(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利
(21)申请号 201711272376 .8
(22)申请日 2017 .12 .06
(65)同一申请的已公布的文献号
申请公布号 CN 108570479 A
(43)申请公布日 2018 .09 .25
(73)专利权人 内蒙古大学
地址 010021 内蒙古自治区呼和浩特市赛
罕区大学西路235号
(72)发明人 梁红宇　刘东军　梁浩　呼啸　 师丙波 .CRISPR/Cas9系统介导的VEGF164基
王辉　王志刚　 因定点敲入绒山羊转基因细胞的构建《中国优
(51)Int .Cl .
C12N 15/90(2006 .01)
C12N 15/85(2006 .01)
C12N 15/877(2010 .01)
A01K 67/027(2006 .01)
(10)授权公告号 CN 108570479 B
(45)授权公告日 2020.04.03
(56)对比文件
CN 103923911 A ,2014 .07 .16 ,说明书全文 .
CN 107142282 A ,2017 .09 .08 ,说明书全文 .
CN 107177591 A ,2017 .09 .19 ,说明书全文 .
吴鋆龙 .基因组编辑新技术对猪CCR5基因的
靶向作用. 《中国优秀硕士学位论文全文数据库
农业科技辑》.2016 ,( 第2期),
唐成程 等 .应用TALEN技术对兔CCR5基因进
行靶向修饰《遗传》 . .2014 ,第36卷( 第4期),360-
368页 .
.
秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑》.2016 ,
( 第11期),
审查员 冯娟
权利要求书1页 说明书18页
序列表11页 附图11页

(54)发明名称
一种基于CRISPR/Cas9技术介导绒山羊VEGF
基因定点敲入的方法
(57)摘要
本发明利用CRISPR/Cas9系统介导完成绒山
羊VEGF基因定点敲入， 其是依据绒山羊的CCR5基
因序列， 构建基于CRISPR-Cas9系统的gRNA表达
载体及VEGF同源重组载体。 然后将优化后的三种
载体共同转入绒山羊胎儿成纤维细胞中 ， 获得
VEGF基因定点敲入的阳性细胞。利用体细胞核移
植技术制备VEGF基因定点整合绒山羊。 本发明所
构建的基于CRISPR/Cas9系统的打靶载体为山羊
VEGF基因的定点敲入提供了一种简单快捷安全
的途径。 该方法在细胞系筛选过程中没有涉及任
何筛选标记基因， 从而大大提高了转基因动物的
安全性， 对绒山羊的遗传育种以及基因功能的研
CN 108570479 B

究具有重要价值。
CN 108570479 B 权　利　要　求　书 1/1 页

1 .一种基于CRISPR-Cas9系统介导绒山羊VEGF基因定点敲入的方法， 其特征在于， 其是
根据绒山羊的CCR5基因序列， 构建基于CRISPR-Cas9系统的gRNA表达载体和VEGF同源重组
载体， 然后将优化后的CRISPR-Cas9载体和上述构建的gRNA表达载体及VEGF同源重组载体
共同转入绒山羊胎儿成纤维细胞中， 获得VEGF基因定点敲入的细胞；
所述绒山羊为阿尔巴斯绒山羊；
靶 位 点 在 安 全 位 点 C C R 5 基 因 的 第 2 外 显 子 上 ，g R N A 靶 序 列 为 5 ’-
GTCTTCTTCTCGCTGCGACAC-3’；
所述CRISPR-Cas9载体的核苷酸序列如SEQ  ID  NO:1所示；
所述gRNA表达载体的核苷酸序列如SEQ  ID  NO:4所示；
所述VEGF同源重组载体的核苷酸序列如SEQ  ID  NO:7所示。
2 .权利要求1所述方法获得的绒山羊VEGF基因定点敲入的细胞系。
3 .权利要求1所述方法在生产VEGF基因定点敲入的克隆绒山羊中的应用， 所述绒山羊
为阿尔巴斯绒山羊。
4 .根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 绒山羊VEGF基因定点敲入的细胞为核移植
供体细胞， 离体的绒山羊卵母细胞为核移植受体细胞， 通过核移植技术获得绒山羊克隆胚
胎， 然后将克隆胚胎通过胚胎移植技术移入绒山羊子宫内妊娠， 获得VEGF基因定点敲入的
绒山羊。

2
CN 108570479 B 说　明　书 1/18 页

一种基于CRISPR/Cas9技术介导绒山羊VEGF基因定点敲入的
方法

技术领域
[0001] 本发明属于动物分子育种领域，
尤其涉及利用CRISPR/Cas9技术定点整合VEGF  基
因获得转基因绒山羊的方法。

背景技术
[0002] 最近生物学研究中， 基因组编辑(Genome  editing)技术是研究者认识特定基因功
能的最新研究技术手段。 随着越来越多的物种全基因组测序的完成， 研究者面临的新挑战
就是如何从大量的数据中获得基因相关功能和应用信息。基因编辑技术是完成这个重要目
标的强大研究工具， 为此也被Science评为2012年十大重要科学进展之一。近年来， 基因组
定点编辑迅速发展。人工核酸内切酶(engineered  endonuclease， EEN)的产生改变了同源
重组的基因打靶技术在应用上受到的限制。 随着近年基因组定点编辑技术迅速发展， 先后
出现了锌指核酸酶(Zinc-finger  nucleases， ZFN)、TALE核酸酶(Transcrition  activator 
like  effector  nucleases， TALENs)和CRISPR/Cas9系统(CRISPR/Cas  system)等技术。这
些人工核酸酶使DNA在靶位点产生双链断裂(Double  stand  breaks， DSBs) ，然后激活细胞
内固有的非同源末端(Non-homologous  ending-joining， NHE)或同源末端(Homologous 
recombination，   HR)以便其修复损伤的DNA， 完成对基因组的定点编辑。
[0003] CRISPR/Cas系统是在大多数古生菌和多数细菌中存在的一种获得性免疫系统，
1987  年在K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因位点附近首次发现串联间隔重复序列， 于2002年
被正式命名为成簇规律间隔的短回文重复序列(clustered  regularly  interspaced 
short  palindrome  repeats ,CRISPR)。CRISPR/Cas9系统主要由编码Cas9蛋白的基因， 一个
短的前导区以及一个由间隔序列和重复序列构成的CRISPR的基因座构成。Cas9蛋白是
CRISPR/Cas系统的标志性蛋白， 具有核酸内切酶活性。CRISPR/Cas9技术通过一段短的RNA
序列与DNA靶序列通过碱基互补原则形成双链， 结合Cas9蛋白在DNA靶位点诱导形成双链断
裂损伤  (double-stranded  break， DSBs)。一个DSBs可以通过两种不同的基因修复途径进
行修复， 一种是非同源末端连接(Non-Homologous  End  Joining， NHEJ)修复途径， 另一种是
同源直接修复(Homology  Directed  Repair， HDR)途径。NHEJ修复途径是一个易错的修复途
径， 经常会引入插入缺失突变导致移码突变或者提前引入终止密码子， 有效的破坏靶基因
的开放阅读框(Open  Reading  Frame， ORF)，导致基因功能失活； HDR修复途径则需要有修复
模板的存在， 该途径用于DSB的修复时可以完整的将修复模板的序列整合到基因组靶位点
上， 所以经常用于在基因组靶位点引入特殊的基因突变。这两种修复途径通常分别用于基
因定点敲除(site-specific  knock  out)和定点敲入(site-specific  knock  in)。HDR途径
用于基因组定点编辑的效率相比利用NHEJ途径进行基因敲除的效率低， 根据细胞类型和状
态以及基因位点和修复模板的不同， 引入外源基因的效率也有所差别。
[0004] 在CRISPR/Cas9系统发挥作用的过程中， sgRNA(single-guide  RNA)序列与基因组
上的靶序列通过碱基配对原则结合， 起着位点特异性的作用。 sgRNA引导Cas9蛋白并与其形

3
CN 108570479 B 说　明　书 2/18 页

成sgRNA/Cas9复合物结合到靶位点， 切割基因组DNA。 所以sgRNA的设计是具有创造性的。

[0005] CRISPR/Cas9技术可以应用在动植物及微生物基因组的编码基因和非编码基因的
定点敲除或者定点整合外源基因， 可以实现在哺乳动物细胞中对特定DNA位点进行编辑(敲
除或定点整合)， 为转基因动物研究提供了简易、 实用的基因组定点编辑技术。
[0006] 利用CRISPR/Cas9技术在基因组的目标位点产生DSBs后， 当修复模板存在的情况
下， 细胞会激活基因同源重组修复途径(HDR途径)。这种途径会严格的按照修复模板来修复
断裂的DNA双链， 可以在目标基因的突变位点产生精确的特定突变， 常用来在基因组目标位
点引入外源基因。利用HDR修复途径对DSB进行修复， 修复模板必须与DSB位点上下游的序列
高度同源性， 在目标位点引入外源基因时需要在外源基因的上下游分别设计一段与DSB位
点上下游序列高度同源的同源臂序列。 所以同源臂的设计是具有创造性的。
[0007] 定点整合外源基因， 特异性整合位点的选择十分重要， 涉及到细胞、 胚胎和个体的
正常生长发育和外源基因的表达， 故靶位点的选择是具有创造性的。
[0008] 特异性整合位点的选择包括3个方面： 其一， sgRNA/Cas9复合物结合到靶位点， 切
割基因组DNA。修复同时会整合入外源基因， 破坏靶位点基因结构， 导致靶位点基因失去功
能， 靶位点基因的选择应保证不会由于其功能失活而影响细胞的正常生理功能和个体的生
长发育； 其二， 插入的外源基因能够高效表达； 其三， 要构建定点整合载体， 整合载体要包括
需要定点整合的外源基因表达盒子和两侧的同源臂。所以整合载体的构建是具有创造性
的。
[0009] 定点整合载体同源臂既可以是传统的构建在载体质粒上的双链DNA序列也可以是
单链的寡聚核苷酸序列(ssODNs)。对于小片段(<50bp)的外源基因的靶向整合， 一般会利用
ssODNs作为修复模板， 它的同源臂的长度一般在50～80个bp之间。对于大片段(>100  bp)的
外源基因的靶向整合， 一般会利用供体质粒(donor  plasmid)作为修复模板， 它的同源臂的
长度一般在800bp左右。
[0010] CCR5(C-C  chemokine  receptor  type  5) ，
又称CD195， 是白细胞膜蛋白， G蛋白偶
联受体， 作为趋化因子受体与免疫系统相关， 主要在T淋巴细胞、 巨噬细胞及树突状细胞等
免疫相关细胞表达， 因其是HIV-1侵染细胞的辅助受体而受到关注。在对抗HIV-1感染研究
中发现， CCR5基因缺失不会对细胞生长代谢和动物的生长发育产生影响， CCR5可以作为基
因编辑靶位点。对小鼠和人细胞的研究表明， 在CCR5位点插入的外源基因可以得到表达。
CCR5基因可以作为基因编辑靶位点使用。
[0011] 基因组编辑技术对基因功能研究和动物品种改良有着重要意义。 长期以来， 通过
传统的同源重组技术进行基因研究和品种改良 ， 效率低、难度大。CRISPR/Cas9技术结构简
单、多位点同时编辑、外源基因整合、不需要任何筛选标记等优点， 使得该技术得以广泛应
用。有学者利用CRISPR/Cas9技术对牛的诱导多功能干细胞(induced  pluripotent  stem 
cell， IPSCs)  基因组进行了基因定点编辑。成功的将外源基因整合到NANOG位点并得到表
达。这一结果显示出技术可以在家畜基因组中进行特异的基因编辑， 但目前还处于细胞水
平， 尚无通过  CRISPR/Cas9技术定点整合外源基因并获得转基因家畜的报道。
[0012] 绒山羊是我国一种独特的生物资源， 经过长期的自然选择和人工选育成为目前世
界上绒纤维品质最好的品种， 但产绒量尚有提高的空间。提高绒山羊产绒量， 培育高产、优
质的绒山羊新品种是绒山羊育种工作目标。但是， CRISPR/Cas9技术在绒山羊分子育种中的

4
CN 108570479 B 说　明　书 3/18 页

应用还缺乏完整的技术方案， 需要解决诸多技术问题， 如提高基因编辑的效率，选择合适编

辑位点及设计精准高效的sgRNA， 定点整合外源基因的模板构建， 避免脱靶效应，发生外源
基因定点整合细胞的筛选、鉴定、扩增，利用阳性细胞通过体细胞核移植(Somatic  cell 
Nuclear  Transplantation，
SCNT)技术构建重构胚，重构胚体外培养发育，胚胎移植，胚胎
移植及妊娠母羊孕期管理， 产后羔羊管理， 定点整合外源基因子代绒山羊的鉴定与管理等。

发明内容
[0013] 基于背景技术存在的技术问题， 本发明提出了一种基于CRISPR/Cas9技术定点整
合  VEGF基因获得转基因绒山羊的方法。
[0014] 为实现本发明所述目的， 本发明提供一种基于CRISPR/Cas9技术在绒山羊基因组 
CCR5位点定点整合VEGF基因表达盒获得转基因绒山羊的方法， 该方法包括下列步骤：
[0015] 1) CCR 5位点的 选择。本发明以 绒山羊 CCR 5基因 全长基因组 序列 (Gene  I D ：
102178672)  为基础，根据第二外显子设计了4条长20～21nt的gRNA(gRNA1、
gRNA2、
gRNA3和
gRNA4)，具体序列见表1。
[0016] 表1

[0017]

[0018] 2)构建gRNA表达载体：
[0019] 在设计的gRNA序列两端分别加上如下下划线标记的序列(5 ′ -3 ′)，
构成片段1：
[0020] Gene-F： TATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
[0021] Gene-R： TAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
[0022] Gene-F中的下划线序列是U6启动子的3 ′ 端序列； Gene-F中的下划线序列是gRNA骨
架的5 ′ 端序列； N指20nt～21nt的分别与靶基因的DNA双链序列反向互补的gRNA序列， 即 
Gene-F和Gene-R中的NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN序列是反向互补的。
[0023] 根据表1中4条长20～21nt的gRNA(gRNA1、 gRNA2、gRNA3和gRNA4)  序列， 在gRNA序
列两端分别加上上述下划线序列， 通过化学合成方法获得4个片段1  命名为U-gRNAs(U-
gRNA1、 U-gRNA2、U-gRNA3和U-gRNA4)。
[0024] 利用逐步降温方法使Gene-F和Gene-R退火形成双链， 片段命名为1。 以gRNA-T2  为
模板用PrimeSTAR保真酶， 使用hgRNA5 ′ 和hgRNA3 ′进行PCR扩增， 得到hgRNA  5 ′端片段和3 ′
端片， 命名为2和3。然后以1、 2、3共同为模板， 利用hgRNA5F和  hgRNA3R进行PCR， 得到大小为
455bp的完整gRNA。将纯化的PCR产物进行末端加  A处理后， 与pMD-19T连接， 转化大肠杆菌
感受态， 进行涂板。次日挑取单菌落， 接种于含Amp的LB液体培养基中， 37℃、220rpm揺菌培
养后进行菌液PCR鉴定。筛选得到的阳性克隆菌液进行测序。提取测序正确的质粒， 命名为
“gRNA-CCR5”， -20℃保存备用。

