Professional Documents
Culture Documents
Agata Płodzich
Pracownia Zapewnienia Jakości, Zakład Transfuzjologii Instytutu Hematologii i Transfuzjologii
Streszczenie
Proteomika jest definiowana jako nauka zajmująca się proteomem, czyli komponentem biał-
kowym, kodowanym przez genom. Termin „proteomika” został po raz pierwszy sformułowany
i zastosowany przez Marca Wilkinsa w 1994 r. Głównym celem badań proteomicznych jest wy-
odrębnienie białek wytwarzanych przez komórki i narządy, zarówno w stanach fizjologicznych,
jak i patologicznych, badanie ich wzajemnych zależności oraz poznanie ich struktur trójwymia-
rowych. Badanie proteomiczne można podzielić na trzy główne etapy: 1) pozyskanie materiału
i jego wstępna obróbka, 2) właściwa analiza profilu białek, 3) analiza otrzymanych danych.
Na każdym z tych etapów wykorzystywane są coraz nowsze i coraz doskonalsze technologie,
a zastosowanie metod proteomicznych w praktyce klinicznej daje realną szansę na identyfi-
kację nowych biomarkerów i nowych celów terapeutycznych, które będzie można wykorzystać
w diagnostyce i leczeniu chorób nowotworowych. Ponadto, możliwa stanie się wcześniejsza
diagnoza choroby, przewidywanie jej postępu i reakcji pacjenta na leczenie. Podczas wykony-
wania eksperymentów proteomicznych badacze napotykają na wiele trudności metodologicz-
nych, które niejednokrotnie uniemożliwiają interpretację wyników i wyciągnięcie wniosków.
Zatem niezbędne okazuje się przyjęcie ogólnych norm pozwalających na porównanie wyników
pochodzących z różnych laboratoriów, a także kryteriów jakościowych, które pozwoliłyby oce-
niać poszczególne etapy analizy. Badania nad biomarkerami różnych jednostek chorobowych
pokazują, że jeżeli te warunki zostaną spełnione, to wyniki otrzymywane w eksperymentach
proteomicznych mają dużą szansę na wykorzystanie w praktyce klinicznej. Celem niniejszej
pracy było przedstawienie dotychczasowych osiągnięć w zakresie badań proteomicznych na
przykładzie wybranych chorób nowotworowych i zespołu Downa.
Słowa kluczowe: proteomika, proteom, modyfikacje potranslacyjne, biomarkery,
techniki proteomiczne, bioinformatyka, proteomika kliniczna, choroby
nowotworowe, zespół Downa
J. Transf. Med. 2013; 6: 48–59
Summary
Proteomics is a branch of scientific research focused on the study of human proteome, i.e
a genome-encoded protein component. The term “proteome” was coined and first used by Marc R.
Wilkins in 1994. The principal aim of proteomic research is selection of cellular and organ-
-produced proteins, in both physiological and pathological conditions and study of their three-
dimension structures and complex interactions. There are three main phases to proteomic
studies : 1) collection and preliminary testing of biological material, 2) protein profile analysis
Adres do korespondencji: mgr Agata Płodzich, IHiT, ul. Gandhi 14, 02–776 Warszawa, tel.: 22 349 63 87, e-mail:
a.plodzich@ihit.waw.pl
48 www.fce.viamedica.pl
Agata Płodzich, Proteomika i jej zastosowanie w wybranych jednostkach chorobowych
3) final data analysis. Each phase relies on increasingly novel and advanced technologies
therefore application of proteomic techniques in clinical practice provides the opportunity of
identifying new biomarkers and novel therapeutic targets for use in diagnostics and treatment
of oncological diseases. Furthermore, proteomic technologies applied in clinical practice allow
for earlier diagnosis of disease, prognosis for treatment and patient’s response to treatment.
Proteomic experiments involve several methodological challenges which may impede data
interpretation and conclusions. A uniform set of standards seems therefore indispensible as
it would allow the comparison of results from different laboratories whereas a uniform set of
quality criteria would enable comparison of results obtained at each stage of analysis. Research
on various biomarkers demonstrates that results of proteomic studies could then be successfully
applied in clinical practice. The aim of this paper was to present the current achievements of
proteomics on the examples of selected malignant tumors and the Down syndrome.
Key words: proteomics, proteome, posttranslational modifications, biomarkers,
proteomic techniques, bioinformatics, clinical proteomics, oncological disorders,
Down syndrome
J. Transf. Med. 2013; 6: 48–59
www.jtm.viamedica.pl 49
Journal of Transfusion Medicine 2013, tom 6, nr 2
zarówno białka uszkodzone czy nieprawidłowo i Leków (FDA, Food and Drug Administration) za-
funkcjonujące, jak i białka obce dla danej komórki, rejestrowała i wprowadziła bortezomib do leczenia
na przykład wirusowe. Wyróżnia się dwa rodzaje klinicznego [8].
ubikwitynacji — monoubikwitynację, która polega Bortezomib to zmodyfikowany kwas dipep-
na przyłączaniu monomerów ubikwityny do danego tydyloborowy, który w sposób selektywny i od-
białka, co jest bardzo słabym sygnałem degradacji, wracalny wiąże się z proteasomem 26S i hamuje
oraz poliubikwitynację, polegającą na przyłączeniu jego działanie, co powoduje apoptozę komórek
polimerów (przynajmniej dimerów) ubikwityny. nowotworowych, a tym samym hamuje rozrost
Powstałe w ten sposób łańcuchy poliubikwitynowe nowotworu. Preparat ten stosowany jest szero-
pełnią funkcję znacznika białek, który kieruje biał- ko w leczeniu chorych na szpiczaka mnogiego,
ko do proteasomu, gdzie następuje jego degradacja ponadto trwają zaawansowane badania nad jego
[4]. Proteasom jest dużym, wielkocząsteczkowym zastosowaniem także w innych chorobach nowo-
kompleksem enzymatycznym, utworzonym z bia- tworowych [5–7].
