(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 112142854 A
(43)申请公布日 2020.12.29
(21)申请号 202010984891 .4 A61P 35/00 (2006 .01)
(22)申请日 2020 .09 .18 A61P 35/02 (2006 .01)
A61P 37/02 (2006 .01)
(71)申请人 南京凯地生物科技有限公司 A61P 31/12 (2006 .01)
地址 211100 江苏省南京市江宁区淳化街 A61P 31/04 (2006 .01)
道芝兰路18号5号楼402室 C12R 1/93 (2006 .01)
(72)发明人 代红久　徐慧　李晓宇　朱靓婧　

(74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限
公司 32200
代理人 唐循文

(51)Int .Cl .
C07K 19/00 (2006 .01)
C12N 5/10 (2006 .01)
C12N 15/867 (2006 .01)
C12N 7/01 (2006 .01)
A61K 39/00 (2006 .01) 权利要求书2页 说明书16页
序列表18页 附图9页

(54)发明名称
免疫调节特异性嵌合抗原受体细胞及制备
方法和应用
(57)摘要
本发明涉及一种免疫调节特异性嵌合抗原
受体细胞及制备方法和应用。本发明通过免疫检
查 点 调 节（P D 1 或 T I G I T）联 合 特 异 性 靶向 人
NKG2DL的嵌合抗原受体的重组载体， 并用其修饰
免疫应答细胞的方法； 获得的新型功能化免疫应
答细胞能有效地靶向攻击多种肿瘤， 及制备的用
于治疗恶性肿瘤的制剂。本发明的免疫检查点调
节（PD1或TIGIT）联合特异性靶向人NKG2DL的嵌
合抗原受体修饰的工程免疫细胞， 遏制抑制因子
诱导免疫细胞的失活， 并阻止肿瘤细胞的免疫逃
逸， 能够明显提高抗肿瘤活性。
CN 112142854 A
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1 .人免疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗原受体， 其特征在于：
所述的嵌合抗原受体包括：
靶向人NKG2DL蛋白的胞外识别结构域氨基酸序列： SEQ  ID  No .2、SEQ  ID  No .3、SEQ  ID 
No .4、SEQ  ID  No .5、SEQ  ID  No .6或SEQ  ID  No .7所示的靶向结合人NKG2DL蛋白的人NKG2D
的氨基酸序列； 或与上述氨基酸序列具有80~99％同源性的经过氨基酸修饰产生的变体；
免疫检查点调节PD1的氨基酸序列为： SEQ  ID  No .16、SEQ  ID  No .17或SEQ  ID  No .18所
示的结合PD-L1分子的免疫检查点PD1氨基酸序列； 或与上述氨基酸序列具有80~99％同源
性的经过氨基酸修饰产生的变体；
或免疫检查点调节TIGIT的氨基酸序列为 ：SEQ  ID  No .19、SEQ  ID  No .20或SEQ  ID 
No .21所示的结合CD155分子的免疫检查点TIGIT氨基酸序列； 或与上述氨基酸序列具有80~
99％同源性的经过氨基酸修饰产生的变体。
2 .根据权利要求1所述的嵌合抗原受体， 其特征在于： 所述的嵌合抗原受体的氨基酸序
列为：
从氨基端到羧基端顺次连接的引导序列的氨基酸序列、 靶向结合人NKG2DL蛋白的胞外
识别结构域氨基酸序列、 铰链区氨基酸序列、 跨膜结构域氨基酸序列、 胞内信号结构域氨基
酸序列和免疫检查点调节PD1或TIGIT组件的氨基酸序列；
所述跨膜结构域包含CD8跨膜结构区、 或CD28跨膜结构区、 或4-1BB跨膜结构区、 或OX40
跨膜结构区、 或ICOS跨膜结构区；
其中所述胞内信号结构域包括免疫受体酪氨酸活化基序和共刺激信号域；
所述免疫受体酪氨酸活化基序包含CD3ζ链的胞内信号结构域或FcεRIγ胞内信号结
构；
所述共刺激信号域包含CD28胞内信号结构域、 4-1BB胞内信号结构域、 OX40胞内信号结
构域或ICOS胞内信号结构域；
所述共刺激信号域包含CD28和4-1BB胞内信号结构域、或4-1BB和OX40胞内信号结构
域、 或CD28和OX40胞内信号结构域。
3 .根据权利要求2所述的嵌合抗原受体， 其特征在于：
编码权利要求2所述的免疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗原受体的核
酸分子 ，包括从5’到3’依次串联连接的 编码所述 引导序列的核苷酸序列、编码靶向人
NKG2DL的核苷酸序列、编码铰链区的核苷酸序列， 编码所述跨膜结构域的核苷酸序列、编码
所述胞内信号结构域的核苷酸序列、编码所述免疫检查点调节（PD1或TIGIT）组件的核苷酸
序列。
4 .一种免疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗原受体的重组载体， 其特征
在于包含权利要求3中所述的核酸分子。
5 .一种重组病毒， 其特征在于包括权利要求4所述的重组载体和病毒颗粒； 所述病毒包
括慢病毒、 腺病毒、 腺联病毒或逆转录病毒。
6 .一种功能化免疫应答细胞， 其特征在于其是通过采用如权利要求5所述的重组病毒
感染免疫效应细胞获得； 所述免疫效应细胞包括细胞毒性T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞、辅
助性T细胞或巨噬细胞。
7 .一种生物制品， 其特征含有权利要求2所述的氨基酸序列； 或含有权利要求3所述的

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核酸分子； 或含有权利要求4所述的重组载体； 或含有权利要求5所述的重组病毒；或含有权

利要求6所述的免疫细胞。
8 .根据权利要求7所述的生物制品在制备治疗癌症、 自身免疫疾病或抗病毒细菌感染
药物中的应用。
9 .根据权利要求8  所述的应用，
其特征在于所述的癌症为胰腺癌、 胃癌、
肝癌、脑癌、
前
列腺癌、 淋巴癌、
白血病、 肠癌、
肺癌、宫颈癌、
卵巢癌、 膀胱癌、食道癌、
肾癌或乳腺癌。

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免疫调节特异性嵌合抗原受体细胞及制备方法和应用

技术领域
[0001] 本发明属于免疫治疗生物医药技术领域，涉及一种免疫检查点调节联合特异性靶
向人NKG2DL的嵌合抗原受体的氨基酸编码序列、及其修饰的免疫应答细胞，以及它们的制
备方法和在药物制备中的应用。

背景技术
[0002] 随着生物技术的飞速发展， 免疫细胞治疗已成为癌症治疗领域的第四大疗法。
[0003] 癌症免疫疗法主要包括过继性细胞治疗、 免疫调节剂、肿瘤疫苗以及免疫结合点
阻断治疗等。其中， 在细胞治疗领域， CAR-T疗法无疑已成为研究机构和制药公司争相“追
捧”的明星。
[0004] CAR-T(Chimeric  Antigen  Receptor  T-Cell，
嵌合抗原受体修饰的T细胞)为代表
的免疫疗法， 其原理主要是通过基因工程手段对病人自身提取的T细胞进行嵌合抗原受体
的修饰形成CAR-T细胞， 该T细胞能特异性地识别肿瘤表面相关抗原(肿瘤细胞标志物) ， 从
而靶向杀伤肿瘤。
[0005] 近年研究表明， NKG2DL蛋白的表达是细胞处于“应激状态”的一个指标， 其在健康
组织中很少有表达或仅短暂地表达， 而通常在不同来源的各种肿瘤细胞表面有较高水平的
表达。NKG2DL蛋白的受体为NKG2D， 研究显示， NKG2D-NKG2DL系统在机体的抗肿瘤免疫中发
挥着重要作用， NKG2D通过识别肿瘤细胞表面产生的NKG2DL来传递活化信号并激活免疫系
统， 从而对肿瘤细胞发挥杀伤作用。 除此之外， 研究发现自身免疫性疾病患者的血清中含有
可溶性NKG2DL， NKG2D-NKG2DL系统在治疗自身免疫性疾病、 抗炎、 抗衰老等方面起到一定作
用(参见Legroux  L等人， Frontiers  in  Immunology，(2019))。因此， NKG2DL的表达作为机
体发生肿瘤时肿瘤细胞上的一个特异性的改变， 为肿瘤的免疫治疗提供了一个更为精确的
靶点， 为相关新疗法和药物的开发提供了启示。
[0006] 此外， 近年研究发现， 第二第三代CAR能够在很大程度上提高T细胞激活增殖及杀
伤能力， 但是由于肿瘤细胞会过表达免疫抑制相关分子， 如CD155/CD112、PD-L1/PD-L2等，
当与免疫细胞上的免疫抑制分子， 如TIGIT、PD1等结合后会迅速诱导该免疫细胞的失活甚
至凋亡从而使肿瘤细胞产生免疫逃逸免于受到攻击。 已有报道在结肠癌， 胃癌肿瘤模型中，
针对PD1/PD-L1， TIGIT/CD155双特异性抗体的确显示出协同作用， 有良好的的抑瘤效果。 因
此， 针对PD1/TIGIT免疫检查点的CAR-T具有良好的药用开发价值。
[0007] 综上所述， 研发一种免疫检查点调节联合特异性嵌合抗原受体修饰的工程化免疫
应答细胞极具应用前景。该工程细胞通过识别肿瘤细胞表面产生的NKG2DL来传递活化信号
并激活免疫系统， 从而对肿瘤细胞发挥杀伤作用； 同时识别肿瘤细胞上的免疫抑制因子， 遏
制免疫抑制并阻止肿瘤细胞的免疫逃逸， 从而能够明显提高肿瘤细胞的杀伤效率。与此同
时， 该工程化细胞还具有一定的治疗自身免疫性疾病、抗炎、抗衰老等的作用， 最终达到良
好地临床治疗效果。

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发明内容
[0008] 鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题， 本发明的目的是为了克服现有肿瘤临
床技术中面临的肿瘤内环境中效应细胞杀死肿瘤细胞的特异性不强和杀伤效率不高的问
题， 提供免疫检查点调节分子联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗原受体、及其重组表达载
体、 工程化的免疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞
及其应用。该设计保留了免疫检查点调节的识别作用， 而又使其免疫检查点调节的免疫抑
制信号通路缺失， 从而捕获其结合分子， 阻断原有的免疫抑制通路。本发明的肿瘤免疫检查
点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞可避免抑制因子诱
导免疫细胞的失活并阻止肿瘤细胞的免疫逃逸， 能够明显提高工程化免疫细胞对肿瘤细胞
的杀伤效率， 从而提供了一种具有应用前景的肿瘤治疗的新手段。与此同时， 该工程化细胞
还具有一定的治疗自身免疫性疾病、 抗炎、 抗衰老等的作用。
[0009] 技术方案
[0010] 一种免疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，
其特征在于所述的免疫细胞含有嵌合抗原受体， 所述的嵌合抗原受体的氨基酸序列为：
[0011] 从氨基端到羧基端顺次连接的引导序列的氨基酸序列、 靶向结合人NKG2DL的胞外
识别结构域氨基酸序列、 铰链区氨基酸序列、 跨膜结构域氨基酸序列、 胞内信号结构域氨基
酸序列和免疫检查点(PD1或TIGIT)调节组件的氨基酸序列；
[0012] 其中靶向结合人NKG2DL的胞外识别结构域氨基酸序列为： SEQ  ID  No .2、SEQ  ID 
No .3、SEQ  ID  No .4、
SEQ  ID  No .5、SEQ  ID  No .6或SEQ  ID  No .7所示的靶向结合人NKG2DL蛋
白的人NKG2D的氨基酸序列； 或与所示SEQ  ID  No .2、SEQ  ID  No .3、SEQ  ID  No .4、SEQ  ID 
No .5、SEQ  ID  No .6或SEQ  ID  No .7氨基酸序列具有80～99％同源性的经过氨基酸修饰产生
的变体。
[0013] 所述免疫检查点PD1的氨基酸序列为： SEQ  ID  No .16、SEQ  ID  No .17或SEQ  ID 
No .18所示的结合PD-L1分子的免疫检查点PD1氨基酸序列； 或与所示SEQ  ID  No .16、 SEQ  ID 
No .17或SEQ  ID  No .18氨基酸序列具有80～99％同源性的经过氨基酸修饰产生的变体。
[0014] 所述免疫检查点TIGIT的氨基酸序列为： SEQ  ID  No .19、SEQ  ID  No .20或SEQ  ID 
No .21所示的结合CD155分子的免疫检查点TIGIT氨基酸序列； 或与所示SEQ  ID  No .19、SEQ 
ID  No .20或SEQ  ID  No .21氨基酸序列具有80～99％同源性的经过氨基酸修饰产生的变体。
[0015] 其中所述胞内信号结构域包括免疫受体酪氨酸活化基序和共刺激信号域；
[0016] 所述的免疫细胞， 其特征在于：
[0017] 编码所述的免疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗原受体的核酸分
子， 包括从5’到3’依次串联连接的编码所述引导序列的核苷酸序列、编码所述靶向结合人
NKG2DL的人NKG2D蛋白受体核苷酸序列、编码铰链区的核苷酸序列， 编码所述跨膜结构域的
核苷酸序列、编码所述胞内信号结构域的核苷酸序列、编码所述免疫检查点(PD1或TIGIT)
调节的核苷酸序列；
[0018] 一种免疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗原受体的重组载体或表
达质粒， 其特征在于包含所述的核酸分子。
[0019] 所述重组载体或表达质粒， 其特征在于重组载体或表达质粒含有启动子， 其中所
述启动子包括EF1α长启动子， 或EFS短启动子。

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[0020] 一种重组病毒， 其特征在于包括所述的重组载体的核苷酸序列和病毒颗粒； 所述

