HQU - Detection of potato virus by indicator plants - ISO/IEC 17025

OP070 Accreditation

HQU - Detection of
potato virus by indicator
plants - OP070

Date : September, 2016

Reference : Chuquillanqui, C.; Zea, B; Ynouye, C.; Muller, G. 2015. HQU - Detection of potato virus
by indicator plants- OP070, v.4. 29 pps. Not for general distribution. For most current version of the
procedure, please contact Giovanna Muller (g.muller@cgiar.org) 1-29 pp.

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HQU - Detection of potato virus by indicator plants, v.4. CIP-OP070 by International Potato Center
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Table of Contents
ENGLISH VERSION ____________________________________________________________________ 4
INTRODUCTION ______________________________________________________________________ 5
SCOPE ______________________________________________________________________________ 5
SAFETY _____________________________________________________________________________ 5
MATERIALS __________________________________________________________________________ 6
EQUIPMENT _________________________________________________________________________ 6
PROCEDURE _________________________________________________________________________ 6
1.1 Production of plantlets in vitro ________________________________________________________ 7
1.2. Transplanting of in vitro plantlets in greenhouse _________________________________________ 7
1.3. Growing of plants _________________________________________________________________ 7
2. Production of indicator plants and Protocol for producing true seed of indicator plants __________ 7
Table 1. Number of days from sowing to inoculating of the indicator plants used in host range test at
CIP ____________________________________________________________________________ 9
3. Host Range Test ___________________________________________________________________ 9
3.1. Sampling _______________________________________________________________________ 10
3.2. Maceration of the sample __________________________________________________________ 10
3.3. Inoculation _____________________________________________________________________ 10
3.5. Development of symptoms _________________________________________________________ 11
3.6. Evaluation ______________________________________________________________________ 12
Monitoring infection and recording results _________________________________________________ 12
Appendix 1. Preparation of soil _________________________________________________________ 14
Appendix 2. Preparation of soil for seed bed _______________________________________________ 15
Appendix 3. Preparation of gibberellic acid (1500 mg/L) solution _______________________________ 15
Appendix 4. Preparation of inoculation fosfate buffer (0.01 M) pH 8 _____________________________ 15
Internal quality control ________________________________________________________________ 15
VERSION EN ESPAÑOL _______________________________________________________________ 17
INTRODUCCIÓN _____________________________________________________________________ 17
SEGURIDAD ________________________________________________________________________ 17
MATERIALES ________________________________________________________________________ 18
PROCEDIMIENTO ____________________________________________________________________ 19
1. Producción de plántulas para la prueba de rango de hospederos ____________________________ 19
1.1 Producción de plántulas in vitro __________________________________________________ 19
1.2. Trasplante de plántulas in vitro en el invernadero ____________________________________ 19
1.3. Cultivo de plantas _____________________________________________________________ 19
2. Producción de plantas indicadoras y Protocolo para producir semilla PI OP070 ______________ 20
Tabla 1. Número de días desde la siembra hasta la inoculación de las plantas indicador utilizado
en la prueba de rango de hospedantes en el CIP ___________________________________ 20
3. Prueba de rango de hospedantes _____________________________________________________ 21
3.1. Muestreo _______________________________________________________________________ 21
3.2. Maceración de la muestra _________________________________________________________ 22
3.3. Inoculación _____________________________________________________________________ 22
3.4. Inoculación de un control sano y un control positivo _____________________________________ 22

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3.5. Detección de síntomas ____________________________________________________________ 23

3.6. Evaluación _____________________________________________________________________ 24
Monitoreo de síntomas y registro de resultados ____________________________________________ 24
4. Eliminación de plantas indicadoras ____________________________________________________ 26
Apendice 1. Preparación de sustrato ____________________________________________________ 26
Apendice 2. Preparación de sustrato para almacigo _________________________________________ 28
Apendice 3. Preparación de solución de ácido gibérelico (1500 mg/L) ___________________________ 28
Apendice 4. Preparación del buffer fosfato de inoculación (0.01 M) pH.8 ________________________ 28
Control de calidad interno _____________________________________________________________ 28

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TITLE HQU - Detection of potato virus by indicator plants - OP070

OWNER * Host Range Especialist

APPROVER * Head HQU

APPROVAL Aug 2008

DATE *

LAST REVIEW September, 2016

DATE *

REVIEW 12 Months
FRECUENCY *

ISSUE DATE Sep 19, 2016 11:21

CONTRIBUTORS Chuquillanqui, Carlos (CIP), Zea, Brenda (CIP)

*

CITATION * 070

KEYWORDS accredited, procedure, head_virology, head_ivu, b_zea, c_chuquillanqui

DOCUMENT ID * OP070

VERSION v.4
NUMBER

COMPETENT G.Muller; B.Flores;C.chuquillanqui; R.Lara; D.Cotera; I.Tineo

PERSONNEL *

RELATED 5.4
CLAUSES

RELATED
DOCUMENTS

CITATION OF Chuquillanqui, C.; Zea, B; Ynouye, C.; Muller, G. 2015. HQU - Detection of potato
THIS virus by indicator plants- OP070, v.4. 29 pps. Not for general distribution. For most
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ENGLISH VERSION

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INTRODUCTION
Potato crops are susceptible to infection with different viruses, which can result in a reduction of yield and
quality of the tubers. Generally under in vivo conditions infection can be detected by the presence of
symptoms in the leaves, tubers, and plant development. However, sometimes the symptoms do not
manifest themselves due to factors such as the concentration of virus in the plant, the climate or
interactive reactions between the virus and the plant.
To determine whether a plant is infected with a virus, serological (eg. ELISA NASH) or molecular (eg.
PCR) methods are used. In addition, the detection of symptoms in indicator plants is also a method that
can be used. At CIP, a set of 11 indicator plants is routinely used for detecting potato viruses. This set of
indicator plants is known to include at least one host susceptible to each of the mechanically transmitted
viruses in potato. By analogy, any other unknown virus that might be present in the potato under indexing
will stand a high probability of being detected through this procedure.

SCOPE
Some plant species react with very visible and characteristic symptoms when infected with a virus. These
plants can be used as an indicator of virus infection. Some plant species react very visible and
characteristic symptoms when infected with plant viruses, including the potato crop and are as follows:
Gomphrena globosa very susceptible to (PVX) showing symptoms at 5 days after inoculation and from 10
to 15 days in the following plants as Nicotiana glutinosa, Nicotiana benthamiana, Nicotiana debneyii,
Datura stramonium, Nicotiana tabacum "White burley" Chenopodium quinoa, Chenopodium murale,
Physalis floridana and Lycopersicon esculentum. These plants can be used as indicator plants virus
infection.

