Bài 1: XÁC ĐỊNH VI SINH VẬT HIẾU KHÍ VÀ TỔNG SỐ

NẤM MỐC VÀ NẤM MEN.

I. Tổng quan
Vi sinh vật hiếu khí là những vi sinh vật chỉ tồn tại và phát triển trong môi
trường có oxy, bao gồm vi khuẩn hiếu khí, nấm men và nấm mốc. Trong quá trình
hô hấp hiếu khí, các vi sinh vật này sử dụng oxy để oxy hóa các chất nền (như
glucose) và tạo ra năng lượng. Ngoài ra, nấm men còn có thể phân giải kị khí (lên
men) đường ở điều kiện thiếu oxy, trong khi các vi khuẩn hiếu khí và nấm mốc khó
có thể phát triển ở điều kiện này.
Vi sinh vật hiếu khí thường tồn tại và phát triển trong môi trường không khí
xung quanh. Việc các vi sinh vật này xâm nhập vào thực phẩm là việc hết sức dễ
dàng. Do đặc thù sử dụng năng lượng của chúng, nên sự hư hỏng thực phẩm khi
nhiễm vi sinh vật là điều khó tránh khỏi.
Để xác định mật độ vi sinh vật trong một mẫu trước hết là pha loãng mẫu,
cấy lên đĩa thạch và sau đó đếm các khuẩn lạc mọc trên đó. Vi khuẩn được cấy trên
đĩa phát triển hình thành các khuẩn lạc từ một hoặc một số vi khuẩn ban đầu.
Những khuẩn lạc này có thể được thấy và đếm bằng mắt thường hoặc kính hiển vi.
Số lượng khuẩn lạc được sử dụng để xác định và đếm vi khuẩn trong mẫu đất,
nước và thực phẩm.
Đếm tổng số vi sinh vật hiếu khí bằng phương pháp đổ đĩa: Chuẩn bị môi
trường ở dạng nóng chảy (40 – 50°C), sau khi hút (cấy) mẫu vào đĩa petri trống rồi
mới đổ môi trường vào. Trộn lẫn mẫu, để nguội và đem đi ủ ở 37°C trong 24 giờ.
Sau đó đếm số khuẩn lạc trên đĩa, các khuẩn lạc phát triển bên trong hoặc bên trên
bề mặt của môi trường. Thông thường, từ 25-250 khuẩn lạc trên một đĩa là một kết
quả đáng tin cậy. Nếu số khuẩn lạc lớn hơn nhiều thì phải tiến hành pha loãng và
chọn những độ pha loãng lớn hơn.
Đếm tổng số nấm men, nấm mốc bằng phương pháp trải đĩa: Chuẩn bị đĩa đã
có môi trường bên trong đó (dạng rắn), sau đó hút mẫu và trải đều mẫu bằng que
cấy trang vô trùng. Đem đĩa đi ủ ở 37°C trong 24 giờ. Sau đó đếm số khuẩn lạc
trên đĩa, các khuẩn lạc phát triển bên trên của bề mặt môi trường.
 II. Cách tiến hành
2.1. Mẫu nguyên liệu
Nước rau má
2.2. Môi trường – Dụng cụ.
2.2.1. Môi trường.
Môi trường DRBC: 15ml × 6 đĩa × 2 tổ = 180ml (+ 20ml trừ hao)
Trong chai môi trường DRBC hướng dẫn pha 31,63 gram cho 1000ml nước cất
Số gram môi trường DRBC cần dùng = 200×31,63 = 6,3 (g)
1000

Cách pha: Cho 6,3g DRBC vào bình schott sau đó cho 200ml nước cất, khuấy
đều.
Nước cất: 9ml × 6 ống × 1 tổ = 54ml
2.2.2. Dụng cụ.
- Bình shott 250ml: 2 bình
- Đĩa petri: 6 đĩa
- Ống nghiệm: 6 ống
- Hộp đầu tiếp: 1 hộp
- Đèn cồn
- Que cấy
- Micropitpette có mức 100 l , 1000 µl
- Cân phân tích
- Tủ ủ
- Máy đếm khuẩn lạc
 2.3. Quy trình thực hiện.
2.3.1. Sơ đồ quy trình.

Pha loãng mẫu

Lấy 1 ml dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng Đổ môi trường DRBC vào đĩa petri.
10−4, 10−5, 10−6, chuyển vào giữa đĩa Mỗi nồng độ 2 đĩa, mỗi đĩa 10 – 15ml.
petri vô trùng (mỗi nồng độ cấy 2 đĩa) Để môi trường đông đặc hoàn toàn

Sau khi cấy, đổ vào mỗi đĩa 10 – 15ml

môi trường PCA đã được làm nguội ở Hút 0,5 ml mẫu vào chính giữa đĩa petri
45 – 50℃

Trộn đều mẫu với môi trường bằng Vô trùng que trải. Trải mẫu vi sinh vật
cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược sao cho mẫu dàn đều khắp bề mặt
chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 3 lần thạch