5
CN 108570479 B 说　明　书 4/18 页

[0025] 采用重叠PCR方法获得455bp的gRNA及其骨架序列编码片段(图1)
[0026] gRNA质粒结构及gRNA二级结构示意图(图2)
[0027] 构建好的gRNA表达载体包括U6启动子、 靶序列、 gRNA骨架和终止信号。分别命名为 
pCCR5-gRNA1、
pCCR5-gRNA2、
pCCR5-gRNA3和pCCR5-gRNA4。
[0028] 3)构建好的gRNA表达载体pCCR5-gRNA1、 pCCR5-gRNA2、pCCR5-gRNA3和  pCCR5-
gRNA4分别与hCas9质粒(图3)共转绒山羊胎儿成纤维细胞(CFFCS) ： 将表达gRNA1、 gRNA2、
gRNA3和gRNA4的表达载体pCCR5-gRNA1、 pCCR5-gRNA2、
  pCCR5-gRNA3和pCCR5-gRNA4分别和
hCas9载体采用电转方法共转染CFFCS。
[0029] 48h后提取细胞基因组DNA， 使用根据CCR5-1、 CCR5-2、 CCR5-3和CCR5-4位点序列两
侧设计的特异性引物(表2)进行PCR扩增， 预期片段长度分别为799bp，800bp，   790bp和
789bp。
[0030] 表2

[0031]

[0032] PCR反应结束后， 产物进行琼脂糖凝胶电泳， 回收纯化4个目的产物片段。

[0033] 使用Surveyor错配酶酶切目的产物片段， 对gRNA1/Cas9、gRNA2/Cas9、
  gRNA3/
Cas9和gRNA4/Cas9分别作用的细胞基因组突变进行检测， 验证gRNA的有效性和细胞基因组
是否发生突变。如果在CCR5位点发生突变， Surveyor错配酶酶切PCR扩增片段的长度分别为
799bp、800bp、 790bp和789bp， 在电泳图上gRNA4表现为发生突变， 其中一个大片段(789bp)
和2个小片段(400bp， 300bp)。从4个gRNAs中选择有效的gRNA应用于下一步骤。
[0034] 在确定gRNA特异性和有效性的基础上， 构建定点整合VEGF基因载体。
[0035] 4)构建VEGF外源基因定点整合载体P1-KV-polyA-P2：
[0036] 本发明所用外源基因VEGF为本实验室前期克隆自阿尔巴斯白绒山羊(GenBank 
accession  number:JX524883)，包含全部的ORF， 编码由190个氨基酸残基组成的VEGF蛋白，
具有促进绒毛生长的功能。在前期工作中我们将此VEGF基因亚克隆到绵羊皮肤特异性启动
子KAP6 .1的下游(参考序列GenBank  accession  number:M95719 .1， 克隆第1位核苷酸1042
位核苷酸间的片段， 共1042p)， 构建了VEGF过表达载体pCDsRed2-KV。在这个pCDsRed2-KV载
体中 ，VEGF基因下游没有连接转录终止信号polyA序列 ，故本发明以 VEGF过表达载体 ：

6
CN 108570479 B 说　明　书 5/18 页

pCDsRed2-KV为模板，
设计PCR引物(表3)，
克隆polyA序列。上游引物添加了Hind  III酶切位
点， 下游引物添加了Kpn  I酶切位点。
[0037] 表3

[0038]

[0039] 应用上述引物， 以pCDsRed2-KV为模板， 通过PCR方法克隆了224bp的polyA序列片

段， 连接到pDsRed2-KV载体的VEGF基因下游， 构成KAP6 .1-VEGF-polyA表达盒，重组载体命
名为pCDsRed2-KV-1(图4)
[0040] 为实现在绒山羊基因组CCR5位点整合入VEGF基因的表达盒  KAP6 .1-VEGF-polyA，
需要在该表达盒两侧加上与绒山羊CCR5位点两侧序列一致的同源臂。根据确定的CCR5基因
序列， 在筛选出的突变的靶位点两侧选取上游同源臂(P1)和下游同源臂(P2)。
[0041] 根据CCR5基因序列和筛选出的靶位点， 设计2对引物(表4) ， P1上、下游引物5 ′ 端引
入了Bam  HI酶切位点； P2上游引物5 ′ 端引入Kpn  I酶切位点， 下游引物5 ′ 端引入Mfe  I酶切
位点。P1片段为CCR基因核苷酸序列的2837位3895位， 预期片段长度1059bp。P2片段为CCR基
因核苷酸序列的3972位5052位， 预期片段长度1082bp。
[0042] 表4

[0043]

[0044] PCR扩增上游同源臂(P1)和下游同源臂(P2)。
[0045] 将扩增得到的P1和P2整合到VEGF过表达载体pCDsRed2-KV-1中， P1位于  KAP6 .1-
VEGF-polyA表达盒上游， P2位于KAP6 .1-VEGF-polyA表达盒下游。考虑到P1  上、
下游引物5 ′
端引入了同一个Bam  HI酶切位点， 可能会出现正、 反连接的结果，正向连接的为正确连接。
这个问题通过对得到的多个重组质粒进行测序， 选出正向连接的质粒， 作为定点整合载体
(图4)， 命名为pP1-KV-PolyA-P2。
[0046] 5)CRISPR/Cas9介导外源VEGF基因表达盒定点整合入CCR5位点的打靶细胞系的筛
选及鉴定：
[0047] 本发明所用供外源VEGF基因表达盒定点整合入CCR5位点的打靶细胞系为绒山羊
胎儿成纤维细胞， 通过原代培养获得， 实验使用P2-P6代细胞(图5)。细胞性别鉴定采用SRY 
基因检测方法。
[0048] 设计SRY基因引物(表5)
[0049] 表5

7
CN 108570479 B 说　明　书 6/18 页

[0050]

[0051] 提取细胞基因组DNA， PCR扩增SRY基因，阳性为雄性， 阴性为雌性。

[0052] 利用构建好的gRNA4表达载体pCCR5-gRNA4、hCas9质粒和线性化的定点整合载体
pP1-KV-PolyA-P2通过电转方法共转染CFFCs，用pCDsRed2-KV作为对照。转染细胞12h和48h
时观察生长状况。
[0053] 将转染48h后生长良好且发出红色荧光的细胞， 通过口吸管法获得单细胞， 接种96 
孔细胞培养板培养获得单细胞克隆细胞系。待单细胞克隆长满细胞培养孔， 逐一传代、扩增
至6孔细胞培养板。待传代培养的6孔细胞培养板长满后， 收集部分细胞用于提取基因组 
DNA用于PCR检测外源表达盒。为了避免检出內源VEGF基因， 根据部分KAP6 .1片段及上游同
源臂侧翼序列设计引物(表6) ， PCR扩增部分KAP6 .1片段及上游同源臂侧翼序列， 预期片段
长度1 .5Kb(图6)。
[0054] 表6

[0055]

[0056] PCR扩增产物电泳检测， 纯化回收目的片段， 测序。根据电泳检测结果和目的片段

序列比对获得定点整合KAP6 .1-VEGF-polyA表达盒的阳性细胞系D39， 可作为后续通过SCNT 
制备重构胚的供体细胞。
[0057] 6)在基因组CCR5位点定点整合VEGF基因的转基因绒山羊制备与鉴定：
[0058] 通过SCNT方法制备转基因绒山羊， 需要几个方面的材料准备和操作步骤， 包括卵
母细胞的采集和体外成熟， 准备核供体细胞(上述得到的定点整合KAP6 .1-VEGF-polyA表达
盒的阳性细胞系D39) ， 制备重构胚胎， 准备受体母羊， 体细胞克隆胚胎移植入受体母羊输卵
管中， 受孕母羊鉴定， 孕期母羊管理， 产羔管理， 新生羔羊管理， 鉴定定点整合VEGF基因的绒
山羊羔羊， 外源VEGF基因的表达检测， 转基因绒山羊管理等。整个过程的各个步骤中， 定点
整合VEGF基因的核供体细胞准备、转基因羊鉴定和外源基因表达检测等内容具有创造性，
其它内容为常规技术。
[0059] 卵母细胞的采集和体外成熟。在商业屠宰场采集绒山羊卵巢， 带回实验室， 使用生
理盐水反复清洗， 放入含有20mL采卵液的培养皿中， 剖割法取卵，释放出卵泡液和卵丘  -卵
母细胞复合体(COCs)。回收的卵母细胞于M199成熟培养液， 培养条件为38 .5℃，  18h后的
COCs置于0 .1％的透明质酸酶中， 用200μL的移液器轻轻反复吹打去掉成熟的卵母细胞表面
的卵丘细胞， 在体视镜下挑选排出第一极体的形态良好的卵母细胞用于细胞核移植。
[0060] 准备核供体细胞(上述得到的定点整合KAP6 .1-VEGF-polyA表达盒的阳性细胞系
D39)。将定点整合VEGF基因的阳性细胞系D39以不同的梯度接种到二十四孔板中，用含有

8
CN 108570479 B 说　明　书 7/18 页

15％FBS的细胞培养液培养细胞48h， 用50μL的0 .25％胰蛋白酶消化2min， 用含450μL的15％

胎牛血清的培养液终止消化， 轻轻吹打使细胞悬浮， 吸取50μL细胞混合液， 准备用于核移
植。
[0061] 制备重构胚胎。将成熟后的卵母细胞脱去颗粒细胞与核供体细胞放入CCB的滴中，
采用盲吸法， 在显微操作仪下吸除第一极体， 同时吸出处于分裂中期的染色体和周围的部
分细胞质。再将核供体细胞注射到卵周隙中， 并使供体细胞与卵质膜接触。将完成的重构胚
胎放入成熟液中清洗三遍， 然后放入培养箱培养30min后进行电融合(融合参数为90V/mm，
一次直流脉冲、 30μs/次)。将电融合好的重构胚再放培养箱中恢复30min。然后， 挑取融合的
胚胎统计计数后， 置于A231875μM  I中激活5min， 然后再将其放入2mM  6-DMAP  培养液中培
养4h， 之后放到发育液中培养。38 .5℃、5％CO2、饱和湿度条件培养48h后挑选发育到2-8细
胞期的胚胎用于移植。
[0062] 准备受体母羊。 九月份成体母羊自然发情， 早上试出来的发情母羊随羊群放牧， 晚
上继续试情， 所有发情母羊记录耳号， 并打好标记， 共150只。 单独圈养进行空腹， 准备手术。
[0063] 体细胞克隆胚胎移植入受体母羊输卵管中。 手术移植前一天对受体母羊禁食， 先
对手术受体母羊注射麻药鹿眠灵， 腹部靠近乳房部剃毛消毒后， 敷已灭菌的创布， 在腹中线
纵线切， 拉出子宫角及卵巢， 查看排卵点。用移植枪吸取4-5枚2-8细胞的克隆胚胎， 移植入
有排卵点一侧的输卵管中。结束后向腹腔内注射20mL抗生素同时肌注5mL抗生素。移植完毕
后用缝合线进行双层缝合， 撒上消炎粉后间断缝合皮肤， 静脉注射苏醒药鹿醒灵。
[0064] 受体羊的术后管理与受孕母羊鉴定。 受体母羊手术后单独进行饲养， 待伤口愈合
后， 进行试情， 观察是否反情。如果两个情期均未返情， 则该受体羊可能具有妊娠情况， 对其
进行B超检查， 进一步确定是否怀孕。
[0065] 孕期母羊管理。 对已妊娠的受体羊进行集中饲养， 并观察其生长发育情况， 进入预
产期的受体羊进行严密的监控保证其可顺利生产。
[0066] 产羔与新生羔羊管理。 刚出生的羔羊进行特殊的看护和管理确保其安全， 每月对
初生羔羊的体长、体高、胸围和体重进行测量并记录， 待羔羊生长至一个月时， 采血样进行
初步鉴定。
[0067] 本发明中接受胚胎移植的150只受体母羊， 有3只母羊各产羔羊1只， 共3只， 为1618
号， 1625号和1652号。其中1652号羔羊于出生7天后死亡， 其余2只存活至今， 一只是带有黑
色绒毛的1625号羊， 另一只是白色1618号羊。
[0068] 定点整合VEGF基因的绒山羊羔羊鉴定及外源VEGF基因表达检测。 本发明对定点整
合VEGF基因的绒山羊鉴定及外源VEGF基因表达检测包括3个方面：
[0069] 第一个方面， 定点整合VEGF基因绒山羊PCR鉴定。在牧场分别采集每只新生羔羊的
血液， 提取基因组DNA作为模板， 使用鉴定引物(表6， 图6)，PCR扩增目的片段。预期片段长度
1500bp。扩增出目的片段的为定点整合VEGF基因的绒山羊。
[0070] 第二个方面， 定点整合VEGF基因绒山羊皮肤组织的实时定量PCR鉴定。在牧场分别
剪取新生羔羊耳尖皮肤组织。采集耳尖皮肤时， 耳尖剃毛， 碘酒消毒， 70％酒精脱碘， 无菌手
术剪剪取整个耳尖(约2～3cm2)置37℃， 含青霉素(100IU/ml)、链霉素(100IU/ml)  生理盐
水中， 1-2h内带回实验室。羔羊耳尖伤口用消炎粉处理。提取绒山羊皮肤组织总  RNA， 反转
录合成cDNA， 以GAPDH基因表达作为内标， 定量PCR检测转基因绒山羊皮肤组织中和对照组

9
CN 108570479 B 说　明　书 8/18 页

绒山羊皮肤组织中VEGF基因的表达。所用引物为(表7， 图7)。
比对VEGF基因mRNA丰度，
过表
达VEGF基因的为转基因绒山羊，
同时确定外源  VEGF基因得到转录。
[0071] 表7

[0072]

