CAPITOLUL IL 3. Variabilitatea genetici a plantelor 3.1. Surse ale variabilitatii genetice Succesul unui program de ameliorare se raporteazé direct la sursele variabilititii genetice de care se dispune. Un pas important in aceast& directie sa realizat din momentul in care amelioratonil a sesizat posibilitatea realizArii variabilit&tii genetice prin inducerea de mutatii si recombinri de gene. Acest fapt s-a petrecut aproximativ la inceputul secolului XX. In prezent, prin acumularile stiintifice realizate, la dispozitia amelioratorului stau si alte surse de variabilitate genetica, ce de exemplu manipularea directa a genelor sau transferul acestora prin utilizarea tehnicilor AND-recombinant, a variatiei somaclonale, pana la aplicarea tehnicilor in vitro a culturilor de celule si fesuturi 3.2, Mutatiile genice Mutatiile spontane apar in natura de obicei la intmplare, sub influenta conditiilor de mediu. O mutatie accidental poate avea loc dup’ afectarea tautomerica a atomului de hidrogen care impiedics imperechierea bazelor complementare la nivelul acidului dezoxiribonucleic. Schimbarile care pot avea loc la nivelul nucleotidelor ADN-ului provoaci schimbari de cod, care la randul lor produc schimbari in codonii ARN-m (ARN-mesager). in aceasta situafie, diferitii aminoacizi pot fi climinati, rezultand sinteza unor proteine diferite, ce pot s& se manifeste prin aparitia unor mutajii spontane naturale, ca de exemplu mutafiile de culoare, talie sa, WATSON (1974) consideri c& mutatiile spontane rezultate numai din modifickri tautomerice pot si aparf cu o frecveni de 10” la nivelul nucleotidelor gi de 10° la nivelul genelor/generatie. jn afara acestui mecanism, mutajiile pot fi cauzate de aberatii cromozomale (delelia, duplicatia, inversia, translocatia) si de multiplicarile de genom (poliploidia). La microorganisme, care au o extraordinara capacitate de mmultiplicare, numérul mutafillor care apar intr-un ciclu de reproductie este foarte mare, De exemplu, numarul uredosporiilor de ruginé a frunzelor de rau (Puccinia recondita f. sp. tritici), in conditiile in care infecteaz& mumai 1% din suprafata foliard/i mp de teren, este de 300 spori/l mmp/zi, respectiv10" spori/zi/ha. Daca frecventa estimata a mutatiilor este de 10° vor aptrea 1.000 de mutante/locus/zi/ha (PARLEVLIET si ZADOKS, 1977) Daci se ia in considerare c& fiecare organism confine cateva mii de gene, putem afirma ca fenomenul mutafional este practic continuu ___ WRIGHT (1931) mengioneaza ci mutatiile spontane sunt intotdeauna mai numeroase decat necesitilile evolutive ale speciei Cand MULLER (dup BOROJEVIC, 1990), a reusit s& induct mutatii la Drosophila melanogaster prin iradiere cu raze X, aceasta a marcat inceputul unei noi ere a geneticii aplicate, mutafiile induse devenind o importanta sursi de variabilitate. De la acest eveniment s-au descoperit si utilizat, pe parcursul anilor, un numar impresionant de factori mutageni fizici si chimici Primele studii privind inducerea mutatiilor la plante se datoresc italianului PIROVANO si americanului STATLER (SAVATTI si colab., 2003) Freeventa mutafiilor induse este mai mare decét a celor spontane, osciland intre 10° - 10/geni/generatie. Unele gene muteaza cu o frecventa mai mare decat altele, dup cum reiese din tabelul 3.1 Tabelul 3.1. Frecventa mutatiilor naturale la porumb (dup STATLER, 1942) ‘inal de | Specia Caracterul ; ne + a gameti Rosa (7) pentru colorarea alcuronei (F) 492 | Culoare inhibitoare (I) si neinhibitoare (i) 106 Purpuriv (Pp) pentru colorarea aleuronei (pr) u Zea mays | Normal (Su) pentru endosperm zaharat (su) 24 Galben (Y) pentru endosperm alb (¥) 2 Normal (Sh) pentru endosperm shrunken (sh) 12 ‘Normal (Wx) pentra endosperm waxy (5) 0 S-a constatat o& spectrul mutaliilor spontane si a celor induse sunt similare si ci mutatiile induse, s-au gasit sau se vor gasi in natur’, jin functie de utilitatea lor, mutatille pot fi folositoare, nefolositoare, sau neutre pentru organism. Deoarece procesul mutafional este aparent §ntamplator si necontrolabil, majoritatea mutatiilor sunt