łek, jego masa cząsteczkowa wynosi około 2 MDa. Ubikwitynacja oraz inne modyfikacje potrans-
Jest to struktura charakterystyczna dla komórek lacyjne są przyczyną tak ogromnej różnorodności,
eukariotycznych. W cytoplazmie oraz w jądrze złożoności i heterogenności białek, a badania nad
komórkowym znajduje się około 30 tys. proteaso- ich przebiegiem stanowią główne wyzwanie dla
mów, które odpowiadają za degradację ponad 80% proteomiki [3].
białek naznaczonych ubikwityną. Główna funkcja
proteasomu sprowadza się do rozpoznania i degra- Białka proteomu jako biomarkery
dacji białka naznaczonego przez układ ubikwityny
do zniszczenia. Proces właściwej degradacji białek Biomarkery to cechy biologiczne o charak-
wewnątrzkomórkowych ma ogromne znaczenie dla terze cząsteczkowym, które można wykorzystać
prawidłowego funkcjonowania organizmu żywego. jako wskaźniki procesów fizjologicznych lub cho-
Dowiedziono, że inhibicja szlaku proteasomów robowych zachodzących w organizmie albo jako
prowadzi do zatrzymania cyklu komórkowego wskaźniki do oceny stopnia odpowiedzi organizmu
i apoptozy. Nieprawidłowe funkcjonowanie protea- na zastosowane leczenie farmakologiczne. Wy-
somów może być przyczyną wielu chorób, w tym krycie biomarkerów zwiększa szansę wczesnego
niektórych nowotworów złośliwych, a także chorób rozpoznania choroby, umożliwia rozpoczęcie indy-
układu nerwowego, takich, jak choroba Alzheimera widualnej terapii dostosowanej do konkretnego pa-
czy Parkinsona. Poza tym, zaburzenia regulacji cjenta oraz dostarcza informacji na temat wyników
szlaku ubikwityna–proteasom może prowadzić zastosowanego leczenia [2, 9].
do powstania oporności na leki. Z tych powodów Biomarkery są przede wszystkim wykorzy-
inhibicja proteasomów stała się nowym celem stywane w prognozowaniu ryzyka wystąpienia
terapeutycznym [4–6]. choroby oraz w badaniach przesiewowych, diag-
Inhibicja proteasomu umożliwia hamowanie nostyce i monitorowaniu przebiegu choroby. Po-
wielu szlaków patogennych prowadzących do po- nadto można je wykorzystać do identyfikacji osób
wstania różnych nowotworów. Znanych jest wiele podatnych na poszczególne choroby. Opisanie
związków hamujących w sposób odwracalny lub biomarkerów charakterystycznych dla danej je-
nieodwracalny czynność proteasomu. Związki te dnostki chorobowej pozwala podzielić populację
można podzielić na naturalne, do których zalicza na podstawie konkretnych genotypów choroby,
się między innymi: eponemycynę, dihydroepone- a nie wyłącznie na wywiadzie rodzinnym. Możli-
mycynę, epoxomycynę czy laktacysteinę, oraz na wość określenia stopnia podatności na daną cho-
syntetyczne będące peptydami z aktywną grupą robę pozwala oszacować ryzyko jej wystąpienia
funkcyjną (aldehydową, winylosulfonową lub ben- w różnych populacjach [10].
zamidową) [6, 7]. Preparat o nazwie bortezomib Niezwykle cennym źródłem potencjalnych bio-
(Velcade®; dawniej określany jako PS-341) został markerów jest osocze, nie tylko jako podstawowy
zaakceptowany jako lek i dopuszczony do użytku materiał kliniczny, ale także jako największy zbiór
klinicznego [7]. ludzkich białek. Oprócz białek fizjologicznych obec-
W badaniach klinicznych II fazy, przeprowadzo- nych w osoczu, w stanach chorobowych znajdują
nych przez Jagannatha i wsp. stwierdzono istotną się w nim także białka patologiczne. Co więcej,
odpowiedź na leczenie u ponad 1/3 pacjentów pobieranie osocza, jest zabiegiem mało inwazyj-
z zaawansowanym szpiczakiem mnogim i na tej nym, niezbyt kosztownym, a pobrane próbki można
podstawie Amerykańska Agencji ds. Żywności łatwo przechowywać. Dzięki dotychczasowym
50 www.jtm.viamedica.pl
Agata Płodzich, Proteomika i jej zastosowanie w wybranych jednostkach chorobowych
badaniom proteomicznym, opublikowano listę 289 się od jednej do ponad 100 000 kopii cząsteczek
białek osocza, ale postęp w zakresie wykorzystania białka. Wreszcie, proteom jest dynamiczny, podlega
technik wielowymiarowych daje realną szansę na zmianom pod wpływem czasu i środowiska [12].
podwojenie tej ilości w najbliższej przyszłości. Licz-
ne dowody naukowe, pochodzące zarówno z badań Etapy badania proteomicznego
proteomicznych, jak i z innych dziedzin sugerują,
że wśród tych 289 białek, znajdują się takie, które Badanie proteomiczne można podzielić na
mogą być biomarkerem znacznej liczby, jeśli nie trzy główne etapy: 1) izolacja i rozdział białek, 2)
większości chorób występujących u ludzi. Jednak identyfikacja białek, 3) analiza sekwencji białka.