病毒包括慢病毒、 腺病毒、 腺联病毒或逆转录病毒。
[0021] 所述的免疫细胞在制备抗胰腺癌、 胃癌、 肝癌、 脑癌、 前列腺癌、 淋巴癌、 白血病、肠
癌、 肺癌、 宫颈癌、 卵巢癌、 膀胱癌、 食道癌、 肾癌或乳腺癌药物中的应用。
[0022] 具体说明
[0023] 第一方面， 本申请提供了一种免疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗
原受体， 所述靶向结合人NKG2DL的人NKG2D蛋白受体或其功能性变体(类似物)， 其包含选自
下组的序列：
[0024] SEQ  ID  No .2、 SEQ  ID  No .3、SEQ  ID  No .4、SEQ  ID  No .5、SEQ  ID  No .6或SEQ  ID 
No .7所示的氨基酸序列， 或在一处或多处氨基酸修饰产生的功能性变体； 其中所述经过氨
基酸修饰的功能性变体为与SEQ  ID  No .2、SEQ  ID  No .3、SEQ  ID  No .4、SEQ  ID  No .5、SEQ 
ID  No .6或SEQ  ID  No .7所示氨基酸序列具有80～99％同源性的多肽。
[0025] 所述免疫检查点PD1的氨基酸序列为： SEQ  ID  No .16、SEQ  ID  No .17或SEQ  ID 
No .18所示的结合PD-L1分子的免疫检查点PD1氨基酸序列； 或与所示SEQ  ID  No .16、 SEQ  ID 
No .17或SEQ  ID  No .18氨基酸序列具有80～99％同源性的经过氨基酸修饰产生的变体。
[0026] 所述免疫检查点TIGIT的氨基酸序列为： SEQ  ID  No .19、SEQ  ID  No .20或SEQ  ID 
No .21所示的结合CD155分子的免疫检查点TIGIT氨基酸序列； 或与所示SEQ  ID  No .19、SEQ 
ID  No .20或SEQ  ID  No .21氨基酸序列具有80～99％同源性的经过氨基酸修饰产生的变体。
[0027] 发明人经过创造性劳动， 不断地进行氨基酸序列设计以及序列的排列组合和筛
选， 对百余条CAR分子的序列进行随机筛选试验和靶向性功能验证(例如构建病毒载体， 以
及进一步感染T细胞， 获得修饰的T细胞， 并检测所得修饰的T细胞的体外活性等试验) ， 之后
根据多个随机组合的结果比对， 再进行序列调整， 最终筛选出效果最好的序列， 获得了本发
明的高效价靶向结合人NKG2DL的人NKG2D蛋白受体氨基酸序列及其功能性变体。
[0028] 发明人经过创造性劳动， 不断地进行氨基酸序列设计以及序列的排列组合和筛
选， 利用软件分析其生物学特性， 挑选出稳定性好， 结合力高的高效价PD1或TIGIT的氨基酸
序列及其功能性变体。
[0029] 第二方面， 本申请提供了一种免疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗
原受体， 其包含从氨基端到羧基端顺次连接的引导序列的氨基酸序列、靶向结合人NKG2DL
的人NKG2D蛋白受体氨基酸序列、铰链区的氨基酸序列， 所述跨膜结构域的氨基酸序列、 所
述胞内信号结构域的氨基酸序列、 所述免疫检查点调节(PD1或TIGIT)的氨基酸序列。所述
靶向结合人NKG2DL的胞外识别结构域的氨基酸序列包含本申请第一方面所述的靶向结合
人NKG2DL的人NKG2D蛋白受体或其功能性变体。
[0030] 胞外识别结构域(还称作胞外域或简单地由其含有的识别元件组成)包含特异性
结合靶细胞的细胞表面上存在的分子的识别元件。
[0031] 在一些非限制性实例中， 前导序列共价连接到细胞外抗原结合结构域的5’末端。
[0032] 在一些实施方式中， 所述免疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗原受
体包括铰链区。
[0033] 在一些实施方式中， 所述跨膜结构域包括跨膜区。
[0034] 在一些实施方式中， 所述铰链区的人CD8多肽的氨基酸序列选自SEQ  ID  No .8所示

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的多肽或经过氨基酸修饰的功能性变体， 其中所述经过氨基酸修饰的功能性变体为与SEQ 
ID  No .8所示氨基酸序列具有90～99％同源性的多肽。
[0035] 在一些实施例中， 所述跨膜区的人CD8的氨基酸序列选自SEQ  ID  No .9所示的多肽
或经过氨基酸修饰的功能性变体 ，其中所述经过氨基酸修饰的功能性变体为与SEQ  ID 
No .9所示氨基酸序列具有90～99％同源性的多肽。
[0036] 在一些实施例中， 所述跨膜区的人CD28的氨基酸序列选自SEQ  ID  No .10所示的多
肽或经过氨基酸修饰的功能性变体， 其中所述经过氨基酸修饰的功能性变体为与SEQ  ID 
No .10所示氨基酸序列具有90～99％同源性的多肽。
[0037] 在一些实施方式中， 所述人4-1BB胞内结构域选自： 具有如SEQ  ID  No .11所示氨基
酸序列的多肽； 或经过氨基酸修饰的功能性变体， 其中所述经过氨基酸修饰的功能性变体
为与SEQ  ID  No .11所示氨基酸序列具有90～99％同源性的多肽。
[0038] 在一些实施方式中， 所述人CD28胞内结构域选自： 具有如SEQ  ID  No .12所示氨基
酸序列的多肽； 或经过氨基酸修饰的功能性变体， 其中所述经过氨基酸修饰的功能性变体
为与SEQ  ID  No .12所示氨基酸序列具有90～99％同源性的多肽。
[0039] 在一些实施方式中， 所述人OX40胞内结构域选自： 具有如SEQ  ID  No .13所示氨基
酸序列的多肽； 或经过氨基酸修饰的功能性变体， 其中所述经过氨基酸修饰的功能性变体
为与SEQ  ID  No .13所示氨基酸序列具有90～99％同源性的多肽。
[0040] 在一些实施方式中， 所述CD3ζ胞内结构域选自： 具有如SEQ  ID  No .14所示氨基酸
序列的多肽； 或经过氨基酸修饰的功能性变体。其中所述经过氨基酸修饰的功能性变体为
与SEQ  ID  No .14所示氨基酸序列具有90～99％同源性的多肽。
[0041] 在一些实施方式中， 所述免疫检查点(PD1或TIGIT)调节组件的氨基酸序列包括：
如SEQ  ID  No .15所示的Furin-2A的核苷酸序列， 所述免疫检查点调节(PD1或TIGIT)的氨基
酸序列包含本申请第一方面所述的人免疫检查点调节(PD1或TIGIT)的蛋白或其功能性变
体。
[0042] 在一些非限制性实施方式中， 所述胞内信号结构域包括免疫受体酪氨酸活化基序
和共刺激信号域；
[0043] 在一些非限制性实施方式中， 免疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗
原受体是重组表达或由载体表达。
[0044] 在某些非限 制性的实施方式中 ， 本申请的免疫检查点调节联合特异性靶向人
NKG2DL的嵌合抗原受体的细胞内结构域还包含至少一个共刺激信号传导区， 其包含至少一
个可提供最佳淋巴细胞活化的共刺激配体分子。
[0045] 在某些非限制性实施方式中， 免疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗
原受体还可包含将抗原结合结构域连接至跨膜结构域的间隔区(spacer)。 间隔区可以是足
够柔性的， 以允许抗原结合结构域在不同方向上定向， 以利于抗原识别。 间隔区可以是来自
IgG1的铰链区、 或免疫球蛋白的CH2CH3区和CD3的部分。
[0046] 在某些非限制性实施方式中， 免疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗
原受体的细胞内结构域可包含可激活或刺激细胞(例如， 淋巴谱系的T细胞)的人CD3ζ多肽。
[0047] 在某些非限制性的实施方式中， 免疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合
抗原受体(CAR)的细胞内结构域还包含至少一个共刺激信号传导区， 其包含至少一个可提

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供最佳淋巴细胞活化的共刺激分子。本文使用的“共刺激分子”是指淋巴细胞对抗原的有效
应答所需的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。至少一个共刺激信号传导区可包含
CD28多肽、 4-1BB多肽、 OX40多肽、 ICOS多肽(不基于与免疫应答相关的蛋白质)， 或其组合。
[0048] 在一些实施方式中， CAR的细胞内结构域的共刺激信号传导区包含两种共刺激分
子： CD28和4-1BB、4-1BB和OX40或CD28和OX40。
[0049] 第三方面， 本申请提供了一种编码第二方面所述的免疫检查点调节联合特异性靶
向人NKG2DL的嵌合抗原受体的核酸分子， 所述核酸分子包含从5’到3’依次串联连接的编码
引导序列的核苷酸序列、编码人NKG2D的核苷酸序列、编码跨膜结构域的核苷酸序列、编码
胞内信号结构域的核苷酸序列、 免疫检查点调节(PD1或TIGIT)的核苷酸序列。
[0050] 在一些实施方式中， 所述核酸分子还包含编码铰链区的核苷酸序列。在一些实施
方式中， 所述胞内信号结构域包括免疫受体酪氨酸活化基序和共刺激信号域；
[0051] 编码靶向结合人NKG2DL的细胞外识别结构域的多核苷酸可以通过密码子优化进
行修饰。密码子优化可以改变天然存在的和重组的基因序列， 以在任何给定的表达系统中
实现最高可能水平的生产力。
[0052] 第四方面， 本申请提供了一种包含本申请第二方面的嵌合抗原受体或本申请第三
方面的核酸的重组载体或表达质粒。
[0053] 免疫应答细胞(例如， T细胞、CTL细胞、NK细胞)的基因修饰可以通过用重组DNA或
RNA构建体转导基本上同源的细胞组合物来实现。在一个实施方案中， 载体是逆转录病毒载
体(例如， γ逆转录病毒或慢病毒)， 其可将DNA或RNA构建体导入宿主细胞基因组。例如免疫
检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗原受体的多核苷酸可以克隆到逆转录病毒
载体中， 并且可以从其内源启动子、逆转录病毒长末端重复序列或从替代的内部启动子驱
动表达。
[0054] 也可使用非病毒载体或RNA。 可以使用随机染色体整合或靶向整合(例如使用核酸
酶、 转录激活子样效应物核酸酶(TALEN)、 锌指核酸酶(ZFN)和/或规律成簇间隔短回文重复
(CRISPR)或转基因表达(例如使用天然或化学修饰的RNA))。
[0055] 在一些实施方式中， 所述载体选自γ-逆转录病毒载体、 慢病毒载体、腺病毒载体、
腺联病毒载体。
[0056] 在一示例性实施方式中， 所述载体是γ-逆转录病毒载体。
[0057] 第五方面， 本申请提供了一种重组病毒， 其是能够表达本发明第二方面所述的免
疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗原受体、且能够侵染免疫应答细胞的病
毒。
[0058] 在一些实施方式中， 所述免疫应答细胞为细胞毒性T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞、
辅助性T细胞或巨噬细胞。
[0059] 在示例性实施方式中， 所述免疫应答细胞为细胞毒性T淋巴细胞。
[0060] 在一些实施方式中， 所述病毒为慢病毒、 腺病毒、 腺联病毒或逆转录病毒等。
[0061] 在一示例性实施方式中， 所述病毒为慢病毒。
[0062] 在一示例性实施方式中， 所述病毒为逆转录病毒。
[0063] 第六方面， 本申请提供了一种分离的修饰的免疫应答细胞， 其包含本申请第二方
面所述的嵌合抗原受体， 其由本申请第三方面所述的重组载体或表达质粒转化所得。

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[0064] 对于细胞的 初始基因修饰以 提供所述的 免 疫检查点 调节联合特异性靶向 人

NKG2DL的嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞， 通常使用逆转录病毒载体进行转导， 然而可
以使用任何其它合适的病毒载体或非病毒递送系统。对于细胞的后续基因修饰以提供包含
含有至少两种共刺激配体的抗原递呈复合物的细胞， 逆转录病毒基因转移(转导)同样证明
是有效的。逆转录病毒载体和合适的组装线的联合也是合适的， 其中衣壳蛋白对于感染人
细胞是有功能的。
[0065] 在一些实施方式中， 所述免疫应答细胞还包含至少一种外源的共刺激配体。
[0066] 可能的转导方法还包括将细胞与生产细胞的直接共培养。 转导病毒载体可用于在
免疫应答细胞中表达共刺激配体(例如4-1BBL和IL-12)。优选地， 选择的载体表现出高的感
染效率和稳定的整合和表达。
[0067] 在一些实施方式中， 优选地， 所述至少一种共刺激配体选自4-1BBL、CD80、CD86、
CD70、 OX40L、
CD48、
TNFRSF14及其组合， 或更优选地，所述共刺激配体是4-1BBL。
[0068] 在一些实施方式中， 所述免疫应答细胞选自T细胞、 自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T
淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、 巨噬细胞、 人胚胎干细胞和可分化成淋巴样细胞的多能干细
胞， 优选T细胞和自然杀伤(NK)细胞， 更优选为T细胞。
[0069] 可以利用用于CAR表达的载体转导从患者分离的多个T细胞亚群。
[0070] 在一示例性实施例中， 其中所述修饰的免疫应答细胞为CAR-T细胞。
[0071] 可以利用所述的免疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗原受体制备
遗传修饰的中央记忆T细胞， 然后冷藏保存。
[0072] 第七方面本申请提供了本申请的第六方面的分离的嵌合抗原受体修饰的免疫应
答细胞的制备方法， 包括以下步骤：
[0073] 首先， 将第三方面所述的核酸分子， 通过分子克隆的方式连接到表达载体中， 获得
所述的免疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗原受体的表达载体；
[0074] 然后， 将获得的所述的免疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗原受体
表达载体转染293T细胞， 获得病毒液；
[0075] 最后用所述病毒液感染免疫应答细胞， 从感染后的细胞中获得表达所述的免疫检
查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞。
[0076] 在一些非限制性实施方式中 ， 本发明修饰的免疫应答细胞可以是淋巴谱系的细
胞。所述淋巴谱系的细胞选自B、T和自然杀伤(NK)细胞， 提供抗体的产生、细胞免疫系统的
调节、 血液中外来物质的检测、 对宿主外源细胞的检测等功能。淋巴谱系的细胞的非限制性
实例包括T细胞、 自然杀伤(NK)细胞、 细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、
巨噬细胞、 胚
胎干细胞和多能干细胞(例如， 可分化成淋巴样细胞的多能干细胞)。
[0077] 在一些实施方式中， 所述免疫应答细胞选自T细胞、 自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T
淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、 巨噬细胞、 人胚胎干细胞和可分化成淋巴样细胞的多能干细
胞， 优选T细胞或自然杀伤(NK)细胞。
[0078] 在一些实例性实施方式中， T细胞是在胸腺中成熟的淋巴细胞， 并且主要负责细胞
介导的免疫。T细胞参与获得性免疫系统。
[0079] 在一些非限制性实施方式中， T细胞包括但不限于T辅助细胞、细胞毒性T细胞、记
忆T细胞(包括中心记忆T细胞、干细胞样记忆T细胞(或干样记忆T细胞)和两种类型的效应

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记忆T细胞(例如， TEM细胞和TEMRA细胞)、调节性T细胞(也称为抑制性T细胞)、 自然杀伤T细