considerate neutre, neafectand in mod pozitiv sau negativ individul purtitor. ‘Asemenca mutafii pot si se mentin& intr-o populajie timp indelungat, atat timp cat genele respective se gaseso in stare heterozigota. Cand genele 317 i. = ai iar un devin homozigote, mutafiile pot si se exteriorizeze, puténd aduce chiar taj purtitorului, in conditii de mediu séhimbat. : os eis: Die tment ce mutatiile rezulta nu numai dintr-o schimbare genetics faa de tipul salbatic, dar si prin delefia uneia sau mai multor baze in AD! . si din aberatiile cromozomale, numeroase mutafii pot si manifeste un efect negativ. Asemenea mutatii sunt eliminate in procesul selectiei naturale sau artificiale. : Selectia naturali favorizeazi mutatiile care sunt avantajoase purtatorilor lor, Aceste mutatii sunt surse potantiale a tot ceea ce este nou, ele jucand un rol important in evolutia speciilor, iar pe de alta parte pot constitui o inepuizabila sursé de variabilitate genetic, explorabila de catre ameliorator (BOROJEVIC, 1990) : 3.3. Recombinarea genelor in comparatie cu mutatiile care sunt asociate de obicei cu schimbari genice, recombinarea genelor nu implica schimbari de acest tip, ci doar in combinafia genelor ce provin de la genitori diferiti. $i in acest caz rezulta o noui variabilitate genetic’. Daci doi genitori difera in dowd perechi de gene alele, care nu sunt Jinkate, unul find dominant $i celalalt recesiv, atunci, ca rezultat al segregarii cromozomilor recombinati in timpul meiozei (diviziunea reductionala) si imperechierea tntémplitoare a gametilor femeli cii-cei masculi, in generatia F, vor apare dou genotipuri homozigote noi, continand noi recombiniri ale xgenelor provenite de la formele parentale. Py Aabb x aaBB P Fi AaBb Fr AABB - genotip nou Aabb - genotip parental aabb - genotip nou aaBB — genotip parental Prin incrucisarea genitorilor care difers - 3 prin trei perechi de in Fz vor apare gase genotipuri noi, difeite de p E ae arinti: Pr AabbCC x aaBBeo P> F, AaBbCe Ey AABBCC -genotip noy __-———-=e—yAABBec - genotip now AAbbCC - genotip parental AAbbce - genotip nou aaBBCC - genotip nou aaBBec - genotip parental aabbCC - genotip nou aabbec - genotip nou Daca formele parentale diferd in 4, 5, 10 sau mai multe caractere (perechi de gene alele — n) apare un numar mare de gameti diferiti (2°) datorita heterozigotiei in F, care, in conditiile imperechierii randomizate, pot da un numir mare (3") de genotipuri gi (2") de fenotipuri diferite in generatia Fa (tabelul 3.2.) Dac& 0 gena poseda cateva alele, cum ar fi cazul formelor poliploide, num&rul recombinarilor genetice si a noilor genotipuri creste considerabil, necesitand un numar mai mare de plante in generatia Fa in acest mod se realizeaza 0 bogata variabilitate geneticd, utilizabila la selectia noilor combinafii de caractere, pentru obtinerea de genotipuri superioare. Tabelul 3.2 Variabilitatea generatiei F; provenita din paringi ce difera inn perechi de gene alele (dupa BOROJEVIC, 1990) asim | Sigipinr [eine | mesmmit | "nacre. |, complet ae 2 3 2 3 4 2 4 6 4 3 8 27 8 4 16 see 16 5 32 243 32 io 1.024 59.089 L024 2 1.084.576 _[_3.487x10" | ~ 1.084.576 3487x107 1.102x10" 50 112.210" _[ 7.6rst0" [132.210 7.161x10" 64x10 [eaeta: 2 = z = ¥ in recombinarea genelor rezulta c4 in urma incrucisarii a doi sau mai mulji genitori, toate combinatiile vor include numai acele gene alele care sunt prezente la parinfi in cazul genelor nelinkate, noile recombin&ri genetice sunt revizibile, ca si frecventa lor in timp (in generatii) fn cazul genelor linkate, recombinarile genetice sunt previzibile doar ca rezultat al crossing-overului, 33dar frecventa lor nu poate fi estimata numai daca distanfele dintre gene pe cromozomi a fost stabilitd anterior prin intermediul hartilor cromozomale in contextul problematicii tratate, merit mentionat i fenomenul de transgresiune genetic’, ca sursi de variabilitate, care se caracterizeazi. prin segregarea caracterelor in una sau ambele directii, in functie de trasiturile formelor parentale. in acest sens, mentionim c& unele genotipuri