[0073] 第三个方面， 定点整合VEGF基因绒山羊皮肤组织蛋白的Western  Blot检测。提取

绒山羊皮肤组织总蛋白， 以VEGF抗体采用Western  Blot检测转基因绒山羊皮肤组织中和对
照组绒山羊皮肤组织中VEGF蛋白的表达量。 比对两种组织中VEGF蛋白量， 过表达VEGF  基因
的为转基因绒山羊， 同时表明外源VEGF基因编码的蛋白质得到表达。
[0074] 转基因绒山羊管理。 两只新生羊生活在内蒙古亿维白绒山羊有限责任公司(原内
蒙古白绒山羊种羊场)的转基因羊养殖场， 主要以放牧试饲养。
[0075] 本发明与现有技术相比具有以下优点:
[0076] (1)关于CCR5位点选择， 近期研究者对以CCR5靶位点的HIV-1受体拮抗剂越来越关
注； 同时CCR5基因缺失不会对物的生长发育产生影响。CCR5可以作为基因编辑靶位点， 使用
ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9、
shRNA、
small  interfering  RNAs(siRNA)等方法抑制或者敲除
CCR5基因可以防止HIV-1入侵时与之结合。 目前未见报道出在CCR5位点整合获得动物(包括
小鼠)。
[0077] (2)关于gRNA的选择 ,绒山羊CCR5基因第一外显子较短， 仅为112bp， 第二外显子较
长， 为1312bp， 而且起始密码子在第二外显子上， 所以本发明根据CCR5第二外显子序列设计
了4条长20nt～21nt的gRNAs。
[0078] (3) 定点整合载体P1-KV-polyA-P2构建 ，本实验设计载体通过本实验已 有的 
pCMV-DsRed进行改造， 起到了保护原基因的准确性， 同时破坏了药物筛选标记， 实现了载体
不带有任何标记， 大大增加了基因编辑动物的安全性， 同源臂的缩短和较短的线性化的整
合载体大大提高转染效率， 也提高整合效率。后续检测工作也容易进行。而且通过酶切连接
上下游同源臂， 快速方便缩短实验周期。
[0079] (4)定点整合VEGF基因的单克隆转基因细胞系， 通过口吸管法挑选得到80株单克
隆细胞， 通过PCR检测获得1株CCR5位点定点整合VEGF基因的阳性单克隆细胞系D39， 效率达
到1 .25％。 效率与其他基因编辑技术显著提高， 而且用时较短， 缩短实验周期。
[0080] (5)CCR5位点定点整合VEGF基因转基因绒山羊的获得， 为用于通过PCR  方法鉴定
CCR5位点特异性整合外源VEGF基因表达盒所用的扩增引物对转基因羔羊鉴定。
[0081] (6)外源VEGF基因的表达检测 ,通过实时定量PCR检测NT、 1618和1625  绒山羊皮肤
组织中， VEGF基因mRNA的表达情况， 结果显示， 1618和1625两只新生羊皮肤组织中VEGF基因

10
CN 108570479 B 说　明　书 9/18 页

mRNA表达量与NT皮肤组织中的表达量相比增高。 蛋白质免疫印迹实验检测NT、 1618、1625绒

山羊皮肤组织中VEGF基因蛋白表达量。结果显示，   1618和1625定点整合绒山羊皮肤组织中
VEGF蛋白表达量较于NT的表达量增高。
[0082] 所述步骤[VEGF外源基因整合载体构建]中的VEGF基因为本课题组克隆的阿尔巴
斯白绒山羊VEGF164基因的cDNA， 包括全长ORF， GenBank收录号为： JX524883。
[0083] 所 述 步 骤 [g R N A 表 达 载 体设 计]中的 C CR 5 基因 为 山羊 C CR 5 基因 (G e n e  I D ：
 
102178672)。
[0084] 所述步骤[卵母细胞的采集和体外成熟]中的采卵液、 Opti-MEM、M199成熟培养液、  
15％胎牛血清的培养液、 细胞混合液、 CCB、
6-DMAP培养液、 发育液均为常规培养液。
[0085] 所述步骤[体细胞克隆胚胎移植]中的抗生素为宁波二厂。
[0086] 所述步骤[体细胞克隆胚胎移植]中的消炎粉为宁波二厂。
[0087] 所述步骤[体细胞克隆胚胎移植]中的鹿醒灵为宁波二厂。
[0088] 所述步骤[体细胞克隆胚胎移植]中的鹿眠灵为宁波二厂。
[0089] 所述步骤[转基因羊的鉴定]中的VEGF抗体为abcam公司。

附图说明
[0090] 下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
[0091] 图1为扩增455bp的gRNA及其骨架序列编码片段的重叠PCR示意图。 这种扩增策略
可以实现3个小片段之间互为模板、 互为引物， 延伸和扩增， 最终获得455bp的  gRNA及其骨
架序列编码片段。
[0092] 图2为构建的表达gRNA的载体结构及gRNA二级结构示意图。 A：载体结构， 由U6启动
子驱动gRNA转录， 下游有终止子序列； B：
gRNA及其骨架二级结构。
[0093] 图3为所用的表达Cas9蛋白的hCas9质粒。 由CMV启动子驱动Cas9基因转录。
[0094] 图4为CCR5位点特异性整合外源VEGF基因表达盒所用的打靶载体P1-KV-PolyA-P2
的构建流程示意图。P1为CCR5基因第二外显子3895bp位核苷酸上游1059  bp片段， P2为CCR5
基因第二外显子3972bp位核苷酸下游1082  bp片段。2个同源臂的长度可以保证带着外源
VEGF基因表达盒实现同源重组， 定点整合。整合的KAP6 .1-VEGF-polyA表达盒中， KAP6 .1是
皮肤特异性启动子， VEGF基因包含了全部的ORF， polyA可以提供转录终止信号， 终止转录。
[0095] 图5为通过SCNT制备重构胚的核供体细胞---绒山羊胎儿成纤维细胞。 绒山羊胎儿
成纤维细胞作为核供体细胞在本实验室使用多年， 具有高效特性。
[0096] 图6为用于通过PCR方法鉴定CCR5位点特异性整合外源VEGF基因表达盒所用的扩
增引物设计示意图。扩增片段是绒山羊基因组不存在的、只有外源整合的VEGF  基因表达盒
所特有的片段， 可以用于转基因细胞和转基因羔羊鉴定。
[0097] 图7为本发明采用实时定量PCR方法检测绒山羊皮肤组织中VEGF基因过表达所用
扩增引物的示意图。皮肤特异性启动子KAP6 .1可以在皮肤组织中过表达外源VEGF基因， 与
对照组相比， 转基因羔羊皮肤组织中VEGF基因过表达。
[0098] 图8为按照图1所示通过重叠PCR分别获得gRNA  5 ′ 端(318bp)片段和gRNA  3 ′端
(117bp) 片段 ，最后获得455bp片段的电 泳图 。表明3个片段成功克隆 得到。M:DL1000 
marker；1:gRNA(455bp)；2:gRNA  5 ′
端(318bp)；
3:gRNA  3 ′
端(117bp)。

11
CN 108570479 B 说　明　书 10/18 页

[0099] 图9为使用Surveyor错配酶酶切检测可能包含有发生突变的靶序列片段的PCR  扩
增产物的电泳图。C： 对照； M：DL2000marker； 1为转染gRNA4检测结果。结果显示  gRNA4导致
细胞基因组发生突变。表明gRNA4是有效的gRNA， 作为后续实验使用。
[0100] 图10为224bp的polyA片段和1059bp的上游同源臂P1和1082bp的下游同源臂P2的
PCR产物电泳图。M:200bp  marker； 1:P1； 2:P2； 3:PolyA。
[0101] 图11为将构建好的P1-KV-polyA-P2质粒使用Nhe  I单酶切， 双酶切Nhe  I和  Kpn  I
双酶切鉴定的电泳图。M： 1KbDLodder  Maker， 1：Nhe酶单酶切， 2：Nhe  I和Kpn  I双酶切。 结果
显示， Nhe  I单酶切目的条带大小7 .3kb， Nhe  I和KpnI双酶切产生条目的带大小为2 .7kb和
5 .6kb，符合预期结果。
[0102] 图12为对准备作为核供体的绒山羊胎儿成纤维细胞提取基因组DNA， PCR扩增  SRY
基因， PCR产物电泳检测的结果。 目的片段大小为497bp。其中M： DL2000marker，  C：H2O，
1：绒
山羊母羊(阴性对照) ， 2：绒山羊胎儿成纤维细胞， 3：绒山羊公羊(阳性对照)。根据PCR产物
电泳检测结果可知本发明所使用的细胞系为雌性。
[0103] 图13为225V/2 .5ms条件， 10μg  pCMV-DsRed-Express2质粒转染1×106个细胞， 转
染效率可以达到100％。 图片为转染后48h的细胞照片。A： 普通光射下拍摄， B： 蓝关激发的绿
色荧光照片。
[0104] 图14为对转染细胞12h和48h后观察生长状况拍照， 结果显示用pCCR5-gRNA4、  
hCas9和pP1-KV-polyA-P2三个载体共同转染的细胞生长状态良好(图14A， B) ；对照实验组
pCDsRed2-KV质粒转染的细胞， 红荧光较强， 转染效率较高(图14C， D) ，
对30  个视野的统计
表明转染效率可以达到100％。
[0105] 图15为通过口吸管法挑选得到的CCR5位点定点整合VEGF基因的阳性单克隆细胞
系D39的PCR鉴定电泳图。 图中M： 250bp  DNA  marker，C：对照，1为阳性细胞系D39。
[0106] 图16为绒山羊卵母细胞形态。 其中A:未成熟的卵母细胞； B:去掉卵丘细胞的成熟
卵母细胞。
[0107] 图17为克隆胚的构建及融合图。 其中A： 克隆胚的构建过程； B克隆胚融合过程。
[0108] 图18为卵母细胞及重组胚发育过程。 其中A： 未成熟卵母细胞； B：
成熟卵母细胞； C、
D、 E、F分别为2细胞、 4细胞、 8细胞和囊胚。
[0109] 图19为出生后30天的1618号羔羊和出生后30天的1625号羔羊。 带有黑色绒毛的为
1625号， 白色的为1618号。
[0110] 图20为新生羔羊出生后30天， 在牧场分别采集每只新生羔羊的血液， 提取基因组
DNA作为模板， 使用表6中的鉴定引物， PCR扩增目的片段的电泳图。预期片段长度1500bp。其
中3、8泳道在预期1500bp出现目的条带， 其模板为通过体细胞核移植产生的转基因雌性羊
羔1618号和1625号的基因组DNA。 12号泳道为定点整合VEGF基因的阳性单克隆细胞系D39基
因组DNA为模板的阳性对照组C1， 13号泳道为以无酶水为模板的阴性对照组C2， 其他泳道为
正常饲养的对照组所生的羊羔， 均未出现目的扩增条带。说明体细胞核移植受体母羊所产
的羊羔1618和1625为CCR5位点定点整合  VEGF基因的转基因绒山羊。
[0111] 图21为实时定量PCR检测对照组(NT)、 1618号和1625号羔羊皮肤组织中  VEGF基因
mRNA的表达丰度图。其中1618号和1625号两只新生羔羊皮肤组织中  VEGF基因mRNA表达量
与NT皮肤组织中的表达量相比显著增高(p＜0 .01)。表明外源VEGF基因在CCR5位点得到高

12
CN 108570479 B 说　明　书 11/18 页

表达。
[0112] 图22为Western  Blot检测NT、
1618号和1625号新生羔羊皮肤组织中VEGF  蛋白表
达量的图。A： Western  Blot图；B：
蛋白免疫印迹条带的灰度分析图。相比NT， 1618  和1625定
点整合绒山羊皮肤组织中VEGF蛋白表达量增高(p＜0 .01)。表明新生绒山羊皮肤组织中
VEGF基因得到高表达。
[0113] 图23为CRISPR/Cas9介导的外源基因整合示意图

具体实施方式
[0114] 在下面的实施例中进一步说明了本发明， 但这并不限制本发明的范围。在实施例
中说明的本发明的制备方法中， 本发明所创新的技术方法给予了特别说明， 无特别说明的
均为常规方法。
[0115] 实施例1： 基于以绒山羊CCR5全长基因组序列(Gene  ID： 102178672)设计gRNA  基
于靶序列设计gRNA是CRISPR/Cas9技术的基本要求。对于定点整合外源基因而言， 靶序列的
选择十分重要， 涉及到细胞、 胚胎和个体的正常生长发育和外源基因的表达， 故靶位点的选
择是具有创造性的。
[0116] 本发明选择绒山羊CCR5基因为靶位点， 既参考了文献数据， 又对绒山羊CCR5全长
基因组序列(Gene  ID： 102178672)进行了序列特征分析。绒山羊CCR5基因第一外显子较短，
仅为112bp， 第二外显子较长， 为1312bp， 而且起始密码子在第二外显子上， 所以本发明根据
CCR5第二外显子序列设计了4条长20nt～21nt的gRNAs(gRNA1、   gRNA2、gRNA3和gRNA4) (表
1)。
[0117] 实施例2： 构建gRNA表达载体
[0118] gRNA表达载体构建需要相应的原件， 包括启动子、 gRNA序列和骨架序列、 转录终止
信号等， 构成一个gRNA序列和骨架序列的转录盒。 故gRNA表达载体构建是需要创造性的。
[0119] 本发明设计gRNA质粒结构示意图如图2所示， 包括U6启动子、 gRNA及其骨架序列和
终止信号序列。首先按照图1所示通过重叠PCR分别获得gRNA  5 ′ 端(318bp)  片段和gRNA  3 ′
端(117bp)片段， 最后获得455bp的编码gRNA及其骨架序列的片段(图  8)。然后以gRNA载体
为基本骨架， 构建成包括U6启动子、 gRNA及其骨架序列和终止信号序列， 并且在大肠杆菌中
可以复制的表达载体pCCR5-gRNAs。
[0120] 1)中间载体为pMD-19T。
[0121] 2)gRNA表达载体构建， 利用逐步降温方法使Gene-F和Gene-R退火形成双链， 片段
命名为1。 以gRNA-T2为模板用PrimeSTAR保真酶， 使用hgRNA5 ′ 和hgRNA3 ′进行PCR扩增。得到
hgRNA  5 ′
端片段和3 ′ 端片， 命名为2和3。然后以1、2、 3共同为模板， 利用hgRNA5F和hgRNA3R
进行PCR， 得到大小为455bp的完整gRNA。将纯化的PCR产物进行末端加A处理后， 与pMD-19T
连接， 转化大肠杆菌感受态， 进行涂板。次日挑取单菌落， 接种于含Amp的LB液体培养基中，
37℃、220rpm揺菌培养后进行菌液PCR鉴定。筛选得到的阳性克隆菌液进行测序。提取测序
正确的 质粒 ，命名为“gRNA-CCR5(pCCR5-gRNA1、pCCR5-gRNA2、pCCR5-gRNA3和pCCR5-
gRNA4)”-20℃保存备用。
[0122] 构建的pCCR5-gRNA1、 pCCR5-gRNA2、
pCCR5-gRNA3和pCCR5-gRNA4载体经测序正确，
各原件按照预定顺序排列。