obecnie, w rutynowej diagnostyce klinicznej,
wykorzystuje się bardzo niewiele z tych białek, Izolacja i rozdział białek
a w ciągu ostatnich dziesięciu lat liczba nowych Pierwszym etapem badania proteomicznego jest
białek akceptowanych przez FDA jako biomarkery izolacja białek z komórek lub tkanek. Drugi etap obe-
zmniejszyła się do zaledwie jednego nowego białka jmuje rozdział białek za pomocą takich metod jak na
diagnostycznego rocznie. Można tylko spekulować przykład elektroforeza dwuwymiarowa (2-DE) [13].
na temat przyczyn tak znacznej rozbieżności mię-
dzy oczekiwaniami rozbudzonymi przez osiągnięcia Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym
w dziedzinie proteomiki, a realiami diagnostyki Technika, którą obecnie najczęściej stosuje
klinicznej i sugerować rozwiązania, które w przy- się do separacji białek nosi nazwę elektrofore-
szłości umożliwią opracowanie skuteczniejszych zy dwuwymiarowej w żelu poliakrylamidowym
narzędzi diagnostycznych [11]. (2D-PAGE) [14]. Metoda jest dwustopniowa.
W pierwszym etapie białka są rozdzielane według
Główne techniki wykorzystywane ich punktu izoelektrycznego (pI). Punkt izoelek-
w proteomice tryczny dla większości białek mieści się w zakresie
pH od 4 do 8. Przy wartości pH równej pI białko
Szybki postęp w obrębie spektrometrii maso- ulega wytrąceniu i jest widoczne w żelu po jego
wej, zainicjowany przez rozwój łagodnych metod wybarwieniu [14, 15].
jonizacji, czyli desorpcji laserowej z udziałem Drugi etap 2D-PAGE pozwala na rozdział
matrycy (MALDI, matrix-assisted laser desorption/ białek według masy cząsteczkowej [15]. Rozdział
/ionization) i elektrorozpylania (ESI, electrospray odbywa się w żelu zawierającym siarczan dodecylu
ionization), przyczynił się do udoskonalenia metod sodu (SDS, sodium dodecyl sulfate) (ryc. 1).
identyfikacji białek — zasadniczego etapu badań Wyizolowane białka są następnie barwione
proteomicznych, a także do postępu w zakresie przy użyciu błękitu kumasyny (CBB, coomassie
technik separacji białka oraz analizy uzyskanych brillant blue) lub bardziej czułego azotanu srebra.
wyników. Klasyczne podejście, polegające na izo- Po barwieniu żele są skanowane i poddawane
lacji pojedynczego białka oraz jego dalszej analizie, analizie za pomocą specjalnego programu kompu-
rozbudowano opisem potranslacyjnych modyfikacji terowego, który ułatwia dopasowanie ich wzorca
białka i poszerzono o narzędzia umożliwiające iloś- i określenie liczby białek. Interesujące badane
ciowe porównanie dwóch próbek lub większej ich miejsca są następnie wycinane z żelu i poddawa-
ilości (proteomika ilościowa). ne trawieniu enzymatycznemu, zazwyczaj przy
Bezpośrednie badanie proteomu pozwala na użyciu trypsyny. W konsekwencji otrzymuje się
pełniejsze przedstawienie zmian zachodzących pojedyncze peptydy, które są następnie analizo-
w organizmie. Jest jednak wiele przeszkód, które wane za pomocą spektrometrii mas (MS, mass
uniemożliwiają pełną analizę proteomiczną, a prze- spektrometry) [13].
de wszystkim złożoność i ogromna różnorodność Typowa elektroforeza 2D-PAGE umożliwia
proteomu. W organizmie ludzkim występuje co jednoczesne rozdzielenie kilku tysięcy białek.
najmniej 250 różnych rodzajów komórek, a każda Otrzymane wzory rozdziału i intensywności „pla-
z nich zawiera od 2000 do 6000 głównych białek, przy mek” (spots) obrazują unikalny profil ekspresji
czym modyfikacje potranslacyjne dodatkowo zwięk- białek wyizolowanych z danych tkanek [14].
szają tę liczbę. Szacuje się, że poszczególne rodzaje Zaletą tej metody jest możliwość różnicowania
komórek człowieka mogą różnić się w zakresie licznych form tego samego białka powstałych wsku-
około 400 specyficznych białek. Innym ważnym tek modyfikacji potranslacyjnych. Przy użyciu elek-
czynnikiem różnicującym jest dynamiczny zakres troforezy nie można natomiast rozdzielić dużych
stężeń białka. W jednej komórce może znajdować białek (powyżej 150 kDa) i białek transbłonowych,
www.jtm.viamedica.pl 51
Journal of Transfusion Medicine 2013, tom 6, nr 2
52 www.jtm.viamedica.pl
Agata Płodzich, Proteomika i jej zastosowanie w wybranych jednostkach chorobowych
www.jtm.viamedica.pl 53
Journal of Transfusion Medicine 2013, tom 6, nr 2
baz danych. W skład NCBI wchodzi na przykład cyjnych organizmu. Nowotwory stanowią grupę
GenBank, czyli baza zawierająca zbiór genowych niezwykle różnorodnych chorób, które, pomimo
sekwencji nukleotydowych oraz SwissProt, na postępów w zakresie diagnozowania i leczenia,
którą składa się znaczna liczba informacji doty- nadal stanowią jedną z głównych przyczyn zgonów
czących funkcji białek, ich struktury, modyfikacji w krajach rozwiniętych, w tym w Polsce [21]. Każ-
potranslacyjnych, jak również wielu innych danych. dego rok na całym świecie choroby nowotworowe
W NCBI przechowywane są także informacje na są rozpoznawane u ponad 11 mln osób. Szacuje się,
temat artykułów biologicznych i medycznych (bazy że do 2020 roku będzie przybywać 16 milionów
PubMed i PubMed Central). nowych przypadków rocznie. Liczba zgonów na
świecie z powodu chorób nowotworowych stale
Zastosowanie proteomiki w wybranych rośnie. Prognozy mówią, że w 2015 roku na raka
jednostkach chorobowych umrze 9 milionów ludzi, a liczba ta w roku 2030
— proteomika kliniczna wzrośnie do 11,4 milionów [22].
