Michel Hernoud : hernoud@bordeaux.inra.

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PhyV – CH2 Croissance et développement des végétaux

supérieurs

I. Généralités sur le développement des végétaux supérieurs

1) Rappel : Cycle de vie des végétaux

Le cycle commence au niveau de la fleur qui contient les organes reproducteurs (pistil et étamines).
À l'intérieur du pistil, on a les ovaires et les ovules (qui contient l'oosphère, le gamète femelle).
Chez les végétaux, toute l'évolution a été vers l'amélioration de la reproduction et notamment la
protection du gamète femelle. On a de nombreuses étapes de développement qui amènent aux deux
types de gamète. Le gamète mâle est contenu dans le grain de pollen, avec. Chez les végétaux
supérieurs, on a une double fécondation qui entraîne la formation de l'embryon principal à partir de
l'oosphère, puis la fécondation avec les noyaux de la cellule centrale forme l'albumen (tissu de
réserve qui sert à nourrir l'embryon principal).
D'autres étapes conduisent au développement de l'embryon à l'intérieur de la graine. Lorsque les
conditions sont favorables, la germination commence et la graine libère la plantule.
On a donc une phase de développement embryonnaire, une phase juvénile (développement des
systèmes aériens et racinaires, à partir de la germination jusqu'à la phase de floraison), puis la phase
adulte et enfin la phase reproductrice. Les deux premières phases font partie du développement
végétatif, alors que les deux autres dont partie de la phase reproductrice.
2) Définitions

a- Croissance
Par opposition aux vertébrés dont la croissance se fait principalement par division cellulaire
(mitose), l'augmentation de taille des végétaux est majoritairement due à l'allongement cellulaire
(auxèse) pendant la différenciation cellulaire. Le grandissement cellulaire est responsable de la
croissance rapide (x3000 en 45 jours) des végétaux. La cellule va se diviser, grandir puis se
différencier.

b- Différenciation cellulaire
Au niveau de l'apex, le méristème produit des cellules indifférenciées totipotentes qui vont se
transformer en cellules photosynthétiques (cellules permettant l'absorption d'énergie photonique et
le phototropisme), en trichomes (cellules permettant le maintient de l'eau à la surface des feuilles, et
servant aussi de protection contre les pathogènes), ou encore en trichomes glandulaires (qui libèrent
des composés collants et répulsifs à base de polyphénols contre les insectes et les pathogènes).
Certaines de ces cellules, si elles sont peu spécialisées, peuvent retourner à un état indifférencié.

Au niveau de la coiffe racinaire, le méristème produit les cellules indifférenciées qui vont ensuite se
transformer en cellules de la coiffe (cellules qui se remplissent d'amidon et de sels de calcium, qui
assurent la pousse verticale vers le bas des racines = gravitropisme).
c- Organogenèse
C'est la formation des organes. Contrairement aux animaux, les plantes ont une croissance continue
au long de leur vie. Tout au long de la plante, on aura formation de nouveaux organes à chaque
cycle saisonnier. De plus, les plantes n'ont pas de lignée germinale (cellules destinées à la formation
des gamètes chez les animaux), ce sont des cellules indifférenciées basiques qui vont devenir des
cellules reproductrices.
Une plante passe par différents stades de développement (embryonnaire, végétatif, floral) qui se
caractérisent par l'apparition ou la croissance de certains organes, on peut donc facilement dissocier
les différentes phases de développement.
Au stade juvénile (développement embryonnaire), après l'ouverture de la graine, les nutriments
contenus dans l'albumen sont contenus dans les cotylédons. Ils deviendront les premières feuilles de
la plante lors de sa sortie de terre, et selon l'espèce s'atrophieront avant de tomber ou se
comporteront comme les autres feuilles.
Le premier organe qui se développe est la racine primaire, produite par les cellules qui se
multiplient au niveau du méristème racinaire (qui s'oppose au méristème apical caulinaire entre les
deux cotylédons), puis la tige poussera par le SAM (Shoot Apical Meristem), qui produira ensuite
les feuilles apicales.
Lors des différents stades de croissance, le SAM change de morphologie et de programme
génétique, il est responsable de la tige et des feuilles, mais aussi de tous les méristèmes aériens qui
seront produit lors du signal de floraison. Pendant le développement végétatif, il gère la croissance
de la tige et la pousse des feuilles sur le tronc, puis au signal de floraison il va produire les
méristèmes inflorescenciels, dont le programme génétique spécifique est la production des
méristèmes floraux qui eux même produiront les cellules germinales.