13
CN 108570479 B 说　明　书 12/18 页

[0123] 实施例3： gRNA有效性检测

[0124] 将pCCR5-gRNA1、 pCCR5-gRNA2、 pCCR5-gRNA3和pCCR5-gRNA4分别和hCas9载体采用
电转方式共转染CFFCS， 48h后提取细胞基因组DNA， DNA提取步骤参照Wizard  Genomic  DNA 
Purification  Kit说明书完成。
[0125] 使用根据CCR5-1、 CCR5-2、CCR5-3和CCR5-4位点两侧序列设计的特异性引物  (表
2)进行PCR扩增，PCR反应体系为LATaqTM  II  25μL ， 上游引物(10uM/L)2μL  ， 下游引物
(10uM/L)2μL， 模板2μL， d3H2O  19μL。PCR反应条件： 95℃5min；95℃  1min、57℃30sec， 72℃
45sec， 33个循环； 72℃10min， 16℃30min。从绒山羊基因组中扩增出含有sgRNA靶位点的片
段， 电泳检测并将目的片段使用GeneJET  Gel  Extraction  Kit  试剂盒进行胶回收并纯化。
[0126] 纯化后的目的片段使用Surveyor错配酶酶切检测。 如果gRNA1、 gRNA2、gRNA3  和
gRNA4诱发突变， 扩增片段将被Surveyor错配酶切为两段， 预期片段长度分别为400bp  和
300bp。 电泳图上会显示3条带， 即PCR扩增片段(700bp) 、被Surveyor错配酶切成的两段
(400bp、300bp)。结果显示gRNA4导致细胞基因组发生突变(图9)。表明  gRNA4是有效的
gRNA， 作为后续步骤使用。
[0127] 实施例4： 构建VEGF基因CCR5位点定点整合载体
[0128] 为实现在绒山羊基因组CCR5位点整合入VEGF基因的表达盒KAP6 .1-VEGF-polyA，
需在该表达盒两侧加上与绒山羊CCR5位点两侧序列一致的同源臂。根据确定的CCR5基因序
列， 在筛选出的、 发生突变的靶位点两侧选取上游同源臂(P1)和下游同源臂(P2)。 同源臂序
列决定CCR5位点定点整合的精准性和整合效率， 故同源臂序列的选择和CCR5  位点定点整
合载体的构建具有创造性。
[0129] 构建CCR5位点定点整合载体的基本骨架是本实验室之前构建的pCDsRed2-KV， 在
这个pCDsRed2-KV载体中， VEGF基因下游没有连接转录终止信号polyA序列， 故本发明山羊
CCR5基因序列为模板， 设计PCR引物(表3)。上游引物添加了HindIII酶切位点， 下游引物添
加了Kpn  I酶切位点。
[0130] 应用上述扩增polyA片段的特异性引物， 以pCDsRed2-KV为模板PCR扩增  SV40的
polyA片段。PCR反应体系为LATaqTM  II  25μL， 上游引物(10uM/L)2μL， 下游引物(10uM/L)2μ
L，模板2μL， d3H2O  19μL。PCR反应条件： 95℃5min； 95℃30sec，  57℃30sec， 72℃30sec，33个
循环； 72℃10min， 16℃30min。克隆得到SV40的224bp  的polyA序列片段(图10) ， 测序正确。
将polyA片段连接到pDsRed2-KV载体的VEGF  基因下游， 构成KAP6 .1-VEGF-polyA表达盒， 重
组载体命名为pCDsRed2-KV-1， 对重组载体测序表明polyA片段正确连接在VEGF基因下游。
在pCDsRed2-KV-1的基础上继续构建CCR5位点定点整合载体。
[0131] 根据CCR5基因序列和筛选出的靶位点(gRNA4互补序列) ， 设计引物(表4) ， 同源臂
P1上、 下游引物5 ′ 端引入了Bam  HI酶切位点； 同源臂P2上游引物5 ′ 引入Kpn  I酶切位点， 下
引物5 ′ 端引入Mfe  I酶切位点。2837位3895位， 预期片段长度1059bp。   P2片段为CCR基因核
苷酸序列的3972位5052位， 预期片段长度1082bp。
[0132] PCR扩增上游同源臂(P1)和下游同源臂(P2)：
[0133] 提取绒山羊胎儿成纤维细胞基因组DNA ， DNA提取步骤参照Wizard  Genomic 
DNAPurification  Kit说明书完成。
[0134] 应用表4中扩增同源臂P1的一对特异性引物、 扩增同源臂P2的一对特异性引物， 以

14
CN 108570479 B 说　明　书 13/18 页

绒山羊基因组DNA为模板分别扩增P1片段和P2片段， PCR反应体系为LATaqTM  II  25μL， 上游

引物(10uM/L)2μL， 下游引物(10uM/L)2μL， 模板2μL， d3H2O  19μL。  PCR反应条件： 95℃5min；
95℃30sec， 60℃30sec，72℃1min，
33个循环； 72℃10min，  16℃30min。 从绒山羊基因组中扩
增出P1片段和P2片段， 电泳检测并将目的片段使用  GeneJET  Gel  Extraction  Kit试剂盒
进行胶回收并纯化。
[0135] 电泳检测得到1059bp的上游同源臂P1和1082bp的下游同源臂P2(图10) ， 测序正
确。
[0136] 将扩增得到的P1和P2整合到VEGF过表达载体pCDsRed2-KV-1中， P1位于  KAP6 .1-
VEGF-polyA表达盒上游， P2位于KAP6 .1-VEGF-polyA表达盒下游。
[0137] 考虑到P1上、 下游引物5 ′ 端引入了同一个Bam  HI酶切位点， 可能会出现正、 反连接
的结果， 正向连接的为正确连接。这个问题通过对得到的多个重组质粒进行测序， 选出正向
连接的质粒， 作为定点整合载体(图4)， 命名为pP1-KV-PolyA-P2。
[0138] 将构建好的P1-KV-polyA-P2质粒使用Nhe  I单酶切， Nhe  I和Kpn  I双酶切鉴定， 用
1％琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示， Nhe  I单酶切目的条带大小7 .3kb， Nhe  I和KpnI  双酶
切产生条目的带大小为2 .7kb和5 .6kb， 符合预期结果(图11)。重组载体测序表明， 各元件按
照预定顺序排列且连接正确。
[0139] 实施例5： CCR5位点定点整合VEGF基因的单克隆细胞系的获得在获得CCR5  位点定
点整合外源KAP6 .1-VEGF-polyA表达盒单克隆细胞系的过程中， 需要经过鉴定细胞系性别、
转染细胞、 筛选、 单克隆培养及转基因细胞系鉴定等过程。其中转染条件的确定和单克隆细
胞系的获得是具有创造性的环节。
[0140] 1) 绒山羊胎儿成纤维细胞为本实验室通过原代培养的方法分离 ， 15％FBS的 
DMEM/F12培养液， 于5％CO2、 37℃的培养箱中培养， 扩增后液氮冻存。用时解冻培养。这些都
是常规方法。
[0141] 2)绒山羊胎儿成纤维细胞的性别鉴定。 解冻通过原代培养得到的冻存绒山羊胎儿
成纤维细胞， 正常培养扩增， 一部分细胞提取细胞基因组DNA， 应用表5中针对SRY基因的特
异性引物， PCR扩增SRY基因片段， 预期片段长度497bp。PCR反应体系为  LATaqTM  II  25μL，
上游引物(10uM/L)2μL， 下游引物(10uM/L)2μL， 模板2μL， d3H2O  19μL。扩增条件： 95℃5min
预变性 ；95℃30sec变性 ，56℃30sec退火 ， 72℃延伸30sec ，   33个循环； 72℃10min ；4℃
30min。同时以来自于母羊和公羊的DNA作为阴性和阳性对照。PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测
是否有目标条带。
[0142] 电泳检测表明未检测到SRY基因片段(图12)。 使用的细胞系为雌性。
[0143] 3）定点整合VEGF基因打靶载体P1-KV-polyA-P2转染绒山羊胎儿成纤维细胞：
[0144] 绒山羊胎儿成纤维细胞电转染法转染条件的确定。 由于打靶载体P1-KV-polyA-P2
中不含有荧光标记基因， 故用pCMV-DsRed-Express2摸索、确定电转条件。解冻培养的绒山
羊胎儿成纤维细胞在100  mm的皿中用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液培养， 细胞汇合度
到达90%时， 消化细胞制成单细胞悬液，用Opti-MEM清洗两遍并弃去上清液， Opti-MEM重悬
6
计数。调整细胞浓度至90  µL含有1×10 个细胞。加入pCMV-DsRed-Express2质粒（1  µg/µ
L）， 将100  µL混合液加入到电击杯中， 加入的过程中避免产生气泡， 使用NEPA21电击， 在1×
6
10 个细胞的恒定条件下， 对电压和脉冲时间进行优化。参照NEPA21使用说明书， 按表8进行

15
CN 108570479 B 说　明　书 14/18 页

转染条件优化。
[0145] 表8

[0146]

[0147] 先吸取10％FBS的培养液10mL加入100mm的细胞培养皿中放到置于37℃、5％CO2、
饱和湿度条件下的培养箱中平衡； 电击结束后， 向电击杯中加入500μL预热的含15％FBS  的
培养液， 轻轻吸打， 将细胞混合液加到预先平衡的培养液中， 置于培养箱培养， 24h后换液。
48h后观察细胞状态及荧光表达情况， 使用流式细胞仪分析转染效率。
[0148] 在10μg  pCMV-DsRed-Express2质粒的恒定条件下， 以不同的电压与脉冲时间组合
参数电 转 ，使用流式细胞仪分析。结果表明225V/2 .5m的转染条件 ，转染效率能够达到
100％，   48h倒置相差显微镜观察细胞见图13。其中A为普通光照射下拍摄， B为蓝光激发的
绿色荧光照片。
[0149] 根据上面所述优化好的电转条件， 利用pCCR5-gRNA4、hCas9和P1-KV-polyA-P2三个
载体共同转染细胞。 同时用pCDsRed2-KV作为对照实验组。
[0150] 复苏培养的原代细胞在100mm的皿培养汇合度到达90％时， 经过两次传代， 以便细
胞恢复良好的状态和活力。按照优化好的转染条件， 待新细胞生长汇合度到达90％时，   PBS
清洗2-3遍后用0 .25％胰蛋白酶消化2min， 培养液终止消化， 轻轻吹打使细胞悬浮并将细胞
收集于15mL离心管中； 然后用Opti-MEM清洗两遍并弃去上清液， 最后加  80μL  Opti-MEM重
悬； hCas9质粒5μL(2000ngμL) ； pCCR5-gRNA4质粒5μL(200ng/μL；打靶载体P1-KV-polyA-P2 
10μL(100ng/μL， 混合， 将100μL混合液加入到电击杯中， 使用NEPA21电转仪进行电击。然后
向电击杯中加入100μL预热的含20％FBS的培养液， 轻轻吸打， 将细胞转移到含5mL预热培养
液的两个60mm培养皿中， 置于培养箱培养。对照实验组pCDsRed2-KV质粒10μL(100ng/μL 
L)。
[0151] 对转染细胞12h和48h后观察生长状况拍照， 结果显示用pCCR5-gRNA4、hCas9  和
pP1 -K V- poly A- P2三个载体共同 转染的 细胞生长状态良 好 (图 1 4A ，B) ；对 照实 验组 
pCDsRed2-KV质粒转染的细胞， 红荧光较强， 转染效率较高(图14C， D)，对30个视野的统计表
明转染效率可以达到100％。
[0152] 4)单克隆细胞系的筛选。
[0153] 本实验通过口吸管方法挑选单克隆细胞。 预先将20％FBS的培养液加入96孔细胞
培养板的每个孔。将转染48h后的细胞， 用PBS清洗2-3遍后用0 .25％胰蛋白酶消化  2min， 用
含10％FBS的培养液终止消化， 轻轻吹打使细胞悬浮离心收集于15mL离心管中； 用培养液悬
浮， 用玻璃管拉制成可以使单个细胞通过的合适直接口吸管， 在显微镜下无菌操作， 将单细

16
CN 108570479 B 说　明　书 15/18 页

胞分别接种预先平衡的96孔细胞培养板。置于培养箱培养。待细胞生长铺满皿底后， 分别用
0 .25％胰蛋白酶消化2min，用含10％FBS的培养液终止消化， 轻轻吹打使细胞悬浮， 将96细
胞培养孔板中的每个孔细胞传到24孔细胞培养板的每个孔中继续扩大培养， 待每个孔细胞
长满时， 然后将每个孔的细胞消化回收传到6孔细胞培养板的每个孔中继续培养。6孔细胞
培养板的每个孔中细胞长满时， 将细胞编号后一半细胞用于基因组DNA的提取； 另一半细胞
冻存。
[0154] 定点整合VEGF基因单克隆细胞系的鉴定。
[0155] 利用表6中的一对特异于外源KAP6 .1-VEGF-polyA表达盒的PCR扩增引物， 以筛选
得到的转基因单克隆 细胞系提取的基因组DNA为模板 ，扩增外源基因。PCR反应体系为
LATaqTM  II  25μL，上游引物(10uM/L)2μL， 下游引物(10uM/L)2μL， 模板2μL，   d3H2O  19μL。
PCR扩增反应条件：95℃5min ；95℃30sec， 57 .5℃30sec， 72℃1 .5min ，
  33个循环； 72℃
10min， 4℃30min。预期片段长度1500bp。PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测， 有阳性片段的为转
基因细胞系， 目的片段胶回收， 将回收产物测序。
[0156] 通过口吸管法挑选得到80单克隆细胞， 通过PCR检测获得1株CCR5位点定点整合
VEGF基因的阳性单克隆细胞系D39（图15）。 图中M： 250  bp  DNA  marker，
C：对照， 1为阳性细
胞系D39。将PCR产物测序正确， 为目的片段序列。得到的CCR5位点定点整合外源KAP6 .1-
VEGF-polyA表达盒的阳性单克隆细胞系D39可直接用于后续SCNT制备重构胚的供体细胞。
[0157] 实施例6： CCR5位点定点整合VEGF基因的转基因绒山羊制备、 鉴定与外源基因表达
检测。通过体细胞核移植方法获得转基因绒山羊需要经过定点整合VEGF基因的核供体细胞
准备、卵母细胞的体外成熟、 受体母羊的准备、重构胚的制备与移植、胚胎移植羊的术后管
理、 受孕母羊鉴定、孕期母羊管理、产羔管理、新生羔羊管理、转基因羊鉴定、外源基因表达
检测和转基因羊后期管理等过程， 其中定点整合外源KAP6 .1-VEGF-polyA表达盒的核供体
细胞准备、 转基因羊鉴定和外源基因表达检测等内容具有创造性， 其它内容为常规技术。
[0158] 1)定点整合VEGF基因的核供体细胞准备。 通过体细胞核移植技术获得转基因绒山
羊， 转基因细胞系的获得至关重要， 将用做核供体细胞。将前面筛选出来的VEGF定点整合阳
性细胞以不同的梯度接种到二十四孔板中，用含有15％FBS的细胞培养液培养细胞， 达到
90％汇合度时， 用50μL的0 .25％胰蛋白酶消化2min， 用含450μL的15％胎牛血清的培养液终
止消化， 轻轻吹打使细胞悬浮， 吸取50μL细胞混合液， 准备用于核移植。
[0159] 2)卵母细胞的体外成熟。 用生理盐水将从屠宰场取得的卵巢清洗3次， 用剪刀剪去
多余的脂肪， 再清洗3次。采用切割法收集卵母细胞， 在显微镜下挑选形态完好， 卵丘细胞完
整、 包裹致密的卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte  complexes ,COCs)。采集到的COCs 
用卵母细胞成熟液清洗三遍， 38 .5℃，5％CO2饱和湿度的条件下成熟培养。18h后， 置于含
0 .1％透明质酸酶的M199溶液中孵育3min， 反复轻轻吹打， 将成熟卵母细胞表面的卵丘细胞
去除， 裸卵用成熟液清洗3次，用显微镜挑出带有第一极体的成熟卵母细胞， 放入培养箱中
备用。
[0160] 本 发 明 共 采 集 未 成 熟的 卵母 细胞 3 0 9 9枚 ， 成 熟 卵母 细胞 2 2 0 6 枚 ，成 熟 率 为
71 .18％。卵母细胞形态见图16。其中A:未成熟的卵母细胞； B:去掉卵丘细胞的成熟卵母细
胞。
[0161] 3)重构胚的制备。 将成熟后的卵母细胞脱去颗粒细胞与核供体细胞放入CCB的滴