SAFETY

Disinfect the greenhouse 1 week before and after working a new badge of materials (see point
3.3).
Use laboratory coat.
Wash hands before and after enter to the greenhouse
Indicator plants should be grown in as near optimal condition as possible to stimulate rapid and
luxuriant growth.
Good control of insect vector of virus into the greenhouse (eg. White fly and afids).
Use masks and gloves during the inoculation process.

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MATERIALS
Plastic bag 4x6x6 cm
Plastic barcode labels
Indicator plants.
Carborundum powder (600 mesh).
Pots 3.5 "
Jiffys 4.3 cm
Plastic tray 24 x 31x 6 cm
Plastic stake
Latex gloves
Bambu stakes
Yellow tramps
Disposable gloves
Disposable mask
Forceps
Wash bottle
Burner
Alcohol
Metal bracket for tools
Laboratory coat
Beakers (1 and 2 liters)
Plant material to be tested (young leaves), approximately 0.5 - 1.0 g.
Inoculation buffer: 0.01M phosphate buffer, pH 8.0. (See appendix 4)

EQUIPMENT

Barcode printer for labels.

Digital camera to capture exceptional image symptoms.
Vapor sterilization chamber
Environmental monitoring device. (HOBO)

PROCEDURE
1. Production of plants for host range testing

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1.1 Production of plantlets in vitro

1.1.1 Prepare the in vitro planlets according to the date of inoculation for the host range test.

1.1.2 Propagate in vitro plantlets in a No. 16 tube to evaluate each accession, according to the Propagated
in vitro protocol (OP-056) .The multiplication is performed from the parent plant.

1.2. Transplanting of in vitro plantlets in greenhouse

The transplanting of the plantlets in the greenhouse takes place at 3-4 weeks after in vitro culture.

1.2.1. In the greenhouse, place 60 jiffies # 7 in a 24 x 31 x 6 cm plastic tray, hydrated with 4 liters of bencil-
dimetilalquil-amonio (Dimanin ®) solution to 0.5 ml / l. Let soak until they hydrate and make a small hole, the
approximate diameter of a pencil, in the center top of each jiffy.
1.2.2. With the help of two forceps, take out a plantlet from each test tube and remove the culture medium
adhered to the roots. Be very careful not to damage the roots.
1.2.3. Transplant the plantlet in the jiffy and identify it with the corresponding label stuck to the stake.
1.2.4. Sterilize forceps in the flame after each transplant.
1.2.5. Complete transplanting in the tray and add a little distilled water to each plantlet to prevent
dehydration.
1.2.6. Cover the tray with a perforated plastic bag over the middle, fix it with adhesive tape to the tray.
1.2.7. Remove the plastic after 2-3 days.
1.2.8. Place the tray on a table in the greenhouse.

1.3. Growing of plants

Grow plant placed in jiffys at a temperature of 18-22°C. after 3 – 4 weeks transplant to pots of 5” of
diameter. Water with tap water to keep the soil moist.

2. Production of indicator plants and Protocol for producing

true seed of indicator plants
Production of the indicator plants takes place in a isolated area (greenhouse 9A), planting the indicator
plants is made following the orders outlined in Table 1.

2.1. Seed germination

2.1.1.Seed from indicator plants are germinated in clean 24 x 31 x 6 cm plastic trays with six holes in the
base to facilitate water drainage. The trays are previously disinfected with bleach 3%.
2.1.2. Fill two thirds of the tray with soil for the seed bed (Appendix 2). Make 10 rows, 0.5 cm deep,
separated by 3-4 cm from each other.
2.1.3. Use one tray for every two indicator plant species, and position 200 (0.2 g/species)seeds per row.
According to the days necessary for germinating and ideal age or size of the plants ready for inoculation

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(see Table 1), start sowing of the indicator species in the 'order of planting' as indicated in Table 1. For
example: Order 1 for Gomphrena globosa; Order 2 for Nicotiana debneyii, N. glutinosa, etc.; Order 3 for
Nicotiana benthamiana; Order 4 for Chenopodium murale, C. quinoa, etc.
2.1.4. Incubate the trays containing the seeds at a temperature of 24-26 ° C until the emergence of the
seedlings. Water regularly to keep the soil in trays wet, with the help of a sprinkler. The time of seed
germination is 4-12 days (Table 1).

2.2 Transplanting indicator plant to pots

2.2.1 When the seeds have grown 2 – 3 true leaves (approximately 4 – 12 days after the sowing), remove
each plant individually of the seed bed and transfer to a pot of 3.5” of diameter. Fill the pots with steril soil
(until the edge), the pots are previously washed and disinfected with bleach 3% (Appendix 1).

2.2.2 Sow the plants in the pots and add more soil. Water immediately with tap water to moist the soil and
then regularly to maintain the plants viable. A week before the inoculation the plants are removed from the
healthy plants production area.

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Table 1. Number of days from sowing to inoculating of the

indicator plants used in host range test at CIP
Order for Indicator plant Treatment with Order of Germination Age for Stage of
inoculation Gibberellic acid planting time inoculation plant
(aprox. (aprox. for
days) days) inoculation
(number
of leaves)

1 N. benthamiana Yes (24h) 3 6 36-41 2- 3

2 N. clevelandii x Yes (24h) 2 8 43 2- 3

N. bigelovii

3 N. debneyii Yes (24h) 2 12 47 2-3

4 N. glutinosa Yes (24h) 2 5 40 2-3

5 N. tabacum Yes (24h) 2 9 44 2-3

"White Burley"

6 C. murale Yes (24h) 4 6 31-36 3

7 C. quinoa No 4 4 29-30 3

8 D. stramonium Yes (48 h) 4 6 31-36 2

9 Gomphrena No 1 7 57 2
globosa

10 Lycopersicum Yes (24 h) 4 11 41 2

esculentum
"Rutgers"

11 Physalis Yes (24 h) 4 12 42 2

floridana

This order makes symptom evaluation easier.

Gibberellic acid doses: 1500 mg / L

3. Host Range Test

3.1. The test is conducted in greenhouse nine, in the virus indexing area, at a temperature of 18-22°C.
3.2. The area and the tables are cleaned and fumigated 1 week before placing a new badge of material to
be indexed.

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Fumigation is done applying fungicide (benomyl 2g/L, FARMATHE @), and a mixture of pesticides
(imidaclopid 1.5 ml/L, CONFIDOR @; abamectina 2ml/L, VERTIMEC @). Set a yellow trap for insects every
two tables.

3.3. A week before the test, sort 15 ranges per table. Place the indicator plants in a row according to the
order established in Table 1.
3.4. Identify each row of indicator plants with a white sign indicating the name of the species.
3.5. The indicator plants will be inoculated according to the indicated age of the plant or number of leaves
per plant as indicated in Table1

3.1. Sampling
3.1.1 Print a bar-coded label for each accession to be evaluated and stick on a plastic bag (10x14 cm).
3.1.2. Put the labeled plastic bag next each corresponding pot.
3.1.3 With the help of the plastic bag, take a portion of the basal, middle and apical leaf of each accession
to be evaluated. Avoid touching the plant with your hands. Each sample should weigh between 0.5 - 1.0 g.