Badania proteomiczne znajdują coraz szersze
W wyniku postępu, jaki dokonał się w ostatnich zastosowanie w diagnozowaniu chorób nowotwo-
latach w dziedzinie technik proteomicznych, można rowych oraz w monitorowaniu postępu i przebiegu
bardzo szybko uzyskać ogromną liczbę danych o istot- choroby. Onkoproteomika, jako gałąź proteomiki,
nym znaczeniu klinicznym. Do poznania złożonej roli zajmuje się badaniem białek oraz ich wzajemnych
białka w regulacji mechanizmów zdrowia i choroby oddziaływań w komórkach nowotworowych i od-
niezbędne jest użycie wielu technik, w tym metody grywa coraz większą rolę w diagnostyce i leczeniu
wysokoprzepustowej opartej na MS, które utorowały nowotworów, jak również w rozwoju terapii indy-
drogę do badań klinicznych również na poziomie sy- widualnych [22].
stemowym. Dodatkowo, konieczna jest analiza inter- Wczesne rozpoznanie nowotworu jest trudne
akcji pomiędzy białkami, oznaczanie ilościowe białek ze względu na często bezobjawowy lub skąpo-
czy globalna analiza modyfikacji potranslacyjnych. objawowy początek choroby. Wpływ na to może
Zastosowanie technik proteomicznych w prak- mieć również ograniczona wiedza w zakresie
tyce klinicznej może przynieść wymierne korzy- etiologii i onkogenezy. Jako istotny wskaźnik stanu
ści w postaci wczesnego rozpoznania choroby, biologicznego organizmu i progresji choroby nowo-
przewidywania jej postępu i odpowiedzi pacjenta tworowej biomarkery stanowią potężne narzędzie
na leczenie czy wyznaczanie nowych celów inter- monitorowania przebiegu choroby oraz oceny za-
wencji terapeutycznej. Obecnie prowadzone są równo skuteczności, jak i bezpieczeństwa nowych
proteomiczne badania kliniczne, które skupiają się środków terapeutycznych [22].
bardziej na analizie tkanek i płynów ustrojowych
i, co za tym idzie, na analizie różnorodności i obfitości Rak gruczołu krokowego
typów komórek, oznaczaniu ilościowym białek, Swoisty antygen sterczowy (PSA, prostate spe-
dostępności próbek z możliwością ich długotrwa- cific antigen) jest jednym z najczęściej wykorzysty-
łej obserwacji klinicznej, jak również na doborze wanych markerów nowotworowych stosowanym
optymalnej metody badań. w diagnozowaniu raka gruczołu krokowego. Należy
Te oraz inne problemy nieodłącznie związane on do markerów nowotworowych dobrze pozna-
z wykorzystywaniem próbek klinicznych powodu- nych, wykorzystywanych zarówno w diagnostyce,
ją, że prowadząc kliniczne badania proteomiczne, jak i w monitorowaniu leczenia [21, 23].
trzeba opierać się na współpracy z przedstawicie- Swoisty antygen sterczowy występuje
lami różnych dziedzin. Co więcej, przeniesienie u wszystkich dorosłych mężczyzn, a jego stężenie
podstawowych odkryć proteomicznych do praktyki może być podwyższone zarówno przy łagodnym
klinicznej jest procesem długotrwałym i kosztow- przeroście gruczołu krokowego, jak i złośliwym
nym, wymagającym szeroko zakrojonej współpracy raku prostaty. Podwyższone stężenie PSA wska-
między badaczami i przedstawicielami różnych zuje zatem tylko na konieczność przeprowadzenia
dziedzin medycyny, w tym wsparcia aparaturowego dalszych badań, a nie odpowiada na pytanie o rodzaj
i udziału przedstawicieli przemysłu [20]. i stan zaawansowania choroby prostaty.
Dowiedziono, że stany patologiczne w obrębie
Choroby nowotworowe — onkoproteomika gruczołu krokowego mają swoje odzwierciedlenie
Terminem „nowotwór” określa się nieprawid- w proteomicznym wzorze białek surowicy. Chcąc
łowy i niekontrolowany rozrost komórek w wyniku potwierdzić tę tezę, przeanalizowano za pomocą
zakłócenia naturalnych mechanizmów regula- technik proteomicznych i porównano próbki su-
54 www.jtm.viamedica.pl
Agata Płodzich, Proteomika i jej zastosowanie w wybranych jednostkach chorobowych
rowicy pacjentów z rozpoznanym rakiem prostaty, lub HCV poddaje się diagnostyce przesiewowej,
u których stężenie PSA wynosiło ≥ 4 ng/ml, w której ustalonym standardem jest oznaczanie bio-
z próbkami surowicy pacjentów, u których nie roz- markera alfa-fetoproteiny (AFP, alpha-fetoprotein)
poznano raka prostaty (stężenie PSA w surowicy oraz wykonywanie badania USG co 6–12 miesięcy.
