮抗菌的方法改进为在 PDAY+ 炭疽病菌平板上直接分离筛选有拮抗作
用的菌株 .结果表明 ,炭疽病菌与其它微生物均生长良好 ,只要控制好洗出液质量浓度 ( 10～
- 1
100 μL 皿 ) ,便可清晰地分辨有拮抗作用的菌落 ,从而减少了工作量和分离的盲目性 ,便于
大批量分离拮抗菌株 .
2. 2　拮抗菌株筛选及其防效测定结果
综合分析纸碟、蕉皮测定结果 ,初步筛选出具有较好拮抗作用的菌株 26个 ,其中酵母菌 1
个 ,细菌 25个 .
防效测定结果表明 ,供试菌株均能一定程度地减少炭疽病斑 .用 SAS 软件进行两因素均
衡 设计方差分析 (董大钧 1993) ,结果表明 ,菌株处理间有显著差异 ( P= 0. 0004) ,说明菌株处
理对香蕉炭 疽病 有显著 作用 . Duncan 氏多重 比较 (表 1)结果 表明 , 96003、 96120、 96206、
95040、 96201、 95019、 95042、 96004等 8个菌株可显著地减少炭疽病病斑数 . 其中 96003效果
最好且稳定 ,使用 1次 ,防效就可达 67% ,直至完全成熟 ,香蕉依然完好 (图 1) .
表 1　供试菌株处理后香蕉病发病比较 1)
Tabl e 1　 A nth racnose di seas e record s on bananas t reat ed wi th t es t ed i solat es

菌株 　病斑平均数 防效 /% 菌株 　　病斑平均数 防效 /%
无菌水 　 45 AB 8 96112 　　 26BCD E 42
96108 　 41 ABC 13 96008 　　 26BCD E 42
95064 　 39 ABC 16 96016 　　 26BCD E 42
95063 　 38 ABC 18 96007 　　 26BCD E 42
96014 　 37 ABCD 20 96117 　　 25BCD E 44
96114 　 36 ABCD 20 96004 　　 24CD E 47
96116 　 36 ABCD 22 95042 　　 23CD E 49
95062E 　 35 ABCD 27 95019 　　 21CD E 53
菌 1b 　 33 ABCD 29 96201 　　 21CD E 53
96018E 　 32 ABCD E 29 95040 　　 17D E 62
95038 　 32 ABCD E 33 96206 　　 17D E 62
95087 　 30 ABCD E 38 96120 　　 16D E 64
96005 　 28 ABCD E 38 96003 　　 15E 67
96024 　 28 ABCD E 42
　　 1)α= 0. 05, df = 54, M S E= 107.7125.

2. 3　拮抗作用机制分析
从纸碟试验结果看 , 60个参试菌株与炭疽病菌在 PDAY平板上的相互作用主要表现为:
( 1)无拮抗作用 ,即参试菌株周围无明显抑菌圈 ,细菌菌落下炭疽菌丝正常生长 ,且能在菌
落间产孢 (图 2A) .
( 2)竞争作用 ,即菌株与炭疽病菌间没有明显的界限 ,有的菌体生长很快 ,菌落内不长炭疽
病菌 ,或炭疽病菌丝生长畸形 ,推测可能为营养竞争机制 (图 2B) .
( 3)抑菌作用 ,即参试菌株周围有明显的抑菌圈 ,此类可能属代谢产物有抑菌作用所致 (图
2C) .
进一步对拮抗菌上清液进行分析 ,结果主要有 3种情况:
( 1)无抑菌圈 ,即代谢产物对炭疽病菌无抑菌作用 (图 3A) .
 · 194· 福建农业大学学报　 1998年第 27卷

( 2)弱抑菌圈 , 肉眼可见有抑菌作用 , 但炭疽病

菌丝可向圈内扩展 (图 3B) .
( 3)有明显抑菌圈 ,即代谢产物起抑菌作用 (图
3C) .
　　上清液有抑菌圈的菌株 ,在纸碟法中也有拮抗
圈 ,但部分菌株在纸碟法中表现有拮抗圈的 ,其上清
液却没有抑菌圈 ,这可能是其抑菌物质不稳定所致 .
对有明显抑菌圈的上清液进行沸水浴 5、 10 min比
较其抑菌作用的变化 ,结果表明代谢产物在高温条
件下仍然有效 ,但高温处理的时间愈长 ,其抑菌效果 　 A、 D. 清水对照 ; B、 C. 96003处理 .
愈差 (图 4) . 　图 1　拮抗菌 96003对香蕉炭疽病的防效
　　经硫酸铵饱和沉淀、透析去盐后的粗蛋白抑菌 　 Fig. 1　 Eff ect of is olat e 96003 on banana anth rac-
测定结果表明 , 96003、 96004、 96005等菌株的蛋白 nos e
都不同程度地起到抑制炭疽病菌的作用 . 其中 96003、 96004抑菌作用更为显著 . 与无抑菌作用
的 95087相比 ,孔穴周围炭疽病菌丝的生长明显地受到抑制 ,但未出现透明的抑菌圈 .可能是蛋
白置放的时间太长所致 ,具体原因还有待进一步研究明确 .