3.2. Maceration of the sample

3.2.1. Add 3 ml of inoculation buffer to each sample bag, using a manual liquid dispenser.
3.2.2. Grind the sample plant material, making lateral and circular movements with the test tube until get on
homogeneous solution.

3.3. Inoculation
3.3.1. Only when the indicator plants have been inspected and found ready for inoculation the bar-coded
label is printed for each accession When printed stick the label on a plastic stake.
3.3.2. Put on latex gloves before inoculation.
3.3.3. Dust carborundum powder (600 mesh) onto leaves of indicator plants.
3.3.4. Place each sample bag containing the extraction sap in front of each host range set, placing the stake
with the accession identification in the first indicator plant from each host range, respectively.
3.3.5. Lightly hold the leaf of the indicator plant with paper towel. Wet your fingertip in the sap and scrub 2-3
leaves of an indicator plant.
3.3.6. Start each scrubbing from the petiole and until the end of the leaf. Avoid excess pressure. Perform
the same procedure for each of the 11 indicator plants.
3.3.7. Immediately after inoculation, wash the sap from the inoculated leaves with a gentle water wash
(using a wash bottle).
3.3.8. Remove all used material, clean the table. Disinfect the gloves (on hands, by washing in bleach 3%
and rinsing in tap water.). Dry hands with paper before proceeding with the next inoculation.

3.3.9 . Range of time between sampling and inoculation is 4 -5 hours

3.4. Healthy and positive control to inoculation

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3.4.1. Healthy and positive controls are used for each batch of plants to be evaluated. Healthy and positive
controls are inoculated with sap from healthy and virus-infected plants, respectively. Positive control
includes the following viruses: PVX, PVY, PVS, APLV and APMV.

3.4.2. First inoculate negative controls (healthy plants) and at the end of the process the positive controls.

3.4.3. Virus-infected plants (virus source) are grown in a greenhouse 7 at 18-22°C with 10.000 lux =
0,9290304 lumen/ft2, 15.000 lux. = 1,393456 lumen/ft2. Healthy plants are grown in an isolated greenhouse
in the same conditions as above.

3.4.4. The batch of virus-source plants used to inoculate positive controls are renewed every month and are
given by virology unit (HQU).

3.5. Development of symptoms

3.5.1. The majority of potato viruses produce clear symptoms under the right conditions (18-22°C).
Symptoms expression depends on temperature, light, and the virus involved. Symptoms can be divided into
two groups:
a). Local symptoms remaining restricted to the site of inoculation
b). Systemic symptoms appearing in all leaves even on those non-inoculated
A description of the common symptoms shown by the indicator plants are given in Table 2.
Certain potato viruses produce only local symptoms in certain indicator hosts, while others produce both
local and systemic symptoms (see Table 2 below).

Table 2. The local and systemic symptoms caused by different viruses of the potato in some
indicator plants | Indicator plant

Indicator PVYO APMV PVS APLV PVX PVT PYV PMTV TRV PSTVd CMV AMV
plant C

N. cs cs - -/mos nrs -/- -/- mos -/- -/- -/- -/-

benthamiana /mos, /mos, /mos /mos, /nlp,
ld ld ld,ns ld

N. clevelandii -/- mos -/- mos, -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
x /ld ns,
N. bigelovii ld, st

N. debneyii cs -/- - -/mos nrs -/- -/- mos, -/- -/- -/- -/-
/mos, /mos /vn, cs,
ll mos, nlp
ns

N. glutinosa - -/mos -/- -/mos cr,clv -/- -/- -/- -/- -/- cs, iys
/mos, /vn, mos,
ld ld, ld,lb

-/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-

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N. tabacum - crs
"White /mos, /vn,
Burley" vn mos,
ns,
nlp

Chenopodium cs/- -/- ns/- -/mos cs,ns an -/- -/- -/- -/-
murale /ll, /ld
led

C. quinoa cs- -/- cs/ld cs/- cs,ns mos -/- -/- lcs -/- -/- -/-
/lcl

D. -/- -/- -/ll -/- cs,ns -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
stramonium /vn,
ld,ll,
mos

Gomphrena -/- -/- -/- -/- ns/ll -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
globosa

Lycopersicum -/- -/- -/- -/- - -/- -/- -/- -/- mos,st, -/- -/-
esculentum /mos ld
"Rutgers"

Physalis mmos mos,ll -/- mmos, Lln, -/- iys -/- -/- -/- -/- iys
floridana ll ald

nlp= necrotic line patterns; crs= chlorotic ring spots; mos= mosaic; cs= chlorotic spots; ns= necrotic spots;
vn= vein necrosis; ld= leaf deformation; st= stunting; cr= chlorotic rings; clv= chlorotic veins; nrs= necrotic
ring spots; ll=local necrotic lesions; lcs= local chlorotic lesions; an = apical necrosis; led = Leaf drop; mmos=
mild mosaic; lda = leaf deformation apical, iys = intervenal yellow spot; lcs= local chlorotic spot; lb = leaf
blister; cr= chlorotic rings; -/- = No symptoms.

Common symptoms in potato

Light mosaic, severe mosaic, bottom leaves rolling, chlorosis, leaves deformation, purple coloration.

3.6. Evaluation

Monitoring infection and recording results

Symptoms on potato plants are evaluated twice: 2-3 weeks after planting (before taking samples for host
range inoculation), after weekly during a month after the inoculation.
Symptoms on indicator plants are evaluated 5 days after inoculation and then weekly up to 25 days after
inoculation.
A description of the common symptoms shown by indicator plants is indicated in Table 3.

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Plants showing symptoms are marked with a red stake in the plant pot. The symptoms are registered in a
evaluation summary sheet (Example:Link), after the results are transferred through wireless LAN using a
hand held computer (pocket PC).
Results indicating infection with one virus or more can be visualized in the CIP-VIR system. Results are
notified to the client within the three weeks after finishing the test.