17
CN 108570479 B 说　明　书 16/18 页

中， 采用盲吸法， 在显微操作仪下吸除第一极体， 同时吸出处于分裂中期的染色体和周围的

部分细胞质。再将核供体细胞注射到卵周隙中， 并使供体细胞与卵质膜接触。将完成的重构
胚胎放入成熟液中清洗三遍， 然后放入培养箱培养30min后进行电融合(融合参数为90  V/
mm， 一次直流脉冲、30μs/次)。将电融合好的重构胚再放培养箱中恢复30min。然后， 挑取融
合的胚胎统计计数后， 置于A231875μM  I中激活5分钟， 然后再将其放入2mM  6-DMAP培养液
中培养4h， 之后放到发育液中培养。38 .5℃、 5％CO2、
饱和湿度条件培养48h后挑选发育到2-
8细胞期的胚胎用于移植。
[0162] 本发明对2206枚成熟的卵母细胞经过融合、 激活后获得1465枚重构胚， 发育至卵
裂期的胚胎747枚。 成熟率达到71 .2％， 融合率达到66 .4％， 卵裂率达到51％， 克隆胚重构及
融合过程见图17， 图18。
[0163] 4)受体母羊的准备。 九月份成体母羊自然发情， 早上试出来的发情母羊随羊
[0164] 群放牧， 晚上继续试情， 所有发情母羊记录耳号， 并打好标记。单独圈养进行空腹，
准备手术。
[0165] 5)重构胚移植。 手术移植前一天对受体母羊禁食， 先对手术受体母羊注射麻药鹿
眠灵， 腹部靠近乳房部剃毛消毒后，用以灭好菌的创布， 在腹中线纵线切， 拉出子宫角及卵
巢， 查看排卵点。用移植枪吸取4-5枚2-8细胞的克隆胚胎， 移植入有排卵点一侧的输卵管
中。结束后向腹腔内注射20mL抗生素同时肌注5mL抗生素。移植完毕后用缝合线进行双层缝
合， 撒上消炎粉后间断缝合皮肤， 静脉注射苏醒药鹿醒灵。
[0166] 本研究将使用体细胞移植技术得到的2细胞、 4细胞和8细胞期胚胎移植到150  只
受体母羊输卵管中。
[0167] 6)受体羊的术后管理与受孕母羊鉴定。 受体母羊手术后单独进行饲养， 待伤口愈
合后， 进行试情，观察是否反情。如果两个情期均未返情， 则该受体羊可能具有妊娠情况， 对
其进行B超检查， 进一步确定是否怀孕。
[0168] 7)孕期母羊管理。 对已妊娠的受体羊进行集中饲养， 并观察其生长发育情况， 进入
预产期的受体羊进行严密的监控保证其可顺利生产。
[0169] 8)产羔与新生羔羊管理。 刚出生的羔羊进行特殊的看护和管理确保其安全， 每月
对初生羔羊的体长、体高、胸围和体重进行测量并记录， 待羔羊生长至一个月时， 采血样进
行初步鉴定。
[0170] 本发明中接受胚胎移植的150只受体母羊， 有3只母羊各产羔羊1只， 共3只。编号为
219029的受体羊在2016年3月2日产羔1只， 为1618号，雌性， 白色绒毛； 编号为313177的受体
羊在2016年3 月12日产羔1只， 为1625号， 雌性， 带有黑色绒毛； 编号为200304的受体羊在
2016年3月17日产羔1只， 为1652号，雌性， 于出生7天后死亡。 1618号羔羊和1625号羔羊生长
发育正常， 存活至今。
[0171] 在出生后2天测定新生羊生长参数如表9所示， 存活的2只羔羊生长良好， 图19  为
出生后30天的1618号羔羊和出生后30天的1625号羔羊。
[0172] 表9

18
CN 108570479 B 说　明　书 17/18 页

[0173]

[0174] 9)定点整合VEGF基因的转基因绒山羊鉴定
[0175] 于新生羔羊出生后30天， 在牧场分别采集每只新生羔羊的血液， 提取基因组DNA作
为模板， 使用表6中的鉴定引物， PCR扩增目的片段。预期片段长度1500bp。扩增出目的片段
的为定点整合VEGF基因表达盒的绒山羊。PCR反应体系和反应程序与中鉴定转基因细胞系
一致。
[0176] PCR扩增产物电泳结果表明， 3、8泳道在预期1500bp出现目的条带， 其模板为通过
体细胞核移植产生的转基因雌性羊羔1618号和1625号。 12号泳道为以转基因单克隆细胞系
D39基因组DNA为模板的阳性对照组C1， 13泳道为以无酶水为模板的阴性对照组C2， 其他泳
道为正常饲养的对照组所生的羊羔， 均未出现目的扩增条带(图20)
[0177] 将3、 8泳道PCR产物纯化、测序， 序列与预期序列比对一致。说明体细胞核移植受体
母羊所产的羊羔1618和1625为CCR5位点定点整合外源KAP6 .1-VEGF-polyA  表达盒的转基
因绒山羊。
[0178] 10)定点整合VEGF基因的转基因绒山羊皮肤组织的实时定量PCR检测。
[0179] 于羔羊出生180天， 在牧场分别剪取新生羔羊耳尖皮肤组织。采集耳尖皮肤时， 耳
尖剃毛， 碘酒消毒， 70％酒精脱碘， 无菌手术剪剪取整个耳尖(约2～3cm2)置37℃， 含青霉素
(100IU/ml)、链霉素(100IU/ml)生理盐水中， 1～2h内带回实验室。羔羊耳尖伤口用消炎粉
处理。提取绒山羊皮肤组织总RNA， 反转录合成cDNA， 定量PCR检测转基因绒山羊皮肤组织和
对照组绒山羊皮肤组织VEGF基因的表达。
[0180] VEGF基因表达检测选取GAPDH作为内参基因 ， 所用引物为表7所示。反应体系为
SYBR  Premix  Ex  Taq  II(2×)10μL， Forward  Primer  0 .4μL， Reverse  Primer0 .4μL，
cDNA 
模板2 .0μL， RNase  Free  H2O  7 .2μL。反应条件： 95℃30s； 95℃5s， 60℃31s， 40个循环； 从60
℃升温至95℃绘制溶解曲线。
[0181] 定量PCR结果使用2-△△Ct方法计算相对表达量， 实验重复3次。并使用SPASS  软
件进行显著性差异分析， 其中**0 .01<p＜0 .05为差异显著， ***p＜0 .01差异极其显著。 比对
VEGF基因mRNA丰度， 转基因绒山羊皮肤组织中VEGF基因过表达。
[0182] 通过实时定量PCR检测对照组(NT)、 1618号和1625号羔羊皮肤组织中VEGF  基因
mRNA的表达丰度如图21所示， 1618和1625两只新生羊皮肤组织中VEGF基因  mRNA表达量与
NT皮肤组织中的表达量相比显著增高(p＜0 .01)。表明外源VEGF基因在CCR5位点得到高表
达。
[0183] 11)新生转基因绒山羊皮肤组织中VEGF蛋白表达检测。
[0184] 如前面所述， 于羔羊出生180天， 在牧场分别剪取新生羔羊耳尖皮肤组织， 按照组
织蛋白抽提液试剂盒说明提取总蛋白， BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。
[0185] 将经过定量和稀释到同一浓度的新生羔羊耳尖皮肤组织总蛋白样品进行Western 

19
CN 108570479 B 说　明　书 18/18 页

Blot检测， SDS-PAGE电泳分离后转膜， 脱脂奶粉封闭， 抗VEGF抗体(Abcam)为一抗孵育4℃孵

育过夜， goat抗rat二抗(Abcam)室温℃孵育1h， ECL试剂盒发光， 放入Tanon  5200全自动化
学发光成像分析系统中照相。 α-tublin为内参。
[0186] Western  Blot检测NT、 1618号和1625号绒山羊皮肤组织中VEGF蛋白表达量明显升
高。如图22所示， 相比NT， 1618和1625定点整合绒山羊皮肤组织中VEGF蛋白表达量较于NT的
表达量增高(p＜0 .01)。 新生绒山羊皮肤组织中VEGF基因在蛋白水平得到高表达。
[0187] 12)转基因羊的管理。 采用放牧式时注意抓好秋膘， 做好越冬管理工作， 做好抓绒、
修蹄、 去湿、 免疫和驱虫等日常管理工作， 完善各项记录。采用网围栏机械隔离， 防止转基因
动物在饲养时与同类野生动物交配。

20
CN 108570479 B 序　列　表 1/11 页

[0001] SEQUENCE  LISTING

[0002] <110>  内蒙古大学
[0003] <120>  一种基于CRISPR/Cas9技术介导绒山羊VEGF基因定点敲入的方法
[0004] <130>  一种基于CRISPR/Cas9技术介导绒山羊VEGF基因定点敲入的方法
[0005] <160>  9
[0006] <170>  PatentIn  version  3 .3
[0007] <210>  1
[0008] <211>  9553
[0009] <212>  DNA
[0010] <213>  hCas9质粒
[0011] <400>  1
[0012] atggtggtgt  cgaagtactt  gaaggctgca  ggcgcgccca  agttggtcag  agtaaacaag  60
[0013] tggataatgt  tttctgcctg  ctccctgatg  ggcttatccc  tgtgcttatt  gtaagcagaa  120
[0014] agcaccttat  cgaggttagc  gtcggcgagg  atcactcttt  tggagaattc  gcttatttgc  180
[0015] tcgatgatct  catcaaggta  gtgtttgtgt  tgttccacga  acagctgctt  ctgctcatta  240
[0016] tcttcgggag  accctttgag  cttttcatag  tggctggcca  gatacaagaa  attaacgtat  300
[0017] ttagagggca  gtgccagctc  gttacctttc  tgcagctcgc  ccgcactagc  gagcattcgt  360
[0018] ttccggccgt  tttcaagctc  aaagagagag  tacttgggaa  gcttaatgat  gaggtctttt  420
[0019] ttgacctctt  tatatccttt  cgcctcgaga  aagtcgatgg  ggtttttttc  gaagcttgat  480
[0020] cgctccatga  ttgtgatgcc  cagcagttcc  ttgacgcttt  tgagtttttt  agacttccct  540
[0021] ttctccactt  tggccacaac  cagtacactg  taagcgactg  taggagaatc  gaatccgccg  600
[0022] tatttcttgg  ggtcccaatc  ttttttgcgt  gcgatcagct  tgtcgctgtt  ccttttcggg  660
[0023] aggatacttt  ccttggagaa  gcctccggtc  tgtacttcgg  tctttttaac  gatgttcacc  720
[0024] tgcggcatgg  acaggacctt  ccggactgtc  gcgaaatccc  tacccttgtc  ccacacgatt  780
[0025] tctcctgttt  ctccgtttgt  ttcgataagt  ggtcgcttcc  gaatctctcc  attggccagt  840
[0026] gtaatctcgg  tcttgaaaaa  attcataata  ttgctgtaaa  agaagtactt  agcggtggcc  900
[0027] ttgcctattt  cctgctcaga  ctttgcgatc  attttcctaa  catcgtacac  tttatagtct  960
[0028] ccgtaaacaa  attcagattc  aagcttggga  tattttttga  taagtgcagt  gcctaccact  1020
[0029] gcattcaggt  aggcatcatg  cgcatggtgg  taattgttga  tctctctcac  cttataaaac  1080
[0030] tgaaagtcct  ttctgaaatc  tgagaccagc  ttagacttca  gagtaataac  tttcacctct  1140
[0031] cgaatcagtt  tgtcattttc  atcgtacttg  gtgttcatgc  gtgaatcgag  aatttgggcc  1200
[0032] acgtgcttgg  tgatctggcg  tgtctcaaca  agctgccttt  tgatgaagcc  ggctttatcc  1260
[0033] aactcagaca  ggccacctcg  ttcagcctta  gtcagattat  cgaacttccg  ttgtgtgatc  1320
[0034] agtttggcgt  tcagcagctg  ccgccaataa  tttttcattt  tcttgacaac  ttcttctgag  1380
[0035] gggacgttat  cactcttccc  tctattttta  tcggatcttg  tcaacacttt  attatcaata  1440
[0036] gaatcatctt  tgagaaaaga  ctggggcacg  atatgatcca  cgtcgtagtc  ggagagccga  1500
[0037] ttgatgtcca  gttcctgatc  cacgtacatg  tccctgccgt  tctgcaggta  gtacaggtag  1560
[0038] agcttctcat  tctgaagctg  ggtgttttca  actgggtgtt  ccttaaggat  ttgggacccc  1620
[0039] agttctttta  taccctcttc  aatcctcttc  atcctttccc  tactgttctt  ctgtcccttc  1680
[0040] tgggtagttt  ggttctctcg  ggccatctcg  ataacgatat  tctcgggctt  atgccttccc  1740
[0041] attactttga  cgagttcatc  cacgacctta  acggtctgca  gtattccctt  tttgatagct  1800

21
CN 108570479 B 序　列　表 2/11 页

[0042] gggctacctg  caagattagc  gatgtgctcg  tgaagactgt  ccccctggcc  agaaacttgt  1860