F, manifest& © precocitate mai pronunatat decat cel mai precoce parinte, 0 talie mai redusi decat pirintele cel mai scund 5.2. Considerand ci un caracter cantitativ este controlat de cinci gene cu efect adit, in generatia F2 se pot obtine urmatoarele combinatii Py aaBBecddee x — AAbbCCDDee Pa 60 cm 80 cm Fy AaBbCcDdee Fy aabbecddee AABBCCDDee 50cm 90 cm mai scurt decat mai inalt decat cel mai scurt genitor cel mai inalt genitor Talia plantelor, caracter cantitativ ce este controlat in principal de gene minore cu efecte aditive, nu exclude si prezenta cdtorva gene majore, in cazul unor genotipuri, in acest sens GALE gi colab., (1981) mentioneaz varietatea de grau Aobakomughi care posed 0 geri majora pentru reducerea taliei, Rht, provenind de la soiul Norin 10. Exemplele prezentate, referitoare la recombinarile genetice si interactiunile care due la noi recombin&ri de caractere s-au referit, in Principal, la plantele diploide. Variabilitatea genetic’ poate fi mult amplificata daca interactiunile au loc la diferite nivele de ploidie, dup’ cum se poate remarca: © supradominanfa ta nivelul © diploid AAaa © tetraploid AAAAaaaa © hexaploid AAAAAAaaaaaa Pe ling& variabilitatea intélnita in populatiile naturale de plante, reiese 4 hibridarea dirijaté a indivizilor genetic diferiti, constituie cea mai sims sursi de variabilitate genetic, utilizabila in ameliorarea plantelor. - 43.4, Transferul de gene , Tehnologia ADN recombinant ocup& o pozitie centrala in cadrul metadologiilor de inginerie genetica prin faptul c& a inaugurat era interventiilor umane asupra patrimoniului ereditar al organismelor, dand posibilitatea transferarii intr-un mod relativ simplu a informatiei genetice de lao specie la alta. Dupa cum se cunoaste, recombinarea ADN reprezint& una din cele mai semnificative activitati ale celulelor datorita cireia se objin generatii de indivizi cu genotipuri noi si se menfine 0 comunicare constant& intre indivizi Recombinarea ADN este un proces natural, limitat de bariere taxonomice, care decurge dupa un mecanism similar la procariote si eucariote. Spre deosebire de recombinarea genelor, tehnologia ADN se refer& la un proces artificial care se desfasoara conform unui program prestabilit, avand ca obiectiv construitea de organisme noi, cu caracteristici neintalnite in natura. Acestea se obtin prin rearanjarea de segmente ADN in cadrul unui genom, astfel incat clementele genetice dobandese o structura aparte, sau prin inserarea unor fragmente mici de ADN purtatoare de informatie genetica dorit’, intr-un genom dat. Tehnologia ADN-recombinant trebuie privit’ ca o modalitate aflata in mana cercetatorului de a clona si a propaga gene ale organismelor eucariote in celule procariote sau invers, modalitate care este controlabilé si bine cunoscuta astizi la nivel moleculat (POPA si colab., 1981). 7 in ultimele decenii, genetica moleculara s-a dezvoltat pind la punctul in care a devenit posibilé izolarea genelor individuale dintr-un organis clonarea lor si incorporarea acestora intr-un alt organism. Asemenea realiziri au fost precedate de studii aprofundate, din care vom aminti investigatiile hui ‘AVERY, MAC LFOD, MAC CARTY in ani 1943-1944 gi ale lui HERSHEY si MARTHA CHASE care au oferit dovezi convingitoare ci ADN-ul constituie materialul genetic primar al viefii (dup&’ WATSON si colab., 1983) WATSON gi CRICK (1953) au stabilit structura de dublu helix al ADNeului iar MENDELSON si STAHL (1958) au explicat replicarea moleculei de ADN. Datorita investigatiilor efectuate de NIRENBERG i colab,, asupra codului genetic (in jurul anilor'60) s-a emis ipoteza c& structura molecule’ de ADN-ARN controleaza in celula, sinteza proteinelor. JACOB si MONOD (1961) au oferit primele explicatii privind mecanismul reglitii genetice a sintezei proteinelor. Cunostinfele acumulate in domeniul geneticii moleculare eu oferit in anii "70 informagii_privind structura secventei moleculare a ADN (dupa SAVATTI sicolab., 2003). Enzimologia replicarii de ADN a permis descoperirea enzimelor de restrictie, capabile s4 sectioneze in anumite