Để yên cho môi trường đông đặc

Ủ 370C trong 24 giờ Ủ ngửa đĩa ở 370C trong 24 giờ

Tính kết quả Tính kết quả

Tổng vi sinh vật hiếu khí trong mẫu Tổng nấm men – nấm mốc trong mẫu
(CFU/ g hoặc CFU/ ml) (CFU/ g hoặc CFU/ ml
2.3.2. Thuyết minh quy trình.
2.3.2.1. Pha loãng mẫu
- Pha loãng mẫu ở nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6
Cách pha loãng mẫu:
+ Ống 10-1: 1ml nước mía + 9ml nước cất.
+ Ống 10-2: 1ml 10-1 + 9ml nước cất.
+ Ống 10-3: 1ml 10-2 + 9ml nước cất.
+ Ống 10-4: 1ml 10-3 + 9ml nước cất.
+ Ống 10-5: 1ml 10-4 + 9ml nước cất.
+ Ống 10-6: 1ml 10-5 + 9ml nước cất.

1ml 1ml 1ml 1ml 1ml

Hình 1.1. Ảnh minh họa quá trình pha loãng mẫu
2.3.2.2. Đối với môi trường DRBC.
Bước 1: Đổ10 - 15ml môi trường DRBC vào đĩa petri. Sau đó đợi môi trường
đông đặc lại hoàn toàn.
Bước 2: Hút lần lượt 0,5ml dịch mẫu đã pha loãng ở nồng độ 10−4, 10−5, 10−6
cho vào giữa đĩa. Mỗi nồng độ cấy 2 đĩa.
Bước 3: Trải mẫu: Dùng que cấy trang đã vô trùng (hơ dưới ngọn lửa đèn cồn), sau
đó đợi que cấy nguội bớt mới bắt đầu trang đều dịch mẫu ra bề mặt thạch trong đĩa
petri, đến khi dịch mẫu khô và dừng lại. Thời gian trang tối đa là 15 phút, vì nếu
quá lâu thì vi sinh vật trong dịch mẫu sẽ chết.
Bước 4: Đem ủ ở 37℃ trong vòng 24 giờ. Sau 24 giờ đọc kết quả.
Bước 5: Tính kết quả tổng nấm men, nấm mốc. (tương tự công thức ở môi trường
PCA).
Lưu ý: Ở tất cả các bước đổ môi trường, hút dịch mẫu, trải mẫu, pha loãng mẫu
phải được thực hiện trước ngọn lửa đèn cồn, tránh vấy nhiểm vi sinh vật từ bên
ngoài vào.
2.4. Tính toán kết quả.
2.4.1. Kết quả.

Hình 1.2: Môi trường DRBC

Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa petri sau khi ủ. Chọn số đĩa
có số đếm trong khoảng 25-250 để tính kết quả .
Tên môi 10−4 10−5 10−6
trường
DRBC 15(loại) 5 ( loại) 12 ( loại)
127 7 (loại) 19(loại)
 Trong đó
A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn (hay nấm men, nấm mốc)
trong 1g hay 1ml mẫu
N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn
ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa
fi: độ pha loãng tương ứng
2.4.2. Tổng vi sinh vật hiếu khí.
Số tế bào vi khuẩn hiếu khí trong 1 ml mẫu
155+142+ 44+26
A= =20 (CFU/ml)
2 ×1 × 4+2 ×1 ×5

2.4.2. Tổng nấm men, nấm mốc

Số tế bào nấm men, nấm mốc trong 0.5 ml mẫu
127
 A= 2 ×0 ,5 × 4 =31 , 75(CFU/ml)

2.5. Giải thích.

-Trên các đĩa môi trường DRBC sau khi cấy mẫu và đem ủ cho vi sinh vật phát triển thì xuất hiện
các khuẩn lạc. `

2.6. Kết luận.

Căn cứ theo Luật An toàn Thực phẩm số: 55/2010/QH12

Quy định giới hạn cho phép vi sinh vật trong nước khoáng và nước giải
khát đóng chai
Giới hạn vi sinh
Sản phẩm Loại vi sinh vật vật (trong 1g hay
1ml thực phẩm)
Tổng số vi sinh vật
100
hiếu khí
Nước giải khát
không cồn Tổng số bào tử
nấm men - nấm 10
mốc
 Nhận xét:
- Nhìn chung, mật độ vi sinh vật hiếu khí và sự xuất hiện của các tế bào nấm
men, nấm mốc có sự chênh lệch rất lớn giữa quy định giới hạn và kết quả thu được
sau thí nghiệm.
- Có thể do nguồn tiếp nhận nguyên liệu không sạch, không rõ nguồn gốc, xuất
xứ, thiết bị xay sử dụng nhiều lần một cách liên tục, đồng thời điều kiện vệ sinh
và môi trường xung quanh không đủ đảm bảo đã dẫn đến tình trạng nước rau má
nhiễm số lượng lớn vi sinh vật.
- Kết quả thu được cho thấy 100% mẫu trong bài thí nghiệm này hoàn toàn không
đáp ứng được yêu cầu và không đạt tiêu chuẩn về chỉ tiêu tổng số vi sinh vật hiếu
khí và tổng số nấm men, nấm mốc trong Quyết định “Quy định giới hạn tối đa ô
nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm” - Quy định giới hạn cho phép vi sinh
vật trong nước khoáng và nước giải khát đóng chai (Số: 46/2007/QĐ-BYT.