[0043] gctttctgga  tgtcctcctt  aaaggtgaga  gagtcatcat  ggatcaactg  catgaagttc  1920
[0044] cggttggcaa  atccatcgga  cttaagaaaa  tccaggattg  tctttccact  ctgcttgtct  1980
[0045] cggatcccat  tgatcagttt  tcttgacagc  cgcccccatc  ctgtatatcg  gcgcctcttg  2040
[0046] agctgtttca  tgactttgtc  gtcgaagaga  tgagcgtaag  ttttcaagcg  ttcttcaatc  2100
[0047] atctccctat  cttcaaacaa  cgtaagggtg  aggacaatgt  cctcaagaat  gtcctcgttc  2160
[0048] tcctcattgt  ccaggaagtc  cttgtcttta  atgattttca  ggagatcgtg  atacgttccc  2220
[0049] agggatgcgt  tgaagcgatc  ctccactccg  ctgatttcaa  cagagtcgaa  acattcaatc  2280
[0050] tttttgaaat  agtcttcttt  gagctgtttc  acggtaactt  tccggttcgt  cttgaagagg  2340
[0051] aggtccacga  tagctttctt  ctgctctcca  gacaggaatg  ctggctttct  catcccttct  2400
[0052] gtgacgtatt  tgaccttggt  gagctcgtta  taaactgtga  agtactcgta  cagcagagag  2460
[0053] tgtttaggaa  gcaccttttc  gttaggcaga  tttttatcaa  agttagtcat  cctttcgatg  2520
[0054] aaggactggg  cagaggcccc  cttatccacg  acttcctcga  agttccaggg  agtgatggtc  2580
[0055] tcttctgatt  tgcgagtcat  ccacgcgaat  ctggaatttc  cccgggcgag  ggggcctaca  2640
[0056] tagtagggta  tccgaaatgt  gaggattttc  tcaatctttt  ccctgttatc  tttcaaaaag  2700
[0057] gggtagaaat  cctcttgccg  cctgaggata  gcgtgcagtt  cgcccaggtg  aatctggtgg  2760
[0058] gggatgcttc  cattgtcgaa  agtgcgctgt  ttgcgcaaca  gatcttctct  gttaagcttt  2820
[0059] accagcagct  cctcggtgcc  gtccattttt  tccaagatgg  gcttaataaa  tttgtaaaat  2880
[0060] tcctcctggc  ttgctccgcc  gtcaatgtat  ccggcgtagc  catttttaga  ctgatcgaag  2940
[0061] aaaatttcct  tgtacttctc  aggcagttgc  tgtctgacaa  gggccttcag  caaagtcaag  3000
[0062] tcttggtggt  gctcatcata  gcgcttgatc  atactagcgc  tcagcggagc  tttggtgatc  3060
[0063] tccgtgttca  ctcgcagaat  atcactcagc  agaatggcgt  ctgacaggtt  ctttgccgcc  3120
[0064] aaaaaaaggt  ctgcgtactg  gtcgccgatc  tgggccagca  gattgtcgag  atcatcatcg  3180
[0065] taggtgtctt  tgctcagttg  aagcttggca  tcttcggcca  ggtcgaagtt  agatttaaag  3240
[0066] ttgggggtca  gcccgagtga  cagggcgata  agattaccaa  acaggccgtt  cttcttctcc  3300
[0067] ccagggagct  gtgcgatgag  gttttcgagc  cgccgggatt  tggacagcct  agcgctcagg  3360
[0068] attgctttgg  cgtcaactcc  ggatgcgttg  atcgggttct  cttcgaaaag  ctgattgtaa  3420
[0069] gtctgaacca  gttggataaa  gagtttgtcg  acatcgctgt  tgtctgggtt  caggtccccc  3480
[0070] tcgatgagga  agtgtccccg  aaatttgatc  atatgcgcca  gcgcgagata  gatcaaccgc  3540
[0071] aagtcagcct  tatcagtact  gtctacaagc  ttcttcctca  gatgatatat  ggttgggtac  3600
[0072] ttttcatggt  acgccacctc  gtccacgata  ttgccaaaga  ttgggtggcg  ctcgtgcttt  3660
[0073] ttatcctcct  ccaccaaaaa  ggactcctcc  agcctatgga  agaaagagtc  atccacctta  3720
[0074] gccatctcat  tactaaagat  ctcctgcagg  tagcagatcc  gattctttct  gcgggtatat  3780
[0075] ctgcgccgtg  ctgttctttt  gagccgcgtg  gcttcggccg  tctccccgga  gtcgaacagg  3840
[0076] agggcgccaa  tgaggttctt  ctttatgctg  tggcgatcgg  tattgcccag  aactttgaat  3900
[0077] tttttgctcg  gcaccttgta  ctcgtccgta  atgacggccc  agccgacgct  gtttgtgccg  3960
[0078] atatcgagcc  caatggagta  cttcttgtcc  atggtggcaa  gggttcgatc  ctctagagtc  4020
[0079] cggaggctgg  atcggtcccg  gtgtcttcta  tggaggtcaa  aacagcgtgg  atggcgtctc  4080
[0080] caggcgatct  gacggttcac  taaacgagct  ctgcttatat  agacctccca  ccgtacacgc  4140
[0081] ctaccgccca  tttgcgtcaa  tggggcggag  ttgttacgac  attttggaaa  gtcccgttga  4200
[0082] ttttggtgcc  aaaacaaact  cccattgacg  tcaatggggt  ggagacttgg  aaatccccgt  4260
[0083] gagtcaaacc  gctatccacg  cccattgatg  tactgccaaa  accgcatcac  catggtaata  4320

22
CN 108570479 B 序　列　表 3/11 页

[0084] gcgatgacta  atacgtagat  gtactgccaa  gtaggaaagt  cccataaggt  catgtactgg  4380

[0085] gcataatgcc  aggcgggcca  tttaccgtca  ttgacgtcaa  tagggggcgt  acttggcata  4440
[0086] tgatacactt  gatgtactgc  caagtgggca  gtttaccgta  aatactccac  ccattgacgt  4500
[0087] caatggaaag  tccctattgg  cgttactatg  ggaacatacg  tcattattga  cgtcaatggg  4560
[0088] cgggggtcgt  tgggcggtca  gccaggcggg  ccatttaccg  taagttatgt  aacgcggaac  4620
[0089] tccatatatg  ggctatgaac  taatgacccc  gtaattgatt  actattaata  actagtcaat  4680
[0090] aatcaatgtc  aacgcgtata  tctggcccgt  acatcgcgaa  gcagcgcaaa  acgcctaacc  4740
[0091] ctaagcagat  tcttcatgca  attgtcggtc  aagccttgcc  ttgttgtagc  ttaaattttg  4800
[0092] ctcgcgcact  actcagcgac  ctccaacaca  caagcaggga  gcagatactg  gcttaactat  4860
[0093] gcggcatcag  agcagattgt  actgagagtg  caccataggg  gatcgggaga  tctcccgatc  4920
[0094] cgtcgacgtc  aggtggcact  tttcggggaa  atgtgcgcgg  aacccctatt  tgtttatttt  4980
[0095] tctaaataca  ttcaaatatg  tatccgctca  tgagacaata  accctgataa  atgcttcaat  5040
[0096] aatattgaaa  aaggaagagt  atgagtattc  aacatttccg  tgtcgccctt  attccctttt  5100
[0097] ttgcggcatt  ttgccttcct  gtttttgctc  acccagaaac  gctggtgaaa  gtaaaagatg  5160
[0098] ctgaagatca  gttgggtgca  cgagtgggtt  acatcgaact  ggatctcaac  agcggtaaga  5220
[0099] tccttgagag  ttttcgcccc  gaagaacgtt  ttccaatgat  gagcactttt  aaagttctgc  5280
[0100] tatgtggcgc  ggtattatcc  cgtattgacg  ccgggcaaga  gcaactcggt  cgccgcatac  5340
[0101] actattctca  gaatgacttg  gttgagtact  caccagtcac  agaaaagcat  cttacggatg  5400
[0102] gcatgacagt  aagagaatta  tgcagtgctg  ccataaccat  gagtgataac  actgcggcca  5460
[0103] acttacttct  gacaacgatc  ggaggaccga  aggagctaac  cgcttttttg  cacaacatgg  5520
[0104] gggatcatgt  aactcgcctt  gatcgttggg  aaccggagct  gaatgaagcc  ataccaaacg  5580
[0105] acgagcgtga  caccacgatg  cctgtagcaa  tggcaacaac  gttgcgcaaa  ctattaactg  5640
[0106] gcgaactact  tactctagct  tcccggcaac  aattaataga  ctggatggag  gcggataaag  5700
[0107] ttgcaggacc  acttctgcgc  tcggcccttc  cggctggctg  gtttattgct  gataaatctg  5760
[0108] gagccggtga  gcgtgggtct  cgcggtatca  ttgcagcact  ggggccagat  ggtaagccct  5820
[0109] cccgtatcgt  agttatctac  acgacgggga  gtcaggcaac  tatggatgaa  cgaaatagac  5880
[0110] agatcgctga  gataggtgcc  tcactgatta  agcattggta  actgtcagac  caagtttact  5940
[0111] catatatact  ttagattgat  ttaaaacttc  atttttaatt  taaaaggatc  taggtgaaga  6000
[0112] tcctttttga  taatctcatg  accaaaatcc  cttaacgtga  gttttcgttc  cactgagcgt  6060
[0113] cagaccccgt  agaaaagatc  aaaggatctt  cttgagatcc  tttttttctg  cgcgtaatct  6120
[0114] gctgcttgca  aacaaaaaaa  ccaccgctac  cagcggtggt  ttgtttgccg  gatcaagagc  6180
[0115] taccaactct  ttttccgaag  gtaactggct  tcagcagagc  gcagatacca  aatactgttc  6240
[0116] ttctagtgta  gccgtagtta  ggccaccact  tcaagaactc  tgtagcaccg  cctacatacc  6300
[0117] tcgctctgct  aatcctgtta  ccagtggctg  ctgccagtgg  cgataagtcg  tgtcttaccg  6360
[0118] ggttggactc  aagacgatag  ttaccggata  aggcgcagcg  gtcgggctga  acggggggtt  6420
[0119] cgtgcacaca  gcccagcttg  gagcgaacga  cctacaccga  actgagatac  ctacagcgtg  6480
[0120] agctatgaga  aagcgccacg  cttcccgaag  ggagaaaggc  ggacaggtat  ccggtaagcg  6540
[0121] gcagggtcgg  aacaggagag  cgcacgaggg  agcttccagg  gggaaacgcc  tggtatcttt  6600
[0122] atagtcctgt  cgggtttcgc  cacctctgac  ttgagcgtcg  atttttgtga  tgctcgtcag  6660
[0123] gggggcggag  cctatggaaa  aacgccagca  acgcggcctt  tttacggttc  ctggcctttt  6720
[0124] gctggccttt  tgctcacatg  ttctttcctg  cgttatcccc  tgattctgtg  gataaccgta  6780
[0125] ttaccgcctt  tgagtgagct  gataccgctc  gccgcagccg  aacgaccgag  cgcagcgagt  6840

23
CN 108570479 B 序　列　表 4/11 页

[0126] cagtgagcga  ggaagcggaa  gagcgcccaa  tacgcaaacc  gcctctcccc  gcgcgttggc  6900

[0127] cgattcatta  atgcagctgg  cacgacaggt  ttcccgactg  gaaagcgggc  agtgagcgca  6960
[0128] acgcaattaa  tgtgagttag  ctcactcatt  aggcacccca  ggctttacac  tttatgcttc  7020
[0129] cggctcgtat  gttgtgtgga  attgtgagcg  gataacaatt  tcacacagga  aacagctatg  7080
[0130] accatgatta  cgccaagctc  tagctagagg  tcgacggtat  acagacatga  taagatacat  7140
[0131] tgatgagttt  ggacaaacca  caactagaat  gcagtgaaaa  aaatgcttta  tttgtgaaat  7200
[0132] ttgtgatgct  attgctttat  ttgtaaccat  tataagctgc  aataaacaag  ttggggtggg  7260
[0133] cgaagaactc  cagcatgaga  tccccgcgct  ggaggatcat  ccagccggcg  tcccggaaaa  7320
[0134] cgattccgaa  gcccaacctt  tcatagaagg  cggcggtgga  atcgaaatct  cgtgatggca  7380
[0135] ggttgggcgt  cgcttggtcg  gtcatttcgc  gaaccccaga  gtcccgctca  gaagaactcg  7440
[0136] tcaagaaggc  gatagaaggc  gatgcgctgc  gaatcgggag  cggcgatacc  gtaaagcacg  7500
[0137] aggaagcggt  cagcccattc  gccgccaagc  tcttcagcaa  tatcacgggt  agccaacgct  7560
[0138] atgtcctgat  agcggtccgc  cacacccagc  cggccacagt  cgatgaatcc  agaaaagcgg  7620
[0139] ccattttcca  ccatgatatt  cggcaagcag  gcatcgccat  gggtcacgac  gagatcctcg  7680
[0140] ccgtcgggca  tgcgcgcctt  gagcctggcg  aacagttcgg  ctggcgcgag  cccctgatgc  7740
[0141] tcttcgtcca  gatcatcctg  atcgacaaga  ccggcttcca  tccgagtacg  tgctcgctcg  7800
[0142] atgcgatgtt  tcgcttggtg  gtcgaatggg  caggtagccg  gatcaagcgt  atgcagccgc  7860
[0143] cgcattgcat  cagccatgat  ggatactttc  tcggcaggag  caaggtgaga  tgacaggaga  7920
[0144] tcctgccccg  gcacttcgcc  caatagcagc  cagtcccttc  ccgcttcagt  gacaacgtcg  7980
[0145] agcacagctg  cgcaaggaac  gcccgtcgtg  gccagccacg  atagccgcgc  tgcctcgtcc  8040
[0146] tgcagttcat  tcagggcacc  ggacaggtcg  gtcttgacaa  aaagaaccgg  gcgcccctgc  8100
[0147] gctgacagcc  ggaacacggc  ggcatcagag  cagccgattg  tctgttgtgc  ccagtcatag  8160
[0148] ccgaatagcc  tctccaccca  agcggccgga  gaacctgcgt  gcaatccatc  ttgttcaatc  8220
[0149] atgcgaaacg  atcctcatcc  tgtctcttga  tcagatccga  aaatggatat  acaagctccc  8280
[0150] gggagctttt  tgcaaaagcc  taggcctcca  aaaaagcctc  ctcactactt  ctggaatagc  8340
[0151] tcagaggcag  aggcggcctc  ggcctctgca  taaataaaaa  aaattagtca  gccatggggc  8400
[0152] ggagaatggg  cggaactggg  cggagttagg  ggcgggatgg  gcggagttag  gggcgggact  8460
[0153] atggttgctg  actaattgag  atgcatgctt  tgcatacttc  tgcctgctgg  ggagcctggg  8520
[0154] gactttccac  acctggttgc  tgactaattg  agatgcatgc  tttgcatact  tctgcctgct  8580
[0155] ggggagcctg  gggactttcc  acaccctaac  tgacacacat  tccacagaat  taattcgcgt  8640
[0156] taaatttttg  ttaaatcagc  tcatttttta  accaataggc  cgaaatcggc  aaaatccctt  8700
[0157] ataaatcaaa  agaatagacc  gagatagggt  tgagtgttgt  tccagtttgg  aacaagagtc  8760
[0158] cactattaaa  gaacgtggac  tccaacgtca  aagggcgaaa  aaccgtctat  cagggcgatg  8820
[0159] gcccactacg  tgaaccatca  ccctaatcaa  gttttttggg  gtcgaggtgc  cgtaaagcac  8880
[0160] taaatcggaa  ccctaaaggg  agcccccgat  ttagagcttg  acggggaaag  ccggcgaacg  8940
[0161] tggcgagaaa  ggaagggaag  aaagcgaaag  gagcgggcgc  tagggcgctg  gcaagtgtag  9000
[0162] cggtcacgct  gcgcgtaacc  accacacccg  ccgcgcttaa  tgcgccgcta  cagggcgcgt  9060
[0163] ggggataccc  cctagagccc  cagctgcgca  gatctgctat  ggcagggcct  gccgccccga  9120
[0164] cgttggctgc  gagccctggg  ccttcacccg  aacttggggg  gtggggtggg  gaaaaggaag  9180
[0165] aaacgcgggc  gtattggccc  caatggggtc  tcggtggggt  atcgacagag  tgccagccct  9240
[0166] gggaccgaac  cccgcgttta  tgaacaaacg  acccaacacc  cgtgcgtttt  attctgtctt  9300
[0167] tttattgccg  tcatagcgcg  ggttccttcc  ggtattgtct  ccttccgtgt  ttcagttagc  9360