A. 无拮抗 ; B.竞争 ; C. 抑菌 .
图 2　所分离菌株与香蕉炭疽病菌间的互作类型
Fi g. 2　 Eff ect s of dif f erent is olat es on Col letot rich um musae

A. 无抑菌 ; B.弱抑菌 ; C. 强抑菌 .

图 3　拮抗菌代谢产物与炭疽病菌间的互作类型
Fi g. 3　 Eff ect s of cult ural fil t rates f rom dif f erent is olat es on Col letot rich um musae
 第 2期　　赵志颖等: 香蕉炭疽病生防拮抗菌筛选及其作用机制 · 195·

3　讨论
3. 1　关于拮抗菌的分离和方法
本试验建立了在含炭疽病菌的 PDAY 平板上直接
分离拮抗菌株的方法 ,改进了原有的在不带菌的培养基
上分离菌株的方法 ,可加快筛选速度 ,减轻工作量 .
从试验结果看 ,有抑菌圈的与有竞争圈的菌株都有
防治炭疽病的效果 ,且拮抗圈大小与最终的防效似乎没 　 A. 无高 温处 理 ; B. 沸水 5 min; C. 沸水 10
有显著的相关性 ,这给拮抗菌的筛选增加了难度 . 因为 , min.
若只筛选产生抑菌圈的菌株 ,往往会遗失较普遍存在的 　图 4　 96003菌株 之抗菌蛋 白对炭 疽病
与病原菌有营养竞争的拮抗菌 .如何建立离体筛选与防 菌的抑菌作用
效之间的关系 ,有待于今后进一步研究 . 　 Fig. 4　 Inhi bi t ory ef fect of crude prot ei n
ext ract ed f rom is olat e 96003 cul tu re on Col -
从蕉园直接采集的香蕉 ,其成熟度及潜伏侵染的程 letot richum musae
度总会有一定的差异 ,也会给试验结果造成一定误差 ,通
过多批多重复试验可排除这一干扰 .
3. 2　关于拮抗菌的作用机制及应用前景
Wilson et al( 1989)研究表明 ,拮抗菌主要有 4种作用机制: 即拮抗作用、竞争作用、诱导抗
性和超寄生 . 本试验结果可将供试菌株的作用机制大致分为抑菌和竞争两种 .要获得具诱导抗
性和超寄生作用的菌株 ,需改变筛选方法 .此外 ,我们是从纸碟法上将菌株与炭疽病菌间生长
相互独立、无抑制作用的情况确定为具竞争作用 ,但要明确供试菌株为营养竞争还是位点竞争
需进一步研究 .
抑菌的菌株主要靠分泌抗菌物质起作用 ,但不同菌株抗菌活性和抗菌物质可能不同 ,有些
菌株在没有活菌体时就不表现抗菌活性 ,可能是因为其抗菌物质不稳定引起 .这种菌株可能难
以制成制剂用于生产 . 有些菌株如 96003,其代谢产物仍保持抗菌活性 ,且对热稳定 ,经硫酸铵
饱和沉淀初步证明是其蛋白质之抗菌活性所致 .为我们今后进一步纯化抗菌蛋白 ,明确其抗菌
特性 ,掌握其产生条件 ,利用基因工程手段克隆编码抗菌蛋白的基因 ,并转化到香蕉等植物上 ,
最终应用于生产提供了广阔的前景 .
香蕉炭疽病与香蕉长势、生理特性及采后的环境条件等多种因素有关 (刘惠怡等 1990) ,
且在香蕉花期、结果期以及贮运期均可侵染 ,病菌便潜伏于蕉果组织表面 ,其病理规律复杂 ,必
需进一步探明其致病及其与叶围 (果围 )微生物相互作用的机理 ,才能更好地开展该病的生物
防治 .
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