Table3. Symptoms Checklist

Short name of the symptom Long name of the symptom Spanish

ALD Apical Leaf deformation Deformación de hojas apical

AN Apical necrosis Necrosis apical

APC Apical purple color Color purpura apical

B Blistering Ampolladura

C Chloris Clorisis

Cs Chlorotic spots Manchas choroticas

Cr Chlorotic rings Anillos cloroticos

Crik Crinkle Borde de foliolos sinuosos

D Dwarfing Enanismo

Ld Leaf deformation Deformación de hojas

Lead Leaf drop Caida de hojas

Lil Little leaf Hojas pequeñas

LL Local necrotic lesions Lesiones Locales Necroticas

LL(c) Chlorotic local lesions Lesiones Locales Cloroticas

LR Leafroll of lower leaves Enrollamiento de hojas inferiores

Lys Intervenal yellow spots Manchas amarillas intervenales

M Mosaic Mosaico

M(m) Mild Mosaic Mosaico suave

Mo Mottling Moteado

M(sev) Severe Mosaic Mosaico severo

NLP Necrotic line patterns Lineas necroticas patronales

Nr Necrotic rings Anillos necróticos

Ns Necrotic spots Manchas necróticas

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Short name of the symptom Long name of the symptom Spanish

R Rugosity Rugosidad

Urg Up right growing Crecimiento erecto

Vc Vein Clearing Aclaramiento de nervaduras

Vn Vein necrosis Necrosis de nervaduras

4. Elimination of indicator plants

After indicator plants are evaluated, plants must be eliminated placing them into autoclaving plastics bags
size 21 x 40 x 4 cm, during 1 hour at 85°C in the vapor sterilization chamber and after that eliminate the
plants.

Appendix 1. Preparation of soil

To prepare 600 kg of soil, weight according table 4 the peat, washed river sand and earthworm humus.
To evaluate 250 entries in the host range test, prepare approximately 1000 kilograms of soil.
Move materials into the soil preparation area. Turn on the machine, mixing and pouring each of the
components. Mix for 15 minutes to homogenize the soil. Open the bottom door of the mixer and drop the
mixture into trucks to empty the entire contents (approximately 14 trucks). Stop the mixer.
Pour the soil into the sterilization tank.
Moisten the soil with approximately 5 liters of tap water using a sprinkler.
Cover the tank with a thick canopy, and seal, so that they are no openings left.
Move the tank into the sterilization area and connect the water vapor booster hose pipe to the tank. Turn on
the engine and sterilize the soil for 4 hours at 75 ° C.
Leave the soil in the tank for 48-72 h (until cool).
Add the soil to the mixing machine again. Turn on the machine and mix for 3-5 minutes before adding NPK
fertilizer, fungicides and peat (Pro-mix) according to Table 4.
Open the bottom door of the mixer and drop the prepared soil in clean plastic bins, 150 liter capacity (10
bins approximately) that have been disinfected with bleach 3%. Close the door and turn off the machine.
Store the bins in greenhouse.
It is advisable to prepare the soil one month prior to its use.

Table 4. Preparation of soil (500kg)

Components Quantity

Ground moss 55.6 kg (10.5 wheelbarrows)

Washed river sand 100 kg ( 2 wheelbarrows)

Earthworm humus 400 kg (8 sacks)

Peat (Pro-mix) 50 kg (1 package)

NPK (20:20:20) 1.25 kg

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Components Quantity

Fungicide Benomyl** 10 g

Pentachloronitrobenzene (PCNB) ** 10 g

** Dissolve 10g of fungicide in 7.5 liters of water (final concentration 1.33 g / l)

Appendix 2. Preparation of soil for seed bed

Mix 50 kg of peat (promix) with 15 liters fungicide solution (0.67 g /liter of benomyl and 0.67 g/liters of
pentachloro nitrobenzene (PCNB)
Store the soil in clean, disinfected bins (150 liter capacity). The soil from one bind is enough for 50 trays.

Appendix 3. Preparation of gibberellic acid (1500 mg/L)

solution
Weigh 375 mg of gibberellic acid.
Add 5 ml of ethanol 96% to dissolve the gibberellic acid.
Add slowly 200 ml distilled water and stir continuously.
Make up to 250 ml with distilled water.
Store in a correctly labeled plastic bottle at 4 ° C, for up to 1 month

Appendix 4. Preparation of inoculation fosfate buffer

(0.01 M) pH 8
Prepare the following solutions with distilled water:

Solution A: NaH2PO4.H20 - 27.6 g/l

Solución B: 28.42 g/l o Na2HP04-12H20 - 71.64 g/l.

Mix 2.65 cm3 of solution A and 47.35 cm3 of solution B and fill up to 100 cm3 with distilled water.

Store in a correctly labeled plastic bottle at 4 ° C, for up to 1 month

Internal quality control

1. Quality check list (Internal Quality Control OP-70).
2. Bar code labels for pots identification.
3. Bar code labels for bags identification during sampling for the inoculation.
4. Continue evaluation of symptoms of indicator and potato plants.
5. Environmental conditions monitoring of the greenhouse using HOBO.

6.

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6. Preventive applications of pesticides.(Links: 9A , 9B, 9C y 2A)

Reference

1. Abad, J.A 1979. Estudio comparativo de dos aislamientos del virus T de la papa. M.Sc. Thesis.
Universidad Nacional Agraria La Molina, Lima, Perú. 90p.
2. Hooker, W.J. (Ed). 1981 Compendium of potato diseases. The American Phytopathological Society,
St. Paul MN, USA. 125 p.
3. Salazar, L, F. 1996. Potato Viruses and Their Control, Lima, Peru. International Potato Center, 214 p.
4. Salazar LF (2005) Emerging and re-emerging potato diseases in the Andes. Potato Research 49 (1):
43-47.
5. Tenorio J, Franco Y, Chuquillanqui C, Owens RA, Salazar LF (2006) Reaction of potato varieties to
Potato mop-top virus infection in the Andes. Amer.J. of potato res (2006) 83:423-431
6. Fuentes, S. and U. Jayasinghe.1993 Amarillamiento de la papa causada por un nuevo virus
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7. Potato Virus & Virus like Diseases of potatoes and production of seed potatoes.(2001).Edited by God
Loebenstein, P.H.Berger,A.A Runt and R.H Lawson. Clemson University
8. Raman, K. V. 1985. Transmission of potato virus by aphids. Technical Information Bulletin 2.
International Potato Center, Lima, Peru. 23 pp.
9. 9.Jayasinghe U. and C. Chuquillanqui. 1992. Uso de plantas Indicadoras para la detección de virus
de papa. Guía de Investigación, Centro Internacional de la papa. CIP 21

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VERSION EN ESPAÑOL

INTRODUCCIÓN
Los cultivos de papa son susceptibles a la infección de diferentes virus, que pueden dar lugar a una
reducción del rendimiento y calidad de los tubérculos. Generalmente la infección bajo condiciones in vivo
puede ser detectada por la presencia de síntomas en las hojas, tubérculos y el desarrollo de la planta.
Sin embargo, a veces los síntomas no se manifiestan debido a factores tales como la concentración del
virus en la planta, el clima o las reacciones interactivas entre el virus y la planta.
Para determinar si una planta está infectada por un virus, se utilizan los métodos serológicos (ejm.
ELISA, NASH) o moleculares (ejm. PCR). Además, la detección de síntomas en plantas indicadoras es
también un método que puede ser usado. En el CIP, un conjunto de 11 plantas indicadoras se usan
sistemáticamente para detectar el virus de la papa. Este conjunto de plantas indicadoras es conocido por
incluir al menos un huésped susceptible a cada uno de los virus que se transmiten mecánicamente en la
papa. Por analogía, cualquier otro virus desconocido que pueda estar presente en la papa bajo
indexación, tendrá una alta probabilidad de detectarse mediante este procedimiento.