胞、粘膜相关恒定T细胞、和γδT细胞。在一些实施方式中， 表达CAR的T细胞表达Foxp3以实
现和维持T调节表型。
[0080] 在一些实施方式中， 至少一种共刺激配体选自4-1BBL、 CD80、
CD86、CD70、
OX40L，
及
其组合。在一个实施方式中， 共刺激性配体是4-1BBL。
[0081] 在一优选实施例中， 所述分离的修饰的免疫应答细胞为T细胞。
[0082] 在一优选实施例中， 所述分离的修饰的免疫应答细胞为自然杀伤(NK)细胞。
[0083] 在一些非限制性实施方式中， 所述分离的修饰的免疫应答细胞(例如T细胞)可以
是自体的、 非自体的(例如同种异体的)、 或在体外衍生自工程化的祖细胞或干细胞。
[0084] 第八方面， 本申请提供了一种药物组合物， 其包含有效量的如本发明第六方面所
述分离的修饰的免疫应答细胞和药学上可接受的赋形剂。
[0085] 本发申请公开的药物组合物， 其包含表达所述的免疫检查点调节联合特异性靶向
人NKG2DL的嵌合抗原受体的分离的修饰的免疫应答细胞和药学上可接受的载体。
[0086] 所述药物组合物的施用可以是自体的或非自体的。 例如， 表达所述的免疫检查点
调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗原受体的免疫应答细胞和包含它的组合物可以从
一个受试者获得， 并施用于相同受试者或不同的相容受试者。可以通过包括导管给药、 静脉
内注射或胃肠外给药来施用本发明公开主题的外周血来源的T细胞或其子代(例如， 体内、
离体或体外衍生的)。当施用本发明公开主题的药物组合物(例如包含所述的免疫检查点调
节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗原受体的免疫应答细胞的药物组合物)时， 通常将其
配制成单位剂量可注射形式(溶液、 悬浊液、 乳浊液)。
[0087] 本申请的组合物可以是制剂。 本申请公开的表达所述的免疫检查点调节联合特异
性靶向人NKG2DL的嵌合抗原受体(CAR)的免疫应答细胞和包含其的组合物可以方便地作为
无菌液体制剂提供， 例如等渗水溶液、 悬浊液、乳浊液、 分散液或粘性组合物， 其可以缓冲至
选定的pH。液体制剂通常比凝胶、其它粘性组合物和固体组合物更容易制备。此外， 液体组
合物更方便施用， 特别是通过注射。另一方面， 粘性组合物可以在适当的粘度范围内配制，
以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载体， 其可以是包含例
如水、 生理盐水、 磷酸盐缓冲盐水、 多元醇(例如甘油、 丙二醇、液体聚乙二醇等)和合适的其
混合物的溶剂或分散介质。
[0088] 可以加入增强组合物的稳定性和无菌性的各种添加剂， 包括抗微生物防腐剂、抗
氧化剂、 螯合剂和缓冲剂。
[0089] 根据本申请， 使用的任何载体、稀释剂或添加剂必须与表达本发明公开主题的所
述的免疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗原受体(CAR)的免疫应答细胞相
容。
[0090] 如果需要， 组合物的粘度可以使用药学上可接受的增稠剂保持在选定的水平。合
适的载体和其它添加剂的选择将取决于确切的给药途径和特定剂型的性质， 例如液体剂型
(例如， 是否将组合物配制成溶液、 悬浊液、凝胶或另一液体形式， 比如时间释放形式或液体
填充形式)。
[0091] 第九方面， 本申请提供了一种用于治疗或预防疾病的试剂盒， 其包含本发明第六
方面所述的免疫应答细胞或本发明第三方面所述的核酸。

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[0092] 第十方面，本申请提供了本发明第一方面所述的靶向结合人NKG2DL的人NKG2D蛋
白受体或其功能性变体、第二方面所述的免疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合
抗原受体、第四方面所述重组载体或表达质粒， 第六方面所述重组病毒、第七方面所述的分
离的修饰的免疫应答细胞， 第九方面所述的试剂盒在治疗， 或预防疾病、 不适或健康失调的
产品中的应用。
[0093] 在一些实施方式中， 所述治疗或预防的疾病包括抗肿瘤、抗衰老、 自身免疫疾病、
抗菌等疾病。
[0094] 作用原理
[0095] 如图1所示，肿瘤表面表达PD-L1或CD155抗原与免疫细胞表面的PD1或TIGIT结合
而产生肿瘤免疫逃逸作用， 一般采用PD1或TIGIT的抑制剂， 干扰PD-L1与PD1或CD155和
TIGIT的结合。所述的PD1抑制剂， 一般为PD-L1类似物或PD1抗体。本发明有别于传统方式，
采用免疫检查点trap， 即采用PD1或TIGIT分子的类似物，但其并没有胞内免疫抑制信号传
导功能， 与肿瘤细胞表面的抗原结合后， 并不产生免疫抑制， 只起到捕获肿瘤作用。
[0096] 具体来说
[0097] 本发明的免疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗原受体修饰的免疫
应答细胞， 该工程细胞通过识别肿瘤细胞表面抗原NKG2DL来传递活化信号并激活免疫系
统 ，从而对肿瘤细胞发挥杀伤作用； 同时 ，将无免疫抑制功能的免疫检查点调节(PD1或
TIGIT)结构表达到免疫应答细胞上， 即其通过识别肿瘤细胞上的PD-L1或CD155， 遏制免疫
抑制并阻止了肿瘤细胞的免疫逃逸， 从而明显提高工程化免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效
率。
[0098] 有益效果
[0099] 本发明利用嵌合抗原受体修饰T细胞技术来制备免疫检查点调节联合特异性靶向
人NKG2DL的嵌合抗原受体修饰的工程免疫细胞， 该制备方法步骤简单， 获得的新型工程免
疫细胞能特异识别肿瘤细胞， 能更有效地靶向攻击肿瘤细胞， 对肿瘤的杀伤率高， 并且可以
用于制备抗肿瘤的产品， 尤其是用于制备治疗NKG2DL阳性肿瘤； 特别是表达PD-L1/CD155的
NKG2DL阳性肿瘤细胞， 本发明的免疫检查点调节联合特异性嵌合抗原受体修饰的工程免疫
细胞遏制免疫抑制并阻止了肿瘤细胞的免疫逃逸， 从而明显提高工程化免疫细胞对肿瘤细
胞的杀伤效率。本发明可有望用于制备抗肿瘤的产品， 尤其是用于制备治疗急性白血病、 结
肠癌、 胰腺癌、
胃癌、胶质瘤、肝癌的药物， 具有良好的产业应用前景。

附图说明
[0100] 图1显示了本发明KD-593/323工程细胞的工作模式示意图。
[0101] 图2为实施例1中的嵌合抗原受体各部分的连接顺序的示意图， 图2A为KD-025，
图
2B为KD-593，
图2C为KD-323。
[0102] 图3显示了本发明的嵌合抗原受体中靶向结合人NKG2DL的蛋白受体人NKG2D蛋白
二级结构图， 所示的A-F分别为发明人根据人NKG2D的氨基酸序列的胞外区， 利用软件分析
其特性， 即以NKG2D与其配体NKG2DL组成复合物的晶体结构(PDB号码：
4S0U)为基础， 通过丙
氨酸扫描， 首先获取到影响亲和力的关键位点的氨基酸， 然后进行单点突变的饱和突变， 根
据这个饱和突变的结果， 进行多点突变的计算挑选出的稳定性好， 配体结合力高的6条序列

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的二级结构图。
[0103] 图4显示了本发明的嵌合抗原受体中人免疫检查点调节(PD1或TIGIT)的蛋白二级
结构图， A-C为PD1的氨基酸序列， D-F为TIGIT的氨基酸序列， 利用软件分析其与其配体相互
作用的生物学特性， 进行突变计算挑选出的稳定性好， 配体结合力高的6条序列的二级结构
图。
[0104] 图5为实施例3中T细胞纯度流式细胞检测结果。
[0105] 图6为实施例4中KD-593CAR-T细胞体外表达检测实验结果。 其中， 图6A为NKG2D的
表达， 图6B为PD1的表达。
[0106] 图7为实施例4中KD-323CAR-T细胞体外表达检测实验结果。 其中， 图7A为NKG2D的
表达， 图7B为TIGIT的表达。
[0107] 图8为实施例4中KD-593病毒转染293T细胞后的表达检测实验结果。 其中， 图8A为
NKG2D的表达， 图8B为PD1的表达。
[0108] 图9为实施例4中KD-323病毒转染293T细胞后的表达检测实验结果。 其中， 图9A为
NKG2D的表达， 图9B为TIGIT的表达。
[0109] 图10为实施例5中KD-593与PD-L1， KD-323与CD155结合的检测实验结果。其中， 图
10A为KD-593与PD-L1的结合率， 图B为KD-323与CD155的结合率。
[0110] 图11为PD-L1、CD155在肿瘤细胞系中表达的检测， 图11A为人急性髓系白血病细胞
MOLM-13、图11B为直肠癌细胞HCT-116。
[0111] 图12为实施例7中KD-593/323  CAR-T细胞体外杀伤实验结果， 其中图12A为KD-593 
CAR-T细胞对MOLM-13靶细胞的杀伤， 图12B为KD-323  CAR-T细胞对HCT-116靶细胞的杀伤。
[0112] 图13为实施例8中KD-593/323  CAR-T细胞体外细胞因子释放实验结果。
[0113] 图14为实施例9中KD-593/323  CAR-T小鼠体内安全性实验， 其中图14A为小鼠脏器
HE染色图片， 图14B为小鼠生存率。

具体实施方式
[0114] 除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术员通
常理解的含义。
[0115] 术语“功能性变体”，是母体结构经过修饰得到的术语“功能性变体”是指与母体具
有相同或相近的生物学功能和性质如与母体具有相同靶向结合功能的结构的变体。作为非
限制性的实例， “功能性变体”可以通过在母体中进行一处或多处保守型取代获得。本申请
中功能性变体是 ，在人NKG2DL的受体 (人NKG2D氨基酸序列)的基础上修饰产生的与人
NKG2DL靶标结合的结构。
[0116] 术语“类似物”是指结构相关的多肽， 其具有参照多肽分子的功能。在本申请中， 指
与配体人NKG2D氨基酸序列结构相关的， 并具有人NKG2DL的靶向结合的多聚氨基酸结构。
[0117] 术语“氨基酸修饰”是指不显著影响或改变包含氨基酸序列的本公开的CAR(例如，
细胞外识别结构域)的结合特征的保守氨基酸修饰。这种保守修饰包括氨基酸取代、 添加和
缺失。
[0118] 术语“保守性氨基酸取代”是其中氨基酸残基被相同组内的氨基酸替代的取代。
[0119] 术语“同源性”：指目标氨基序列或目标核苷酸序列与参考序列比较显示的氨基酸

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或核苷酸的高比例匹配性。本文中的同源性可使用标准软件如BLAST或FASTA确定。
[0120] 术语“嵌合抗原受体(CAR)”：嵌合抗原受体包括引导肽部分、细胞外靶标识别结构
域、 跨膜结构域和细胞内结构域。
[0121] CAR可以既结合抗原又转导T细胞激活的功能， 其不依赖于MHC限制。因此，CAR是
“通用”免疫抗原受体， 其可以治疗具有抗原阳性肿瘤的患者群体， 不论其HLA基因型如何。
使用表达肿瘤特异性CAR的T淋巴细胞的过继性免疫疗法可以是用于治疗癌症的强大治疗
策略。
[0122] 术语“识别”是指选择性结合靶标。 本文使用的术语“特异性结合”或“特异性结合
到”或“特异性靶向”是指多肽或其片段识别并结合目的生物分子(例如多肽) ， 但其基本上
不识别结合样品中的其他分子， 例如天然地包括本发明多肽的生物样品中的其他分子。
[0123] 术语“特异性结合”是指两个分子(例如配体和受体)之间的结合， 其特征是甚至在
存在许多其他不同分子时， 一种分子(配体)与另一种特异分子(受体)结合的能力， 即在分
子的异质混合物中显示一种分子对另一分子的优先结合的能力。配体与受体的特异性结合
也如下被证明： 存在过量未标记的配体时， 经可检测标记的配体与受体的结合降低(即结合
竞争实验)。
[0124] 术语“共刺激分子”是指淋巴细胞对抗原的有效应答所需的除抗原受体或其配体
之外的细胞表面分子。
[0125] 术语“载体”是指任何遗传元件， 比如质粒、 噬菌体、 转座子、粘粒、染色体、病毒、病
毒粒子等， 其当关联有适当的控制元件时能够复制， 并且其可以将基因序列转移到细胞中。
因此， 该术语包括克隆和表达载体， 以及病毒载体和质粒载体。
[0126] 术语“表达载体”是指一种重组核酸序列， 即重组DNA分子，其含有期望编码序列和
在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的适当的核酸序列。用于在原核生
物中表达所必需的核酸序列通常包括启动子、操纵子(可选的)和核糖体结合位点， 通常伴
随其它序列。 已知真核细胞利用启动子、增强子和终止子及聚腺苷酸化信号。
[0127] 本文使用的术语“免疫应答细胞”是指在免疫应答中起作用的细胞、 或其祖细胞、
或其子代细胞。
[0128] 术语“分离的细胞”是指与天然伴随细胞的分子和/或细胞组分分离的免疫细胞。
[0129] 本文使用的术语“调节” 是指正或负地改变。
[0130] 本文使用的术语“外源的”是指并非内源性存在于细胞中或不以足以达到过表达
时获得的功能性效果的水平存在的核酸分子或多肽。因此， 术语“外源的”将包括在细胞中
表达的任何重组核酸分子或多肽， 例如外源、 异源和过表达的核酸分子和多肽。
[0131] 本文使用的术语“外源核酸分子或多肽”是指并非正常存在于细胞中或由细胞获
得的样品中的核酸分子(例如， cDNA、DNA或RNA分子)或多肽。该核酸可以来自另一生物体，
或者其可以是例如细胞或样品中并非正常表达的mRNA分子。
[0132] 以下通过实施例对本发明作进一步的说明 ， 但本发明并不限于这些具体实施方
式。 下面实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。
[0133] 实施例1制备免疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗原受体的表达质
粒
[0134] 总体设计如下：

