T.C.

DEMİROĞLU BİLİM ÜNİVERSİTESİ

TIP FAKÜLTESİ

MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR
UYGULAMA KİTAPÇIĞI
Dönem I

Adı-Soyadı:…………………………………………

Numara: ………………………………………………….

Prof. Dr. Mustafa ÖZYURT

Prof. Dr. Nezahat GÜRLER
Dr.Öğr.Üyesi Mete TEZ

2022-2023

0
 ÖNSÖZ

Sevgili Öğrencilerimiz,

Prof. Dr. Filiz AYDIN

Dönem I Öğrencilerimiz,

Demiroğlu Bilim Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı’nın

Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulama kitapçığı, Dönem I boyunca yapacağınız uygulama
derslerinin öğrenim hedeflerini ve çalışmalarını içerir. Her konunun ana başlığı altında önce o
konuya ait genel bilgiler ve kullanılacak metoda ilişkin prensipler ayrıntılı olarak anlatılır.
Yapacağınız deneyler “UYGULAMALAR” başlığı altında (Uygulama 1.,Uygulama 2. v.b.
olarak) sıralanmıştır.
Başarılı bir laboratuvar sürecini tamamlayabilmek için her öğrencinin Mikrobiyoloji
Laboratuvar Uygulama kitapçığı’nı uygulama öncesi okuyarak gelmesi, yapılacak deneylerin
teorik ve pratik kısımlarına hazır olması beklenir. Laboratuvar çalışmaları sonunda
uygulama sonuçlarınızı boratuvardaki sorumlu hocalarınıza göstermeden laboratuvardan
ayrılmamanız gereklidir.
Ayrıca tüm dönem boyunca, ilk uygulama konusunda vurgulanan laboratuvar kuralları
ve laboratuvar güvenliği ile ilgili konulara titizlikle uyulması, uygulamalar boyunca hem siz
öğrencilerimizin güvenliği hem de uygulamanın güvenilirliği açısından son derece önemlidir.
Anabilim Dalımız olarak Tıp Fakültesi Dönem I aşamasını başarıyla geçirmenizi
dileriz.

Prof. Dr.Mustafa ÖZYURT

Mikrobiyoloji AB Dalı Başkanı

UYGULAMA DERSLERİ
1. Mikrobiyoloji laboratuvarında
çalışma kuralları, biyogüvenlik
ve Mikrobiyolojide kullanılan
araç ve gereçlerin tanıtılması
2. Boyasız preparat hazırlama ve
Basit boyama yöntemler
3. Gram boyama yöntemi
DÖNEM I UYGULAMA DERSLERİ VE ÖĞRENİM HEDEFLERİ
ÖĞRENİM
ALT ÖĞRENİM HEDEFLERİ/ALT KAZANIMLAR
HEDEFLERİ/KAZANIMLAR
o Mikrobiyoloji Laboratuvarının
Tanıtımını yapabilmeli
o Mikrobiyoloji laboratuvarında çalışma
kuralları ve Mikrobiyolojide kullanılan
araç ve gereçlerin tanıtımını
yapabilmeli
o Mikroskopik inceleme için boyasız
preparat hazırlama ve Basit Boyama
Yöntemlerini açıklayabilmeli
o Gram Boyama Yönteminin
özelliklerini tanımlayabilmeli ve
uygulayabilmeli
 Mikrobiyoloji laboratuvarında çalışma kurallarının amacını açıklayabilmeli
 Mikrobiyoloji laboratuvarında uyulması gereken kuralları sayabilmeli
 Mikrobiyoloji laboratuvarında kullanılan mikroskop çeşitlerini ve özelliklerini tanımlayabilmeli
 Işık mikroskobunun kullanma amacını tanımlayabilmeli
 Işık mikroskopunda boyasız ve boyalı preparat incelenmesinde görülen mikroorganizmaları
ve hücreleri sayabilmeli ve özelliklerini açıklayabilmeli
 Mikrobiyoloji Laboratuvarında kullanılan cihazların (santrifüj, etüv, otoklav, pastör fırını,
benmari, ultraviyole lambası, bek, petri kutusu,
öze, iğne öze, lam, lamel ve eküvyonun özelliklerini açıklayabilmeli
 Laboratuvara gönderilen örnekleri açıklayabilmeli
 İstek formlarında mutlaka olması gereken bilgileri açıklayabilmeli
 Klinik örneklerin laboratuvarda red kriterlerini açıklayabilmeli
 Mikroskopik inceleme için gönderilen hasta materyali veya kültürdeki kolonisinden alınan örneğin
lam üzerine yayılmasını açıklayabilmeli ve uygulayabilmeli
 Mikroskopik inceleme için hazırlanan preparatın kurutulması ve tesbit işlemini açıklayabilmeli ve
uygulayabilmeli
 Basit boyama yöntemlerini açıklayabilmeli
 Mikroskopik inceleme için hazırlanan preparatın metilen mavisi ile boyanma basamaklarını açıklayabilmeli
 Mikroskopta metilen mavisi ile boyalı preparatta hücreleri ve mikroorganizmaların morfolojilerini tanımlayabilmeli
 Mikroskopik inceleme için gönderilen hasta materyali veya kültür kolonisinden negatif preparat hazırlama
basamaklarını açıklayabilmeli
 Negatif preparatlarda mikroorganizmaları tanımlayabilmeli
 Bileşik boyama yöntemlerini sayabilmeli ve özelliklerini açıklayabilmeli
 İncelenecek örneğin lam üzerine yayılmasını uygulayabilmeli
 Gram boyama basamaklarını açıklayabilmeli ve uygulayabilmeli
 Gram boyama yönteminde görülen hücreleri tanımlayabilmeli
 Gram olumlu ve olumsuz mikroorganizmaları mikroskopta tanımlayabilmeli
  Bileşik boyama yöntemlerinden aside dirençli boyama yöntemlerini sayabilmeli
4. Aside dirençli bakteri boyama  EZN boyama yöntemi uygulanacak mikroorganizmaları sayabilmeli
yöntemi o Ehrlich-Ziehl-Neelsen (EZN) Boyama  EZN boyama yönteminin özelliklerini açıklayabilmeli
Yönteminin özelliklerini  EZN boyama için gönderilen örneklerin hazırlanmasını açıklayabilmeli
 Homogenizasyon- Dekontaminasyon- Konsantrasyon Yöntemini açıklayabilmeli
tanımlayabilmeli ve uygulayabilmeli
 EZN boyama basamaklarını tanımlayabilmeli ve uygulayabilmeli
 EZN ile boyalı preparatlarda hücreleri, normal flora mikroorganizmaları ve ARB morfolojilerini tanımlayabilmeli
ve gösterebilmeli
 UYGULAMA-1

MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARINDA ÇALIŞMA KURALLARI,

BİYOGÜVENLİK VE MİKROBİYOLOJİDE KULLANILAN ARAÇ VE
GEREÇLERİN TANITILMASI

Amaç: Mikrobiyoloji laboratuvarının tanıtımı, çalışma kuralları, gönderilen örnekler ile

Klinik Mikrobiyoloji laboratuvarında kullanılan araç ve gereçlerin tanıtılması amaçlanmıştır.
Öğrenme Hedefleri:
1. Mikrobiyoloji laboratuvarında çalışma kurallarının amacını açıklayabilmeli
2. Mikrobiyoloji laboratuvarında uyulması gereken kuralları sayabilmeli
3. Mikrobiyoloji laboratuvarında kullanılan mikroskop çeşitlerini ve özelliklerini
tanımlayabilmeli
4. Işık mikroskobunun kullanma amacını tanımlayabilmeli
5. Işık mikroskopunda boyasız ve boyalı preparat incelenmesinde görülen
mikroorganizmaları ve hücreleri sayabilmeli ve özelliklerini açıklayabilmeli
6. Mikrobiyoloji Laboratuvarında kullanılan cihazların (santrifüj, etüv, otoklav, pastör
fırını, benmari, ultraviyole lambası, bek, petri kutusu, öze, iğne öze, lam, lamel ve
eküvyonun özelliklerini açıklayabilmeli
7. Laboratuvara gönderilen örnekleri açıklayabilmeli
8. Klinik örneklerin laboratuvarda red kriterlerini açıklayabilmeli
9. İstek formlarında mutlaka olması gereken bilgileri açıklayabilmeli

MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARI TANITIMI VE

ÇALIŞMA KURALLARI

Klinik Mikrobiyoloji Laboratuvarı, mikroorganizmaların neden olduğu enfeksiyonlarda

hasta örneğindeki etkenin varlığını ortaya koymada ve mikroorganizma ile konak ilişkilerini
tanımlayabilmede kanıta dayalı hizmet verebilen ve bir çok alt bölümden oluşan laboratuvar
birimidir. Tanıya dayalı hedef organizmaların çeşitliliği esas alındığında Klinik Mikrobiyoloji
Laboratuvarları; Bakteriyoloji, Mikobakteriyoloji, Mikoloji, Viroloji, Parazitoloji ve
İmmünoloji bölümlerinden oluşur. Viroloji ve Mikobakteriyoloji laboratuvarları genellikle
Referans Tıp Merkezlerinde ve Üniversite hastanelerinde mevcuttur. Bünyelerinde bu
bölümlerin eksik olduğu hastaneler, virolojik ve/veya mikobakteriyolojik hasta örneklerini bu
merkezlere gönderirler. Konağın bağışık sistemine ait incelemelerin gerçekleştirildiği
İmmünoloji laboratuvarlarında tanı amaçlı çeşitli immuno serolojik tanı yöntemleri uygulanır.
Bazı sağlık merkezlerinde ve hastanelerde Immünoloji laboratuvarları, Klinik Mikrobiyoloji
laboratuvarından bağımsız işletilirler.
Klinik Mikrobiyoloji Laboratuvarının hedefi, hastalığa neden olan mikroorganizmalarının
tanımını yapmak, gerektiğinde antimikrobiyal ilaçlara duyarlılığını belirlemek ve klinisyene
tanı ve tedavide yardımcı olmaktır. Bu nedenle mikrobiyoloji laboratuvarına gönderilen
örneklerin yeterli miktarda olması, doğru yer ve zamanda alınması, uygun koşullarda
laboratuvara gönderilmesi gerekir. Sonuçların doğru yorumlanabilmesi için laboratuvarın
mutlaka klinisyenle iş birliği halinde olması gerekir.

Mikrobiyoloji Laboratuvarına gönderilen örnekler aşağıda belirtilen durumlarda çalışmaya

alınmaz:
1. Etiketsiz örnek gönderme
2. Örnek alımını takiben laboratuvara gönderme süresinin uzamış olması
3. İdrar örneğinin bir saatten fazla oda ısısında beklemesi
4. Dışkı (Gaita) örneklerinin bir saatten fazla beklemiş olması (trofozoidler -)
5. Klinik olarak “Gonore” şüpheli hastalara ait genital örneğin bir saatten fazla beklemiş
olması
6. Steril olmayan uygunsuz veya delik kapta örnek gönderme
7. Ağzı açık olarak veya dışı hasta örneği ile kirlenmiş kaplarda gönderilen örnekler
8. Uygun olmayan yerden ve uygun olmayan koşullarda alınmış ve/ veya saklanmış
örnekler
9. Aynı periyotta aynı hasta ve aynı bölgeden alınan tekrarlı örnekler
10. Özellik arz eden etkenler için (anaerob bakteriler) uygun sürede ve uygun taşıma
vasatında gönderilmeyen örnekler
11. Yetersiz örnek
Örneğin alınması: Tedaviden önce olmalı, uygun bölge, uygun zamanda, yeterli miktarda ve
uygun örnek toplama kabında (eküvyon, steril enjektör ve ponksiyon iğneleriyle, steril sızıntı
yapmayan, ağzı burgulu kaplar) olmalıdır. Örneklerle birlikte olması gereken bilgileri içeren
formların doldurulup gönderilmesi de gerekir.
 İstem Formlarında Olması Gereken Bilgiler

 Tarih ve saat
 Hasta adı ve soyadı
 Hasta yaşı ve cinsiyeti
 Dosya veya protokol numarası
 Servis veya poliklinik adı
 Örneğin cinsi ve alınma zamanı
 Kullanılan antibiyotik veya diğer ilaçlar
 Klinik bulgular ve öntanı
 Varsa altta yatan hastalık
 İzleyen doktorun adı ve tel numarası