punete molecula de ADNizolarea_genclor KORNBERG, 1959). Din acest moment si pani la : Ieculé de ADN individuale si clonarea lor, pentru a obfine aga numita mol recombinant, nu a fost decdt un pas. Studiile mentionate exhaustiv, au imy manipularea genetic’ si transferarea ADN-recom! altul, prin metode eficiente, pentru a realiza 0 producti folositoare in industria chimic’, farmaceutica etc Procesul in sine nu este simplu, cerand rezolvares probleme biochimice si pur tehnice. fn principiu, pentru transferul de ADN specific la nivel celular se disting urmatoarele etape mai importante: © identificarea secvenjei ADN (a genelor) ce urmeazi a 6 transferat’; © izolarea si clonarea ADN-ului, apelind la tehnica ADN- recombinant, © transferul ADN-ului la celulele plantei gazda pe diferite cai (transformare, transductie etc); © integrarea, transcriptia gi translafia‘ADN-ului in celulele plantei gazda (fig 3.1.) pulsionat cercetarile privind binant de la un organism la crescdnda de proteine a unor seri de La inceputurile experienfelor privind transferul de gene, virusurile au fost utilizate ca vectori pentru genele dorite. Ca dati mai recent, sunt utilizate mai ales plasmidefe in realizarea acestui scop, dar studii-de ultima ora indica c& in unele cazuri este posibil transferul genelor printr-o injectare direct& in celul& (protoplast), sau in organitele celulare, Un numar mare de experiente de inginerie genetic’ s-au efectuat la nivelul procariotelor. La nivelul eucariotelor problema este mai complex, genele transferate nefiind capabile de a se exprima intotdeauna. Pani in prezent aplicarea tehnicilor ADN-ului recombinant a avut succese palpabile in producerea insulinei umane, a hormonului de crestere uman sia interferonului (CRACIUN, 1987)Z VECTOR ( cr 1 Ae PASAGER (GENA SS ES TS D ‘ADN RECOMBINANT MATPULARE, Fig 3.1, Schema gencraki a tchnologiei ADN recombinant in cazul plantelor, metodologia transferului de gene este limitata la transferul unor gene singulare. Aga se explic& dificultatea realizarii capacitatii de fixare a azotului atmosferic prin transferul genelor fixatoare de azot (nif), de la bacterii Ia plantele cultivate, sau extinderea grupului de plante gazda pentru Rhizobium , cu m&rirea eficientei sistemului simbiotic. Daca transferul genci “nif” nu reprezint& o problemi major din punct de vedere a ingineriei_| genetice, realizarea conditiilor optime pentru exprimarea ei, cum ar fi protectia nitrogenazei de inactivarea oxidativs, asimilarea si transferul azotului fixat de citre celulele plantei gazda, reprezinta limite greu de trecut, presupundnd interventia unui complex de gene, cu modificarea “arhitecturi biochimice” a plantelor (CRACIUN, 1987). Dintre obiectivele noi, posibile_a_fi_realizate_pe_calea_inginerici genctice, menjion’m sporirea randamentului fotosintetic prin modificarea structurii moleculare a plastogenelor plantelor de tip C-3 spre tipul C-4, mai ficient, sporirea randamentului utilizérii ingrdsmintelor minerale prin modificarea genelor ce controleaz4 sinteza enzimelor active in aceasti cale metabolici (SAVATTI, BOTEZ, 1987). Prin utilizarea unor agenfi vectori de tipul plasmidei "Ti" de le Agrobacterium este posibilé realizarea transportului unei heterogene de la 0 forma donatoare, la plantele de cultura. Calea generala de rezolvare a acestei 37probleme presupuine integrarea heterogenelor in aparatul transcriptional "i" al plantelor, eliminarea prin selectie a segmentului ADN tumoral cu mentinerea_markerului “nos” specific plasmidian, regenerarea plantelor transformate si selectia lor pe bazi de markeri. in prezent aceasti metoda a fost aplicata cu succes pentru transferul rezistentei la antibiotice de la bacterii la plante superioare dicotiledonate (tomate) si a unor heterogene de utilitate practicd, cum ar fi a rezistentei la boli, daundtori, erbicide, fitotoxine etc. la diferite plante de cultura. Din cele mentionate reiese c& tehnica ADN-ului recombinant permite amelioratorului s& induc& schimbari dorite intr-un organism. Hibridarea nu poate oferi aceasti alternativa deoarece genele dorite iau parte la recombinari, impreun& cu cele nedorite, Mutatiile induse par si mai putin satisf%icdtoare datorita aparitiei lor intamplatoare gi a spectrului lor imprevizibil Transferul de gene este, fara indoiala, o sursi de variabilitate genetica de mare perspectiva, care a fost utilizata cu succes, atéi la nivelul procariotelor cat i a eucariotelor Utilizarea lui la nivelul eucariotelor va fi amplificata odata cu acumularea mai multor informatii in domeniul biologiei moleculare si a perfectionarii unor noi metodologii de lucru. 