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[0135] 1、
免疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗原受体的氨基酸序列的确
定
[0136] 首先， 从美国国立医学图书馆(NCBI)的Genbank数据库中搜索到人NKG2D的全长氨
基酸序列(NP_031386 .2) ， PD1蛋白的全长氨基酸序列(NP_005009 .2) ,TIGIT蛋白的全长氨
基酸序列(NP_776160 .2)。
[0137] 其次， 构建免疫检查点调节(PD1或TIGIT)联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗原受
体， 即确定嵌合抗原受体分子的氨基酸序列：
[0138] 自氨基端到羧基端， 由引导肽的氨基酸序列(如SEQ  ID  No .1所示)、 人NKG2D氨基
酸序列(如SEQ  ID  No .2、SEQ  ID  No .3、SEQ  ID  No .4、SEQ  ID  No .5、SEQ  ID  No .6或SEQ  ID 
No .7所示)、 人CD8铰链区的氨基酸序列(如SEQ  ID  No .8所示)、 人CD8跨膜区的氨基酸序列
(如SEQ  ID  No .9所示)或人CD28跨膜区的氨基酸序列(如SEQ  ID  No .10所示)、 人4-1BB胞内
结构域的氨基酸序列(如SEQ  ID  No .11所示)或人CD28胞内结构域的氨基酸序列(如SEQ  ID 
No .12所示)或人OX40胞内结构域的氨基酸序列(如SEQ  ID  No .13所示)或两者组合、 人CD3ζ
结构域的氨基酸序列(如SEQ  ID  No .14所示)、 Furin-2A的氨基酸序列(如SEQ  ID  No .15所
示)、PD1的氨基酸序列(如SEQ  ID  No .16、SEQ  ID  No .17或SEQ  ID  No .18)、 TIGIT的氨基酸
序列(如SEQ  ID  No .19、
SEQ  ID  No .20或SEQ  ID  No .21所示)依次串联而成；
[0139] 图3所示的A-F分别为发明人根据人NKG2D的氨基酸序列的胞外区， 利用软件分析
其特性， 即以NKG2D与其配体NKG2DL组成复合物的晶体结构(PDB号码： 4S0U)为基础， 通过丙
氨酸扫描， 首先获取到影响亲和力的关键位点的氨基酸， 然后进行单点突变的饱和突变， 根
据这个饱和突变的结果， 进行多点突变的计算挑选出的稳定性好， 配体结合力高的6条序列
的二级结构图；
[0140] 图4为发明人根据PD1或TIGIT的氨基酸序列， 利用软件分析其与其配体相互作用
的生物学特性， 进行突变计算挑选出的稳定性好， 结合力高的序列； 其中， 图A-C为与PD-L1
结合力高的PD1序列的二级结构图， 图D-F为与CD155结合力高的TIGIT序列的二级结构图。
[0141] 密码子优化的序列包括： 编码引导序列的核苷酸序列、编码人NKG2D序列的核苷酸
序列、编码人CD8铰链区的核苷酸序列、编码人CD8或CD28跨膜区的核苷酸序列、编码人4-
1BB或CD28或OX40胞内结构域的核苷酸序列、编码CD3ζ结构域的核苷酸序列、编码Furin-2A
的核苷酸序列、编码PD1或TIGIT的核苷酸序列， 图2表示嵌合抗原受体各部分的连接顺序的
示意图。
[0142] 表1为不同的靶向人NKG2DL的NKG2D氨基酸序列和人免疫检查调节(PD1或TIGIT)
的氨基酸序列组合时， 按照下述的方法所构建的载体、获得的病毒和获得相应的CAR-T细
胞， 并按照下述方法检测的CAR和免疫检查点分子表达； 结果表明： 人NKG2D氨基酸序列(如
SEQ  ID  No .2所示)和PD1(如SEQ  ID  No .16所示)或TIGIT氨基酸序列(如SEQ  ID  No .19所
示)组合时， CAR表达和PD1或TIGIT的表达最佳， 可作为后续的活性验证实验。
[0143] 表1为不同序列组合CAR和免疫检查点调节的表达

14
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[0144]

[0145]

[0146] 2、表达免疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗原受体分子质粒的构
建
[0147] 本发明选用步骤1中表达最好的一条CAR序列， 其命名为KD-593(氨基酸序列如SEQ 
ID  No .22所示，核苷酸如SEQ  ID  No .24所示)完成后续实施例的药效验证试验， 其具体序列
如下：
[0148] 自氨基端到羧基端， 由引导肽的氨基酸序列(如SEQ  ID  No .1所示)、 人NKG2D氨基
酸序列(如SEQ  ID  No .2所示)、 人CD8跨膜区的氨基酸序列(如SEQ  ID  No .9所示)、人4-1BB

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胞内结构域的氨基酸序列(如SEQ  ID  No .11所示)、 人CD3ζ结构域的氨基酸序列(如SEQ  ID 

No .14所示)、 Furin-2A的氨基酸序列(如SEQ  ID  No .15所示)、PD1的氨基酸序列(如SEQ  ID 
No .16所示)依次串联而成。
[0149] 本发明选用步骤1中表达最好的另一条CAR序列， 其命名为KD-323(氨基酸序列如
SEQ  ID  No .23所示， 核苷酸如SEQ  ID  No .25所示)完成后续实施例的药效验证试验， 其具体
序列如下：
[0150] 自氨基端到羧基端， 由引导肽的氨基酸序列(如SEQ  ID  No .1所示)、 人NKG2D氨基
酸序列(如SEQ  ID  No .2所示)、 人CD8跨膜区的氨基酸序列(如SEQ  ID  No .9所示)、 人4-1BB
胞内结构域的氨基酸序列(如SEQ  ID  No .11所示)、 人CD3ζ结构域的氨基酸序列(如SEQ  ID 
No .14所示)、Furin-2A的氨基酸序列(如SEQ  ID  No .15所示)、TIGIT的氨基酸序列(如SEQ 
ID  No .19所示)依次串联而成。
[0151] 全基因合成免疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗原受体分子的核
苷酸序列(南京一道生物合成)见SEQ  ID  No .24或SEQ  ID  No .25， 通过分子克隆的方式连接
到慢病毒载体lentiGuide-Puro(Addgene， 美国) ，构建单一编码框的全长CAR序列表达框，
利用EF1  alpha启动子或EFS启动子进行表达。
[0152] 具体操作步骤如下：
[0153] 全基因合成免疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗原受体分子的核
苷酸序列， PCR扩增人工合成CAR分子序列， 经Axygen胶回收试剂盒(杭州泽衡)回收， 与经过
限制性内切酶SmaI和MluI消化的载体lentiGuide-Puro(Addgene， 美国) ，进行同源重组连
接， 形成KD-593/323表达载体。
[0154] 具体重组连接反应的体系和条件如下：
[0155] 重组连接体系：
[0156] 胶回收的PCR产物5μl， 胶回收的SmaI和MluI酶切lentiGuide-Puro质粒(Addgene，
美国)3μl； 4X  1402  QuickCloning  Kit(南京基诺美)5μl； 去离子水7μl；连接反应体系体积
20μl；
[0157] 重组连接条件： 将上述反应体系置于50℃水浴中， 反应15min后置冰上1min。
[0158] 取10ul重组连接产物经感受态Stbl3转化， 具体转化操作步骤如下。
[0159] 将5μl连接产物加入到50μl的感受态细胞(Stbl3， 购买自美国Invitrogen公司)
中， 冰浴30min， 42℃45s， 冰浴2min， 然后加入500μl无抗LB液体培养基后， 37℃，200rpm震荡
培养40min， 涂布氨苄抗性的LB固体平板， 在37℃培养箱中过夜。等待单菌落出现后， 挑取5
个大小适中的菌落， 提取质粒， 并送往商业测序公司测序， 将测序结果与拟合成的核苷酸
(即免疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗原受体的核苷酸)比对证实序列完
全正确， 证明获得了表达免疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗原受体的质粒
(KD-593或KD-323表达质粒)。
[0160] 免疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗原受体表达质粒的提取和纯
化。
[0161] 将含有KD-593或KD-323表达 质粒的Stbl3菌株在LB培养基中大量培养 ， 采用
Qiagen  Plasmid  Midi  Kit(德国Qiagen公司)进行高纯度无内毒素抽提， 以备感染。(具体
的检测操作过程参见Qiagen质粒抽提试剂盒说明书)。

16
CN 112142854 A 说　明　书 14/16 页

[0162] 实施例2： 慢病毒载体的病毒液的制备

[0163] 将实施例1获得的表达免疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗原受体
的重组质粒 (KD-593/323表达质粒) 和包装载体psPAX2和VSVG ，按照10 ：8：5的比 例，用
LipofectamineTM  6000转染试剂(购买自ThermoFisher公司，
产品型号为11668019)共转染
293T细胞(具体的转染操作过程参见ThermoFisher转染说明书) ， 转染后6小时更换为完全
培养基(购买自Life  Technologies公司， 产品型号为11995-065)，培养48小时和72小时后，
分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液， 病毒上清液通过超离心浓缩病毒， 获得携带表达
免疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗原受体的慢病毒载体的病毒液(下面简
称KD-593或KD-323病毒液)。
[0164] 实施例3： T细胞的分离培养
[0165] 取健康供者的新鲜外周血， 通过密度梯度离心分离新鲜的外周血单核细胞； 再利
用偶联了抗-CD3抗体和抗-CD28抗体的顺磁磁珠(购买自美国Invitrogen公司， 产品信息为
Human  T-Activator  CD3/CD28)来富集CD3+T细胞，
具体来说，
将外周血单核细
胞稀释至浓度为(10～30)×106个单个细胞/ml， 再将磁珠与细胞以3:1的比例在培养皿中
混合， 室温下共孵育2-3小时， 利用磁微粒收集器(Magnetic  particles  concentrator， 简
称MPC， 购买自美国Invitrogen公司)富集CD3+T细胞。最后将富集的CD3+T细胞重悬于培养
基(购买自美国Life  Technologies公司， 产品信息为OpTmizerTM  T-Cell  Expansion  SFM)
中， 调至细胞浓度为1×106个/ml， 最后在37℃、 5％CO2培养箱中培养2天， 检测结果见图5。
[0166] 实施例4： 免疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗原受体T细胞(KD-
593  CAR-T或KD-323  CAR-T)的制备
[0167] 首先， 取实施例3获得的CD3+T细胞或293T细胞(ATCC， 美国) ， 接种到24孔板， 接种
5
浓度为1～10×10 个细胞/ml， 在37℃、 5％CO2环境培养约24小时(培养时间依据具体实践而
定， 一般来说， 保证在病毒液感染时细胞汇合率介于50-70％之间)。之后， 取实施例2收集的
KD-593/323病毒液， 按照MOI＝10-40的值， 一同加入细胞培养瓶后， 封好口， 放入平角离心
机后， 低速(500g-1000g/min)离心1小时， 然后放入培养箱中37℃培养。感染后48小时后获
得表达免疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗原受体T细胞(KD-593  CAR-T或
KD-323  CAR-T) ，
可以进行下一步的功能实验， 如图1所示的是该工程细胞工作示意图， 即该
工程细胞通过识别肿瘤细胞表面产生的NKG2DL来传递活化信号并激活免疫系统， 从而对肿
瘤细胞发挥杀伤作用； 同时识别肿瘤的多种免疫检查点分子如PD-L1/PD-L2， CD155/CD122，
遏制免疫抑制并阻止了肿瘤细胞的免疫逃逸， 从而明显提高工程化免疫细胞对肿瘤细胞的
杀伤效率。
[0168] 利用流式细胞术分析检测CAR蛋白的表达：
[0169] 离心细胞， 用PBS清洗两次后重悬于FACS液中 (含0 .1％叠氮化钠和0 .4％BSA的
PBS)； 将Anti-CD314抗体(APC-anti-human  CD314(NKG2D)， biolegend，320808)加入细胞悬
液中 ，4℃孵育1h ，并设置同型对照组 (APC  Mouse  IgG1 ， κIsotype  Ctrl  Antibody ，
biolegend ，400120) ；将Human  TIGIT  APC-conjugated  Antibody (R&D  Systems ，
FAB7898A)， Anti-PD1抗体(APC， biolegend，621610)加入细胞悬液中， 4℃孵育1h， 并设置对
照组； 清洗细胞两次后， 加入200μL的FACS液重悬细胞； BD  FacsCanto  II用于获取染色细
胞， FlowJo用于分析结果。如图6， 7所示， 对照组为感染空载体病毒液的T细胞， 几乎检测不

17
CN 112142854 A 说　明　书 15/16 页

到CAR分子的表达 ；实验组为感染KD-593/323病毒液的T细胞 ，NKG2D的表达率分别为

79 .3％/75 .9％， PD1/TIGIT表达率分别为24 .7％/31 .2％。如图8， 9所示， 对照组为未感染病
毒液的293T细胞， 几乎检测不到CAR分子的表达； 实验组为感染KD-593/323病毒液的293T细
胞， NKG2D的表达率分别为98 .1％/99 .7％， PD1/TIGIT表达率分别为89 .9％/96 .4％。
[0170] 实施例5： KD-593与PD-L1， KD-323与CD155结合检测
[0171] 具体操作步骤如下：
[0172] 首先， 取293T细胞， 接种到24孔板， 接种浓度为1～10×105个细胞/ml， 在37℃、 5％
CO2环境培养约24小时(培养时间依据具体实践而定， 一般来说， 保证在病毒液感染时细胞
汇合率介于50-70％之间)。之后， 取实施例2收集的KD-593/323病毒液， 按照MOI＝10-40的
值， 感染293T细胞。
[0173] 培养48h后收集细胞， 4℃300g离心5min；用PBS清洗两次后重悬于FACS液中(含
0 .1％叠氮化钠和0 .4％BSA的PBS) ； 将PD-L1一抗(Recombinant  Human  PD-L1/B7-H1  Fc 
Chimera  Protein ,CF， 156-B7-100) ，CD155一抗(Recombinant  Human  PVR  Fc  Chimera 
Protein ,CF，C642)加入细胞悬液中， 4℃孵育4h， 并设置对照组； 清洗细胞两次后， 加入200μ
L的FACS液重悬细胞； 将二抗(Human  IgG  Fc  PE-conjugated  Antibody，FAB110P-100)加入
细胞悬液中， 4℃孵育1h； 清洗细胞两次后， 加入200μL的FACS液重悬细胞； BD  FacsCanto  II
用于获取染色细胞， FlowJo用于分析结果。如图10所示， 对照组为未感染病毒液的293T细
胞， 几乎不与PD-L1/CD155结合； 实验组为感染KD-593病毒液的293T细胞与PD-L1的结合率
为75 .8％， 感染KD-323病毒液的293T细胞与CD155的结合率为85％。
[0174] 实施例6： 肿瘤细胞系(也称靶细胞系)PD-L1， CD155表达检测
[0175] 具体操作步骤如下：
[0176] 供试肿瘤细胞系(也称靶细胞系) ： 人急性髓系白血病细胞MOLM-13(ATCC， 美国)、
直肠癌细胞HCT-116(ATCC， 美国)
[0177] 首先检测在各种供试肿瘤细胞系中的表达。 收集供试肿瘤细胞， PBS清洗两次后重
悬于FACS液(含0 .1％叠氮化钠和0 .4％BSA的PBS)中， 计数， 调整细胞浓度至1x106/ml； 分别
加入抗体PD-L1(R&D  Systems， FAB1561G-100)和同型对照Mouse  IgG1(IC002G)， 以及Human 
CD155/PVR  APC-conjugated  Antibody(R&D  Systems，FAB25301A)和同型对照Mouse  IgG1 
APC (R&D  Systems) ，4℃孵育60分钟 ；PBS清洗两次 后重悬于FACS液 ，流式细胞仪 (BD 
FacsCanto  II)分析细胞荧光， 并采用FlowJo软件分析结果。流式结果如图11所示， MOLM-13
细胞PD-L1的表达率为22 .1％， HCT-116细胞CD155表达率为90 .8％， 对照组基本无表达(另
注： 图11中， 横坐标表示荧光强度； 纵坐标代表细胞数目)。
[0178] 实施例7： KD-593/323  CAR-T细胞体外杀伤实验
[0179] 每一种靶细胞系对应地设置一个实验组和3个对照组， 其中， 实验组添加的是实施
例4所得的人免疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的CAR-T细胞的细胞悬液； 空白对照
组添加的是没有感染病毒的T细胞(即实施例3获得的CD3+T细胞) ； KD-019对照组添加的是
靶向CD19的CAR-T细胞(制备方法参照CN109803983A) ； KD-025对照组添加靶向人NKG2DL的
CAR-T细胞(制备方法参照CN109803983A)。
[0180] 首先， 按照实施例4方法感染制备KD-019  CAR-T、 KD-593/323  CAR-T细胞， 感染后
继续培养72小时后进行杀伤接种， 每一种靶细胞系经过CSFE荧光染色后， 在荧光显微镜下