Mikrobiyoloji Laboratuvarına Gönderilen Örnekler

1. Steril vücut sıvıları ( kan kültürü, BOS kültürü, Diğer vücut sıvıları kültürü)
2. Solunum sistemi örnekleri
- Üst solunum yolu (ÜSY) örnekleri ( burun sürüntüsü, nazofarinks sürüntüsü,
boğaz sürüntüsü, sinüs materyali)
-Alt solunum yolu (ASY) örnekleri ( balgam, bronkoskopi örneği, bronko
alveolar lavaj, transtrakeal aspirat, akciğer aspiratı, )
3. Üriner sistem örnekleri ( idrar)
4. Genital sistem örnekleri
- Kadın genital örnekler (vagen, serviks, endometrium, üretra)
- Erkek genital örnekler ( üretra, prostat, epididim)
5. Gastrointestinal sistem örnekleri ( dışkı, rektal sürüntü, diğer GIS örnekleri)
6. Yara örnekleri (yanık örnekleri, yüzeyel yara, derin yara örnekleri (apse ve deri
biyopsileri)
7. Kulak örnekleri (dış kulak yolu ve orta kulak örnekleri)
8. Göz örnekleri ( konjunktiva, kornea, göz kapağı, göz içi sıvısı )
 MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARI PRATİKLERİNDE UYULMASI
GEREKEN KURALLAR

Mikroorganizmaların birçoğu insanda hastalık oluşturabilir, hatta bazı enfeksiyöz ajanlar

öldürücü olabilmektedir. Bu nedenle mikrobiyoloji laboratuvarlarında çalışırken, laboratuvar
personelinin canlı mikroorganizmalar veya onların toksik ürünleriyle ilgili testleri yaparken,
kendilerini, diğer laboratuvar çalışanlarını, toplumu ve çevreyi koruması ve onların
güvenliğini sağlaması büyük önem taşımaktadır. Laboratuvarda doğrudan veya dolaylı olarak
hasta örnekleri ile temas eden tüm personel hem çevre güvenliği hem de kişisel güvenlikleri
açısından bilgili ve tedbirli olmak zorundadır. Dolayısı ile mikrobiyoloji laboratuvarında
güvenli çalışılabilmesi için aşağıda açıklanan ve uygulanması gerekli tüm kuralların bilinmesi
ve eksiksiz olarak yerine getirilmesi şarttır. Bunlar;
1. Mikrobiyoloji laboratuvarında kullanılacak çoğu materyal bulaşıcı olduğundan öğrenci
kendisini, yanındakileri ve çevresini kontamine etmemeğe dikkat etmelidir. Bunun
için laboratuvar sorumlusunun yapacağı açıklamalara uyum göstermelidir.
2. Pratiklere mutlaka beyaz önlük ile gelinmelidir. Önlüklerin önü sürekli kapalı
tutulmalı, uzun saçlı kız ve erkek öğrenciler saçlarını arkadan bağlayarak öne
gelmesini önlemelidir.
3. Laboratuvardan çıkarken önlük çıkarılarak laboratuvarda bırakılmalı ya da özel
poşetlere konulmalıdır.
4. Eğer tehlikeli bir etkenle çalışılıyorsa mutlaka eldiven, gözlük, maske, başlık gibi
koruyucular kullanılmalıdır
5. Laboratuvarda hiçbir şey yenilip içilmemelidir. Ayrıca elleri ve çeşitli malzemeleri
yüze, göze, ağza dokundurmaktan kaçınılmalıdır.
6. Deri yoluyla hastalıkların bulaşma riskinden dolayı laboratuvar ortamında çalışırken
açık yaralar mutlaka yara bandı ile kapatılmalıdır.
7. Laboratuvarda kullanılan mikroskop, araç ve gereçlerin daima temiz ve bakımlı
bulundurulmasına ve çevrenin kirletilmemesine dikkat edilmelidir.
8. Kullanılan pipet, tüp, lam, lamel gibi tüm malzemeler, içerisinde dezenfektan madde
bulunan kaplara ve sorumlu tarafında belirlenen yere konulmalıdır. Kesinlikle masa
üzerine bırakılmamalıdır.
9. Çalışma bittiği zaman masa üzeri düzenlenmeli ve dezenfekte edilmelidir.
10. Laboratuvardan çıkarken tüm araç, gereç ve ocakların açık olup olmadığı kontrol
edilmeli, laboratuvarın güvenliği kesin olarak sağlanmalıdır.
 11. Her pratik çalışmasından sonra, laboratuvar çıkışı eller mutlaka bol su ve sabun ile
yıkanmalı, bu husus asla ihmal edilmemelidir.

MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARINDA BULUNAN VE KULLANILAN

BAZI ARAÇ GEREÇLERİN TANIMI

Çeşitli laboratuvar malzemeleri içinde mikrobiyoloji laboratuvarı için gerekli olan araç
gereçlerden önemli olanlar
1. Santrifüj 19. Cam Balon, Erlen, Beher, Mezur
2. Etüv (İnkübatör) 20. Penset
3. Otoklav 21. Pipet , Otomatik pipet ve ucu
4. Pastör fırını 22. Buzdolabı ve derin dondurucular
5. Benmari 23. Lam, Lamel
6. Ultraviyole (UV) lambası 24. Steril bistüri ucu ve sapı
7. Bek (alev) 25. Anaerobik kabin veya jar
8. Öze 26. Kesici-Delici Tıbbi Atık kovası
9. Hassas Terazi 27. Tıbbi ve Evsel Atık kovaları
10. Mikroskop (Işık ve Floresan) 28. Eldiven (steril ve non steril)
11. Eküvyon çubuğu (Swab) 29. Maske (Cerrahi ve hepa filtreli)
12. Dispenser (antibiyotik disk dağıtıcısı) 30. Gözlük
13. Sterilizasyon filtreleri 31. Göz yıkama solusyonu
14. Değişik hacimli steril enjektörler 32. Muhtelif Besiyerleri
15. pH metre 33. Boya kapları (şale)
16. Havlu peçete, sıvı sabun, dezenfektan 34. Havan veya doku homojenizatörü
17. Petri kutusu 35. Distile su cihazı
18. Cam tüp
Şekil 1 : Mikrobiyoloji laboratuvarında kullanılan muhtelif araç gereçler