3) Spécificités du développement des végétaux

Au moins au niveau anatomique, les méristèmes ont été étudiés depuis longtemps.
Au niveau du méristème, on a le dôme méristématique en elle même et les primodiums d'organes.
Chez la plante, la production de cellules germinales se fait à partir d'un tissu indifférencié de la L2.

a- Importance du développement post-embryonnaire

b- Régénération et totipotence des cellules végétales

II. Etude du développement

1) Arabidopsis thaliana : plante modèle

A.thaliana a un génome court et entièrement séquencé, de plus elle est de petite taille et facilement
cultivable. Son temps de génération court et sa capacité à produire beaucoup de graines permet de
produire de nombreuses générations en un temps court. De plus, elle réagit bien a la mutagénèse
chimique et par insertion et peut donc être mutée efficacement. On peut aller sur le site du NASC
pour commander des mutants avec un génotype particulier en quantités voulues.

2) Obtention et caractérisation des mutants

Les mutants étudiés sont principalement des mutants dans le développement végétatif : on peut
observer des absences de trichomes (cellules spécialisées), absence d'hypocotyle (absence d'une
portion d'organe), absence de méristèmes...
Les mutants Wuschel, SML (ShootMeristemLess) et Clavata sont les principaux. Ils permettent de
montrer les démarches d'étude du développement végétatif. Ils ont été isolés par un crible de
phénotypes aberrants.
Le mutant SML a un système racinaire normal et deux cotylédons, mais aucune autre feuille non
primordium, on n'a aucun méristème visible, ni aucune cellules à caractère méristématique.
Wuschel ne présente pas de primordia non plus, et les cotylédons sont séparés par une zone ou
devrait normalement se développer le méristème, mais ce sont des cellules non méristématiques.
À l'inverse, le mutant Clavata a un phénotype de méristème super-exprimé, cela permet de dire que
les gènes codants pour ces mutations gèrent le méristème et son développement. Il est proposé que
Wuschel intervient la formation de cellules méristématiques.
Chez SML, il y a deux allèles (l'un sévère et l'autre faible), qui conduisent à la mort rapide de la
plante (pas de méristème pour l'allèle sévère) ou à une très faible production d'organes (forme
faible).
Le méristème n'est pas présent immédiatement à la fécondation . Il faut passer par plusieurs phases
du développement embryonnaire pour le créer. La première division est asymétrique et va former le
suspenseur (relie l'embryon au tissu maternel pour la nutrition), l'autre cellule va subir des divisions
successives jusqu'au stade 16c, ou on remarque des différenciations cellulaires. Au stade globulaire,
on trouve les cellules qui formeront le méristème. Au stade cœur, les phénomènes de régionalisation
permettent de différencier la partie aérienne et racinaire. Dans la partie aérienne, le méristème s'est
mis en place et les cotylédons sont en train de se développer. Cela signifie que son stade définitif est
entre le stade globulaire et cœur, on peut en déduire que des gènes qui agissent sur celui-ci, comme
Wuschel ou Clavata se mettent en action à ces périodes de développement. On va alors étudier si les
gènes sont en action, pour définir précisément quand le méristème final est en place. On peut
utiliser des gènes rapporteurs, de l'hybridation in-situ, ou alors faire des tests de Northern Blot (cette
technique a été supplantée par la rtPCR). Le Northern Blot et la rtPCR sont des méthodes
quantitatives relatives par rapport à un gel de référence et à des contrôles en différentes conditions.
L'hybridation in-situ permet d'étudier l'action génétique directement dans le tissu. On va faire une
fixation avec un composé capable de faire des pontages des molécules cellulaires (formaldéhyde ou
glutaraldéhyde) pour former un réseau qui « immobilise » la cellule, on empêche ainsi tout
phénomène de dégradation à partir de l'ajout du fixateur. Après la fixation, on va faire une inclusion
(paraffine ou résine) pour « solidifier » le tissu et remplacer l'eau par un support inerte qui permet
de définitivement stopper les réactions enzymatiques et de conserver le système sur une longue
durée. On peut ensuite faire des coupes sériées d'épaisseur définie dans la paraffine avec un
microtome. On fait des coupes dans un organe en 3D, donc les coupes sériées permettent en
observation successive de reproduire dans l'espace ce qui se passait dans l'organe vivant. On étudie
les coupes au microscope : on ajoute une sonde marquée qui reconnaît spécifiquement l'ARNm du
gène en enlevant la paraffine. On observera alors une coloration dans les cellules ou l'ARNm est
présent et donc ou le gène est exprimé. Ce n'est pas une méthode quantitative, car on ne peut pas
utiliser de référence. Cette méthode permet cependant d'avoir la localisation de l'expression du
gène. En faisant une reconstitution spatiale des coupes, on peut voir la distribution dans l'organe. On
peut aussi le faire dans le temps et observer l'expression spatio-temporelle du gène.
L'alternative à l'hybridation in-situ est l'utilisation de gènes rapporteurs (GUS par exemple, couplé à
un promoteur répondant à l'auxine, cela permet de ou l'auxine s'accumule dans la plante). L faut
disposer d'une plante transformable (puis transformée), et du promoteur du gène que l'on étudie. Il
existe des biais liés au gène rapporteur : en fonction du lieu d'insertion du gène rapporteur dans le
génome, on n'aura pas les même résultats.
En hybridation in-situ de Wuschel, on voit qu'au stade 8c, le gène n'est pas exprimé. À l'embryon
16c, on a des cellules au centre qui sont colorées, donc le gène y est exprimé. Sur un embryon plus
tardif (globulaire, torpille, cœur) on a une expression très centralisée, sur quelques cellules au centre
de l'embryon, et ensuite, son expression ne varie pas jusqu'à la floraison. Wuschel est exprimé à la
base du méristème, dans la zone centrale, ou les cellules se divisent très peu. Chez le mutant, on n'a
pas de formation méristématique, car les cellules du centre organisateur expriment le gène muté.
Elles sont normalement à l'origine de toutes les cellules du méristème, qui elles-même seront à
l'origine de toutes les cellules de la partie aérienne de la plante. Ce sont donc des cellules souches,
et Wuschel (gène natif) permet de maintenir le poule de cellules souches en les multipliant.
La plante mutante est en fait formée en dehors du méristème apical caulinaire, par le méristème
axillaire, qui va former une plante à partir de cellules souches aberrantes, qui ne produit pas de
graines. C'est une mutation récessive, et pour l'étudier, on doit utiliser une génération
supplémentaire.
Le mutant Clavata a un dôme méristématique beaucoup plus grand que celui du sauvage, et on
observe qu'en plus, il produit plus de primordia pour un même stade de développement. On peut
donc dire que la protéine native (absente chez le mutant présentant un méristème plus grand) est un
régulateur négatif du gène Wuschel, l'empêchant de produire trop de cellules souches, et ainsi
limiter la taille du méristème. Clavata est associé aux mutations de trois gènes différents (Clv 1,2 et
3 qui produisent des méristèmes surdimensionnés et produisant plus d'organes). (Voir TD)