18
CN 112142854 A 说　明　书 16/16 页

对靶细胞进行计数， 调整细胞密度约为2×106cells/ml， 20μl/孔，接种靶细胞于96孔培养

板中； 按照效靶比为0 .25： 1、 1:1、4:1加入效应细胞T、KD-019  CAR-T、KD-593  CAR-T或KD-
323  CAR-T细胞； 然后将细胞置于37℃温箱培养24h； 最后利用7-AAD/CFSE细胞毒性测试试
剂盒(购买自Biovision公司， 货号： K315-100) ， 并按照该试剂盒的操作说明书来评估KD-
593  CAR-T或KD-323  CAR-T细胞对上述靶细胞系的杀伤情况。如图12所示， 图12A和12B分别
是MOLM-13和HCT-116细胞的杀伤结果， KD-025  CAR-T和KD-593  CAR-T对MOLM-13有一定的
杀伤作用， 同时KD-025  CAR-T和KD-323  CAR-T对HCT-116也有一定的杀伤作用； 加入PD1或
TIGIT后， KD-593  CAR-T对MOLM-13或KD-323  CAR-T对HCT-116的杀伤比KD-025  CAR-T高， 说
明KD-593  CAR-T表达的PD1及KD-323  CAR-T表达的TIGIT中和了免疫检查点分子对T细胞的
免疫抑制影响。
[0181] 实施例8： KD-593  CAR-T、KD-323  CAR-T细胞体外细胞因子释放实验
[0182] 实验设置一个实验组和3个对照组， 其中， 实验组添加的是实施例4所得的人免疫
检查点分子联合特异性靶向人NKG2DL的CAR-T细胞的细胞悬液； 空白对照组添加的是没有
感染病毒的T细胞(即实施例3获得的CD3+T细胞) ； KD-019对照组添加的是靶向CD19的无关
CAR-T细胞； KD-593和KD-323对照组添加靶向人NKG2DL的CAR-T细胞。
[0183] 首先， 按照实施例4方法感染制备KD-019  CAR-T、KD-025  CAR-T、KD-593  CAR-T、
KD-323  CAR-T细胞， 感染后继续培养72小时后进行杀伤接种， 靶细胞系调整细胞密度约为
6
1 .5×10 cells/ml， 20μl/孔， 接种靶细胞于96孔培养板中； 按照效靶比为4： 1加入效应细胞
T、 KD-019  CAR-T、 KD-025  CAR-T、 KD-593  CAR-T、KD-323  CAR-T细胞； 然后将细胞置于37℃
温箱培养24h； 最后利用Human  IFN-γELISA  Kit  II试剂盒(购买自BD公司， 货号： 550612)，
Human  TNF  ELISA  Kit  II试剂盒(购买自BD公司， 货号： 550610)并按照该试剂盒的操作说
明书来评估KD-593/323  CAR-T细胞对上述靶细胞系的杀伤细胞因子释放情况。如图13所
示， KD-025  CAR-T或KD-593  CAR-T细胞与肿瘤细胞MOLM-13， 以及KD-025  CAR-T或KD-323 
CAR-T细胞与肿瘤细胞HCT-116共培养后， 与对照组相比 ， INF-γ和TNF-α显著增加， KD-593
和KD-323组的INF-γ、 TNF-α释放明显高于KD-025组， 说明KD-593  CAR-T表达的PD-1和KD-
323  CAR-T表达的TIGIT中和免疫检查点分子了对T细胞的免疫抑制影响。
[0184] 实施例9： KD-593/323  CAR-T小鼠体内安全性实验
[0185] 首先， 按照实施例4方法感染制备KD-593/323  CAR-T细胞， 如图14所示为KD-593/
323  CAR-T细胞对小鼠主要脏器和生存周期的影响。 从图14可以看出， KD-593/323  CAR-T细
胞不会引起小鼠心、肝、肺、 肾等主要脏器发生炎症、 水肿和坏死(图14A) ， 并且对小鼠的生
存周期没有任何负面影响(图14B)。
[0186] 总之， 本发明所构建的免疫检查点调节联合特异性靶向人NKG2DL的嵌合抗原受体
的病毒载体， 以及经其修饰的工程免疫细胞可以应用于治疗多种肿瘤， 包括胰腺癌、 胃癌、
肝癌、 脑癌、 前列腺癌、 淋巴癌、 白血病、 肠癌、 肺癌、 宫颈癌、卵巢癌、 膀胱癌、 食道癌、 肾癌或
乳腺癌。

19
CN 112142854 A 序　列　表 1/18 页

序列表
<110>  南京凯地生物科技有限公司
<120>  免疫调节特异性嵌合抗原受体细胞及制备方法和应用
<160>  25
<170>  SIPOSequenceListing  1 .0
<210>  1
<211>  21
<212>  PRT
<213>  引导序列(2  Ambystoma  laterale  x  Ambystoma  jeffersonianum)
<400>  1
Met  Ala  Leu  Pro  Val  Thr  Ala  Leu  Leu  Leu  Pro  Leu  Ala  Leu  Leu  Leu
1  5  10  15
His  Ala  Ala  Arg  Pro
20
<210>  2
<211>  136
<212>  PRT
<213>  NKG2D序列1(2  Ambystoma  laterale  x  Ambystoma  jeffersonianum)
<400>  2
Ser  Leu  Phe  Asn  Gln  Glu  Val  Gln  Ile  Pro  Leu  Thr  Glu  Ser  Tyr  Cys
1  5  10  15
Gly  Pro  Cys  Pro  Lys  Asn  Trp  Ile  Cys  Tyr  Lys  Asn  Asn  Cys  Tyr  Gln
20  25  30
Phe  Phe  Asp  Glu  Ser  Lys  Asn  Trp  Tyr  Glu  Ser  Gln  Ala  Ser  Cys  Met
35  40  45
Ser  Gln  Asn  Ala  Ser  Leu  Leu  Lys  Val  Tyr  Ser  Lys  Glu  Asp  Gln  Asp
50  55  60
Leu  Leu  Lys  Leu  Val  Lys  Ser  Tyr  His  Trp  Met  Gly  Leu  Val  His  Ile
65  70  75  80
Pro  Thr  Asn  Gly  Ser  Trp  Gln  Trp  Glu  Asp  Gly  Ser  Ile  Leu  Ser  Pro
85  90  95
Asn  Leu  Leu  Thr  Ile  Ile  Glu  Met  Gln  Lys  Gly  Asp  Cys  Ala  Leu  Tyr
100  105  110
Ala  Ser  Ser  Phe  Lys  Gly  Tyr  Ile  Glu  Asn  Cys  Ser  Thr  Pro  Asn  Thr
115  120  125
Tyr  Ile  Cys  Met  Gln  Arg  Thr  Val
130  135
<210>  3

20
CN 112142854 A 序　列　表 2/18 页

<211>  136
<212>  PRT
<213>  NKG2D序列2(2  Ambystoma  laterale  x  Ambystoma  jeffersonianum)
<400>  3
Ser  Leu  Phe  Asn  Gln  Glu  Val  Gln  Ile  Pro  Leu  Thr  Glu  Ser  Tyr  Cys
1  5  10  15
Gly  Pro  Cys  Pro  Lys  Asn  Trp  Ile  Cys  Tyr  Lys  Asn  Asn  Cys  Tyr  Gln
20  25  30
Phe  Phe  Asp  Glu  Ser  Lys  Asn  Trp  Tyr  Glu  Ser  Gln  Ala  Ser  Cys  Met
35  40  45
Ser  Gln  Asn  Ala  Ser  Leu  Leu  Lys  Val  Tyr  Ser  Lys  Glu  Asp  Gln  Asp
50  55  60
Leu  Leu  Lys  Leu  Val  Lys  Ser  Arg  His  Trp  Met  Gly  Leu  Val  His  Ile
65  70  75  80
Pro  Thr  Asn  Gly  Ser  Trp  Gln  Trp  Glu  Asp  Gly  Ser  Ile  Leu  Ser  Pro
85  90  95
Asn  Leu  Leu  Thr  Ile  Lys  Glu  Arg  Gln  Lys  Gly  Asp  Cys  Ala  Leu  Tyr
100  105  110
Ala  Ser  Ser  Phe  Lys  Gly  Arg  Ile  Glu  Asn  Cys  Ser  Thr  Pro  Asn  Thr
115  120  125
Tyr  Ile  Cys  Met  Gln  Arg  Thr  Val
130  135
<210>  4
<211>  136
<212>  PRT
<213>  NKG2D序列3(2  Ambystoma  laterale  x  Ambystoma  jeffersonianum)
<400>  4
Ser  Leu  Phe  Asn  Gln  Glu  Val  Gln  Ile  Pro  Leu  Thr  Glu  Ser  Tyr  Cys
1  5  10  15
Gly  Pro  Cys  Pro  Lys  Asn  Trp  Ile  Cys  Tyr  Lys  Asn  Asn  Cys  Tyr  Gln
20  25  30
Phe  Phe  Asp  Glu  Ser  Lys  Asn  Trp  Tyr  Glu  Ser  Gln  Ala  Ser  Cys  Met
35  40  45
Ser  Gln  Asn  Ala  Ser  Leu  Leu  Lys  Val  Tyr  Ser  Lys  Glu  Asp  Gln  Asp
50  55  60
Leu  Leu  Lys  Leu  Val  Lys  Ser  Arg  His  Trp  Met  Gly  Leu  Val  His  Ile
65  70  75  80
Pro  Thr  Asn  Gly  Ser  Trp  Gln  Trp  Glu  Asp  Gly  Ser  Ile  Leu  Ser  Pro
85  90  95

21
CN 112142854 A 序　列　表 3/18 页

Asn  Leu  Leu  Thr  Ile  Arg  Glu  Arg  Gln  Lys  Gly  Asp  Cys  Ala  Leu  Tyr
100  105  110
Ala  Ser  Ser  Phe  Lys  Gly  Arg  Ile  Glu  Asn  Cys  Ser  Thr  Pro  Asn  Thr
115  120  125
Tyr  Ile  Cys  Met  Gln  Arg  Thr  Val
130  135
<210>  5
<211>  136
<212>  PRT
<213>  NKG2D序列4(2  Ambystoma  laterale  x  Ambystoma  jeffersonianum)
<400>  5
Ser  Leu  Phe  Asn  Gln  Glu  Val  Gln  Ile  Pro  Leu  Thr  Glu  Ser  Tyr  Cys
1  5  10  15
Gly  Pro  Cys  Pro  Lys  Asn  Trp  Ile  Cys  Tyr  Lys  Asn  Asn  Cys  Tyr  Gln
20  25  30
Phe  Phe  Asp  Glu  Ser  Lys  Asn  Trp  Tyr  Glu  Ser  Gln  Ala  Ser  Cys  Met
35  40  45
Ser  Gln  Asn  Ala  Ser  Leu  Leu  Lys  Val  Tyr  Ser  Lys  Glu  Asp  Gln  Asp
50  55  60
Leu  Leu  Lys  Leu  Val  Lys  Ser  Arg  His  Trp  Met  Gly  Leu  Val  His  Ile
65  70  75  80
Pro  Thr  Asn  Gly  Ser  Trp  Gln  Trp  Glu  Asp  Gly  Ser  Ile  Leu  Ser  Pro
85  90  95
Asn  Leu  Leu  Thr  Ile  Lys  Glu  Lys  Gln  Lys  Gly  Asp  Cys  Ala  Leu  Tyr
100  105  110
Ala  Ser  Ser  Phe  Lys  Gly  Arg  Ile  Glu  Asn  Cys  Ser  Thr  Pro  Asn  Thr
115  120  125
Tyr  Ile  Cys  Met  Gln  Arg  Thr  Val
130  135
<210>  6
<211>  136
<212>  PRT
<213>  NKG2D序列5(2  Ambystoma  laterale  x  Ambystoma  jeffersonianum)
<400>  6
Ser  Leu  Phe  Asn  Gln  Glu  Val  Gln  Ile  Pro  Leu  Thr  Glu  Ser  Tyr  Cys
1  5  10  15
Gly  Pro  Cys  Pro  Lys  Asn  Trp  Ile  Cys  Tyr  Lys  Asn  Asn  Cys  Tyr  Gln
20  25  30
Phe  Phe  Asp  Glu  Ser  Lys  Asn  Trp  Tyr  Glu  Ser  Gln  Ala  Ser  Cys  Met