< 1 ng/ml). Wykorzystując techniki proteomicz- Jest to jednak standard postępowania daleki od
ne, poprawnie wskazano 95% pacjentów spośród doskonałości. Alfa-fetoproteina to glikoproteina
38 chorych ze stwierdzonym rakiem prostaty. Z kolei wytwarzana w wątrobie, przewodzie pokarmo-
177 (78%) z 228 badanych pacjentów prawidłowo wym i pęcherzyku żółciowym płodu, która jest
zakwalifikowano jako chorych z łagodnym przero- wykorzystywana jako biomarker HCC, chociaż jej
stem stercza, a w grupie 137 mężczyzn ze zwięk- zwiększone stężenie obserwowane jest jedynie
szonym stężeniem PSA (4 – 10 ng/ml) wykazano u 50–70% chorych. Należy podkreślić, że zwiększone
swoistość tego testu na poziomie 71%. Jeżeli stężenie AFP występuje także we wstępnej fazie
przedstawione wyniki uzyskają potwierdzenie zakażenia HBV, po czym obniża się lub nawet po-
w dalszych badaniach, diagnostyka wzoru białek su- wraca do normy, zanim znowu wzrośnie w kolejnej
rowicy metodami proteomiki może zyskać istotne fazie zaawansowania choroby [28, 29].
znaczenie przy podejmowaniu decyzji dotyczących Za diagnostycznie istotne uznawane jest stęże-
diagnozowania choroby i wyboru metod leczenia nie AFP ponad 400 ng/ml, ale tak wysokie wartości
pacjentów z podwyższonym poziomem PSA [24]. obserwuje się zaledwie u niewielkiego odsetka
Poznanie dynamiki zmian i ekspresji wielu pacjentów chorych na HCC. Przy niższym stężeniu
różnych białek w procesie rozwoju raka prosta- AFP wykonywanie badań monitorujących, w tym
ty oraz procesu angiogenezy stanowi pierwszy badania USG nawet co trzy miesiące, nie przy-
krok w opracowaniu nowych, unikalnych technik czynia się do poprawy wykrywalności HCC [28].
leczenia. Stąd tak ogromne zainteresowanie oraz pośpiech
w zakresie identyfikacji nowych biomarkerów
Rak wątroby HCC, które można byłoby zastosować do wczes-
Rak wątrobowokomórkowy (HCC, hepato- nego wykrywania choroby i monitorowania sku-
cellular carcinoma) jest piątym co do częstości teczności jej leczenia [29]. Z najnowszych badań
występowania nowotworem złośliwym na świecie. wynika, że diagnozowanie nowotworu i wykrywa-
Jako czynniki ryzyka wystąpienia choroby ziden- nie niewielkich zmian świadczących o obecności
tyfikowano zakażenie wirusem zapalenia wątroby HCC, można usprawnić, wykorzystując obok AFP
typu B lub C, oraz marskość wątroby [25, 26]. również jej podfrakcje, czyli AFP-L3 oraz DCP [28]
W skali światowej ponad 52% przypadków (des-gamma-karboksy-protrombina), które są
zachorowania na HCC wiąże się z zakażeniem nieprawidłową protrombiną, niezdolną do wiązania
wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV, hepatitis wapnia [29].
B virus) i 25% z zakażeniem wirusem zapalenia Pomiar DCP charakteryzuje się czułością
wątroby typu C (HCV, hepatitis C virus). Rak porównywalną do oznaczania AFP lub niższą
wątrobowokomórkowy pozostaje nadal jednym (50–70%), jest jednak bardziej swoisty (do 90%),
z nowotworów o największej śmiertelności na dlatego w diagnostyce różnicowej HCC i zmian
świecie, mimo że czynniki ryzyka są dobrze znane. o charakterze nienowotworowym DCP okazał się
Dzieje się tak dlatego, że rozpoznanie choroby we bardziej przydatnym markerem niż AFP. Ponadto,
wczesnym okresie jest trudne [27]. stosując DCP, można skuteczniej wykrywać nie-
Rak wątrobowokomórkowy, piąty co do czę- wielkie zmiany chorobowe HCC: przy niewielkich
stości występowania nowotwór na świecie, plasuje ogniskach (o średnicy ok. 2 cm) wynik dodatni
się na miejscu trzecim jako przyczyna zgonów uzyskiwano u około 33% pacjentów [30, 31].
na choroby nowotworowe. W skali światowej Identyfikacja nowej grupy cząsteczek zwanych
corocznie diagnozuje się około 626 tys. nowych mikro RNA (miRNA) jest bardzo obiecującym ob-
przypadków HCC i odnotowuje 600 tys. zgonów szarem badań w zakresie diagnostyki HCC, mimo
z powodu tej choroby. Chociaż nadal nie udało się że badanie to wykracza poza obszar proteomiki.
poznać wszystkich mechanizmów rozwoju HCC, MikroRNA stanowią klasę krótkich, około 21–23-
zidentyfikowano jednak wiele czynników patolo- -nukleotydowych, niekodujących cząsteczek RNA,
gicznych, genetycznych i molekularnych leżących które zidentyfikowano u organizmów jądrowych.