ALCANCE

Algunas especies de plantas reaccionan con síntomas muy visibles y característicos cuando están
infectados con virus de vegetales, entre ellas el cultivo de papa y son las siguientes: Gomphrena globosa
muy susceptible a (PVX) que muestran los síntomas a los 5 días después de la inoculación,y a partir de
los 10 hasta los 15 días en las siguientes plantas como: Nicotiana glutinosa, Nicotina.benthamiana ,
Nicotiana debneyii , Datura stramonium , Nicotiana.tabacum “ White burley ” Chenpodium quinoa ,
Chenopodium murale , Physalis floridana y Lycopersicon esculentum. Estas plantas pueden ser usadas
como plantas indicadoras de infección de virus.

SEGURIDAD

Desinfectar el invernadero 1 semana antes y despues de trabajar un lote nuevo de materiales (ver
punto 3.3).
Usar mandil de laboratorio.
Lavarse las manos antes y después de ingresar al invernadero.
Las plantas indicadoras deberían ser cultivadas en las condiciones mas optimas como sea posible
para estimular el crecimiento rápido y frondoso.
Buen control de insectos vectores de virus (Ejemplo mosca blanca y afidos) dentro del
invernadero.
Usar mascarilla y guantes descartables durante el proceso de inoculación.

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MATERIALES
Bolsas plásticas 4x6x6 cm
Etiquetas plásticas con código de barras
Plantas indicadoras.
Polvo de Carborundum (600 mesh).
Macetas 3.5 "
Jiffys 4.3 cm
Bandeja de plástico 24 x 31x 6 cm
Estacas de plástico
Guantes de látex
Estacas de plástico
Estacas de bambu
Trampas amarillas
Guantes descartables
Mascarilla descartable
Pinzas
Pizeta
Mechero
Alcohol
Soporte de metal para herramientas
Mandíl de laboratorio
Vasos de precitación de (1 y 2 Litros)
Material vegetal a ser analizado (Hojas jóvenes), aproximadamente 0.5 - 1.0 g.
Buffer de inoculación: 0.01M buffer fosfato, pH 8.0 (Ver apendice 4).

QUIPAMIENTO

.
Impresora de etiquetas con código de barras.
Cámara digital para capturar imágenes de síntomas excepcionales.
Cámara de esterilización a vapor.
Dispositivo de monitoreo ambiental (HOBO).

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PROCEDIMIENTO

1. Producción de plántulas para la prueba de rango de

hospederos

1.1 Producción de plántulas in vitro

1.1.1 Preparar las plántulas in vitro de acuerdo a la fecha de inoculación para la prueba de rango de
hospedantes.
1.1.2 Propagar plántulas in vitro de cada accesión a evaluar en tubos de 16 x 125 mm de acuerdo al
protocolo de multiplicación in vitro (OP-56). La multiplicación se realiza a partir de una sola planta la cual se
denomina planta madre.

1.2. Trasplante de plántulas in vitro en el invernadero

El trasplante de las plántulas en el invernadero se realiza después de 3-4 de la multiplicación in vitro.

1.2.1. En el invernadero, coloque 60 jiffys # 7 en una bandeja de plástico de 24 x 31 x 6 cm, hidratarlos con
4 litros de bencil-dimetilalquil-amonio (Dimanin ®) 0,5 ml/ l. Dejar remojar hasta que se hidraten y hacer un
orificio pequeño, con un diámetro aproximado de un lápiz, en la parte superior del centro de cada jiffy.
1.2.2. Con la ayuda de dos pinzas, saque una plántula de cada tubo de ensayo y extraiga el medio de
cultivo adherido a las raíces. Sea muy cuidadoso en no dañar a las raíces.
1.2.3. Trasplante la plántula en el jiffy de 4.3 cm (3M) e identifíque la con la etiqueta correspondiente
pegada en un estaca.
1.2.4. Esterilice las pinzas con la ayuda de un mechero después de cada trasplante.
1.2.5. Complete el trasplante en la bandeja y agregue un poco de agua destilada a cada plántula para
prevenir la deshidratación.
1.2.6. Cubra la bandeja con una bolsa plástica perforada por el medio, y pegarla con cinta adhesiva a la
bandeja.
1.2.7. Retire el plástico después de 2-3 días.
1.2.8. Coloque la bandeja en una mesa en el invernadero.

1.3. Cultivo de plantas

Cultivar las plantas colocadas en los jiffys a una temperatura de 18-22°C, después de 3-4 semanas
trasplantar a macetas de 5 pulgadas de diámetro. Regar con el agua del caño para mantener el suelo
húmedo

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2. Producción de plantas indicadoras y Protocolo para

producir semilla PI OP070
La producción de plantas indicadoras se realiza en un área aislada (Invernadero 9A), la siembra de plantas
indicadoras se desarrolla siguiendo el orden de la Tabla 1.

2.1. Germinación de semillas

2.1.1. Las semillas de las plantas indicadoras son germinadas en bandejas plásticas limpias de 24 x 31 x 6
cm, con seis agujeros en la base para facilitar el drenaje del agua. Las bandejas se desinfectan
previamente con lejía al 3%.
2.1.2. Llenar dos tercios de la bandeja con tierra para la cama de las semillas (Apéndice 2), hacer 10
surcos de 0.5 cm de profundidad y 3-4 cm de distancia entre surco.
2.1.3. Use una bandeja para cada dos especies de plantas indicadoras y coloque 200 semillas (0.2 g
/especie) por surco, se realiza la siembra de las especies indicadoras según los días necesarios para la
germinación, edad ideal o el tamaño de las plantas para la inoculación (ver Tabla 1). Por ejemplo: Orden 1
para Gomphrena globosa; Orden 2 para Nicotiana debneyii, N. glutinosa, etc. ; Orden 3 para Nicotiana
benthamiana; Orden 4 para Chenopodium murale, C. quinoa, etc.
2.1.4. Incubar las bandejas que contienen las semillas a una temperatura de 24-26 °C hasta la emergencia
de las plántulas. Regar con ayuda de un rociador para mantener la tierra húmeda de las bandejas. El
tiempo de germinación de las semillas es de 4-12 días (Ver Tabla 1).

