SDS-PAGE Desarrollo

0:09
SDS PAGE is a technique used by many researchers to separate mixtures of proteins by size.

0:16
Successful completion of this technique is an essential first step for many methods of protein analysis,
like immunoblotting.

0:24
By itself, it is a useful tool in assessing protein size and purity.

0:35
In order to understand the SDS PAGE technique, you must first understand its principal components.

0:42
SDS PAGE stands for sodium dodasil sulfate, polyacrylamide gel electrophoresis, sodium dodasil
sulfate.

0:50
The first part of this, or SDS, is an anionic detergent.

0:55
This means that it is composed of a hydrophilic group with a net negative charge and a long
hydrophobic chain with neutral charge.

1:04
The hydrophobic chain blankets proteins in proportion to their mass at a rate of 1.4g of SDS per gram
of protein.

1:13
This provides the proteins with the driving force necessary for size driven separation in an electric
field.

1:20
Polyacrylamide gel electrophoresis utilizes a hydrogel made from polyacrylamide.

1:26
Polyacrylamide is a polymer that forms a very regular matrix through which proteins can move.

1:33
The more concentrated the gel is, the slower the proteins will traverse across it when exposed to an
electric field.

1:40
The process of using a spatially uniform electric field to influence an object's motion is known as
electrophoresis.

1:50
SDS PAGE is performed on proteins isolated from many different sources, including cells in culture,
tissues, blood, urine and yeast.

2:02
Proteins from these various sources must first be separated from other cellular components using
techniques including homogenization and centrifugation, often followed by the use of lysis buffers.

2:15
Once the protein is is isolated, its concentration is often measured to ensure equal loading of samples
by comparing the amount of protein in the sample to albumin standards in a bisynconic acid or BCA
colorimetric assay.

2:32
An important step to remember is the addition of the loading buffer.

2:36
The loading buffer has three main functions.

2:40
First, thanks to SDS and additional reducing agents, it denatures the proteins, which basically means it
turns complex protein structures into a linear chain of amino acids.

2:53
Secondly, it contains glycerin, which ensures that the sample doesn't float away when it's loaded in
the wells of the gel.

3:00
And finally, most commercial loading buffers include a dye such as bromophenol blue, which can be
tracked to measure the progress of the electrophoresis step.

3:10
After adding the loading buffer, the samples need to be mixed and then boiled for 5 minutes.

3:17
This allows the strong disulfide bonds in the proteins to be broken with the help of a reducing agent
such as beta mercapto ethanol.

3:25
Once all the disulfide bonds are broken, SDS Canmore evenly coat the proteins.

3:31
Next, the samples are quickly spun down and are then ready to be loaded into the gel system for
electrophoresis.
3:46
Before the samples can be loaded, the gel system must first be assembled.

3:51
This begins with the purchase or fabrication of a polyacrylamide gel.

3:56
Pre made gels are becoming more and more popular because acrylamide is neurotoxic and can cause
brain damage.

4:03
The gel cassette contains wells that are used to load the samples.

4:08
Once the gels are secured into place, the inner and outer chambers are filled with a buffer that
contains the same concentration of ions used to make the gels.

4:19
This creates an electrical circuit that passes seamlessly from the cathode, through the gel and into the
anode.

4:26
Next, molecular weight ladders are typically loaded into the gel followed by the samples.

4:32
As the gel runs, the latter will spread and create visible protein bands of known sizes.

4:39
At the final steps, these bands can be used to calculate each protein size.

4:45
Once all the samples are loaded, the positive and negative terminals on the gel box are connected to
a power source capable of maintaining a constant voltage for a long period of time.

4:57
Gels are typically started at around 60 volts until the entire sample has entered the gel region called
the stacking gel.

5:05
Then the voltage is increased to around 200 volts for 30 minutes to one hour, depending on the size
and concentration of the gel and the size of the protein of interest.

5:23
When electrophoresis is complete, the cassette is removed and opened to expose the gel.

5:29
The gel can then be stained with a typical protein stain such as Kumasi, blue or Silverstein to visualize
the protein bands within the gel.

5:38
Kumasi stain can detect bands with as little as 15 nanograms of protein, whereas silver stain can
detect bands with as little as one nanogram of protein.