3) Méristèmes inflorescenciel et floral

La notion d'identité est importante : quand la cellule quitte la zone méristématique, elle change
d'identité. De même, si un méristème quitte la boucle Wus-Clv, il ne sera plus végétatif. Des gènes
qui n'étaient pas encore exprimés le transforme en méristème inflorescenciel. Il est caractérisé par la
production de méristèmes floraux. Le gène Leafy (Lfy), dont le mutant produit des feuilles à la
place des organes floraux, est important dans la définition de l'identité du méristème inflorescenciel.
Par hybridation in-situ, on observe qu'il est exprimé au niveau du méristème inflorescenciel et des
méristèmes floraux. En absence de Lfy, les méristèmes floraux ne sont pas produits et on a un retour
à l'état de méristème végétatif (production de feuilles par défaut). D'autres gènes, comme apetala1
et cauliflower, interviennent dans l'identité du méristème inflorescenciel et plus tard dans celle du
méristème floral. Le gène cauliflower présente des mutants ou les méristèmes perdent leur identité
et prolifèrent.
Il est nécessaire de caractériser les organes sur lesquels on travaille dans la physiologie du
développement. Chez A.thaliana, on a 20 stades de développement de la fleur, dont chacun peut être
différencié. Cela permet de faire le suivi du développement.
Méristème floral → sépales (le recouvre) → pétales → étamines → gynécée (ensemble des
carpelles, chez arabidopsis, on en a deux fusionnées).
Chez les plantes, les organes sont organisés en verticilles (cercles concentriques autour du
gynécée) :
-V1 : sépales,
-V2 : pétales,
-V3 : étamines,
-V4 : gynécée.
Formule florale normale : V1→S, V2→P, V3→E, V4→C
Dans la plante modèle, on a 4 sépales, 4 pétales, 6 étamines et 2 carpelles.
On a isolé des gènes qui agissent dans le développement floral en cherchant des mutants.
Le mutant Ap1 est caractérisé par une absence de pétales et de sépales :
Formule florale : V1→C, V2→E, V3→E, V4→C.
Le mutant agamous (sans organes reproducteurs) est caractérisé par une formule florale :
V1→S, V2→P, V3→P, V4→S.
Les mutants ap3 et pistilata (Pi) donnent le même phénotype caractérisé par une formule florale :
V1→S V2→S, V3→C, V4→C.
Ces quatre mutants sont des homéotiques, ou un organe remplace un autre organe (mis en évidence
par Goethe).
La description des mutants a permis de proposer : les différents gènes sont capables de réguler
l'identité de deux verticilles à la fois. Ap1 dirige l'identité des sépales et des pétales, Agamous dirige
carpelles et étamines, Ap3 et Pi dirigent pétales et étamines.
Les chercheurs ont défini un modèle de régulation ABC :
Fonction A = Ap1, B (Ap3, Pi), C (AG).
Si A est exprimé seul, on a une identité sépales. Quand, on a Ap1 + Ap3/Pi, on aura des pétales.
Quand on a B+C, on aura des étamines, et quand AG s'exprime tout seul, on formera des carpelles.
Les fonctions A et C sont mutuellement exclusives (A réprime C et inversement).
Le modèle ABC s'enrichit de deux autres fonctions, mais il se suffit à lui-même. Le triple mutant
produira des feuilles.
Quel que soit le contexte, les gènes homéotiques sont exprimés là ou ils doivent diriger l'apparition
des organes. Ces gènes appartiennent à une même famille qui code pour des facteurs de
transcription à MADS-box (domaine de fixation à l'ADN) avec des cibles différentes, qui spécifient
le programme génétique qui définit l'identité des organes. Ce facteur de transcription possède aussi
des domaines de dimérisation (même protéine) ou de multimérisation (protéine différente). Les
protéines peuvent interagir avec les différentes protéines à MADS-box. Le système est complexe,
car on a observé d’autres mutants au niveau du développement floral, notamment des mutants
sepalata (qui ne présentent que des feuilles à la place des organes floraux → fonction E). Les
protéines à MADS-box vont aussi interagir avec ces gènes, en formant des quartet (assemblages de
quatre sous unités protéiques se faisant en fonction de l'expression des gènes. Le premier quartet qui
se forme est 2(Ap1)-2(Sep), car au début du développement de la fleur, c'est l'expression du gène
Ap1 qui domine (etc).