3.5. Variabilitatea somaclonala in principiu, se considera c& plantele provenite din cultura in vitro dau descendenti identici din punct de vedere fenotipic, cu biotipul din a cérei celule sau fesuturi provine. $-a constatat cd in funcjie de mediul de cultura, varsta celulelor sau a fesuturilor in cultur’, genotipul, efectele temperaturii, a luminii g.a. pot s& produc& 0 accentuati variabilitate la unele caractere conditionate monogenic (culoare, forma etc.), ca si caracterele determinate poligenic (talia, ramificarea $.a.). Acest tip de variabilitate a fost denumiti de LARKIN si SCOWCROFT (1981), variatie somaclonala, considerind-o utilizabila in procesul de ameliorare a plantelor, ca o sursi de variabilitate genetica, Trecfndu-se in revist4 cunostinfele acumulate in acest domeniu s-a ajuns la concluzia ci variabilitatea somaclonalé este conditionath de “ifmitoarele cauze majore - _ schimbari evidente la nivelul cariotipului; - rearanjari cromozomale; = crossing-over somatic si schimbari intre cromatidele surori; = existenfa elementelor transpozabile, ~ amplificarea si diminuarea efectelor genelor. in funcjie de natura schimbérilor menjionate, somaclonele sunt mai mult sau mai putin stabile sau fertile. Au fost emise opinii ce considera c& 38multe din variajile somaclonale ar putea fi mutatii preexistente ce Se so fest in eutturile in vitro (BARBIER si DULIEU, 1980). In acelagi sens. LORZ si BROWN (1986) considera culturle de celule ca un “tatameht mutagen”. S-a constatat cf daci ciclul de culturd a fesuturilor se prelungeste, vy ant incidenta variabilittii este mai evidenta, mai ales in cazul calusului hediferenfiat, suspensiilor de celule sau protoplasti si mal putin in cazul ulturilor de meristeme, Aceiasi autori consideri c& marile schimbéri sariglogice ce pot si apari la nivelul descendentei somacionale, si © Consecinfa cumulata a stresurilor suferite din timpul pasirilor succesivé de pe un mediu de cultur& pe altul Desi originea majoritttii_variatiilor sor cunoscute existenfa lor ne face s& consideram de variabilitate genetic’, compatibilé cu Iucrarile de ameliorare & macionale mu sunt pe deplin c& ele constituie 0 sursi noua plantelor. Bibliografie fects génétiques observés sur plantes BARBIER, M., H.L. DULIBU, 1980, E ar culture i vitro, de Tabac régénéreds & partir de cotyledons pi ‘Ann, Amelior. Plantes, 30, p. 321-344 BOROJEVIC, S., 1990, Principles and Methods of Plant Breeding, Elsevier ‘Amsterdam, Oxford, New York, Tokyo, p. 3 CRACIUN, T., 1987, Geniul genetic si ameliorarea plantelor, p. 333. GALE, MD. and §. YOUSSEFIAN, 1985, Dwarfing genes in wheat, Ur GE_ Russel (Editor) Progress in Plant Breeding ~ 1, Butterworth, London, p. 1-35 LARKIN, PJ. and NR. SCOWCROFT, 1981, Somaclonal variation — A novel source of variability from cell cultures for plant improvement, Theor. Appl. Genet. 60, p. 197-214. LORZ, Hand P.TM. BROWN, 1986, Variability in tissue culture derived planis — possible origins, drawbacks and advantages, Tn: Genetic Manipulation in Plant Breeding, Walter de Gruyter, Berlin, p. 513-534 POPA, 1M, ANA POPESCU, 1981, Tehnologia ADN recombinant si aplicatiile sale in agriculturd, Prob. gen. teoret, aplicat, vol. XIII, 6, p. 339-371 PARLEVLIET, JE. and J.C. ZADOK' disease resistance, a new view in resistance in plants, Euphytica, 27, P. 5-2 SAVATTI, M., 1983, Ameliorarea plantelor si produ Agro., Cluj-Napoca, p. 292. Ed. Ceres, §, 1977, The integrated concept of cluding horizontal and vertical 1 cerea de simanta, Tipo. 39