2.2. Trasplante de plantas indicadoras a macetas

2.2.1. Cuando las semillas de las plantas han formado 2-3 hojas verdaderas (aproximadamente 4-12 días
déspues de la siembra), remueve cada planta individualmente de la cama de semillas y transferirla a una
maceta de 3.5 pulgadas de diámetro. Llenar con sustrato estéril las maceta (hasta el borde), las macetas
son previamente lavadas y desinfectadas con 3% de lejía (Apéndice 1).
2.2.2. Sembrar las plantas en las macetas y cubra con más tierra. Riegue de inmediato con agua corriente
para humedecer el suelo y luego regularmente para mantener viables las plantas.
Una semana antes de la inoculacion la plantas son retiradas del área de producción de plantas sanas.

Tabla 1. Número de días desde la siembra hasta la inoculación de las

plantas indicador utilizado en la prueba de rango de hospedantes en el
CIP

Order for Indicator plant Treatment with Order of Germination Age for Stage of
inoculation Gibberellic acid planting time inoculation plant
(aprox. (aprox. for
days) days) inoculation
(number
of leaves)

1 N. benthamiana Yes (24h) 3 6 36-41 2- 3

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2 N. clevelandii x Yes (24h) 2 8 43 2- 3

N. bigelovii

3 N. debneyii Yes (24h) 2 12 47 2-3

4 N. glutinosa Yes (24h) 2 5 40 2-3

5 N. tabacum Yes (24h) 2 9 44 2-3

"White Burley"

6 C. murale Yes (24h) 4 6 31-36 3

7 C. quinoa No 4 4 29-30 3

8 D. stramonium Yes (48 h) 4 6 31-36 2

9 Gomphrena No 1 7 57 2
globosa

10 Lycopersicum Yes (24 h) 4 11 41 2

esculentum
"Rutgers"

11 Physalis Yes (24 h) 4 12 42 2

floridana

This order makes symptom evaluation easier.

Gibberellic acid doses: 1500 mg / L

3. Prueba de rango de hospedantes

3.1. La prueba se realiza en el invernadero 9, en el área de indexado de virus, a una temperatura de18-22°
C.
3.2. El área y las mesas son limpiadas y fumigadas 1 semana antes colocar un nuevo lote de materiales a
indexar. La fumigación se hace aplicando fungicida (benomyl 2g/L, FARMATHE @) y una mezcla de
pesticidas (imidaclopid 1.5 ml/L, CONFIDOR @; abamectina 2ml/L, @ de VERTIMEC). Instalar una trampa
amarilla para los insectos cada dos mesas.
3.3. Una semana antes a la prueba, ordenar 15 rangos por mesa. Colocar las plantas indicadoras en fila de
acuerdo al orden establecido en el Cuadro 1.
3.4. Identificar cada fila de las plantas indicadoras con una etiqueta blanca que indique el nombre de la
especie.
3.5. Las plantas indicadoras se inocularán según la edad indicada o número de hojas por planta según se
indica en el Cuadro 1.

3.1. Muestreo
3.1.1 Imprimir una etiqueta con código de barras para cada accesión a ser evaluada y pegarla en una bolsa
plástica (10 x 14 cm).

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3.1.2. Colocar la bolsa etiqueta junto a cada maceta correspondiente.

3.1.3 Con ayuda de la bolsa tomar una porción de la hoja basal, media y apical de cada accesión que se va
evaluar. Evite tocar la planta con las manos. Cada muestra debe contener entre 0.5-1.0 g.

3.2. Maceración de la muestra

3.2.1. Añadir 3 ml de buffer de inoculación a cada bolsa de muestra, usando un dispensador líquido manual.
3.2.2. Moler el material vegetal de la planta muestreada, realizando movimientos laterales y circulares
ayuda de un tubo de ensayo hasta conseguir una solución homogenea.

3.3. Inoculación
3.3.1. Solo cuando las plantas indicadoras han sido inspeccionadas y encontradas listas para la
inoculación, se imprime la etiqueta con código de barras para cada accesión. Cuando se imprime la
etiqueta pegarla en una estaca de plástico.
3.3.2. Ponerse los guantes de látex antes de la inoculación.
3.3.3. Esparcir el polvo de carborundun (malla de 600) sobre dos hojas de cada una de las plantas
indicadoras.
3.3.4. Colocar cada bolsa de muestreo que contiene la savia de extracción delante de cada conjunto de
host range, colocando la estaca con la identificación de accesiones en la primera planta indicadora de cada
rango de hospedantes, respectivamente.
3.3.5. Mantener levemente la hoja de la planta indicadora con papel toalla. Moje la yema de los dedos en la
savia y frote 2-3 hojas de la planta indicadora.
3.3.6. Comience cada uno frotando desde el pecíolo hasta el final a la punta de la hoja. Evitar presión
excesiva. Realice el mismo procedimiento para cada una de las 11 plantas indicadoras.
3.3.7. Inmediatamente después de la inoculación, lave la savia de las hojas inoculadas con un lavado de
agua suave (usando una pizeta).
3.3.8. Eliminar todo material usado, limpiar la mesa. Desinfectar los guantes (con las manos, lavándolos en
3% de lejía y enjuagarlos con agua del caño.). Secar las manos con papel antes de proceder con la
siguiente inoculación.

3.3.9, Rango de tiempo entre muestreo y la inoculaciónn es 4 -5 horas

3.4. Inoculación de un control sano y un control

positivo
3.4.1. Se utilizan controles sanos y positivos en cada uno de los grupos de plantas a evaluar. Los controles
sanos y positivos son inoculados con savia de plantas sanas e infectadas con virus, respectivamente. El
control positivo incluye los siguientes virus: PVX, PVY, PVS, APLV y APMV.
3.4.2. Se inoculan primero los controles negativos (plantas sanas) y al final del proceso se inoculan los
controles positivos.
3.4.3. Las plantas infectadas por virus (fuente de virus) son cultivadas en el invernadero 7 a una
temperatura de 18-22°C con una intensidad luminosa de 10.000 lux = 0,9290304 lumen/ft2, 15.000 lux. =
1,393456 lumen/ft2 . Las plantas sanas se cultivan en un invernadero aislado bajo las mismas condiciones

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anteriores.
3.4.4. El lote de plantas de fuente de virus usadas para inocular los controles positivos se renuevan todos
los meses y son proporcionadas por la unidad de virologia (HQU).