u podłoża tej choroby [28]. Liczbę cząsteczek miRNA w genomie człowieka
Osoby znajdujące się w grupie ryzyka, a więc szacuje się na około 1000, z czego dotychczas zi-
cierpiące na marskość wątroby lub/i zakażone HBV dentyfikowano około 500. Rola miRNA sprowadza
www.jtm.viamedica.pl 55
Journal of Transfusion Medicine 2013, tom 6, nr 2
się do obniżania ekspresji genów poprzez hamo- występujący rzadziej niż inne złośliwe schorzenia
wanie ich translacji. Cząsteczki miRNA uczest- kobiecych narządów rodnych [32].
niczą w wielu ważnych procesach biologicznych, Wczesne wykrycie choroby może przedłużyć
a wyniki prowadzonych ostatnio badań wykazały lub uratować życie, obecnie jednak nie ma metod
wiele przykładów zaburzeń regulacji mikroRNA przesiewowych na tyle czułych, aby umożliwiały
w chorobach nowotworowych. Dowiedziono, że wykrycie raka jajnika w bardzo wczesnym okresie
mikroRNA nie tylko regulują ekspresję licznych choroby, kiedy objawy nie są jeszcze wyraźnie wi-
onkogenów i genów supresorowych, ale same doczne. Dlatego konieczne staje się opracowanie
również mogą występować w roli onkogenów skutecznych metod wczesnej diagnostyki tego
i supresorów [28]. schorzenia. Obecnie, najczęściej wykorzystywa-
MikroRNA regulują ekspresję genów po- nym i najdokładniej przebadanym markerem jest
przez wiązanie do specyficznych matrycowych CA-125 — glikoproteina błonowa występująca na
RNA (mRNA), co w konsekwencji zapobiega ich powierzchni wielu rodzajów komórek nabłonko-
translacji. Ponieważ każdy rodzaj miRNA może wych. Badanie krwi oceniające stężenie Ca-125
jednocześnie regulować ekspresję setek genów, i techniki obrazowania, takie jak tomografia kompu-
cząsteczki te kontrolują całe podstawowe programy terowa, przezpochwowe badanie ultrasonograficz-
transkrypcyjne definiujące zasadnicze cechy komó- ne lub połączenie testu immunologicznego CA-125
rek. W związku z powyższym, profilowanie miRNA z jedną z metod obrazowania pozwalają na monito-
stało się niezwykle cenną metodą fenotypowania rowanie pacjentów już zdiagnozowanych. Nie jest
i klasyfikowania nowotworów [28]. to jednak wystarczająco swoiste badanie diagno-
Dużo niezależnych grup badaczy przeprowa- styczne [33], gdyż podwyższone stężenie CA-125
dziło kompleksowe analizy miRNA związanych obserwuje się również w wielu innych chorobach.
z HCC, co dostarczyło wielu cennych informacji Ponadto w badaniach immunohistochemicznych
na temat markerów miRNA. Ilość miRNA koreluje materiału pooperacyjnego wykazano, że tylko 20%
z najważniejszymi parametrami choroby, takimi jak: raków jajnika produkuje CA-125. Co więcej, marker
przerzuty, różnicowanie, zakażenie HBV lub HCV, ten nie zawsze jest uwalniany do krwiobiegu we
wznowy nowotworu i czas przeżycia pacjenta. Nie- wczesnej fazie wzrostu nowotworu; podwyższone
które miRNA zaangażowane są w kancerogenezę stężenie CA-125 obserwuje się u zaledwie 50–60%
HCC poprzez promowanie komórek macierzystych chorych w stopniu I zaawansowania choroby [34].
raka i kontrolę proliferacji i apoptozy. Inne kon- Chociaż oznaczanie stężenia CA-125 nie spełniło
trolują migrację komórek i ich inwazję, przez co wszystkich oczekiwań ginekologów i onkologów,
są związane z progresją HCC. MiRNA związane jest to nadal najbardziej powszechnie stosowana
z HCC nie tylko dostarczają nowych informacji na te- metoda w diagnostyce raka jajnika.
mat molekularnych podstaw HCC ale również służą Innym, niezwykle obiecującym markerem
jako nowe narzędzia diagnostyczne i prognostyczne diagnostycznym raka jajnika jest HE4 (human
tej choroby. Obecnie jednak tylko kilka miRNA epididymis protein 4) — podfrakcja 4 ludzkiego biał-
można wykorzystać w tym obiecującym obszarze, ka z komórek nabłonkowych najądrza [35], które
co jednak wymaga dalszego potwierdzenia w bada- jest białkiem o masie cząsteczkowej 11 kDa. Jego
niach prospektywnych [28]. zwiększone stężenie obserwuje się w przypadku
raka jajnika. W prawidłowej tkance jajnika ekspre-
Rak jajnika sja genu WFDC2 kodującego HE4 i wytwarzanie
Rak jajnika stanowi przyczynę zgonu ponad tego białka obserwowane jest na minimalnym po-
125 000 kobiet rocznie na całym świecie, czyli ziomie [36]. Oznaczanie białka HE4 może zoptyma-
więcej niż wszystkie inne nowotwory ginekologicz- lizować wykrywanie raka jajnika w jego wczesnym
ne. Wczesne wykrycie nowotworu (I lub II okres okresie. Z badań wynika, że HE4 charakteryzuje się
zaawansowania) daje ponad 90% szans na przeży- większą czułością i większą swoistością niż CA-125
cie, ale tylko około 20% wszystkich przypadków (odpowiednio 96,9% v. 85,7% oraz 96,3% v. 79%)
zostaje wykryte we wczesnym okresie choroby. i wydaje się, że zastosowanie tego biomarkera w
Większość przypadków raka jajnika ujawnia się diagnozowaniu łagodnych nowotworów jajnika daje
w III i IV stopniu zaawansowania klinicznego, co daje lepsze rezultaty niż zastosowanie CA-125 [35].