24
CN 108570479 B 序　列　表 5/11 页

[0168] ctcccccgtt  taaactcatt  actaaccggt  agggatcgaa  ccctttcaca  ccttcctctt  9420

[0169] cttcttgggg  tcagccctgc  tgtctccacc  gagctgagag  aggtcgattc  ttgtttcata  9480
[0170] gagccccgta  attgactgat  gaatcagtgt  ggcgtccagg  acctcctttg  tagaggtgta  9540
[0171] ccgctttctg  tct  9553
[0172] <210>  2
[0173] <211>  3868
[0174] <212>  DNA
[0175] <213>  CCR5基因组序列
[0176] <400>  2
[0177] ccaactcaga  agaaactgca  tttcctactt  ttatgctgtc  tatatgtttg  acttgcacag  60
[0178] ctcagctggt  cagaggagtt  gagacatccg  ttcccctacg  agaatctctc  tcggtaagtt  120
[0179] ctctctcagc  taactttgcc  tatttcttag  cgcagcttga  gtgatgagta  aaagccttta  180
[0180] caggaaacca  tagaaaacat  cagaaataca  ccaggcgttc  actgaactat  cttaaactat  240
[0181] aatctttaag  taaggaaaaa  gttaagagtt  tagaatcagt  ttcagactgt  gataacatca  300
[0182] aagatacaaa  acaggattat  gaatggaaga  ctataaaaag  ccctcacctt  tcaaaagaaa  360
[0183] gatattttcg  gagaataatt  actggccaaa  actttgacag  acatgatctt  ttggttagga  420
[0184] gaaataaaac  ctcctcagca  ggatgccctc  tgaacatgtg  cccaaccaca  agctgtgtct  480
[0185] aagtctcctt  ttatttctgc  caaggaaaga  aggaagcctg  aaaattggcc  aaattaataa  540
[0186] caagttataa  atatcaaatc  aactttcata  gcaaatctag  ttgattcttt  ttctggctca  600
[0187] gaatttaaag  gagagatttt  tctgtgagct  tttcccagct  gcttaatctg  aggtactggg  660
[0188] agcttgagtc  tcacagggac  taattagaga  aaattctcag  tcaagcggtg  ggacctaaat  720
[0189] agaccaggca  agttagtggg  ttgcgaagga  acaaagctaa  tacaggatgt  atgctaggag  780
[0190] atgaaacact  gtccacttga  ccacttctta  tgtattaggg  gagggggtcc  ttaatcatag  840
[0191] cagctcagaa  actacaaaca  caaacttcag  agaaaatgtg  agaatgggaa  tcgggacttg  900
[0192] acaactggct  gctggctcct  atgaccttct  ccagggactc  gggcatcagt  ctgtctcatt  960
[0193] ttgactacat  caaggctcca  ggctgacaat  cctgcttgta  gttctctcac  caaggagtga  1020
[0194] aagacaggga  ccacagcaga  taagttacag  tcagcactgc  ctgccttcaa  aattagttgc  1080
[0195] ttactccctg  tgggtctttg  gggaagttac  tcatcttctc  tgtgctctga  ggttcttatt  1140
[0196] tgcaaaacgg  ggacaataaa  cctgacctgc  ctcactgagt  caccttgagg  attaactgaa  1200
[0197] tgaatgaagt  gaagcttaga  acagtgctta  gcaagcaaag  tgccctagag  aactgttcat  1260
[0198] tatcaccagc  aagcccctaa  tgatgctatg  tgtaagctaa  ctccagggaa  tgacagtaag  1320
[0199] aacagacacg  gttggacagt  tcctgaccca  gtttctggac  attgttatca  cagcttcatt  1380
[0200] cactgcacgt  ggctacacaa  catccaattt  tatttggtga  gatgattgat  gctctccgtc  1440
[0201] tagtaaacag  agtgttagtc  gctcaggcgt  gtctgactct  tatgacccca  tggattgtag  1500
[0202] cccaccaggc  tccactgacc  atggaattct  ccaggcaaga  atactggagt  gggttgccat  1560
[0203] ttccttctcc  aggggatctt  cccaacccag  ggatcgaatc  caggtctcct  gcattgcagg  1620
[0204] cagattcttt  accatctgag  ccaccacgga  aacccaaagc  agagaagcta  gcagcaaact  1680
[0205] aatataaaaa  gttcactgtt  tgacaaaaaa  aaggacttca  gttaaatgta  gaaatctacg  1740
[0206] tatcaatttt  taaaacctac  ttaagtatat  aaaacggttt  gcattcatga  tggactgcta  1800
[0207] aggacattct  aggactttat  aaaacacctt  ttctttattt  acagagtcaa  gcaaaatgga  1860
[0208] ttatcaaaca  tcaactcccc  tctatgacat  tgattatggg  atgtcagagc  catgccaaaa  1920
[0209] aatcaacgtg  aggcaaattg  caggccagct  cttgccccca  ctctactcgc  tggtgttcat  1980

25
CN 108570479 B 序　列　表 6/11 页

[0210] ctttggtttt  gtgggcaact  tgctggttgt  cctcatcctg  ataaactgca  aaaagctgaa  2040

[0211] gagcatgact  gacatctatc  tgctcaactt  ggccatctct  gacctacttt  tcatcatcac  2100
[0212] tatcccattc  tgggctcact  acgctgcaga  ccagtgggta  tttggaaata  caatgtgcca  2160
[0213] gttattcaca  gggttctatt  tcattggtta  ttttggtgga  atcttcttca  tcatcctctt  2220
[0214] gacaatcgat  aggtacctgg  ctatcgttca  tgctgtgttt  gctttaaaag  ccagaacagt  2280
[0215] cacctttggg  gcagtgacaa  gtggggtcac  gtgggtggtg  gctatgtttg  cctctctccc  2340
[0216] aggaattatc  tttaccaaat  cccaaaagga  aggctctcgt  catacgtgca  gcccacattt  2400
[0217] cccatccaat  cagtatcatt  tctggaagag  tttccaaact  ttaaagatag  tcatcttggg  2460
[0218] gctggtgctg  cctctgcttg  tcatgatcgt  ctgctactcg  ggaatcataa  aaaccctgct  2520
[0219] ccagtgtcgc  agcgagaaga  agaagcacaa  ggctgtgagg  ctcatcttcg  tgatcatgat  2580
[0220] tgtctacttt  ctcttctggg  ctccctacaa  catcgtcctc  ctcctgagca  ccttccagga  2640
[0221] attcttcggc  ttgaataact  gcagtgactc  taacaggctg  gaccaagcca  tgcaggtgac  2700
[0222] agagaccctg  gggatgacgc  actgctgcat  caaccccatc  atctatgcct  tcgtggggga  2760
[0223] gaagttccga  aactatctcc  tacggttctt  ccgaaagtac  atcgccagcc  gcttctgcaa  2820
[0224] aggctgtcca  gtcttccagg  gagaggctcc  agagcgagtg  agctccgttt  acacacgatc  2880
[0225] cacgggagaa  caggaagtct  ctgttggctt  gtgatctgac  tcagttcata  tatgcaaact  2940
[0226] gtgggggagc  agttcaagag  gaaattactg  tcaacaaggg  tttaagattc  atccatcaat  3000
[0227] ttggcatcag  ctctaaatat  attagatatt  tcaagcccat  caattctaga  aagccaaagc  3060
[0228] aaaacacgct  gatgaaatag  caatcttctc  accgcccccc  tccacataca  acaatttatt  3120
[0229] ggcaagctct  cccctcacta  caaaaggttc  aatgtttaaa  aaaaaaaatc  ctcagagaat  3180
[0230] tattaattcc  tgagtttggt  tacctgaaca  ggaataacaa  aatgaactga  ggaaagtatt  3240
[0231] gtatagtttc  ttatctgggt  agggcaatag  ccaggttgca  aatgtgatta  aaataggtcc  3300
[0232] ttctcttgcc  atggggagaa  aagacatgcc  ggtgatcaga  taaggaatga  catcttccat  3360
[0233] gtgggatctc  tcccaaaagg  tacgttaata  agttccacag  acactgatgc  caaggaagag  3420
[0234] ccctgtggtc  tgctgagagc  tgggaaggct  tcttcgcaga  aaaggtactg  gaggccaatg  3480
[0235] gtctgtcagc  ggagaaggaa  gctgagctcc  aggatgcagg  cactgcacag  gcaaaacttg  3540
[0236] gctgtgggga  gacaggcact  ggctggggga  gctcctggga  ggaaaaatga  ggctggtgca  3600
[0237] tgagaaaact  ggacggcatt  gctcatcaaa  ttcagagagc  agagtgggga  gccctggcca  3660
[0238] atgttgcaga  aagctcattc  tgtaaccaaa  ggatggcctg  gaaaggtgag  cattcaggtc  3720
[0239] aaggagacca  gcaacaatgt  gatcaagtga  ggaggctcca  ctaaagttga  agccagagat  3780
[0240] gggaaggatg  gataccacct  cacagcactg  aggatgagag  ccagcagaat  ttggggtgga  3840
[0241] tttggcttgg  cagtgaaggg  cagagagg  3868
[0242] <210>  3
[0243] <211>  20
[0244] <212>  DNA
[0245] <213>  sgRNA靶位点
[0246] <400>  3
[0247] gtgtcgcagc  gagaagaaga  20
[0248] <210>  4
[0249] <211>  455
[0250] <212>  DNA
[0251] <213>  gRNA质粒

26
CN 108570479 B 序　列　表 7/11 页

[0252] <400>  4
[0253] tgtacaaaaa  agcaggcttt  aaaggaacca  attcagtcga  ctggatccgg  taccaaggtc  60
[0254] gggcaggaag  agggcctatt  tcccatgatt  ccttcatatt  tgcatatacg  atacaaggct  120
[0255] gttagagaga  taattagaat  taatttgact  gtaaacacaa  agatattagt  acaaaatacg  180
[0256] tgacgtagaa  agtaataatt  tcttgggtag  tttgcagttt  taaaattatg  ttttaaaatg  240
[0257] gactatcata  tgcttaccgt  aacttgaaag  tatttcgatt  tcttggcttt  atatatcttg  300
[0258] tggaaaggac  gaaacaccgt  cgtgggggag  aagttccgag  ttttagagct  agaaatagca  360
[0259] agttaaaata  aggctagtcc  gttatcaact  tgaaaaagtg  gcaccgagtc  ggtgcttttt  420
[0260] ttctagaccc  agctttcttg  tacaaagttg  gcatt  455
[0261] <210>  5
[0262] <211>  1202
[0263] <212>  DNA
[0264] <213>  上游同源臂序列
[0265] <400>  5
[0266] agcaagcccc  taatgatgct  atgtgtaagc  taactccagg  gaatgacagc  ttaagaacag  60
[0267] acacggttgg  acagttcctg  acccagtttc  tggacatcgt  tatcacagct  tcattcactg  120
[0268] cacgtggcta  cacaacatcc  aattttattt  ggtgagatga  ttgatgctct  ccgtctagta  180
[0269] aacagagtgt  tagtcgctca  ggcgtgtctg  actcttatga  ccccatggat  tgtagcccac  240
[0270] caggctccac  tgaccatgga  attctccagg  caagaatact  ggagtgggtt  gccatttcct  300
[0271] tctccagggg  atcttcccaa  cccagggatt  gaatccaggt  ctcctgcatt  gcaggcagat  360
[0272] tctttaccat  ctgagccacc  acggaaaccc  aaagcagaga  agctagcagc  aaactaatat  420
[0273] aaaaagttca  ctgtttgaca  aaaaaaagga  cttcagttaa  atgtagaaat  ctatgtatca  480
[0274] atttttaaaa  cctacttaag  tatataaaat  ggtttgcatt  catgatggac  tgctaaggac  540
[0275] attctaggac  tttataaaac  accttttctt  tatttacaga  gtcaagcaaa  atggattatc  600
[0276] aaacatcaac  tcccctctat  gacattgatt  atgggatgtc  agagccatgc  caaaaaatca  660
[0277] acgtgaggca  aattgcaggc  cagctcttgc  ccccactcta  ctcgctggtg  ttcatctttg  720
[0278] gttttgtggg  caacttgctg  gttgtcctca  tcctgataaa  ctgcaaaaag  ctgaagagca  780
[0279] tgactgacat  ctatctgctc  aacttggcca  tctctgacct  acttttcatc  atcactatcc  840
[0280] cattctgggc  tcactacgct  gcagaccagt  gggtatttgg  aaatacaatg  tgccagttat  900
[0281] tcacagggtt  ctatttcatt  ggttattttg  gtggaatctt  cttcatcatc  ctcttgacaa  960
[0282] tcgataggta  cctggctatc  gttcatgctg  tgtttgcttt  aaaagccaga  acagtcacct  1020
[0283] ttggggcagt  gacaagtggg  gtcacgtggg  tggtggctat  gtttgcctct  ctcccaggaa  1080
[0284] ttatctttac  caaatcccaa  aaggaaggct  ctcgtcatac  gtgcagccca  catttcccat  1140
[0285] ccaatcagta  tcatttctgg  aagagtttcc  aaactttaaa  gatagtcatc  ttggggctgg  1200
[0286] tg  1202
[0287] <210>  6
[0288] <211>  1081
[0289] <212>  DNA
[0290] <213>  下游同源臂序列
[0291] <400>  6
[0292] agcacaaggc  tgtgaggctc  atcttcgtga  tcatgattgt  ctactttctc  ttctgggctc  60
[0293] cctacaacat  cgtcctcctc  ctgagcacct  tccaggaatt  cttcggcttg  aataactgca  120

27
CN 108570479 B 序　列　表 8/11 页

[0294] gtgactctaa  caggctggac  caagccatgc  aggtgacaga  gaccctgggg  atgacgcact  180