22
CN 112142854 A 序　列　表 4/18 页

35  40  45
Ser  Gln  Asn  Ala  Ser  Leu  Leu  Lys  Val  Tyr  Ser  Lys  Glu  Asp  Gln  Asp
50  55  60
Leu  Leu  Lys  Leu  Val  Lys  Ser  Arg  His  Trp  Met  Gly  Leu  Val  His  Ile
65  70  75  80
Pro  Thr  Asn  Gly  Ser  Trp  Gln  Trp  Glu  Asp  Gly  Ser  Ile  Leu  Ser  Pro
85  90  95
Asn  Leu  Leu  Thr  Ile  Arg  Glu  Arg  Gln  Lys  Gly  Asp  Cys  Ala  Leu  Tyr
100  105  110
Ala  Ser  Ser  Phe  Lys  Gly  His  Ile  Glu  Asn  Cys  Ser  Thr  Pro  Asn  Thr
115  120  125
Tyr  Ile  Cys  Met  Gln  Arg  Thr  Val
130  135
<210>  7
<211>  136
<212>  PRT
<213>  NKG2D序列6(2  Ambystoma  laterale  x  Ambystoma  jeffersonianum)
<400>  7
Ser  Leu  Phe  Asn  Gln  Glu  Val  Gln  Ile  Pro  Leu  Thr  Glu  Ser  Tyr  Cys
1  5  10  15
Gly  Pro  Cys  Pro  Lys  Asn  Trp  Ile  Cys  Tyr  Lys  Asn  Asn  Cys  Tyr  Gln
20  25  30
Phe  Phe  Asp  Glu  Ser  Lys  Asn  Trp  Tyr  Glu  Ser  Gln  Ala  Ser  Cys  Met
35  40  45
Ser  Gln  Asn  Ala  Ser  Leu  Leu  Lys  Val  Tyr  Ser  Lys  Glu  Asp  Gln  Asp
50  55  60
Leu  Leu  Lys  Leu  Val  Lys  Ser  Arg  His  Trp  Met  Gly  Leu  Val  His  Ile
65  70  75  80
Pro  Thr  Asn  Gly  Ser  Trp  Gln  Trp  Glu  Asp  Gly  Ser  Ile  Leu  Ser  Pro
85  90  95
Asn  Leu  Leu  Thr  Ile  Arg  Glu  Tyr  Gln  Lys  Gly  Asp  Cys  Ala  Leu  Tyr
100  105  110
Ala  Ser  Ser  Phe  Lys  Gly  Arg  Ile  Glu  Asn  Cys  Ser  Thr  Pro  Asn  Thr
115  120  125
Tyr  Ile  Cys  Met  Gln  Arg  Thr  Val
130  135
<210>  8
<211>  45
<212>  PRT

23
CN 112142854 A 序　列　表 5/18 页

<213>  CD8铰链区(2  Ambystoma  laterale  x  Ambystoma  jeffersonianum)

<400>  8
Thr  Thr  Thr  Pro  Ala  Pro  Arg  Pro  Pro  Thr  Pro  Ala  Pro  Thr  Ile  Ala
1  5  10  15
Ser  Gln  Pro  Leu  Ser  Leu  Arg  Pro  Glu  Ala  Cys  Arg  Pro  Ala  Ala  Gly
20  25  30
Gly  Ala  Val  His  Thr  Arg  Gly  Leu  Asp  Phe  Ala  Cys  Asp
35  40  45
<210>  9
<211>  24
<212>  PRT
<213>  CD8跨膜区(2  Ambystoma  laterale  x  Ambystoma  jeffersonianum)
<400>  9
Ile  Tyr  Ile  Trp  Ala  Pro  Leu  Ala  Gly  Thr  Cys  Gly  Val  Leu  Leu  Leu
1  5  10  15
Ser  Leu  Val  Ile  Thr  Leu  Tyr  Cys
20
<210>  10
<211>  27
<212>  PRT
<213>  CD28跨膜区(2  Ambystoma  laterale  x  Ambystoma  jeffersonianum)
<400>  10
Phe  Trp  Val  Leu  Val  Val  Val  Gly  Gly  Val  Leu  Ala  Cys  Tyr  Ser  Leu
1  5  10  15
Leu  Val  Thr  Val  Ala  Phe  Ile  Ile  Phe  Trp  Val
20  25
<210>  11
<211>  42
<212>  PRT
<213>  4-1BB胞内结构域(2  Ambystoma  laterale  x  Ambystoma  jeffersonianum)
<400>  11
Lys  Arg  Gly  Arg  Lys  Lys  Leu  Leu  Tyr  Ile  Phe  Lys  Gln  Pro  Phe  Met
1  5  10  15
Arg  Pro  Val  Gln  Thr  Thr  Gln  Glu  Glu  Asp  Gly  Cys  Ser  Cys  Arg  Phe
20  25  30
Pro  Glu  Glu  Glu  Glu  Gly  Gly  Cys  Glu  Leu
35  40
<210>  12
<211>  41

24
CN 112142854 A 序　列　表 6/18 页

<212>  PRT
<213>  CD28结构域(2  Ambystoma  laterale  x  Ambystoma  jeffersonianum)
<400>  12
Arg  Ser  Lys  Arg  Ser  Arg  Leu  Leu  His  Ser  Asp  Tyr  Met  Asn  Met  Thr
1  5  10  15
Pro  Arg  Arg  Pro  Gly  Pro  Thr  Arg  Lys  His  Tyr  Gln  Pro  Tyr  Ala  Pro
20  25  30
Pro  Arg  Asp  Phe  Ala  Ala  Tyr  Arg  Ser
35  40
<210>  13
<211>  36
<212>  PRT
<213>  OX40结构域(2  Ambystoma  laterale  x  Ambystoma  jeffersonianum)
<400>  13
Arg  Asp  Gln  Arg  Leu  Pro  Pro  Asp  Ala  His  Lys  Pro  Pro  Gly  Gly  Gly
1  5  10  15
Ser  Phe  Arg  Thr  Pro  Ile  Gln  Glu  Glu  Gln  Ala  Asp  Ala  His  Ser  Thr
20  25  30
Leu  Ala  Lys  Ile
35
<210>  14
<211>  112
<212>  PRT
<213>  CD3ζ结构域(2  Ambystoma  laterale  x  Ambystoma  jeffersonianum)
<400>  14
Arg  Val  Lys  Phe  Ser  Arg  Ser  Ala  Asp  Ala  Pro  Ala  Tyr  Gln  Gln  Gly
1  5  10  15
Gln  Asn  Gln  Leu  Tyr  Asn  Glu  Leu  Asn  Leu  Gly  Arg  Arg  Glu  Glu  Tyr
20  25  30
Asp  Val  Leu  Asp  Lys  Arg  Arg  Gly  Arg  Asp  Pro  Glu  Met  Gly  Gly  Lys
35  40  45
Pro  Arg  Arg  Lys  Asn  Pro  Gln  Glu  Gly  Leu  Tyr  Asn  Glu  Leu  Gln  Lys
50  55  60
Asp  Lys  Met  Ala  Glu  Ala  Tyr  Ser  Glu  Ile  Gly  Met  Lys  Gly  Glu  Arg
65  70  75  80
Arg  Arg  Gly  Lys  Gly  His  Asp  Gly  Leu  Tyr  Gln  Gly  Leu  Ser  Thr  Ala
85  90  95
Thr  Lys  Asp  Thr  Tyr  Asp  Ala  Leu  His  Met  Gln  Ala  Leu  Pro  Pro  Arg
100  105  110

25
CN 112142854 A 序　列　表 7/18 页

<210>  15
<211>  26
<212>  PRT
<213>  Furin-2A(2  Ambystoma  laterale  x  Ambystoma  jeffersonianum)
<400>  15
Arg  Ala  Lys  Arg  Ser  Gly  Ser  Gly  Glu  Gly  Arg  Gly  Ser  Leu  Leu  Thr
1  5  10  15
Cys  Gly  Asp  Val  Glu  Glu  Asn  Pro  Gly  Pro
20  25
<210>  16
<211>  215
<212>  PRT
<213>  PD-1序列1(2  Ambystoma  laterale  x  Ambystoma  jeffersonianum)
<400>  16
Met  Gln  Ile  Pro  Gln  Ala  Pro  Trp  Pro  Val  Val  Trp  Ala  Val  Leu  Gln
1  5  10  15
Leu  Gly  Trp  Arg  Pro  Gly  Trp  Phe  Leu  Asp  Ser  Pro  Asp  Arg  Pro  Trp
20  25  30
Asn  Pro  Pro  Thr  Phe  Ser  Pro  Ala  Leu  Leu  Val  Val  Thr  Glu  Gly  Asp
35  40  45
Asn  Ala  Thr  Phe  Thr  Cys  Ser  Phe  Ser  Asn  Thr  Ser  Glu  Ser  Phe  Val
50  55  60
Leu  Asn  Trp  Tyr  Arg  Met  Ser  Pro  Ser  Asn  Gln  Thr  Asp  Lys  Leu  Ala
65  70  75  80
Ala  Phe  Pro  Glu  Asp  Arg  Ser  Gln  Pro  Gly  Gln  Asp  Cys  Arg  Phe  Arg
85  90  95
Val  Thr  Gln  Leu  Pro  Asn  Gly  Arg  Asp  Phe  His  Met  Ser  Val  Val  Arg
100  105  110
Ala  Arg  Arg  Asn  Asp  Ser  Gly  Thr  Tyr  Leu  Cys  Gly  Ala  Ile  Ser  Leu
115  120  125
Ala  Pro  Lys  Ala  Gln  Ile  Lys  Glu  Ser  Leu  Arg  Ala  Glu  Leu  Arg  Val
130  135  140
Thr  Glu  Arg  Arg  Ala  Glu  Val  Pro  Thr  Ala  His  Pro  Ser  Pro  Ser  Pro
145  150  155  160
Arg  Pro  Ala  Gly  Gln  Phe  Gln  Thr  Leu  Val  Val  Gly  Val  Val  Gly  Gly
165  170  175
Leu  Leu  Gly  Ser  Leu  Val  Leu  Leu  Val  Trp  Val  Leu  Ala  Val  Ile  Cys
180  185  190
Ser  Arg  Ala  Ala  Arg  Gly  Thr  Ile  Gly  Ala  Arg  Arg  Thr  Gly  Gln  Pro

26
CN 112142854 A 序　列　表 8/18 页

195  200  205

Leu  Gln  Glu  Asp  Pro  Ser  Val
210  215
<210>  17
<211>  215
<212>  PRT
<213>  PD-1序列2(2  Ambystoma  laterale  x  Ambystoma  jeffersonianum)
<400>  17
Met  Gln  Ile  Pro  Gln  Ala  Pro  Trp  Pro  Val  Val  Trp  Ala  Val  Leu  Gln
1  5  10  15
Leu  Gly  Trp  Arg  Pro  Gly  Trp  Phe  Leu  Asp  Ser  Pro  Asp  Arg  Pro  Trp
20  25  30
Asn  Pro  Pro  Thr  Phe  Ser  Pro  Ala  Leu  Leu  Val  Val  Thr  Glu  Gly  Asp
35  40  45
Asn  Ala  Thr  Phe  Thr  Cys  Ser  Phe  Ser  Asn  Thr  Ser  Glu  Ser  Phe  Val
50  55  60
Leu  Asn  Trp  Tyr  Arg  Met  Ser  Pro  Ser  Asn  Gln  Thr  Asp  Lys  Leu  Ala
65  70  75  80
Ala  Phe  Pro  Glu  Asp  Arg  Ser  Gln  Pro  Gly  Gln  Asp  Cys  Arg  Phe  Arg
85  90  95
Val  Thr  Gln  Leu  Pro  Asn  Gly  Arg  Asp  Phe  His  Met  Ser  Val  Val  Arg
100  105  110
Ala  Arg  Arg  Asn  Asp  Ser  Gly  Thr  Tyr  Leu  Cys  Gly  Ala  Ile  Ser  Leu
115  120  125
Ala  Pro  Lys  Ala  Gln  Ile  Lys  Glu  Ser  Leu  Arg  Ala  Glu  Leu  Arg  Val
130  135  140
Thr  Glu  Arg  Arg  Ala  Glu  Val  Pro  Thr  Ala  His  Pro  Ser  Pro  Ser  Pro
145  150  155  160
Arg  Pro  Ala  Gly  Gln  Phe  Gln  Thr  Leu  Val  Val  Gly  Val  Val  Gly  Gly
165  170  175
Leu  Leu  Gly  Ser  Leu  Val  Leu  Leu  Val  Trp  Val  Leu  Ala  Val  Ile  Cys
180  185  190
Ser  Arg  Ala  Ala  Arg  Gly  Thr  Ile  Gly  Ala  Arg  Arg  Thr  Gly  Gln  Pro
195  200  205
Leu  Lys  Glu  Asp  Pro  Ser  Ala
210  215
<210>  18
<211>  215
<212>  PRT

27
CN 112142854 A 序　列　表 9/18 页

<213>  PD-1序列3(2  Ambystoma  laterale  x  Ambystoma  jeffersonianum)

<400>  18
Met  Gln  Ile  Pro  Gln  Ala  Pro  Trp  Pro  Val  Val  Trp  Ala  Val  Leu  Gln
1  5  10  15
Leu  Gly  Trp  Arg  Pro  Gly  Trp  Phe  Leu  Asp  Ser  Pro  Asp  Arg  Pro  Trp
20  25  30
Asn  Pro  Pro  Thr  Phe  Ser  Pro  Ala  Leu  Leu  Val  Val  Thr  Glu  Gly  Asp
35  40  45
Asn  Ala  Thr  Phe  Thr  Cys  Ser  Phe  Ser  Asn  Thr  Ser  Glu  Ser  Phe  Val
50  55  60
Leu  Asn  Trp  Tyr  Arg  Arg  Ser  Pro  Ser  Asn  Lys  Thr  Asp  Lys  Leu  Ala
65  70  75  80
Ala  Phe  Pro  Glu  Asp  Arg  Ser  Gln  Pro  Gly  Gln  Asp  Cys  Arg  Phe  Arg
85  90  95
Val  Thr  Gln  Leu  Pro  Asn  Gly  Arg  Asp  Phe  His  Met  Ser  Val  Val  Arg
100  105  110
Ala  Arg  Arg  Asn  Asp  Ser  Gly  Thr  Tyr  Leu  Cys  Gly  Ala  Ile  Ser  Leu
115  120  125
Ala  Pro  Lys  Ala  Gln  Ile  Lys  Glu  Ser  Leu  Arg  Ala  Glu  Leu  Arg  Val
130  135  140
Thr  Glu  Arg  Arg  Ala  Glu  Val  Pro  Thr  Ala  His  Pro  Ser  Pro  Ser  Pro
145  150  155  160
Arg  Pro  Ala  Gly  Gln  Phe  Gln  Thr  Leu  Val  Val  Gly  Val  Val  Gly  Gly
165  170  175
Leu  Leu  Gly  Ser  Leu  Val  Leu  Leu  Val  Trp  Val  Leu  Ala  Val  Ile  Cys
180  185  190
Ser  Arg  Ala  Ala  Arg  Gly  Thr  Ile  Gly  Ala  Arg  Arg  Thr  Gly  Gln  Pro
195  200  205
Leu  Lys  Glu  Asp  Pro  Ser  Ala
210  215
<210>  19
<211>  181
<212>  PRT
<213>  TIGIT序列1(2  Ambystoma  laterale  x  Ambystoma  jeffersonianum)
<400>  19
Met  Arg  Trp  Cys  Leu  Leu  Leu  Ile  Trp  Ala  Gln  Gly  Leu  Arg  Gln  Ala
1  5  10  15
Pro  Leu  Ala  Ser  Gly  Met  Met  Thr  Gly  Thr  Ile  Glu  Thr  Thr  Gly  Asn
20  25  30