 Santrifüjler
Santrifüjler sıvı ortamlardaki parçacıkların çöktürülmesi amacı ile kullanılan gereçlerdir.
 Etüvler
Aerob, fakültatif, anaerob ve kapnofilik (karbondioksitli ortamda üreyebilen)
mikroorganizmaların üretilmesi için istenilen ısıya ayarlanabilen sıcak hava dolaplarıdır.
 Otoklav (Laboratuvar tipi)
Belirli ısı ve basınç derecelerine ayarlanabilen basınca dayanıklı kazanlardır. Laboratuvar tipi
Otoklav ile sterilizasyonda temel ilke, ön vakumsuz olarak 1 atmosfer basınç altında, 121
◦C‘de 15 dakika süreyle doymuş su buharına maruzyettir.
  Pastör fırını
170◦C‘de 1 saat, 160◦C‘de 2 saat veya 150◦C‘de 2.5 saat kuru sıcak hava ile sterilizasyon
yapmaya yarayan cihazdır. Elektrikle çalışan ısıtıcı sistemi ve malzemelerin konulduğu sıcak
hava dolabı şeklinde bölümü vardır.
 Benmari
İstenilen ayarlardaki ısı derecelerinde sıcak su elde etmeye ve suyu bu derecelerde sabit
tutmaya yarayan, kapağı bulunan küvet şeklinde cihazdır. Bazı ısıya dayanıksız solusyon veya
sıvıların sterilizasyonunda benmari (sıcak su banyosu) ile sterilizasyon (tindalizasyon) işlemi
uygulanır. Bu amaçla üç gün süreyle, her gün 56◦C‘de veya 60◦C‘de 1 saatlik uygulama
yapmak gerekir.
 Ultraviyole lambası
Oda havasının ve yüzeylerin ultraviyole ışını ile sterilizasyon veya dezenfeksiyonunda
kullanılan lambalardır.
 Bek
Doğal gaz veya sanayi tipi gaz ile çalışan, küçük ocaklardır. Özellikle hasta örnekleri ile
yapılacak işlemler öncesi özelerin yakma ve hazırlanan preparatların alevden geçirilmesi ve
çalışma sırasında kısmi olarak korumalı bir steril alan sağlamada kullanılır.
 Petri kutusu
Genel üretim ve antibiyogram amaçlı katı besiyerlerinin hazırlanmasında kullanılan geniş,
yuvarlak görünümde, yaklaşık 2 cm derinlikte, isteğe bağlı değişen çaplarda, birbirine geçen
kapak ve alt kısımdan oluşan cam veya plastik malzemedir.
 Öze
Çabuk ısınan ve çabuk soğuyan, 4-5 cm boyunda platin telden yapılmış, ucu halka biçiminde
yada iğne ucu tarzında düz olan ve incelenecek hasta materyalinden veya üremiş tek
koloniden alarak besiyeri yüzeyine ekim yapmaya yarayan çelikten veya piyasada hazır halde
satılan tek kullanımlık steril plastikten bir gereçtir.
 Lam
Direkt inceleme veya boyama için preparat hazırlanmasında kullanılan dikdörtgen şeklinde
camlardır.
 Lamel
Çeşitli amaçlarla kullanılan, ortalama 2x2 cm boyutlarında, kare şeklinde, çok ince camdan
yapılmış malzemedir.
 Eküvyon çubuk (swab)
Çeşitli vücut bölgelerinden inceleme örneklerinin alınması ve bazı ekimlerin yapılmasında
kullanılan pamuk uçlu, ahşap veya plastik saplı örnek alma çubuğudur.
 Cam Balon ve Erlenmayer
Besiyerleri ve solusyonların hazırlanmasında kullanılan yüksek ısıya dayanıklı, 50-3000 ml
hacimli cam malzemelerdir.
 Mezur
Silindir şeklinde üzerinde ölçüler bulunan cam kaptır. Hacmi 10-1000ml arasında olabilir.
Besiyerine eklenecek olan distile suyun miktarını ölçmek amacı için kullanılır.
 Pipet
Üzeri çizgilerle çeşitli ölçülere ayrılmış 1ml-25 ml arasında değişen hacimli cam
borucuklardır. Hazırlanacak malzemelere eklenecek herhangi bir sıvının ölçümünde kullanılır.
 Otomatik pipet ve ucu
5 µl- 5000 µl arasındaki ölçülerde otomatik pipetler olmakla birlikte daha çok 1ml den küçük
hacimlerde çalışılması gereken testlerde kullanılır. Otomatik pipetler için özel olarak
hazırlanan plastik pipet uçları bir kez kullanılır ve atılır. Özellikle serolojik testlerde ve
moleküler testlerde otomatik pipetlerin kullanılması gerekmektedir. Moleküler testlerde ve
bakteriyolojide kullanılan plastik pipet uçları otoklavda steril edildikten sonra kullanılmalıdır.
Serolojik tetkikler için steril olması gerekmez.
 Hassas terazi
Besiyeri veya doku örneğini tartmada kullanılan, 10 gramın altındaki ölçümlerde 0.01 gram
ağırlığa kadar tartım yapabilen terazilerdir.
 pH metre
Sıvı besi yerlerinin ve diğer sıvıların pH değerlerini doğrulamak için, en azından 0,1
hassasiyetinde elektrometrik pH metreler kullanılır. Elektrik veya pille çalışan aletlerdir.
 Distile su cihazı
Besi yerleri veya diğer solüsyonlar için çok lüzumlu olan saf suyu elde etmede kullanılan
aletlerdir.
 Havan veya Doku homojenizatörü
Havan porselen veya camdan yapılmış kalın ve ağzı geniş kaplardır. İçinde doku örneği veya
her hangi bir katı madde parçası ezilir. Doku homojenizatörleri havan ile aynı amaçla
kullanılmak üzere elektrikli doku ezicileridir.
  Mikroskop
Mikroskop, çıplak gözle görülemeyecek kadar küçük organizmaların ve cisimlerin birkaç
mercek yardımıyle büyütülerek görüntüsünün incelenmesini sağlayan bir alettir. Genel olarak
mikroskop mekanik ve optik kısım olmak üzere iki büyük kısma ayrılarak incelenir. Mekanik
kısmı ayak, gövde, tabla ve tüpten ibarettir. Optik kısmı ise okülerle objektifleri taşıyan ve
dairesel dönebilen rovelver denilen kısımdan ibarettir. Çok çeşitli mikroskop türleri olmasına
rağmen mikrobiyoloji alanında en sık kullanılanları; Işık mikroskobu (Şekil 2), Floresan
mikroskop, Elektron mikroskop, İnvert mikroskop, Faz kontrast ve karanlık alan
mikroskoplarıdır.