tylko 11% szans na przeżycie 5 lat. Objawy raka Analiza surowicy pacjentek z uwidocznioną
jajnika są zróżnicowane i często błędnie przypi- w badaniu ultrasonograficznym patologiczną masą
sywane innym chorobom. Dlatego z jego powodu w obrębie przydatków wykazała, że HE4, jako test
umiera najwięcej kobiet, mimo że jest to nowotwór wykrywania raka jajnika, charakteryzuje się czułoś-
56 www.jtm.viamedica.pl
Agata Płodzich, Proteomika i jej zastosowanie w wybranych jednostkach chorobowych
cią na poziomie 67% i swoistością 96%. Wykazano liczbę badań inwazyjnych, nie są jednak wolne od
również, że połączenie dwóch markerów — CA125 wad. Wymienione markery nie są swoiste dla DS;
i HE4 powoduje znaczny wzrost czułości i swoisto- wykorzystuje się je również w diagnostyce zespołu
ści w porównaniu z zastosowaniem każdego z tych Edwardsa (trisomia chromosomu 18) czy zespołu
markerów pojedynczo [36]. Pataua (trisomia chromosomu 13) [37].
Obecnie żaden ze znanych markerów nie jest Postęp, jaki ostatnio dokonał się w zakresie
na tyle czuły, aby po jego zastosowaniu można było metod proteomiki ilościowej, stwarza możliwość
ustalić precyzyjne i niebudzące wątpliwości rozpo- wykrywania nowych biomarkerów, które można
znanie. Wysokie stężenie biomarkera wskazuje na będzie wykorzystać do monitorowania postępu cho-
znaczne zaawansowanie procesu nowotworowego, roby i do poznania mechanizmów cząsteczkowych
ale może też, pomimo obecności guza, utrzymywać leżących u podłoża DS [40].
się w granicach prawidłowych. Prowadzone przez Tsangarisa i wsp. [41]
Priorytetem w badaniach nad markerami badania proteomiczne płynu owodniowego pocho-
nowotworowymi powinno być zatem wykry- dzącego od kobiet spodziewających się dziecka
wanie swoistych antygenów przypisanych do z DS oraz od kobiet z prawidłowo przebiegającą
konkretnych nowotworów, jak również opraco- ciążą wykazały, że w przypadku zespołu Downa
wanie testów diagnostycznych umożliwiających z trisomią 21 chromosomu występuje prawie
wykrywanie choroby w jej najwcześniejszym, czterokrotny wzrost stężenia PGBM — proteogli-
bezobjawowym okresie. kanu zawierającego siarczan heparanu (basement
membrane — specific heparin sulfate proteoglycan
Choroby nienowotworowe — zespół Downa core protein). Ponadto u kobiet spodziewających
w rozpoznawaniu prenatalnym się dziecka z DS stwierdzono dwukrotny wzrost
Zespół Downa (DS, Down syndrome) jest stężenia alfa-1 mikroglobuliny (AMBP, alfa micro-
najbardziej rozpowszechnionym zaburzeniem globulin) i zmniejszenie o 40% stężenia prekursora
genotypu ludzkiego, spowodowanym trisomią insulinopodobnego czynnika wzrostu wiążącego
21 chromosomu [37]. białko 1 (IBP-1, insuline- like growth factor binding
Początkowo, ryzyko wystąpienia DS było naj- protein 1 precursor). Wyniki przedstawionych badań
częściej szacowane na podstawie wyniku potrójne- wskazują jednoznacznie na konieczność prowadze-
go testu przeprowadzanego w drugim trymestrze nia dalszych analiz proteomicznych, które zapewne
ciąży oraz na podstawie wieku matki. Test opierał zrewolucjonizują diagnostykę jednostek chorobo-
się na pomiarze stężeń matczynych markerów wych w bardzo wczesnym okresie ich rozwoju [41].
surowiczych takich jak: AFP, podjednostka b ludz-
kiej gonadotropiny kosmówkowej (fbhCG, human Wady i ograniczenia
chorionic gonadotropin), niezwiązany estriol (uE3, badań proteomicznych
unconjugated estriol) i inhibina A [38].
Obecnie, badania przesiewowe w kierunku Podczas wykonywania eksperymentów prote-
zespołu Downa polegają na obliczeniu ryzyka na omicznych w warunkach laboratoryjnych badacze
podstawie pomiaru markerów biochemicznych napotykają na wiele trudności metodologicznych.
w surowicy krwi matki, wykonywanych w pierwszym Jednen z pierwszych problemów stanowi sposób
lub drugim trymestrze ciąży. Badania te są często pobierania próbki [42]. Jest to niezwykle istotny
uzupełniane badaniem USG przezierności karkowej etap we wszystkich badaniach proteomicznych,
płodu, co umożliwia zwiększenie ogólnego poziomu ponieważ na stężenie białek wpływa bardzo wiele
wykrywalności do 90–95% [37]. czynników, w wyniku czego białka mogą ulegać
Pomimo intensywnych wysiłków zmierzają- agregacji, proteolizie lub utlenianiu. Jeżeli na
cych do poprawy jakości metod przesiewowych, sposób pobierania materiału nie zwraca się nale-
najwyższy osiągalny stopień wykrywalności wynosi żytej uwagi, to zmiany zachodzące pod wpływem
95%, ale około 2,5–5% wyników okazuje się fałszy- czynników zewnętrznych mogą zafałszować wyni-
wie dodatnich [37, 39]. Po przeprowadzeniu tych ki. Często analizie proteomicznej poddawane są
badań, kobiety z grupy wysokiego ryzyka mogą komórki hodowane in vitro, co wynika z faktu,
opowiedzieć się za badaniem inwazyjnym, takim że w wielu przypadkach zmiany patologiczne,
jak amniopunkcja lub pobranie próbek kosmków zachodzą tylko w niewielkim odsetku komórek
kosmówki [38]. danej tkanki. Jednak nie ma pewności, że zjawiska
Badania przesiewowe odgrywają istotną rolę zachodzące w komórkach hodowanych in vitro będą
w diagnostyce prenatalnej i pozwalają ograniczyć także zachodziły w warunkach in vivo.