28
CN 112142854 A 序　列　表 10/18 页

Ile  Ser  Ala  Glu  Lys  Gly  Gly  Ser  Ile  Ile  Leu  Gln  Cys  His  Leu  Ser
35  40  45
Ser  Thr  Thr  Ala  Gln  Val  Thr  Gln  Val  Asn  Trp  Glu  Gln  Gln  Asp  Gln
50  55  60
Leu  Leu  Ala  Ile  Cys  Asn  Ala  Asp  Leu  Gly  Trp  His  Ile  Ser  Pro  Ser
65  70  75  80
Phe  Lys  Asp  Arg  Val  Ala  Pro  Gly  Pro  Gly  Leu  Gly  Leu  Thr  Leu  Gln
85  90  95
Ser  Leu  Thr  Val  Asn  Asp  Thr  Gly  Glu  Tyr  Phe  Cys  Ile  Tyr  His  Thr
100  105  110
Tyr  Pro  Asp  Gly  Thr  Tyr  Thr  Gly  Arg  Ile  Phe  Leu  Glu  Val  Leu  Glu
115  120  125
Ser  Ser  Val  Ala  Glu  His  Gly  Ala  Arg  Phe  Gln  Ile  Pro  Leu  Leu  Gly
130  135  140
Ala  Met  Ala  Ala  Thr  Leu  Val  Val  Ile  Cys  Thr  Ala  Val  Ile  Val  Val
145  150  155  160
Val  Ala  Leu  Thr  Arg  Lys  Phe  Val  Cys  Phe  Arg  Ile  His  Ser  Val  Glu
165  170  175
Gly  Asp  Leu  Arg  Arg
180
<210>  20
<211>  181
<212>  PRT
<213>  TIGIT序列2(2  Ambystoma  laterale  x  Ambystoma  jeffersonianum)
<400>  20
Met  Arg  Trp  Cys  Leu  Leu  Leu  Ile  Trp  Ala  Gln  Gly  Leu  Arg  Gln  Ala
1  5  10  15
Pro  Leu  Ala  Ser  Gly  Met  Met  Thr  Gly  Thr  Ile  Glu  Thr  Thr  Gly  Asn
20  25  30
Ile  Ser  Ala  Glu  Lys  Gly  Gly  Ser  Ile  Ile  Leu  Gln  Cys  His  Leu  Ser
35  40  45
Ser  Thr  Thr  Ala  Gln  Val  Thr  Gln  Val  Asn  Trp  Glu  Gln  Gln  Asp  Gln
50  55  60
Leu  Leu  Ala  Ile  Cys  Asn  Ala  Asp  Leu  Gly  Trp  His  Ile  Ser  Pro  Ser
65  70  75  80
Phe  Lys  Asp  Arg  Val  Ala  Pro  Gly  Pro  Gly  Leu  Gly  Leu  Thr  Leu  Gln
85  90  95
Ser  Leu  Thr  Val  Asn  Asp  Thr  Gly  Glu  Tyr  Phe  Cys  Ile  Tyr  His  Thr
100  105  110

29
CN 112142854 A 序　列　表 11/18 页

Arg  Pro  Asp  Gly  Thr  Tyr  Thr  Gly  Arg  Ile  Phe  Leu  Glu  Val  Leu  Glu
115  120  125
Ser  Ser  Val  Ala  Glu  His  Gly  Ala  Arg  Phe  Gln  Ile  Pro  Leu  Leu  Gly
130  135  140
Ala  Met  Ala  Ala  Thr  Leu  Val  Val  Ile  Cys  Thr  Ala  Val  Ile  Val  Val
145  150  155  160
Val  Ala  Leu  Thr  Arg  Lys  Phe  Val  Cys  Phe  Arg  Ile  His  Ser  Val  Glu
165  170  175
Gly  Asp  Leu  Arg  Arg
180
<210>  21
<211>  181
<212>  PRT
<213>  TIGIT序列3(2  Ambystoma  laterale  x  Ambystoma  jeffersonianum)
<400>  21
Met  Arg  Trp  Cys  Leu  Leu  Leu  Ile  Trp  Ala  Gln  Gly  Leu  Arg  Gln  Ala
1  5  10  15
Pro  Leu  Ala  Ser  Gly  Met  Met  Thr  Gly  Thr  Ile  Glu  Thr  Thr  Gly  Asn
20  25  30
Ile  Ser  Ala  Glu  Lys  Gly  Gly  Ser  Ile  Ile  Leu  Gln  Cys  His  Leu  Ser
35  40  45
Ser  Thr  Thr  Ala  Gln  Val  Thr  Gln  Val  Asn  Trp  Glu  Gln  Gln  Asp  Gln
50  55  60
Leu  Leu  Ala  Ile  Cys  Asn  Ala  Asp  Leu  Gly  Trp  His  Ile  Ser  Pro  Ser
65  70  75  80
Phe  Lys  Asp  Arg  Val  Ala  Pro  Gly  Pro  Gly  Leu  Gly  Leu  Thr  Leu  Gln
85  90  95
Ser  Leu  Thr  Val  Asn  Asp  Thr  Gly  Glu  Tyr  Phe  Cys  Ile  Tyr  His  Thr
100  105  110
Lys  Pro  Asp  Gly  Thr  Tyr  Thr  Gly  Arg  Ile  Phe  Leu  Glu  Val  Leu  Glu
115  120  125
Ser  Ser  Val  Ala  Glu  His  Gly  Ala  Arg  Phe  Gln  Ile  Pro  Leu  Leu  Gly
130  135  140
Ala  Met  Ala  Ala  Thr  Leu  Val  Val  Ile  Cys  Thr  Ala  Val  Ile  Val  Val
145  150  155  160
Val  Ala  Leu  Thr  Arg  Lys  Phe  Val  Cys  Phe  Arg  Ile  His  Ser  Val  Glu
165  170  175
Gly  Asp  Leu  Arg  Arg
180

30
CN 112142854 A 序　列　表 12/18 页

<210>  22
<211>  659
<212>  PRT
<213>  K D-593  CAR分子氨基酸 序列 (2  Am bys toma  la tera le  x  Am bys toma 
jeffersonianum)
<400>  22
Met  Ala  Leu  Pro  Val  Thr  Ala  Leu  Leu  Leu  Pro  Leu  Ala  Leu  Leu  Leu
1  5  10  15
His  Ala  Ala  Arg  Pro  Ser  Leu  Phe  Asn  Gln  Glu  Val  Gln  Ile  Pro  Leu
20  25  30
Thr  Glu  Ser  Tyr  Cys  Gly  Pro  Cys  Pro  Lys  Asn  Trp  Ile  Cys  Tyr  Lys
35  40  45
Asn  Asn  Cys  Tyr  Gln  Phe  Phe  Asp  Glu  Ser  Lys  Asn  Trp  Tyr  Glu  Ser
50  55  60
Gln  Ala  Ser  Cys  Met  Ser  Gln  Asn  Ala  Ser  Leu  Leu  Lys  Val  Tyr  Ser
65  70  75  80
Lys  Glu  Asp  Gln  Asp  Leu  Leu  Lys  Leu  Val  Lys  Ser  Tyr  His  Trp  Met
85  90  95
Gly  Leu  Val  His  Ile  Pro  Thr  Asn  Gly  Ser  Trp  Gln  Trp  Glu  Asp  Gly
100  105  110
Ser  Ile  Leu  Ser  Pro  Asn  Leu  Leu  Thr  Ile  Ile  Glu  Met  Gln  Lys  Gly
115  120  125
Asp  Cys  Ala  Leu  Tyr  Ala  Ser  Ser  Phe  Lys  Gly  Tyr  Ile  Glu  Asn  Cys
130  135  140
Ser  Thr  Pro  Asn  Thr  Tyr  Ile  Cys  Met  Gln  Arg  Thr  Val  Thr  Thr  Thr
145  150  155  160
Pro  Ala  Pro  Arg  Pro  Pro  Thr  Pro  Ala  Pro  Thr  Ile  Ala  Ser  Gln  Pro
165  170  175
Leu  Ser  Leu  Arg  Pro  Glu  Ala  Cys  Arg  Pro  Ala  Ala  Gly  Gly  Ala  Val
180  185  190
His  Thr  Arg  Gly  Leu  Asp  Phe  Ala  Cys  Asp  Phe  Trp  Val  Leu  Val  Val
195  200  205
Val  Gly  Gly  Val  Leu  Ala  Cys  Tyr  Ser  Leu  Leu  Val  Thr  Val  Ala  Phe
210  215  220
Ile  Ile  Phe  Trp  Val  Arg  Ser  Lys  Arg  Ser  Arg  Leu  Leu  His  Ser  Asp
225  230  235  240
Tyr  Met  Asn  Met  Thr  Pro  Arg  Arg  Pro  Gly  Pro  Thr  Arg  Lys  His  Tyr
245  250  255
Gln  Pro  Tyr  Ala  Pro  Pro  Arg  Asp  Phe  Ala  Ala  Tyr  Arg  Ser  Arg  Asp

31
CN 112142854 A 序　列　表 13/18 页

260  265  270

Gln  Arg  Leu  Pro  Pro  Asp  Ala  His  Lys  Pro  Pro  Gly  Gly  Gly  Ser  Phe
275  280  285
Arg  Thr  Pro  Ile  Gln  Glu  Glu  Gln  Ala  Asp  Ala  His  Ser  Thr  Leu  Ala
290  295  300
Lys  Ile  Arg  Val  Lys  Phe  Ser  Arg  Ser  Ala  Asp  Ala  Pro  Ala  Tyr  Gln
305  310  315  320
Gln  Gly  Gln  Asn  Gln  Leu  Tyr  Asn  Glu  Leu  Asn  Leu  Gly  Arg  Arg  Glu
325  330  335
Glu  Tyr  Asp  Val  Leu  Asp  Lys  Arg  Arg  Gly  Arg  Asp  Pro  Glu  Met  Gly
340  345  350
Gly  Lys  Pro  Arg  Arg  Lys  Asn  Pro  Gln  Glu  Gly  Leu  Tyr  Asn  Glu  Leu
355  360  365
Gln  Lys  Asp  Lys  Met  Ala  Glu  Ala  Tyr  Ser  Glu  Ile  Gly  Met  Lys  Gly
370  375  380
Glu  Arg  Arg  Arg  Gly  Lys  Gly  His  Asp  Gly  Leu  Tyr  Gln  Gly  Leu  Ser
385  390  395  400
Thr  Ala  Thr  Lys  Asp  Thr  Tyr  Asp  Ala  Leu  His  Met  Gln  Ala  Leu  Pro
405  410  415
Pro  Arg  Arg  Ala  Lys  Arg  Ser  Gly  Ser  Gly  Glu  Gly  Arg  Gly  Ser  Leu
420  425  430
Leu  Thr  Cys  Gly  Asp  Val  Glu  Glu  Asn  Pro  Gly  Pro  Met  Gln  Ile  Pro
435  440  445
Gln  Ala  Pro  Trp  Pro  Val  Val  Trp  Ala  Val  Leu  Gln  Leu  Gly  Trp  Arg
450  455  460
Pro  Gly  Trp  Phe  Leu  Asp  Ser  Pro  Asp  Arg  Pro  Trp  Asn  Pro  Pro  Thr
465  470  475  480
Phe  Ser  Pro  Ala  Leu  Leu  Val  Val  Thr  Glu  Gly  Asp  Asn  Ala  Thr  Phe
485  490  495
Thr  Cys  Ser  Phe  Ser  Asn  Thr  Ser  Glu  Ser  Phe  Val  Leu  Asn  Trp  Tyr
500  505  510
Arg  Met  Ser  Pro  Ser  Asn  Gln  Thr  Asp  Lys  Leu  Ala  Ala  Phe  Pro  Glu
515  520  525
Asp  Arg  Ser  Gln  Pro  Gly  Gln  Asp  Cys  Arg  Phe  Arg  Val  Thr  Gln  Leu
530  535  540
Pro  Asn  Gly  Arg  Asp  Phe  His  Met  Ser  Val  Val  Arg  Ala  Arg  Arg  Asn
545  550  555  560
Asp  Ser  Gly  Thr  Tyr  Leu  Cys  Gly  Ala  Ile  Ser  Leu  Ala  Pro  Lys  Ala
565  570  575

32
CN 112142854 A 序　列　表 14/18 页

Gln  Ile  Lys  Glu  Ser  Leu  Arg  Ala  Glu  Leu  Arg  Val  Thr  Glu  Arg  Arg
580  585  590
Ala  Glu  Val  Pro  Thr  Ala  His  Pro  Ser  Pro  Ser  Pro  Arg  Pro  Ala  Gly
595  600  605
Gln  Phe  Gln  Thr  Leu  Val  Val  Gly  Val  Val  Gly  Gly  Leu  Leu  Gly  Ser
610  615  620
Leu  Val  Leu  Leu  Val  Trp  Val  Leu  Ala  Val  Ile  Cys  Ser  Arg  Ala  Ala
625  630  635  640
Arg  Gly  Thr  Ile  Gly  Ala  Arg  Arg  Thr  Gly  Gln  Pro  Leu  Gln  Glu  Asp
645  650  655
Pro  Ser  Val
<210>  23
<211>  625
<212>  PRT
<213>  K D-323  CAR分子氨基酸 序列 (2  Am bys toma  la tera le  x  Am bys toma 
jeffersonianum)
<400>  23
Met  Ala  Leu  Pro  Val  Thr  Ala  Leu  Leu  Leu  Pro  Leu  Ala  Leu  Leu  Leu
1  5  10  15
His  Ala  Ala  Arg  Pro  Ser  Leu  Phe  Asn  Gln  Glu  Val  Gln  Ile  Pro  Leu
20  25  30
Thr  Glu  Ser  Tyr  Cys  Gly  Pro  Cys  Pro  Lys  Asn  Trp  Ile  Cys  Tyr  Lys
35  40  45
Asn  Asn  Cys  Tyr  Gln  Phe  Phe  Asp  Glu  Ser  Lys  Asn  Trp  Tyr  Glu  Ser
50  55  60
Gln  Ala  Ser  Cys  Met  Ser  Gln  Asn  Ala  Ser  Leu  Leu  Lys  Val  Tyr  Ser
65  70  75  80
Lys  Glu  Asp  Gln  Asp  Leu  Leu  Lys  Leu  Val  Lys  Ser  Tyr  His  Trp  Met
85  90  95
Gly  Leu  Val  His  Ile  Pro  Thr  Asn  Gly  Ser  Trp  Gln  Trp  Glu  Asp  Gly
100  105  110
Ser  Ile  Leu  Ser  Pro  Asn  Leu  Leu  Thr  Ile  Ile  Glu  Met  Gln  Lys  Gly
115  120  125
Asp  Cys  Ala  Leu  Tyr  Ala  Ser  Ser  Phe  Lys  Gly  Tyr  Ile  Glu  Asn  Cys
130  135  140
Ser  Thr  Pro  Asn  Thr  Tyr  Ile  Cys  Met  Gln  Arg  Thr  Val  Thr  Thr  Thr
145  150  155  160
Pro  Ala  Pro  Arg  Pro  Pro  Thr  Pro  Ala  Pro  Thr  Ile  Ala  Ser  Gln  Pro
165  170  175