5:48
In two-dimensional gel electrophoresis samples are separated by two separate properties on gels 1
dimension at a time.

5:57
First samples are loaded and arranged according to their isoelectric points on localized pH gradient
strips.

6:04
The proteins in the strip are then denatured and are placed on top of a typical polyacrylamide gel
where they are secured in place with fresh gel solution.

6:14
Then second dimension separation is performed by SDS PAGE.

6:20
While isoelectric focusing isn't the only option for 2D gel electrophoresis, it is the most common 2
dimensional gel.

6:28
Electrophoresis is an invaluable tool that provides insights into protein complexes and suborganelle
organization.

6:37
After running the gel, a very common next step is to transfer the proteins from the gel onto a
membrane made of PVDF or nylon for analysis.

6:48
You can then use specific antibodies to probe the membrane and look for proteins of interest.

6:55
Shown here are typical immunoblot results where the researcher used three different signal
amplification techniques to determine which best shows the presence of the PIT ONE protein
throughout a number of serial dilutions.

7:09
You've just watched Joe's video on protein separation using SDS page.

7:15
You should now understand the steps involved in resolving a protein by size using this powerful
technique.

7:22
As always, thanks for watching.
SDS-PAGE Desarrollo

0:09
SDS PAGE es una técnica utilizada por muchos investigadores para separar mezclas de proteínas por tamaño.

0:16
La realización con éxito de esta técnica es un primer paso esencial para muchos métodos de análisis de
proteínas, como el immunoblotting.

0:24
Por sí misma, es una herramienta útil para evaluar el tamaño y la pureza de las proteínas.

0:35
Para comprender la técnica SDS PAGE, primero hay que entender sus componentes principales.

0:42
SDS PAGE son las siglas de sodium dodasil sulfate, electroforesis en gel de poliacrilamida.

0:50
La primera parte, o SDS, es un detergente aniónico.

0:55
Esto significa que está compuesto por un grupo hidrófilo con carga neta negativa y una larga cadena hidrófoba
con carga neutra.

1:04
La cadena hidrófoba blanquea las proteínas en proporción a su masa, a razón de 1,4 g de SDS por gramo de
proteína.

1:13
Esto proporciona a las proteínas la fuerza motriz necesaria para la separación por tamaño en un campo eléctrico.

1:20
La electroforesis en gel de poliacrilamida utiliza un hidrogel hecho de poliacrilamida.

1:26
La poliacrilamida es un polímero que forma una matriz muy regular a través de la cual pueden moverse las
proteínas.

1:33
Cuanto más concentrado esté el gel, más lentamente lo atravesarán las proteínas cuando se expongan a un
campo eléctrico.
1:40
El proceso de utilizar un campo eléctrico espacialmente uniforme para influir en el movimiento de un objeto se
conoce como electroforesis.

1:50
La SDS PAGE se realiza en proteínas aisladas de muchas fuentes diferentes, como células en cultivo, tejidos,
sangre, orina y levaduras.

2:02
Las proteínas de estas diversas fuentes deben separarse primero de otros componentes celulares mediante
técnicas que incluyen la homogeneización y la centrifugación, a menudo seguidas del uso de tampones de lisis.

2:15
Una vez aislada la proteína, a menudo se mide su concentración para garantizar la igualdad de carga de las
muestras comparando la cantidad de proteína de la muestra con los estándares de albúmina en un ensayo
colorimétrico de ácido bisintónico o BCA.

2:32
Un paso importante que hay que recordar es la adición del tampón de carga.

2:36
El tampón de carga tiene tres funciones principales.

2:40
En primer lugar, gracias al SDS y a los agentes reductores adicionales, desnaturaliza las proteínas, lo que
básicamente significa que convierte las estructuras proteicas complejas en una cadena lineal de aminoácidos.

2:53
En segundo lugar, contiene glicerina, que garantiza que la muestra no flote cuando se carga en los pocillos del
gel.

3:00
Por último, la mayoría de los tampones de carga comerciales incluyen un colorante, como el azul de
bromofenol, que puede utilizarse para medir el progreso de la electroforesis.