3.5. Detección de síntomas

3.5.1. La mayoría de los virus de la papa producen síntomas claros en condiciones adecuadas (18-22°C).
La expresión de síntomas depende de la temperatura, luz y el virus involucrado. Los síntomas pueden
dividirse en dos grupos:
a). Síntomas locales que permanecen restringidos al lugar de inoculación
b). Síntomas sistémicos que aparecen en todas las hojas incluso en aquellas no inoculadas
Una descripción de los síntomas más comunes mostrados por las plantas indicadoras se describe en el
Cuadro 2.
Ciertos virus de papa producen solo síntomas locales en ciertos huéspedes indicadores, mientras otros
producen ambos, tanto síntomas locales y sistémicos (ver Cuadro 2 abajo).

Tabla 2. Los síntomas locales y sistémicos causados por diferentes virus de la papa en algunas
plantas indicadoras

Indicator PVYO APMV PVS APLV PVX PVT PYV PMTV TRV PSTVd CMV AMV
plant C

N. cs cs - -/mos nrs -/- -/- mos -/- -/- -/- -/-

benthamiana /mos, /mos, /mos /mos, /nlp,
ld ld ld,ns ld

N. clevelandii -/- mos -/- mos, -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
x /ld ns,
N. bigelovii ld, st

N. debneyii cs -/- - -/mos nrs -/- -/- mos, -/- -/- -/- -/-
/mos, /mos /vn, cs,
ll mos, nlp
ns

N. glutinosa - -/mos -/- -/mos cr,clv -/- -/- -/- -/- -/- cs, iys
/mos, /vn, mos,
ld ld, ld,lb

N. tabacum - -/- -/- -/- crs -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
"White /mos, /vn,
Burley" vn mos,
ns,
nlp

Chenopodium cs/- -/- ns/- -/mos cs,ns an -/- -/- -/- -/-
murale /ll, /ld
led

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C. quinoa cs- -/- cs/ld cs/- cs,ns mos -/- -/- lcs -/- -/- -/-
/lcl

D. -/- -/- -/ll -/- cs,ns -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
stramonium /vn,
ld,ll,
mos

Gomphrena -/- -/- -/- -/- ns/ll -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
globosa

Lycopersicum -/- -/- -/- -/- - -/- -/- -/- -/- mos,st, -/- -/-
esculentum /mos ld
"Rutgers"

Physalis mmos mos,ll -/- mmos, Lln, -/- iys -/- -/- -/- -/- iys
floridana ll ald

nlp= necrotic line patterns; crs= chlorotic ring spots; mos= mosaic; cs= chlorotic spots; ns= necrotic spots;
vn= vein necrosis; ld= leaf deformation; st= stunting; cr= chlorotic rings; clv= chlorotic veins; nrs= necrotic
ring spots; ll=local necrotic lesions; lcs= local chlorotic lesions; an = apical necrosis; led = Leaf drop; mmos=
mild mosaic; lda = leaf deformation apical, iys = intervenal yellow spot; lcs= local chlorotic spot; lb = leaf
blister; cr= chlorotic rings; -/- = No symptoms.

Sintomas comunes en papa:

Mosaico suave, Mosaico severo, Enrollamiento de hojas inferiores, Clorosis, Deformación de Hojas,
Coloración purpura.

3.6. Evaluación

Monitoreo de síntomas y registro de resultados

Los síntomas en las plantas de papa se evalúan dos veces: 2-3 semanas después de la siembra (antes de
tomar muestras para inoculación de rango de hospedantes), luego semanalmente durante 1 mes después
de la inoculación.
Los síntomas en las plantas indicadoras se evalúan 5 días después de la inoculación y luego
semanalmente hasta 25 días después de la inoculación.
Una descripción de los síntomas comunes mostrados por las plantas indicadoras se indica en el Cuadro 3.
Las plantas que muestran los síntomas se marcan con una estaca roja en la maceta de la planta. Se
registran los síntomas en una hoja resumen de evaluación (Example:Link ), luego se transfieren los
resultados al servidor corporativo a través de la red inalámbrica LAN usando una computadora de mano
(pocket PC).
Los resultados de las accesiones infectadas con uno o mas viruses pueden visualizarse en el sistema de
CIP-VIR. La notificación de resultados se realizará dentro de las tres semanas posteriores a la fecha de
culminación de los ensayos.

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Tabla 3. Lista de síntomas

Short name of the symptom Long name of the symptom Spanish

ALD Apical Leaf deformation Deformación de hojas apical

AN Apical necrosis Necrosis apical

APC Apical purple color Color purpura apical

B Blistering Ampolladura

C Chloris Clorisis

Cs Chlorotic spots Manchas choroticas

Cr Chlorotic rings Anillos cloroticos

Crik Crinkle Borde de foliolos sinuosos

D Dwarfing Enanismo

Ld Leaf deformation Deformación de hojas

Lead Leaf drop Caida de hojas

Lil Little leaf Hojas pequeñas

LL Local necrotic lesions Lesiones Locales Necroticas

LL(c) Chlorotic local lesions Lesiones Locales Cloroticas

LR Leafroll of lower leaves Enrollamiento de hojas inferiores

Lys Intervenal yellow spots Manchas amarillas intervenales

M Mosaic Mosaico

M(m) Mild Mosaic Mosaico suave

Mo Mottling Moteado

M(sev) Severe Mosaic Mosaico severo

NLP Necrotic line patterns Lineas necroticas patronales

Nr Necrotic rings Anillos necróticos

Ns Necrotic spots Manchas necróticas

R Rugosity Rugosidad

Urg Up right growing Crecimiento erecto

Vc Vein Clearing Aclaramiento de nervaduras

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Short name of the symptom Long name of the symptom Spanish

Vn Vein necrosis Necrosis de nervaduras

4. Eliminación de plantas indicadoras

Después de la evaluación, las plantas deben ser colocadas en bolsas plásticas de 21 x 40 x 4cm, durante 1
hora a 85ºC en la cámara de esterilización a vapor y después eliminar las plantas.

Apendice 1. Preparación de sustrato

Materiales y/o insumos Para preparación de sustrato
* Musgo Molido ( 16kg/saco ) 20 sacos = 320 kg
* Arena de rio 200 kg
* Humus de lombriz 16 sacos (40 kg/saco) = 640 kg
* SOGEMIX SM-2 = 3 fardos (30 Kg/saco) =90 kg

Paca de 108 litros (3.8 cu ft) compactada. SOGEMIX SM-2 es un sustrato de cultivo a base de musgo
esfágnico y que contiene Vermiculita y Perlita para el cultivo de una gran variedad de especies vegetales.
Este medio de cultivo es muy completo, ligero y uniforme. Ha sido preparado con un alto grado de
consistencia para asegurar el desarrollo vegetal óptimo. Contiene Calcita y Dolomita como corrector de pH
y una carga inicial de fertilizante = Peso = 27-34 kg
* Agua caño 15 litros
* Fertilizante Compuesto (NPK) 20-20-20: 2.5 kg
* Fungicida: Farmathe: (Benomil) = 20 gr
* PCNB: (Pentacloro Nitrobenceno) = 20 gr
* Agua de caño 15 litros
* Combustible: Petróleo Diesel 2 = 12 galones
* Preparación de la arena
* Lavar la arena varias veces con agua de caño con el fin de eliminar sales y residuos en una carretilla un
día antes de la preparación del sustrato
* Trasladar la arena con una carretilla hacia el área de preparación de sustrato