Şekil 1.1. Işık Mikroskobu

 UYGULAMA-2

MİKROSKOPİK İNCELEME, BOYASIZ PREPARAT HAZIRLAMA VE BASİT

BOYAMA YÖNTEMLERİ

Amaç: Materyalden mikroskopik incelemeler için öğrencilerin boyasız preparat hazırlamaları

ve “Basit Boyama Yöntemleri”ni uygulayabilmeleri amaçlanmıştır
Öğrenim Hedefleri:
1. Mikrobiyolojide kullanılan mikroskop türlerini ve ışık mikroskobunun kullanımına
yönelik basamakları bilmeli
2. Hasta örneğinden veya üremiş kültür kolonisinden lam lamel arası boyasız preparat
(ıslak preparasyon) hazırlayabilmeli ve saptanan hücre morfolojilerini
değerlendirebilmeli
3. Basit boyama yöntemleri sayabilmeli
4. Mikroskopik inceleme için ;
a. Hasta örneğinden veya kültür kolonisinden alınan örneğin lam üzerine
yayılmasını açıklayabilmeli ve uygulayabilmeli
b. Hazırlanan preparatın kurutulması ve tesbit işlemini açıklayabilmeli ve
uygulayabilmeli
c. Hazırlanan preparatı metilen mavisi ile boyama basamaklarını açıklayabilmeli
d. Mikroskopta metilen mavisi ile boyalı preparatta hücreleri ve
mikroorganizmaların morfolojilerini tanımlayabilmeli
5. Mikroskopik inceleme için gönderilen örnek veya kültür kolonisinden negatif preparat
hazırlama basamaklarını açıklayabilmeli
6. Negatif preparatlarda mikroorganizmaları tanımlayabilmeli

I. Mikroskoplar ve mikroskopik incelemelerde teknik yaklaşımlar;

Çok çeşitli mikroskop türleri olmasına rağmen mikrobiyoloji alanında en sık
kullanılanları; Işık mikroskobu, Floresan mikroskop, Elektron mikroskop,İnvert mikroskop,
Faz kontrast ve karanlık alan mikroskoplarıdır. Işık mikroskopları genellikle X10 oküler ve
X4, X10, X20, X40, X60 ve X100 olmak üzere ihtiyaca göre tercih edilebilir farklı objektifler
ile en az 40 , en fazla 1000 büyütmeye kadar kullanılabilir. Ortalama ayırt ettirici gücü 0.2
μm kadardır. Bu nedenle birçok bakteri ve mantarların incelenmesi için uygundur, ancak
virüsler ışık mikroskobu ile görülemezler.
 Mikroskopik incelemelerde teknik yaklaşımlar;
Mikrobiyoloji laboratuvarlarında (bakteriyolojide) mikroorganizmaları tanımlamak
amacıyla hem direkt boyasız olarak hem de boyanarak inceleme yapmak gerekir.
Mikroskopik incelemelerde hazırlanan preparatlar tablaya yerleştirildikten sonra ilk önce en
küçük büyütmeli objektif ( x4 veya x10) ve mikro-makro vidalar yardımı ile alan bulunur.
Ardından boyasız preparatlar için; x40 veya x60 büyütmeli objektif ve mikro vidalar
yardımıyla alan netleştirildikten sonra, boyalı preparatlar için; alana önce immersiyon yağı
damlatılır, takiben x100’lük objektif yavaşça ve el yardımıyla yandan kıvrılarak immersiyon
yağ içine daldırılır, alan mikro vidalar yardımıyla netleştirilir ve preparat incelenir.

II. Boyasız preparat hazırlama ve inceleme

Boyasız preparat incelemesi daha çok; hasta dışkı örneklerinde protozoonların (kist, trofozoit
ve parazit yumurtasının) araştırılması ve kültürde bakteri hareketlerinin görülmesi amacıyla
yapılır.
Direkt hasta örneğinden preparat hazırlanamada dikkat edilmesi gereken hususlar:
1. Temiz lam üzerine bir damla distile su (gaita için lugol) damlatılır.
2. Damlanın üzerine yeteri kadar (mercimek tanesi kadar gaita) örnek konur ve homojen bir
şekilde ezilir.
3. Lam üzerine lamelin kenarı yerleştirilir böylece sıvının teması sağlanır
4. Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için lamel yavaşça bırakılır (gaita parazit yumurtası,
kist vb. yönünden) incelenir
5. Bazı sıvı örneklerden bir damla konur, lamel kapatılır ve incelenir.

1 2 3 4 5

Şekil 2.1 : Direkt mikroskobik preparasyon

Kültürde üremiş koloniden hareket muayenesi için preparatlar hazırlanır. Bakteri hareketlerini
sağlayan organeller hassas olduğu için ilgili örnekten preparat hazırlarken birtakım noktalara
dikkat etmek gerekir. Bunlar;
 Kültür, etüvden çıkarıldıktan hemen sonra preparat hazırlanıp incelenmelidir.
 Kullanılan lam soğuk olmamalı, oda ısısında olmalı, gerekirse etüvde ısıtılmalıdır.
 Lam üzerindeki kültür sıvısında bir akma hareketi varsa akma durduğunda inceleme
yapılmalıdır.
1. Lam-lamel arası preparatta hareket incelemesi
 Temiz lam üzerine sıvı kültürden bir damla konur.
 Üzerine lamel kapatılır.
 Mikroskopta 10’ luk objektifle saha bulunur.
 40’ lık objektifle incelemeye geçilir.
 Gerçek hareket ya da brownier hareket yönünden inceleme yapılır.
2. Asılı damla preparatı ile hareket incelemesi
 Sıvı kültür örneğinden bir damla lama konur ve lam ters çevrilerek çukur lamın
çukur kısmına kapatılır.
 Mikroskopta 10’luk objektifle saha bulunur.
 40’ lık objektifle incelenir.