3:10
Después de añadir el tampón de carga, hay que mezclar las muestras y luego hervirlas durante 5 minutos.

3:17
Esto permite romper los fuertes enlaces disulfuro de las proteínas con la ayuda de un agente reductor como el
beta mercapto etanol.

3:25
Una vez rotos todos los enlaces disulfuro, el SDS Canmore recubre uniformemente las proteínas.

3:31
A continuación, las muestras se centrifugan rápidamente y están listas para cargarse en el sistema de gel para la
electroforesis.

3:46
Antes de cargar las muestras, hay que montar el sistema de gel.

3:51
Esto comienza con la compra o fabricación de un gel de poliacrilamida.

3:56
Los geles prefabricados son cada vez más populares porque la acrilamida es neurotóxica y puede causar daños
cerebrales.

4:03
El casete de gel contiene pocillos que se utilizan para cargar las muestras.

4:08
Una vez que los geles están fijados en su sitio, las cámaras interior y exterior se llenan con un tampón que
contiene la misma concentración de iones utilizada para fabricar los geles.

4:19
Esto crea un circuito eléctrico que pasa sin interrupciones desde el cátodo, a través del gel y hasta el ánodo.

4:26
A continuación, se cargan en el gel las escalas de peso molecular, seguidas de las muestras.

4:32
A medida que el gel avanza, estas últimas se extenderán y crearán bandas de proteínas visibles de tamaños
conocidos.

4:39
En los pasos finales, estas bandas pueden utilizarse para calcular el tamaño de cada proteína.

4:45
Una vez cargadas todas las muestras, los terminales positivo y negativo de la caja de gel se conectan a una
fuente de alimentación capaz de mantener un voltaje constante durante un largo período de tiempo.

4:57
Los geles suelen iniciarse a unos 60 voltios hasta que toda la muestra ha entrado en la región del gel
denominada gel de apilamiento.
5:05
A continuación, se aumenta el voltaje a unos 200 voltios durante 30 minutos a una hora, dependiendo del
tamaño y la concentración del gel y del tamaño de la proteína de interés.

5:23
Una vez finalizada la electroforesis, se retira el casete y se abre para exponer el gel.

5:29
A continuación, el gel puede teñirse con una tinción típica para proteínas, como Kumasi, azul o Silverstein, para
visualizar las bandas de proteínas dentro del gel.

5:38
La tinción de Kumasi puede detectar bandas con tan sólo 15 nanogramos de proteína, mientras que la tinción de
plata puede detectar bandas con tan sólo un nanogramo de proteína.

5:48
En la electroforesis bidimensional en gel, las muestras se separan por dos propiedades distintas en geles de una
dimensión cada vez.

5:57
Se cargan las primeras muestras y se disponen según sus puntos isoeléctricos en tiras de gradiente de pH
localizado.

6:04
A continuación, las proteínas de la tira se desnaturalizan y se colocan sobre un gel de poliacrilamida típico,
donde se fijan con solución de gel fresca.

6:14
A continuación se realiza la separación en segunda dimensión mediante SDS PAGE.

6:20
Aunque el enfoque isoeléctrico no es la única opción para la electroforesis en gel 2D, es el gel bidimensional
más común.

6:28
La electroforesis es una herramienta inestimable que permite comprender mejor los complejos proteicos y la
organización de las suborganelas.
6:37
Después de correr el gel, un paso siguiente muy común es transferir las proteínas del gel a una membrana de
PVDF o nylon para su análisis.

6:48
A continuación, se pueden utilizar anticuerpos específicos para sondear la membrana y buscar las proteínas de
interés.

6:55
Aquí se muestran los resultados típicos de un inmunoblot en el que el investigador utilizó tres técnicas diferentes
de amplificación de la señal para determinar cuál mostraba mejor la presencia de la proteína PIT ONE a lo largo
de una serie de diluciones seriadas.

7:09
Acaba de ver el vídeo de Joe sobre la separación de proteínas mediante la página SDS.

7:15
Ahora deberías comprender los pasos necesarios para resolver una proteína por tamaño mediante esta potente
técnica.

7:22
Como siempre, gracias por verlo.