La fonction D gère l'identité des ovules avec des gènes à MADS-box. Certains considèrent que les
ovules sont le cinquième verticille de la fleur, ou encore que c'est un organe indépendant des
verticilles. Les protéines Sep, AG et celles codées par des gènes de la fonction D (seedstick (Stk) et
Shatterproof (Shp) 1 et 2) forment le dernier quartet. Si on a un mutant fonction D, des carpelles se
forment à l'intérieur des carpelles V4.
Les gènes à MADS-box sont régulés par d'autres gènes qui eux régulent l'identité des méristèmes :
par exemple, pour exprimer AG, on a vu qu'il fallait l'expression des gènes Lfy et Wus, et qu'il
fallait aussi que les deux protéines agissent simultanément sur le gène pour que la protéine AG soit
produite.
On a essayé de construire des gènes rapporteurs avec des promoteurs contenant les séquences de
fixation des protéines Wus et Lfy dans différentes configurations.
La fleur est une structure avec une croissance déterminée, elle ne peut pas dépasser un certain
nombre de cellules : exemple du gène cadastral Superman, qui régule l'activité de la fonction B
(présence de plus d'étamines et moins de carpelles en conséquence). Il s'exprime très exactement à
la zone de frontière entre les verticilles 3 et 4.

La régulation est donc très fine, sur quelques épaisseurs de cellules. Si le gène « déborde » il va
limiter le développement des organes floraux. On a pu montrer que son expression est dépendante
d'Ap3. Quand Ap3 n'est plus actif, le gène s'inactive, de même pour Pi, AG. Si on surexprime l'un
de ces gènes, Sup va s'exprimer sur toutes les zones frontières. Si on mute Lfy, on n'aura plus
d'action de Sup.
Une fois que les carpelles sont formés, plus aucun organe ne se forme, donc on a un message vers le
méristème qui lui indique d'arrêter la production de ces organes : c'est la terminaison florale. Elle
implique une boucle de rétrocontrôle par le gène AG, car il est le dernier gène a spécifier l'identité
du dernier verticille de la fleur. On peut en déduire que si AG n'est pas présent, la fleur va continuer
à produire des organes (voir mutant AG) selon la formule S(PPS)n, n pouvant aller jusqu'à 40
(épuisement par encombrement plutôt que par régulation génétique). Or, l production de cellules
souches est gérée par Wus. On voit chez le mutant AG que le gène Wus continue à être exprimé au
delà de son stade normal (stade 6 chez WT) pour produire des organes floraux.