Procedimiento de preparación

Para evaluar 250 entradas por la prueba de rango, preparar 1,250 kg de sustrato, pesar los materiales
según a la tabla 4 como musgo molido, humus de lombriz, y arena de rio lavada. Realizando el proceso en
dos partes debido a que la capacidad de la maquina mezcladora de 650 kg. Colocarlos en carretilla para
trasladar los materiales hacia el área de preparación de sustrato y según el siguiente proceso:
# Desinfección de la maquina mezcladora previo a la introducción del sustrato con legía (hipoclorito de
sodio) al 5 %
# Verter el musgo molido poco a poco en la maquina mezcladora
# Luego el humus de lombriz
# En seguida la arena de rio lavada
# Poner en funcionamiento la maquina mezcladora por 20 minutos con el fin de homogenizar la mezcla del

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sustrato
# Al cabo de los 20 minutos de mezcla, abrir la compuerta inferior de la maquina mezcladora en forma
circular, recepcionar la mezcla en una carretilla para trasladar al coche de des infestación
# Verter el sustrato en el coche de des infestación y humedecer el sustrato con 5 litros de agua corriente
utilizando una regadera, cubrir y cerrar herméticamente con un toldo de lona plastificada, sujetarlo con
cordones de nylon de tal manera que no quede aberturas y evitar la fuga del vapor.
# Trasladar el coche hacia el área de des infestación
# Conectar el coche conteniendo el sustrato a través de una manguera impulsadora de alta presión de 4” a
la maquina impulsadora de vapor de agua.
# En este paso un personal de la unidad de apoyo a la investigación se encarga de poner funcionamiento la
máquina de des infestación.
# Tiempo des infestación 3 horas y a 75oC
# A cabo de este tiempo el coche con el sustrato dejar enfriar por 48 -72horas
# Después del enfriamiento y desinfestado el sustrato trasladar hacia la maquina mezcladora para
incorporar otros materiales como indica en el paso 14
# Poner en funcionamiento nuevamente la maquina mezcladora por 10 minutos y durante este tiempo
incorporar lo siguiente material: Sogemix SM-2+fertilizante compuesto (20-20-20) +Fungicidas: Farmathe y
PCNB, según indica en la tabla 4.
# Después de la mezcla total del sustrato se abre la compuerta inferior de la maquina mezcladora y se
procede a recibir el sustrato en tacho de plástico de 100 litros previamente desinfectado con legía al 2 %
# Almacenar el sustrato en los tacho de plástico, en un ambiente del invernadero 9, previamente
desinfectado con fungicida (Farmathe 2.0 gr/lt), Insecticida: Vertimec 1.5 m/lt, Confidor 1.5 ml/lt y Movento
1.0 gr/lt) y herméticamente cerrados los tachos, con una etiqueta de identificación y fecha de preparación.
# Cerrar la compuerta y apagar la maquina mezcladora
# Unas vez culminado la esterilizacion se procede a la desinfección de la maquina mezcladora y los
materiales usados en este proceso

Tabla 4. Preparación de suelo (para 1250 kg)

Componentes Cantidad

Musgo molido 16 kg/saco 20 sacos (320 kg)

Arena de río lavada 200 kg

Humus de lombriz 16 sacos (40kg/saco kg (640 kg)

Turba (Sogemix SM-2) 3 fardos(30 kg/saco (90 kg)

Abono NPK (20:20:20) 2.5 kg

Funguicida: Farmathe Benomil (Benomil)** 20 g

Pentacloronittrobenceno (PCNB)** 20 g

**Dissolve 20g of fungicide in 15 liters of water (final concentration 1.33 g / l)

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Apendice 2. Preparación de sustrato para almacigo

1. Elegir un lugar apropiado para la preparación del sustrato de almacigo

2. Usar plástico estéril limpio para extender el sogemix SM-2 y moler más finamente

3. Usar 50 Kg de Sogemix

4. Esterilizar por 1 hora y a 75oc de temperatura

4. Aplicar los siguientes pesticidas en la siguiente dosis: Farmathe 10 gr/lt Y PCNB 10 gr/lt en 15 Litros de
agua

5. Usando una lampa mezclar la solución de pesticida y el Sogemix, 3 Veces

6. Almacenar el sustrato en un tacho de plástico de 100 litros y colocando una etiqueta con fecha de
preparación

7. Los tachos con el sustratos almacenar en una parte del invernadero 9 A

9. Esta cantidad de sustrato para 50 bandejas de plástico cuyas medidas son 24x31x 6 Cm

Apendice 3. Preparación de solución de ácido

gibérelico (1500 mg/L)
Pesar 375 mg de ácido giberélico.Agregar 5 ml de de etanol al 96% y disolver.Agregar lentamente 200 ml
de agua destilada y agitar continuamente.Enrazar a 250 ml con agua destilada. Almacenar en un frasco de
plástico a 4°C correctamente etiquetados, por un máximo de 1 mes.

Apendice 4. Preparación del buffer fosfato de

inoculación (0.01 M) pH.8
Preparar las siguientes soluciones con agua destilada:
Solución A: NaH2PO4.H20 - 27.6 g/l
Solución B: Na2HP04. - 28.42 g/l o Na2HP04-12H20 - 71.64 g/l.
Mezclar 2.65 cm3 de la solución A y 47.35 cm3 de la solución B y enrazar a to100 cm3 con agua destilada.

Almacenar en un frasco de plástico a 4°C correctamente etiquetados, por un máximo de 1 mes.

Control de calidad interno

1.- Lista de control de calidad ( HQU - Detection of potato virus by indicator plants - OP070 )

2.- Etiquetas con códigos de barra para la identificación de las macetas.

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3.- Etiquetas con códigos de barra para la identificación de las bolsas durante la toma de muestras para la
inoculación.
4.- Evaluación continua de los síntomas de plantas indicadoras y plantas de papa.
5.- Monitoreo de condiciones ambientales del invernadero utilizando el HOBO.
6.- Aplicaciones preventivas de pesticidas (Links: 9A , 9B, 9C y 2A)

Bibilografia

1. Abad, J.A 1979. Estudio comparativo de dos aislamientos del virus T de la papa. M.Sc. Thesis.
Universidad Nacional Agraria La Molina, Lima, Perú. 90p.
2. Hooker, W.J. (Ed). 1981 Compendium of potato diseases. The American Phytopathological Society,
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