www.jtm.viamedica.pl 57
Journal of Transfusion Medicine 2013, tom 6, nr 2
58 www.jtm.viamedica.pl
Agata Płodzich, Proteomika i jej zastosowanie w wybranych jednostkach chorobowych
23. Bindukumar B., Schwartz S., Aalinkeel R., Mahajan S. i wsp. 34. Bast R.C. Jr. Status of Tumor Markers in Ovarian Cancer Screen-
Proteomic profiling of the effect of prostate-specific antigen on ing. J Clin Oncol. 2003; 21: 200s–205s.
prostate cancer cells. Prostate 2008; 68: 1531–1545. 35. Chang X., Ye X., Dong L., Cheng H., i wsp. Human Epi-
24. Petricoin E.F. 3rd, Ornstein D.K., Paweletz C.P. i wsp. Serum pro- didymis Protein 4 (HE4) as a serum tumor biomarker in
teomic patterns for detection of prostate cancer. J. Natl. Cancer patients with ovarian carcinoma. Int. J. Gynecol. Cancer
Inst. 2002; 94: 1576–1578. 2011; 21: 852–858.
25. Yokoo H., Kondo T., Fujii K. i wsp. Proteomic signature cor- 36. Moore R.G., Brown A.K., Miller M.C. i wsp. The use of
responding to alpha fetoprotein expression in liver cancer cells. multiple novel tumor biomarkers for the detection of ovarian
Hepatology 2004; 40: 609–617. carcinoma in patients with a pelvic mass. Gynecol. Oncol.
26. Tangkijvanich P., Anukulkarnkusol N., Suwangool P. i wsp. Clini- 2008; 108: 402–408.
cal Characteristics and Prognosis of Hepatocellular Carcinoma: 37. Cho C.K., Diamandis E.P. Application of proteomics to prenatal
Analysis Based on Serum Alpha-fetoprotein Levels. J. Clin. Gas- screening and diagnosis for aneuploidies. Clin. Chem. Lab. Med.
troenterol. 2000; 31: 302–308. 2011; 49: 33–41.
27. Steel L.F., Shumpert D., Trotter M. i wsp. A strategy for the com- 38. Pennings J.L., Koster M.P., Rodenburg W., Schielen P.C., de Vries
parative analysis of serum proteomes for the discovery of biomark- A. Discovery of novel serum biomarkers for prenatal Down syn-
ers for hepatocellular carcinoma. Proteomics 2003; 3: 601–609. drome screening by integrative data mining PLoS. One 2009; 4:
28. Behne T., Sitki Copur M. Biomarkers for Hepatocellular Carci- e8010.
noma. International Journal of Hepatology 2012; 1–7. 39. Heywood W.E., Madgett T.E., Wang D. i wsp., 2D DIGE analysis
29. Feng J.T., Liu Y.K., Song H.Y., Dai Z. Heat-shock protein 27: of maternal plasma for potential biomarkers of Down Syndrome.
A potential biomarker for hepatocellular carcinoma identified by Proteome Sci. 2011; 9: 56.
serum proteome analysis. Proteomics 2005; 5: 4581–4588. 40. Chen C.P., Chen Y.H., Chern S.R., Chang S.J. i wsp. Placenta pro-
30. Wang C.S., Lin C.L., Lee H.C. i wsp. Usefulness of serum des- teome analysis from Down syndrome pregnancies for biomarker
gamma carboxy prothrombin in detection of hepatocellular carci- discovery. Mol Biosyst., 2012; 8: 2360–2372.
noma, Word J. Gastroenterol. 2005; 11: 6115−6119. 41. Tsangaris G.T., Karamessinis P., Kolialexi A. i wsp. Proteomic
31. Donati M., Brancato G., Donati A. Clinical biomarkers in hepatocel- analysis of amniotic fluid in pregnancies with Down syndrome.
lular carcinoma (HCC). Front Biosci (Schol Ed) 2010; 2: 571–577. Proteomics 2006; 6: 4410–4419.
32. Suh K.S., Park S.W., Castro A. i wsp. Ovarian cancer Biomarkery 42. Tarkowski B., Girstun A. Zastosowanie spektrometrii mas
for molecular biosensors and translational medicine. Expert Rev. w poszukiwaniach biomarkerów chorób nowotworowych. Kosmos
Mol. Diagn., 2010; 10: 1069–1083. 2005; 54 (4): 331–343.
33. Tchagang A.B., Tewfik A.H., DeRycke M.S., Skubitz K.M., Skub- 43. Silberring J., Problemy proteomiki klinicznej — trendy, niebez-
itz A.P. Early detection of ovarian cancer using group biomarkers. pieczeństwa i problemy. Postępy Biologii Komórki 2009; 36 (25):
Mol. Cancer Ther. 2008; 7: 27–37. 111–115.
www.jtm.viamedica.pl 59