Şekil 2.2 Lam lamel arası ve asılı damla preparasyonu

Pozitif sonuç – aceleci, zikzak, yuvarlanma veya diğer anlamlı yer değiştirme
şeklinde hareketlerin gözlenmesi.
Negatif sonuç – hareket görülmemesi veya sadece Brownian hareket varlığı
 Mikroorganizmaların hareket organelleri ince yapılı olduğu için ışık mikroskobunda
görülmeleri mümkün değildir. Bu nedenle karanlık alan mikroskobundan kullanılır.
Karanlık alan mikroskopta mikroorganizmalar, karanlık zemin üzerinde parlak
görüntü verir.

III. Basit boyama

Mikroorganizmaların mikroskobik incelemede görülebilmesi ve ayırt edilebilmesi için,
çeşitli boylarla boyanmış olması gereklidir. Boyayarak incelemede ilk aşama, preparat
hazırlamaktır. Hangi boya yöntemi kullanılırsa kullanılsın, preparat hazırlamak üç temel
aşamada gerçekleştirilir.

1. İncelenecek örneğin lam üzerine yayılması

İyi bir preparat hazırlamak için lamların çok temiz, yağsız ve çiziksiz olması gerekir. Temiz
olmayan yağlı lamlara incelenecek örneğin sürülmesi oldukça zordur. Preparat hazırlamak
amacıyla öze, iğne, eküvyon, pastör pipeti kullanılır. İnceleme materyali olarak ise, direkt
hastalık materyali, kültür materyali yada patolojik lezyonlardan alınan parçalar kullanılabilir.
Öncelikle lamın rodajlı kısmına hasta örneğinin numarası yazılır. Takiben sıvı materyalden
öze ile direkt olarak, bir kaç öze dolusu alınarak lam üzerine yayılır. Bunun yanında pipet
yada pastör pipeti ile de sıvı materyal lam üzerine aktarılabilir. Materyal katı yada yarı katı
ise, lamın 1/3’lük kısmına bir damla serum fizyolojik (SF) konulur. Öze ile materyalden bir
miktar alınıp önce lamın orta kısmına sürülerek ezilir. Ardından öze yardımıyla lam
üzerindeki SF solüsyonu ile azar azar karıştırılarak orta kısımdaki materyal ezilmeye çalışılır.
Bu işlem birkaç defa yapılarak, SF ile materyal iyice karıştırılarak lam yüzeyine homojen
olarak yayılır. Eküvyon ile alınan materyal ise direkt olarak lam üzerine sürülerek yayılır.
İnceleme örneği doku parçaları ise, bu doku parçaları bir pens ile tutularak lam üzerine
bastırarak sürmek suretiyle yayımı yapılır.

1. Preparatın kurutulması
Üzerine materyal sürülmüş olan lamın tespit edilmeden önce mutlaka kurutulması gerekir.
Kurutma işlemi oda ısısında, yada etüvde tutmak suretiyle yapılır. Alev üzerinde kurutmak
bakterilerin morfolojik yapılarını bozabileceği için sakıncalıdır.
 2. Preparatın tespit edilmesi
Lam üzerine sürümü yapılan ve kurutulan hücrelerin lama yapışmasını sağlamak amcayla
tespit edilmesi gerekir. Tespit işlemi iki grup altında toplanır:
A. Fiziksel tespit: Bakteriyolojik incelemelerde en sık kullanılan yöntemdir.
1. Havada kurutarak tespit: En az 2-3 saat bekletilerek yapılır. Yavaş ve pek
güvenilir olmayıp, sık kullanılmamaktadır.
2. Alevde tespit: Preparat, yayma yapılan yüzey üstte kalacak şekilde bir
ucundan tutulur. Lamın alt yüzeyi yanmakta olan bek alevinin içerisinde
45ºC eğimle üç defa sokulup çıkarılarak aleve yalatılır. Bu işlem sırasında
preparatın uzun süre alev içerisinde kalmamasına ve materyalin
yanmamasına özen gösterilir. İşlemin sonunda lam, elin üst yüzüne
dokundurulduğunda dayanılabilecek derecede sıcak olmalıdır. Boyama
işlemine başlanmadan önce lamın soğuması beklenmelidir. En sık
kullanılan tespit yöntemidir.
B. Kimyasal tespit: Lökosit, eritrosit, protozoon gibi hücrelerin bulunduğu
preparatların ısı ile tespit edilmesi halinde bu hücreler zarar görebilirler. Bu
yüzden bu tür preparatların tespitinde kimyasal tespit sıvılarından yararlanılır. Bu
amaçla yayması yapılarak kurutulmuş preparat üzerine ilave edilmiş saf etil alkol
ile 8-10 dakika, saf metil alkol ile 3-5 dakika veya aseton ile 5 dakika süreyle
muamele edilerek tespit işlemi yapılabilir.
3. Basit boyama işlemi
Bu yöntemle mikroorganizmaların boyanmasında tek bir boya eriyiği kullanılır. Bu
boyamada mikroorganizmaların yalnızca morfolojik yapılarının incelenmesi ve görünür hale
gelmelerinin sağlanması amaçlanır. Tüm hücreler aynı renkte boyanmış olarak görülür.

1. Bazik boyalarla basit boyama: Metilen mavisi, sulu fuksin, kristal viyole, safranin
gibi boyalardan sadece biri kullanılarak basit boyama yapılır. En sık kullanılan yöntem
ise metilen mavisiyle boyama yöntemidir.
Metilen mavisiyle boyama:
Löffler’in metilen mavisi eriyiği kullanılır. Bakterilerin çoğu bu boyayı yoğun bir
şekilde absorbe ettikleri için görünür hale gelmelerini kolaylaştırır.
Tespit edilmiş, soğutulmuş preparatın üzerine, tüm yüzeyi kaplayacak şekilde boya
dökülür, 1 dakika bekletildikten sonra musluk suyuyla yavaşça yıkanır. Havada veya
zaman kazanmak için kurutma kağıdı arasında kuruması sağlanır. Mikroskopta
 immersiyon objektifi ile incelenir. Tüm bakteriler ve hücreler mavi renge boyanmış
olarak görülür.