[0295] gctgcatcaa  ccccatcatc  tatgccttcg  tgggggagaa  gttccgaaac  tatctcctac  240
[0296] ggttcttccg  aaagtacatc  gccagccgct  tctgcaaagg  ctgtccagtc  ttccagggag  300
[0297] aggctccaga  gcgagtgagc  tccgtttaca  cacgatccac  gggagaacag  gaagtctctg  360
[0298] ttggcttgtg  atctgactca  gctcatatat  gcaaactgtg  ggggagcagt  tcaagaggaa  420
[0299] attactgtca  acaagggttt  aagattcatc  catcaatttg  gcatcagctc  taaatatatt  480
[0300] agatatttca  agcccatcaa  ttctagaaag  ccaaagcaaa  acacgctgat  gaaatagcaa  540
[0301] tcttctcacc  gcccccctcc  acatacaaca  atttattggc  aagctctccc  ctcactacaa  600
[0302] aaggttcaat  gtttaaaaaa  aaaaatcctc  agagaattat  taattcctga  gtttggttac  660
[0303] ctgaacagga  ataacaaaat  gaactgagga  aagtattgta  tagtttctta  tctgggtagg  720
[0304] gcaatagcca  ggttgcaaat  gtgattaaaa  taggtccttc  tcttgccatg  gggagaaaag  780
[0305] acatgccggt  gatcagataa  ggaatgacat  cttccatgtg  ggatctctcc  caaaaggtac  840
[0306] gttaataagt  tccacagaca  ctgatgccaa  ggaagagccc  tgtggtctgc  tgagagctgg  900
[0307] gaaggcttct  tcgcagaaaa  ggtactggag  gccaatggtc  tgtcagcgga  gaaggaagct  960
[0308] gagctccagg  atgcaggcac  tgcacaggca  aaacttggct  gtggggagac  aggcactggc  1020
[0309] tgggggagct  cctgggagga  aaaatgaggc  tggtgcatga  gaaaactgga  cggcattgct  1080
[0310] c  1081
[0311] <210>  7
[0312] <211>  4034
[0313] <212>  DNA
[0314] <213>  VEGF同源重组载体序列
[0315] <400>  7
[0316] tttatttggt  gagatgattg  atgctctccg  tctagtaaac  agagtgttag  tcgctcaggc  60
[0317] gtgtctgact  cttatgaccc  catggattgt  agcccaccag  gctccactga  ccatggaatt  120
[0318] ctccaggcaa  gaatactgga  gtgggttgcc  atttccttct  ccaggggatc  ttcccaaccc  180
[0319] agggattgaa  tccaggtctc  ctgcattgca  ggcagattct  ttaccatctg  agccaccacg  240
[0320] gaaacccaaa  gcagagaagc  tagcagcaaa  ctaatataaa  aagttcactg  tttgacaaaa  300
[0321] aaaaggactt  cagttaaatg  tagaaatcta  tgtatcaatt  tttaaaacct  acttaagtat  360
[0322] ataaaatggt  ttgcattcat  gatggactgc  taaggacatt  ctaggacttt  ataaaacacc  420
[0323] ttttctttat  ttacagagtc  aagcaaaatg  gattatcaaa  catcaactcc  cctctatgac  480
[0324] attgattatg  ggatgtcaga  gccatgccaa  aaaatcaacg  tgaggcaaat  tgcaggccag  540
[0325] ctcttgcccc  cactctactc  gctggtgttc  atctttggtt  ttgtgggcaa  cttgctggtt  600
[0326] gtcctcatcc  tgataaactg  caaaaagctg  aagagcatga  ctgacatcta  tctgctcaac  660
[0327] ttggccatct  ctgacctact  tttcatcatc  actatcccat  tctgggctca  ctacgctgca  720
[0328] gaccagtggg  tatttggaaa  tacaatgtgc  cagttattca  cagggttcta  tttcattggt  780
[0329] tattttggtg  gaatcttctt  catcatcctc  ttgacaatcg  ataggtacct  ggctatcgtt  840
[0330] catgctgtgt  ttgctttaaa  agccagaaca  gtcacctttg  gggcagtgac  aagtggggtc  900
[0331] acgtgggtgg  tggctatgtt  tgcctctctc  ccaggaatta  tctttaccaa  atcccaaaag  960
[0332] gaaggctctc  gtcatacgtg  cagcccacat  ttcccatcca  atcagtatca  tttctggaag  1020
[0333] agtttccaaa  ctttaaagat  agtcatcttg  gggctggtgg  gatcctctag  agattaatct  1080
[0334] gcagttcatg  gggtcactaa  gagtcgggca  tggctgagcg  acttcacttt  catgtatcac  1140
[0335] tttcatgcat  tggagaagga  aatggcaacg  cactccagtg  ttcttgcctg  gagaatccca  1200

28
CN 108570479 B 序　列　表 9/11 页

[0336] gggctggggg  agcctggtgc  actgccatct  ctggggtcgc  acagagtcgg  acatgactga  1260

[0337] agagacttag  cagcagcagt  agcagcatgt  tgataaggga  cttggtttag  cacattaata  1320
[0338] aacataaata  tgttagtata  ttggatattt  tcttagaata  taaatctaac  actaatgaac  1380
[0339] agactagttt  gtataactgt  atattcaatt  tagaaaaaca  agtggagaaa  tcagatttca  1440
[0340] agaaataact  cctttttgca  gtccttcaat  agaaattgag  cataaatgtg  aattagtcat  1500
[0341] tggcatagac  agaaaaatat  aatgcatttt  gctcagactt  ggtttactgg  aaactttaac  1560
[0342] tggttggatt  atgatcaaca  tcatgggaat  aaaagataca  ttgtagtttc  aatataggaa  1620
[0343] agaaactgaa  tcactgaaga  agataatttg  gatcaagaag  ataagaatct  ttgagtaaaa  1680
[0344] aggagttgtt  agtcttaaga  aaaaaatttt  aacgtttggt  gaaacaaact  gaggtcaaga  1740
[0345] gcaaataaga  ttaagaccaa  caaatatatt  tctcactata  ctgaaggtgc  taggtggtta  1800
[0346] aaataaaatg  tgtgatctgg  gacaggactg  tgtaggtgtg  agtctgcatc  tcctctcatt  1860
[0347] caattcctta  actggataag  aggaatctaa  actgagatgt  caacacagca  agcctgctga  1920
[0348] atttctctga  ggtttcatct  ttggttgtga  acaacaagct  aattagtcca  gtcataaagt  1980
[0349] tagccaatgg  catgaaggtg  tggtgggtca  cacccacact  gagagcatat  aaaaggccct  2040
[0350] ctgcagggag  aaatgtccac  actcaagtga  cacttctact  ctaattctct  acccgagaac  2100
[0351] aacctcaaca  agcaacacct  cctagagcaa  tcgtcgacat  gaactttctg  ctctcttggg  2160
[0352] tgcattggag  ccttgccttg  ctgctctacc  ttcaccatgc  caagtggtcc  caggctgcac  2220
[0353] ccatggcaga  aggagggcag  aaaccccatg  aagtgatgaa  gttcatggat  gtctaccagc  2280
[0354] gcagcttctg  ccgtcccatt  gagaccctgg  tggacatctt  ccaggagtac  ccagatgaga  2340
[0355] ttgagttcat  tttcaagccg  tcctgtgtgc  ccctgatgcg  gtgcgggggc  tgctgtaatg  2400
[0356] acgaaagtct  ggagtgtgtg  cccactgagg  agtccaacat  caccatgcag  attatgcgga  2460
[0357] tcaaacctca  ccaaagccag  cacataggag  agatgagttt  cctacagcat  aacaaatgtg  2520
[0358] aatgcagacc  aaagaaagat  aaagcaaggc  aagaaaatcc  ctgtgggcct  tgctcagagc  2580
[0359] ggagaaagca  tttgtttgta  caagatccgc  agacgtgtaa  atgttcctgc  aaaaacacag  2640
[0360] actcgcgttg  caaggcgagg  cagcttgagt  taaacgaacg  tacttgcaga  tgtgacaagc  2700
[0361] cgaggcggtg  agcatgcaag  cttctgtgcc  ttctagttgc  cagccatctg  ttgtttgccc  2760
[0362] ctcccccgtg  ccttccttga  ccctggaagg  tgccactccc  actgtccttt  cctaataaaa  2820
[0363] tgaggaaatt  gcatcgcatt  gtctgagtag  gtgtcattct  attctggggg  gtggggtggg  2880
[0364] gcaggacagc  aagggggagg  attgggaaga  caatagcagg  catgctgggg  atgcggtggg  2940
[0365] ctctatgggt  accagcacaa  ggctgtgagg  ctcatcttcg  tgatcatgat  tgtctacttt  3000
[0366] ctcttctggg  ctccctacaa  catcgtcctc  ctcctgagca  ccttccagga  attcttcggc  3060
[0367] ttgaataact  gcagtgactc  taacaggctg  gaccaagcca  tgcaggtgac  agagaccctg  3120
[0368] gggatgacgc  actgctgcat  caaccccatc  atctatgcct  tcgtggggga  gaagttccga  3180
[0369] aactatctcc  tacggttctt  ccgaaagtac  atcgccagcc  gcttctgcaa  aggctgtcca  3240
[0370] gtcttccagg  gagaggctcc  agagcgagtg  agctccgttt  acacacgatc  cacgggagaa  3300
[0371] caggaagtct  ctgttggctt  gtgatctgac  tcagctcata  tatgcaaact  gtgggggagc  3360
[0372] agttcaagag  gaaattactg  tcaacaaggg  tttaagattc  atccatcaat  ttggcatcag  3420
[0373] ctctaaatat  attagatatt  tcaagcccat  caattctaga  aagccaaagc  aaaacacgct  3480
[0374] gatgaaatag  caatcttctc  accgcccccc  tccacataca  acaatttatt  ggcaagctct  3540
[0375] cccctcacta  caaaaggttc  aatgtttaaa  aaaaaaaatc  ctcagagaat  tattaattcc  3600
[0376] tgagtttggt  tacctgaaca  ggaataacaa  aatgaactga  ggaaagtatt  gtatagtttc  3660
[0377] ttatctgggt  agggcaatag  ccaggttgca  aatgtgatta  aaataggtcc  ttctcttgcc  3720

29
CN 108570479 B 序　列　表 10/11 页

[0378] atggggagaa  aagacatgcc  ggtgatcaga  taaggaatga  catcttccat  gtgggatctc  3780

[0379] tcccaaaagg  tacgttaata  agttccacag  acactgatgc  caaggaagag  ccctgtggtc  3840
[0380] tgctgagagc  tgggaaggct  tcttcgcaga  aaaggtactg  gaggccaatg  gtctgtcagc  3900
[0381] ggagaaggaa  gctgagctcc  aggatgcagg  cactgcacag  gcaaaacttg  gctgtgggga  3960
[0382] gacaggcact  ggctggggga  gctcctggga  ggaaaaatga  ggctggtgca  tgagaaaact  4020
[0383] ggacggcatt  gctc  4034
[0384] <210>  8
[0385] <211>  1426
[0386] <212>  DNA
[0387] <213>  上游检测测序结果
[0388] <400>  8
[0389] agcaagcccc  taatgatgct  atgtgtaagc  taactccagg  gaatgacagc  ttaagaacag  60
[0390] acacggttgg  acagttcctg  acccagtttc  tggacatcgt  tatcacagct  tcattcactg  120
[0391] cacgtggcta  cacaacatcc  aattttattt  ggtgagatga  ttgatgctct  ccgtctagta  180
[0392] aacagagtgt  tagtcgctca  ggcgtgtctg  actcttatga  ccccatggat  tgtagcccac  240
[0393] caggctccac  tgaccatgga  attctccagg  caagaatact  ggagtgggtt  gccatttcct  300
[0394] tctccagggg  atcttcccaa  cccagggatt  gaatccaggt  ctcctgcatt  gcaggcagat  360
[0395] tctttaccat  ctgagccacc  acggaaaccc  aaagcagaga  agctagcagc  aaactaatat  420
[0396] aaaaagttca  ctgtttgaca  aaaaaaagga  cttcagttaa  atgtagaaat  ctatgtatca  480
[0397] atttttaaaa  cctacttaag  tatataaaat  ggtttgcatt  catgatggac  tgctaaggac  540
[0398] attctaggac  tttataaaac  accttttctt  tatttacaga  gtcaagcaaa  atggattatc  600
[0399] aaacatcaac  tcccctctat  gacattgatt  atgggatgtc  agagccatgc  caaaaaatca  660
[0400] acgtgaggca  aattgcaggc  cagctcttgc  ccccactcta  ctcgctggtg  ttcatctttg  720
[0401] gttttgtggg  caacttgctg  gttgtcctca  tcctgataaa  ctgcaaaaag  ctgaagagca  780
[0402] tgactgacat  ctatctgctc  aacttggcca  tctctgacct  acttttcatc  atcactatcc  840
[0403] cattctgggc  tcactacgct  gcagaccagt  gggtatttgg  aaatacaatg  tgccagttat  900
[0404] tcacagggtt  ctatttcatt  ggttattttg  gtggaatctt  cttcatcatc  ctcttgacaa  960
[0405] tcgataggta  cctggctatc  gttcatgctg  tgtttgcttt  aaaagccaga  acagtcacct  1020
[0406] ttggggcagt  gacaagtggg  gtcacgtggg  tggtggctat  gtttgcctct  ctcccaggaa  1080
[0407] ttatctttac  caaatcccaa  aaggaaggct  ctcgtcatac  gtgcagccca  catttcccat  1140
[0408] ccaatcagta  tcatttctgg  aagagtttcc  aaactttaaa  gatagtcatc  ttggggctgg  1200
[0409] tgggatcctc  tagagattaa  tctgcagttc  atggggtcac  taagagtcgg  gcatggctga  1260
[0410] gcgacttcac  tttcatgtat  cactttcatg  cattggagaa  ggaaatggca  acgcactcca  1320
[0411] gtgttcttgc  ctggagaatc  ccagggctgg  gggagcctgg  tgcactgcca  tctctggggt  1380
[0412] cgcacagagt  cggacatgac  tgaagagact  tagcagcagc  agtagc  1426
[0413] <210>  9
[0414] <211>  497
[0415] <212>  DNA
[0416] <213>  SRY基因序列
[0417] <400>  9
[0418] cggtggtaca  gcaacaaaat  actttcgcct  ttgggaaaac  ctcttccttg  tgcacagaca  60
[0419] atcatagtgc  aaatgatcag  tgtgaaaggg  gcgaaaatgt  tacggagagc  agccaggacc  120

30
CN 108570479 B 序　列　表 11/11 页

[0420] acgtcaagcg  acccatgaac  gccttcattg  tgtggtctcg  tgaacgaaga  cgaaaggtgg  180

[0421] ctctagagaa  tcccaaattg  caaaactcag  agatcagcaa  gcagctggga  tacgagtgga  240
[0422] aaaggcttac  agatgctgaa  aagcgcccat  tctttgagga  ggcacagaga  ctactagcta  300
[0423] tacaccgaga  caaatacccg  ggctataaat  atcgacctcg  tcggaaagcc  aagaggccac  360
[0424] agaaatcgct  tgatgcagac  tctccaatac  tatgcaacca  gatggatgta  gagacattgc  420
[0425] accccttcac  atacagggac  gattgtgcca  agaccacaca  ctcacaaatg  gaaagccaat  480
[0426] tatgccgctc  acagtcc  497

31
CN 108570479 B 说　明　书　附　图 1/11 页

图1

图2A

图2B

32
CN 108570479 B 说　明　书　附　图 2/11 页

图3

图4

33
CN 108570479 B 说　明　书　附　图 3/11 页

图5

图6

图7

34
CN 108570479 B 说　明　书　附　图 4/11 页

图8

图9

图10

35
CN 108570479 B 说　明　书　附　图 5/11 页

图11

图12

图13

36
CN 108570479 B 说　明　书　附　图 6/11 页

图14

图15

37
CN 108570479 B 说　明　书　附　图 7/11 页

图16

图17

38
CN 108570479 B 说　明　书　附　图 8/11 页

图18

39
CN 108570479 B 说　明　书　附　图 9/11 页

40
CN 108570479 B 说　明　书　附　图 10/11 页

图21

41
CN 108570479 B 说　明　书　附　图 11/11 页

图23

42