33
CN 112142854 A 序　列　表 15/18 页

Leu  Ser  Leu  Arg  Pro  Glu  Ala  Cys  Arg  Pro  Ala  Ala  Gly  Gly  Ala  Val
180  185  190
His  Thr  Arg  Gly  Leu  Asp  Phe  Ala  Cys  Asp  Phe  Trp  Val  Leu  Val  Val
195  200  205
Val  Gly  Gly  Val  Leu  Ala  Cys  Tyr  Ser  Leu  Leu  Val  Thr  Val  Ala  Phe
210  215  220
Ile  Ile  Phe  Trp  Val  Arg  Ser  Lys  Arg  Ser  Arg  Leu  Leu  His  Ser  Asp
225  230  235  240
Tyr  Met  Asn  Met  Thr  Pro  Arg  Arg  Pro  Gly  Pro  Thr  Arg  Lys  His  Tyr
245  250  255
Gln  Pro  Tyr  Ala  Pro  Pro  Arg  Asp  Phe  Ala  Ala  Tyr  Arg  Ser  Arg  Asp
260  265  270
Gln  Arg  Leu  Pro  Pro  Asp  Ala  His  Lys  Pro  Pro  Gly  Gly  Gly  Ser  Phe
275  280  285
Arg  Thr  Pro  Ile  Gln  Glu  Glu  Gln  Ala  Asp  Ala  His  Ser  Thr  Leu  Ala
290  295  300
Lys  Ile  Arg  Val  Lys  Phe  Ser  Arg  Ser  Ala  Asp  Ala  Pro  Ala  Tyr  Gln
305  310  315  320
Gln  Gly  Gln  Asn  Gln  Leu  Tyr  Asn  Glu  Leu  Asn  Leu  Gly  Arg  Arg  Glu
325  330  335
Glu  Tyr  Asp  Val  Leu  Asp  Lys  Arg  Arg  Gly  Arg  Asp  Pro  Glu  Met  Gly
340  345  350
Gly  Lys  Pro  Arg  Arg  Lys  Asn  Pro  Gln  Glu  Gly  Leu  Tyr  Asn  Glu  Leu
355  360  365
Gln  Lys  Asp  Lys  Met  Ala  Glu  Ala  Tyr  Ser  Glu  Ile  Gly  Met  Lys  Gly
370  375  380
Glu  Arg  Arg  Arg  Gly  Lys  Gly  His  Asp  Gly  Leu  Tyr  Gln  Gly  Leu  Ser
385  390  395  400
Thr  Ala  Thr  Lys  Asp  Thr  Tyr  Asp  Ala  Leu  His  Met  Gln  Ala  Leu  Pro
405  410  415
Pro  Arg  Arg  Ala  Lys  Arg  Ser  Gly  Ser  Gly  Glu  Gly  Arg  Gly  Ser  Leu
420  425  430
Leu  Thr  Cys  Gly  Asp  Val  Glu  Glu  Asn  Pro  Gly  Pro  Met  Arg  Trp  Cys
435  440  445
Leu  Leu  Leu  Ile  Trp  Ala  Gln  Gly  Leu  Arg  Gln  Ala  Pro  Leu  Ala  Ser
450  455  460
Gly  Met  Met  Thr  Gly  Thr  Ile  Glu  Thr  Thr  Gly  Asn  Ile  Ser  Ala  Glu
465  470  475  480
Lys  Gly  Gly  Ser  Ile  Ile  Leu  Gln  Cys  His  Leu  Ser  Ser  Thr  Thr  Ala

34
CN 112142854 A 序　列　表 16/18 页

485  490  495

Gln  Val  Thr  Gln  Val  Asn  Trp  Glu  Gln  Gln  Asp  Gln  Leu  Leu  Ala  Ile
500  505  510
Cys  Asn  Ala  Asp  Leu  Gly  Trp  His  Ile  Ser  Pro  Ser  Phe  Lys  Asp  Arg
515  520  525
Val  Ala  Pro  Gly  Pro  Gly  Leu  Gly  Leu  Thr  Leu  Gln  Ser  Leu  Thr  Val
530  535  540
Asn  Asp  Thr  Gly  Glu  Tyr  Phe  Cys  Ile  Tyr  His  Thr  Tyr  Pro  Asp  Gly
545  550  555  560
Thr  Tyr  Thr  Gly  Arg  Ile  Phe  Leu  Glu  Val  Leu  Glu  Ser  Ser  Val  Ala
565  570  575
Glu  His  Gly  Ala  Arg  Phe  Gln  Ile  Pro  Leu  Leu  Gly  Ala  Met  Ala  Ala
580  585  590
Thr  Leu  Val  Val  Ile  Cys  Thr  Ala  Val  Ile  Val  Val  Val  Ala  Leu  Thr
595  600  605
Arg  Lys  Phe  Val  Cys  Phe  Arg  Ile  His  Ser  Val  Glu  Gly  Asp  Leu  Arg
610  615  620
Arg
625
<210>  24
<211>  1977
<212>  DNA
<213>  K D-593  CAR分子核苷酸 序列 (2  Am bys toma  la tera le  x  Am bys toma 
jeffersonianum)
<400>  24
atggcacttc  ctgtgacagc  tcttttgctg  ccattggccc  tgttgcttca  cgctgctcgg  60
ccatcattgt  tcaatcagga  ggtccaaatt  cctctcaccg  agagttactg  tggtccttgc  120
cccaaaaact  ggatctgtta  caagaataac  tgctaccaat  ttttcgatga  atctaaaaac  180
tggtatgagt  cccaagcctc  ttgtatgtcc  caaaacgcga  gcctccttaa  agtatacagc  240
aaagaggacc  aggacctttt  gaagctggtc  aagtcttacc  actggatggg  gcttgtacat  300
atccctacga  atggaagttg  gcaatgggag  gacggcagca  ttctcagccc  aaatctgctt  360
actattattg  aaatgcagaa  gggggattgt  gctctttatg  caagctcttt  caaaggttac  420
atcgaaaatt  gctccacccc  taatacctac  atatgtatgc  aaagaacggt  tacgacgacg  480
ccagccccgc  gcccgcctac  acctgctccg  acgatagcaa  gtcaaccgtt  gtcattgcgc  540
cccgaagctt  gtaggcctgc  cgcggggggc  gcagtgcata  cgcgcggcct  ggatttcgcc  600
tgtgatttct  gggtgcttgt  ggttgtcgga  ggcgtgctcg  cttgttactc  acttctcgtc  660
accgtcgcgt  tcatcatttt  ctgggtccgg  tcaaaaaggt  cacgcctgct  ccacagtgac  720
tacatgaata  tgaccccacg  acggcccggg  cctacccgga  aacattacca  gccctacgct  780
ccaccacggg  attttgctgc  atatcggtca  cgcgatcagc  gactgccgcc  ggatgcccac  840

35
CN 112142854 A 序　列　表 17/18 页

aaaccgccag  ggggtgggag  ctttcgaaca  cccatccaag  aggaacaagc  ggatgcacat  900

agtacacttg  ctaaaataag  ggttaaattc  tctaggagtg  cggatgcacc  ggcatatcag  960
cagggccaaa  accaactcta  taatgaattg  aatctcggta  ggcgggagga  atacgatgtg  1020
ctcgataaac  gacgaggtag  ggatccagag  atgggcggta  aaccacgccg  gaaaaatcct  1080
caagaagggc  tgtacaacga  gctccagaag  gataaaatgg  cagaagcata  cagtgagata  1140
ggcatgaagg  gggaacggcg  gaggggtaaa  ggtcacgacg  gactctatca  aggtttgtca  1200
acagcgacaa  aggataccta  cgacgcgctt  catatgcaag  ccctcccacc  tagaagggca  1260
aaaagatcag  ggtctggaga  ggggaggggc  agtctcctca  catgcggcga  tgtagaagaa  1320
aaccctggac  cgatgcagat  tcctcaagca  ccctggcctg  tagtgtgggc  cgtattgcag  1380
cttgggtggc  gacccggctg  gttccttgac  agcccagacc  gaccttggaa  tccgccaaca  1440
tttagtccag  cacttctggt  agtcacagaa  ggcgataacg  cgacttttac  ttgcagtttc  1500
agcaacacaa  gtgaatcttt  tgttttgaat  tggtacagga  tgtcccccag  taaccagacc  1560
gacaaacttg  cggccttccc  tgaggaccgg  agtcagccgg  ggcaggattg  ccgctttagg  1620
gtcacacaac  ttcctaatgg  gcgagacttc  cacatgtccg  tagtaagggc  acggcgaaat  1680
gactctggaa  catatctttg  tggggccata  tcactggctc  cgaaagcgca  gataaaggag  1740
tctttgcgag  cggagttgag  agtgactgaa  cgacgagcgg  aggtgccgac  ggctcaccct  1800
agcccgtctc  cacgacccgc  ggggcagttt  cagactctgg  ttgtgggggt  tgttggtggc  1860
cttctcggtt  cccttgttct  gctggtttgg  gtgttggcgg  taatctgtag  tagagcggct  1920
cgagggacga  taggggctcg  aaggaccgga  cagcccctcc  aagaagatcc  cagcgta  1977
<210>  25
<211>  1875
<212>  DNA
<213>  K D-323  CAR分子核苷酸 序列 (2  Am bys toma  la tera le  x  Am bys toma 
jeffersonianum)
<400>  25
atggccttgc  cggttacagc  cttgctcctc  ccgcttgcac  tccttttgca  tgctgcccgc  60
ccatctcttt  ttaatcaaga  ggtccagatt  cccttgacag  aatcatattg  cggcccttgt  120
ccaaagaatt  ggatctgcta  caaaaataac  tgctatcaat  tctttgatga  gagtaaaaat  180
tggtatgagt  cacaggcctc  ttgtatgtcc  cagaatgcct  ccctgctcaa  ggtctactca  240
aaagaggatc  aagacctctt  gaagctggta  aagtcctacc  attggatggg  cctcgtgcac  300
atacctacaa  acggttcatg  gcaatgggag  gacggttcta  tcctttcccc  gaacctcctt  360
acaattattg  aaatgcagaa  aggagattgt  gccctgtacg  ctagttcctt  taagggctat  420
atagagaatt  gttctacacc  aaatacttac  atctgtatgc  agcgcacagt  aactacaact  480
cccgccccaa  ggccccccac  tcccgctcca  actattgctt  cacaaccttt  gtcactgcgc  540
cctgaagcat  gtcggccagc  tgccgggggg  gcagtgcata  ctcgggggct  cgactttgct  600
tgtgacttct  gggttttggt  cgtggtggga  ggggtgttgg  cgtgctactc  actgttggtt  660
acggttgcat  ttatcatttt  ttgggtcagg  agcaagagat  caagacttct  ccacagcgat  720
tacatgaaca  tgacgccacg  gagacctggc  cccacacgca  aacattacca  accatacgcc  780
ccgccacgcg  atttcgcagc  gtatcgctcc  agagaccagc  gactcccacc  agacgcgcac  840

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CN 112142854 A 序　列　表 18/18 页

aaaccacctg  gaggcggttc  cttcagaacg  cccattcagg  aagaacaagc  tgacgcccac  900

tcaactctcg  ccaaaataag  agtaaaattt  tcacgctcag  cagacgcccc  cgcatatcag  960
caggggcaaa  atcagttgta  taacgaactt  aacctcggcc  gacgcgagga  gtacgacgtc  1020
ttggacaaaa  ggaggggacg  agatccagaa  atgggtggaa  aaccgagacg  aaagaatcct  1080
caagaaggtc  tttataacga  acttcagaaa  gataaaatgg  ccgaagcgta  ctccgaaata  1140
gggatgaaag  gcgagaggcg  aaggggtaaa  ggacatgacg  gtctctatca  ggggttgagt  1200
acggccacta  aagatacgta  tgacgccctg  catatgcaag  ctcttccacc  tcgacgcgct  1260
aagaggagtg  gatctggtga  gggacgcggc  tccctcctta  cttgtggaga  tgttgaggag  1320
aatccaggcc  cgatgcgctg  gtgcctgctt  ctgatatggg  cccaaggact  gagacaggcc  1380
ccactcgcaa  gcggtatgat  gaccggaaca  atcgaaacta  caggtaatat  cagcgcagaa  1440
aaaggcggca  gtataattct  ccaatgccac  ctgtctagca  ccactgccca  agtgacccag  1500
gtaaactggg  aacaacagga  ccaactcttg  gccatctgca  atgctgacct  ggggtggcac  1560
atcagcccga  gcttcaaaga  tcgggtagcg  ccgggaccgg  gattggggct  cactctgcaa  1620
tcattgacag  ttaacgacac  cggagaatac  ttttgcatat  atcacacgta  cccagatggc  1680
acttacacgg  gacgaatatt  cctggaggta  cttgaatctt  ctgttgctga  acacggtgcc  1740
cggttccaaa  ttccgttgct  cggcgcgatg  gctgcgaccc  ttgtagtgat  atgtactgct  1800
gtaatagtcg  tagtggccct  tacaaggaag  tttgtgtgtt  tccgcattca  tagcgttgag  1860
ggggacctca  gacgg  1875

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CN 112142854 A 说　明　书　附　图 1/9 页

图1

图2

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CN 112142854 A 说　明　书　附　图 2/9 页

图3

图4

39
CN 112142854 A 说　明　书　附　图 3/9 页

图5

图6

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CN 112142854 A 说　明　书　附　图 4/9 页

图7

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CN 112142854 A 说　明　书　附　图 5/9 页

图8

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CN 112142854 A 说　明　书　附　图 6/9 页

图9

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CN 112142854 A 说　明　书　附　图 7/9 页

图10

图11

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CN 112142854 A 说　明　书　附　图 8/9 页

图12

图13

45
CN 112142854 A 说　明　书　附　图 9/9 页

图14

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