Şekil 2.3. Kültür örneğinden metilen mavisi ile boyama

2. Asit boyalarla basit boyama: Asit boyalar bakterileri boyamadığı için yalnızca
zemini boyarlar. Boyalı zemin üzerinde bakteriler renksiz olarak görülürler. Zor
boya alan bazı mikroorganizmaları ve daha çok bakteri kapsüllerini görebilmek
için kullanılır. Bu boyama yöntemine negatif boyama adı da verilir. Bu amaçla
gelenllikle çini mürekkebi veya nigrosin kullanılır.
Çini mürekkebi veya Nigrosin ile Negatif boyama
Bir lam üzerine uç kısmına yakın olarak bir damla çini mürekkebi/nigrosin
damlatılır. İncelenecek bakteri kolonisinden öze ile bir miktar alınarak çini
mürekkebi/nigrosin boyası ile iyice karıştırılır. Bir lam yada lamelle bu karışıma
45º eğimle temas ettirilip lam boyunca sürüklenerek yayılır. Havada kurutulan
preparat, alkol yada alevden geçirilerek tespit edilir. Mikroskopta immersiyon
objektifi ile incelenir. Kapsüllü bakterilerde, kapsül yapısı boyanmadığı için
siyaha boyanmış zemin üzerinde, etrafında boyanmamış boşluklar olarak
görülürler.

Şekil 2.4. Kültür örneğinden Çini mürekkebi ve Nigrosin boya ile Negatif
boyama
 UYGULAMA-3

GRAM BOYAMA

Amaç: Bileşik boyama yöntemlerinden biri olan ve rutin bakteriyolojide sıkça kullanılan
Gram boyama’yı tanımlayabilmesi ve uygulayabilmesi amaçlanmıştır
Öğrenme Hedefleri:
1. Bileşik boyama yöntemlerini sayabilmeli ve özelliklerini açıklayabilmeli
2. İncelenecek örneğin lam üzerine yayılmasını uygulayabilmeli
3. Gram boyama basamaklarını açıklayabilmeli ve uygulayabilmeli
4. Gram boyama yönteminde görülen hücreleri tanımlayabilmeli
5. Gram olumlu ve olumsuz mikroorganizmaları mikroskopta tanımlayabilmeli

Bileşik boyama işleminde preparat birden fazla boya ile boyanır. Bu yöntem ayırt edici bir
boyama yöntemi olup, Gram boyanma özelliklerine göre bakterilerin gruplara ( gram negatif
veya gram pozitif) ve morfolojik yapılarına göre (kok, diplokok, basil, kokobasil) ayrımları
mümkündür.

A- GRAM BOYAMA YÖNTEMİ

Bu yöntem ilk defa 1884 yılında Christiansen Gram isimli araştırıcı tarafından bulunmuştur.
Bu yöntem ile bakteriler, hücre duvar yapısı özelliklerine dayanılarak, gram pozitif ve gram
negatif olmak üzere iki ana gruba ayrılırlar. Mikrobiyolojik olarak en önemli boyama
yöntemlerinden birisidir.
Bu boyamada tespit edilmiş preparat üzerine kristal viyole boyası dökülür, 1 dakika
bekletildikten sonra preparat su ile yıkanır. Sonra üzerine mordan olarak lügol eriyiği dökülür
1 dakika bekletilir ve su ile yıkanır. Sonraki aşamada 30 saniye süreyle alkol ile
renksizleştirme işlemi (dekolarizasyon) yapılır. Preparat üzerindeki alkol hafif şekilde
çalkalanarak dökülür ve sonra preparat su ile yıkanır. Zıt boya olarak preparatın üzerine sulu
fuksin (veya nötral kırmızısı, safranin vs.) dökülür ve 30-60 saniye süreyle bekletilerek su ile
yıkanır. Preparat kurutulup, mikroskobun immersiyon objektifiyle incelenir. Şekil 3.1
Gram pozitif bakteriler mavimsi mor renkte, gram negatif bakteriler pembemsi kırmızı renkte
görülürler. Şekil 3.2- Şekil 3.3
Gram boyamada, uygulanan kristal viyole ve lügolden sonra, lam üzerinde bulunan bütün
bakteriler bu boyaları içine alırlar ve bütün bakteriler kristal viyole rengi olan mavi-mor
renkte görülürler. Kalın peptidoglikan tabakasına sahip gram pozitif bakterilerde Kristal
viyole boyası, lügol yardımıyla teikoik asit içeren hücre duvarıyla kimyasal bağ kurar ve bu
nedenle, dekolarizasyon aşamasında aldığı boyayı bırakmayıp boyanın rengi olan mavi-mor
renkte boyanırken hücre duvarında lipid yönünden zengin, ancak zayıf peptidoglikan
tabakasına sahip gram negatif bakteriler ise alkolün etkisiyle bu iki boyayı bırakarak son
basamakta uygulanan fuksin boyasını alarak pembe-kırmızı renkte görünürler Şekil 3.4

1. Kristal viyole 2. İyot 4. Safranin uygulanır

uygulanır uygulanır 3. Alkolle yıkanır
(zıt boya)
(pembe boya) (Boya saptar) (renksizleştirme)
boya

Şekil 3.1. Gram Boyama Yöntemi

Şekil 3.2. Gram boyanmış üretral örnekte Şekil 3.3 Karışık bakteri kültüründen yapılan
Pembe boyalı lökositler içnde Gram negatif Gram negatif basiller ve Gram pozitif koklar
Diplokok bakteriler ( Neisseria gonorrhoeae)
 UYGULAMA-4

ASİDOREZİSTAN (ASİT FAST) BOYAMA YÖNTEMLERİ

Amaç: Bileşik boyama yöntemlerinden biri olan Asidorezistan boyama yöntemlerinin

özelliklerini tanımlayabilmesi ve Ehrlich-Ziehl-Neelsen (EZN) boyama yöntemini
uygulayabilmesi amaçlanmıştır.
Öğrenim Hedefleri:
1. Bileşik boyama yöntemlerinden aside dirençli boyama yöntemlerini sayabilmeli
2. EZN boyama yöntemi uygulanacak mikroorganizmaları sayabilmeli
3. EZN boyama yönteminin özelliklerini açıklayabilmeli
4. EZN boyama için gönderilen örneklerin hazırlanmasını açıklayabilmeli
5. Homogenizasyon- Dekontaminasyon- Konsantrasyon tekniğini açıklayabilmeli
6. EZN boyama basamaklarını tanımlayabilmeli ve uygulayabilmeli
7. EZN ile boyalı preparatlarda hücreleri, normal flora mikroorganizmalarını ve ARB
morfolojilerini tanımlayabilmeli ve gösterebilmeli

Mikobakteriler bakteriyolojik boyalar ile güç boyanırlar. Ancak fenollü ve yoğun boya
eriyiklerinin uzun süre ve ısı ile uygulanması sonucunda boyanabilirler. Bir kez boyandıktan
sonra diğer bakterilerin aksine asit-alkol uygulaması ile boyalarını bırakmazlar. Bu boyanma
özelliğine sahip bakterilere aside dirençli bakteri (Asidorezistan bakteri, ARB) denir.
Tüberküloz çeşitli organları tutabilmesine karşın en sık tutulan organ akciğerlerdir. Bu
nedenle tanıda en sık kullanılan hasta örneği balgamdır. Balgam incelemesi en kolay, en ucuz,
en sık kullanılan ve tanısal değeri oldukça yüksek bir yöntemdir. Boyanmış yayma
preparatların mikroskopla incelenmesi ile aside dirençli bakteri (ARB) saptanması, klinik
örnekte mikobakteri varlığını gösteren ilk bakteriyolojik kanıttır.

Asidorezistan (Asit Fast) boyama yöntemleri:

1. EZN (Ehrlich-Ziehl-Neelsen) boyama
2. Kinyoun boyama
3. Florokrom boyama (Auramin-Rhodamine boyama)
EZN (Ehrlich-Ziehl-Neelsen) Boyama Yöntemi (Şekil 4.1)
En yaygın olarak kullanılan asidorezistan bakteri boyama yöntemidir.
Yapılışı:
1. Hazırlanarak kurutulmuş balgam preparatı alt yüzünden üç kez alevden geçirilerek
tespit edilir ve preparat soğuduktan sonra boyanmak üzere lam ızgarası üzerine
bırakılır.
2. Fenollü fuksin (karbol fuksin) boyasından preparatlar üzerine tamamen örtülecek
miktarda bolca dökülür.
3. Ucunda pamuk bulunan tel alkole daldırılır, çıkarılır ve yakılır. Bu alev
preparatların altından yavaşça gezdirilirken preparatların üzerinde sigara dumanına
benzer bir buhar çıkacak fakat kaynamayacak derecede 2-5 dakika süre ile ısıtılır.
Bu esnada boya eksilirse eklenerek kuruması önlenir.
4. Süre sonunda bir pens yardımı ile preparat üzerindeki boya dökülür, su ile yıkannır
ve üzerine %3-5’lik asit-alkol eriyiği dökülerek dekolore edilir (renksizleştirilir).
Bu işlem hiç renk kalmayıncaya kadar bir kaç kez yinelenir. Sonunda preparat su
ile tekrar yıkanır.
5. Preparat bu kez zıt boya olarak Löfler’in metilen mavisi ile 30sn-1 dakika boyanır,
takiben yıkanır ve kurutulur.
6. Kurumuş preparat üzerine bir damla immersiyon yağı damlatılır ve immersiyon
objektifi ile incelenir.
Fenollü fuksin uygulamasında preparatta bulunan her çeşit bakteri, hücre ve diğer oluşumlar
boyayı alır ve kırmızıya boyanır. Asit alkol uygulaması ile sadece asidorezistan bakteriler
aldıkları boyayı bırakmaz. Zıt boya uygulaması ile boyalarını bırakan oluşumlar ve zemin
maviye boyanır. Mikroskopta aside dirençli basiller mavi zeminde pembe-kırmızı ince
çubuklar halinde görülmektedir Şekil 4.2.
EZN (Ehrlich-Ziehl-Neelsen) Boyama Yöntemi (Şekil 4.1)

1. EZN boyama 2. Tesbit edilmiş örnek 3. Preparatların altından kaynatmadan

yönteminde bulunan lamın üzerine bolca buhar çıkacak kadar 2-5 dakika kadar
kullanılan karbol fuksin dökülür ısıtılır. Isıtma sırasında boya azalırsa
boyalar ve asit ilave edilir
alkol

4. Preparatlar su ile tamamen 5) Löflerin metilen mavisi ile 1

yıkanır ve . Asit-alkol ile dakika boyanır
dekolarize edilir.(rensizleştirme)

6. Preparat tazziksiz su ile tamamen yıkanır,

kurutulur ve immersiyon objektifinde incelenir

Şekil 4.2. EZN Boyama Yöntemi ile boyanmış bir balgam örneğinde
birçok kırmızı aside-dirençli basiller.
KAYNAKLAR

1. Başustaoğlu A.Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvarlarında Biyogüvenliğin Önemi.

Başustaoğlu A., Güney M.(Editörler): Klinik Mikrobiyoloji Laboratuvarlarında
Biyogüvenlik. KLİMUD yayınları No:2, Sayfa 3-9, Sim Matbaacılık Ltd Sti., Ankara,
Ekim 2012
2. Özyurt M, Hoşbul T. Enfeksiyöz Örneklerin Taşınması ve İşlenmesi . Başustaoğlu A.,
Güney M.(Editörler): Klinik Mikrobiyoloji Laboratuvarlarında Biyogüvenlik.
KLİMUD yayınları No:2, Sayfa 203-221, Sim Matbaacılık Ltd Sti., Ankara, Ekim
2012
3. Us D., Başustaoğlu A. (Çeviri editörleri) : Tıbbi Mikrobiyoloji, (Murray P.R,
Rosenthal K.S, Pfaller M.A -editörler) , 7.Baskı, Pelikan Kitabevi - 2016
4. Başustaoğlu A. Us D. (Çeviri editörleri); Koneman’s Color atlas and Diagnostic
Microbiology, 7.Baskı (Türkçe Baskı), Hipokrat Kitabevi 2017
5. Başustaoğlu A, Kubar A., Yıldıran Ş.T:, Tanyüksel M (Çeviri editörleri) : Klinik
Mikrobiyoloji , (Murray P.R, Baron E.J., Jorgensen J.H., Landry M.L., Pfaller M.A -
editörler), 9.Baskı , Atlas Kitapçılık – 2009
6. Topçu A.W., Söyletir G., Doğanay M.: Enfeksiyon Hastalıkları ve Mikrobiyolojisi,
Cilt 1 ve Cilt II, 4.Baskı, Nobel Tıp Kitabevleri -2017
7. Altındiş M. Tıbbi mikrobiyoloji Laboratuvar Kitabı, Nobel tıp kitabevi, 2013
8. Günalp A, Yılmaz YA, Pınar A. Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvarı Eğitim Kitabı.
Hacettepe Üniversitesi Yayınları. Ankara 2003.