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  • Cap 9 - Estrutura Do DNA e Cromossomos

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    Laíce Garcia
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    Cap 9 _ estrutura do DNA e cromossomos

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    Cap 9 - Estrutura Do DNA e Cromossomos

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    DNA e a Estrutura Molecular dos Cromossomos A descoberta da nuclefna fm 1868, Johann Friedrich Miescher, jover suigo estudante de Medicina ficou fascinado com uma subst&ncia dcida que ialou de pidcitos obtides em ataduras usadas em curatvos de ferdas hhumanas.Primeio, ele separou pidcitos das ataduras e dos frag- iment scteciadoe, dapots tratouaeallulae come pape, wim proteoitica isolada do estémago de porcos. Depo do tratamen- to com pepsina, ele isolou urna substancia dcida que chamou de “nuelaina’. A nucaina de Miescher era incomum, porque continha sgyandes quantidades de nitrogénio e fésforo, dos elementos que na época se pensava que s6 coexstssem em alguns tips de gor- dle. Misecar eneraves um ertige daserivarde « devcoberts da rnuclena er pidcitos hurmanos e o apresentou para publicagao em 1869. No entanto,o editor da revista & qual enviu o artigo rece- beu os resultados com ceticismo e deci repetir os experiments le proprio. Por esse mativo,o artigo de Miescher que descrevia a ruclena s6 fi publicado em 1871, 2 anos depois da apresentacéo. Naguela époce, no era pessivel preveraimportincia da subs tancia que Miescher chamou de nuclena.A exsténcia de cadeias poliuclestidcas, © principal componente do material cido da rucleina de Miescher,s6 foi documentada na década de 1940. 0 papel dos écidos nucleicos no armazenamento e na transmisséo de informagdes genéticas s6 foi confirmado em 1944, ea estru- ‘ura em dupla hélice do DNA 26 foi descoberte em 1953, Mesrno ‘em 1953, muitos geneticistas relutava em aceitar a ideia de que PANORAMA > Funcdes do material genético > Comprovacio de que as informacées genéticas so armazenadas no DNA > Estruturas do DNA edo RNA > Estrutura do cromossomo em procariotos e virus » Estrutura do cromossomo em eucariotos Micrografiaeletrrica de transmiss2o com cor acentuada de uma ‘Hula de &,collyota com extrusao de grande parte de seu DNA, (05 dcidos nucleicos, endo as proteinas, continham as informagies _genéticas, porque a variabilidade estrutural dos cidos nucleicos era menor que a das proteinas, 194 Fundamentos de Genética Fung6ées do material genético © material genético deve se replicar, controlar 0 cresci- mento e o desenvolvimento do organismo e possibilitar a adaptacao do organismo a variacoes do ambiente. Em 1865, Mendel mostrou que os “Merkmalen” (agora “genes") transinitiam informagdes yenéticas, ©, m2 pr meira parte do século 20, seus padroes de transmissio foram amplamente estudados. Embora tenham esclare- cido pouco a natureza molecular dos genes, 08 eatudos genéticos classics mostraram que 0 material genético tem tres funcdes essenciais: 1. A funcao genotipica,repicacao. O material genético ar- ‘mazena informacoes genéticas e transmite com preci so as informacées dos pais para a prole, geracdo apés eragio. 2. A funcio fenotipica, expressio gtnica. O material gené- tico controla o fenétipo do organismo. Ou seja, 0 ma- terial genética determina o ereseimento do organismo, desde 0 zigoto unicelular até o adulto maduro. 3. A funcio evolutiva, mutagao. O material genético sofre alteracdes para produzir variacdes que possibilitem a PONTOS ESSENCIAIS adaptacio dos organismos a modificagdes do ambien- te, de maneira que haja evolucao. ‘Outros estudos genéticos iniciais estabeleceram correla- ‘in preciea entre as padres de tranemissin de genes r 0 ‘comportamento dos cromossomos durante a reproducao sexuada, um forte indicio de que os genes geralmente cstio localizados nos cromossomos. Assim. as tentativas posteriores de descobrir a base quimica da hereditarie- dade conenuataiirse 1s niuléculas preseiites 1109 UO- 0s cromossomos sio constituidos de dois tipos de grandes moléculas orgiinicas (macromoléculas) as protet nas 05 écidos nucleicos. Existem dois tipos de dcidos muclei- ‘CoS: Scido desoxirribonucteico (DNA) € dcido ribonuceico (RNA). Durante a década de 1940 e 0 infcio da década de 1950 ‘08 resultados de experimentos precisos indicaram clara- mente que as informagoes genéticas sto armazenadas ‘em cidos nucleicos, ndo em proteinas. Na maioria dos organismos as informagSes sio codificadas na estrutura do DNA. No entanto, em muttos virus pequenos as infor macées genéticas esto no RNA. cs [isantecetigpelieteotabafsepion evemicbernipimye apentliie, wplieanareifigte fenatipica, expressioginica a funcio evolution, mutagdo. Comprovacdo de que as informacées genéticas sao armazenadas no DNA Na maioria dos organismos, as informagées estdo codi- ficadas no DNA. Em alguns virus, o material genético & ‘Oo RNA ‘Vésias tints de evideueias iudivetas sugeriran que DNA abriga as informacées genéticas de organismos vi- vos. Por exemplo, a maior parte do DNA celular esta nos ‘cromossomos, enquanto o RNA e as proteinas também sio abundantes no citoplasma. Além disso, ha cortelagao precisa entre a quantdade de DNA por celula ¢ 0 nume- ro de conjuntos de cromossomos por célula. A maioria das células somaticas de organismos diploides contém o dobro da quantidade de DNA presente nas células ger minativas haploides (gametas) da mesma espécie. A com- posicéo molecular do DNA é a mesma (com raras exce- (ges) em todas a8 células de um organismo, a0 pasta que a composicao do RNA e das proteinas varia muito de um tipo celular para outro. O DNA é mais estavel que o RNA ‘omas proteinas. Uma vez que o material genético tem de armazenar e transmitir informagoes dos pais para a pro- 1c, poderiamos esperar que fossc estévcl, como o DNA. Embora essas correlagdes sejam uma forte indicagdo de que o DNA € 0 material genético, nao sio, de maneira alguma, uma comprovacio. COMPROVACAO DE QUE 0 DNAEO MEDIADOR DA TRANSFORMACAO A descoberta da transformacéio em Streptococcus pmeumo- nniae por Frederick Griffith foi comentada no Capitulo & Quando ele injetou em camundongos bactérias tipo IIS (Wirulentas quando vwvas) destruidas pelo calor mais bac- térias tipo TIR (avirulentas) vivas, muitos camundongos tiveram pneumonia e morreram, € nos corpos foram en- ccontradas células tipo IMIS vivas. Algum clemento das lulas destrufdas pelo calor - 0 “principio transformador” = convertera as células tipo IIR vivas em tipo IIS. Em 1081, Richard Sia 6 Martin Nawsan fizeram a mecma ove perimento in vitro, mostrando que os camundongos nao participavam do processo de transformacao (Figura 9.1). 0 experimento de Sia € Dawon preparou o terreno para a demonstracéo, por Oswald Avery, Colin MacLeod e Maclyn McCarty, de que o “prinefpio tranaformador” em S. pneumoniae era 0 DNA. Avery € colaboradores mostra- Tipo IR vivas, de capsula Bactérias tipo IR vivas Capitulo | DNAea Estrutura Molecular dos Cromossomos 195 crescendo em meio de cultura Tipo lS destruidas pelo calor Bactérias tipo IS destruidas ppelo calor em meio de cultura Tipo IS destruidas pelo calor Bel Tipo IR vives Tipo IIS destruiées pelo ccalor mais tipo IR vivas ‘em meio de curtura Tratamento com soro que precipita célilas IR da mistira - Conia tno iS Bactérias IR preciptadas 1m FICURA 9.1 Demonstraglo da tansformagio em Streptococcus pneumonize in vtro por Sia Dawson. ram que 0 DNA é 0 tinico componente das células tipo AMS necessério para transtormar células tipo IIR em tipo IIS (Figura 92). Mas como eles poderiam ter certeza de que 0 DNA eta 1valmente puro? £ difieline comprovar a pureza de ‘qualquer substincia macromolecular. Talvez @ prepara- ‘Gao de DNA contivesse algumas moléculas de protefna, ¢ ‘essas proteinas contaminantee fosem rexponsdveis pela ‘transformacao observada. Os experimentos mais defini- tivos na comprovacao por Avery, Macleod e McCarty de que 0 DNA era o principio transformador empregaram ‘enzimas que degradam DNA, RNA ou proteinas, Em ex- periments separatlus, y DNA alaente purificadly de Célula tipo IIIS foi tratado com as enzimas (1) desoxie- ribonuclease (DNAse), que decompae o DNA, (2) ribonucle- ase (RNase), que decompse o RNA, ou (3) proteases, que decompéem proteinas; em seguida, testou-se a capacida- de do DNA de transformar células tipo IIR em tipo HIS. Apenas o tratamento com DNase teve algum efeito sobre a atividade transformadora da preparacao de DNA - ele aaboliu por completo (Figura 9.2). Embora o mecanismo molecular de transformacio te- nha continuado desconhecido durante muitos anos, os resultados obtides por Avery ¢ colaboradores mostraram claramente que as informacées genéticas do Streptococcus estio no DNA. Hoje os geneticistas sabem que o segmen- to de DNA no cromossomo de Sireptococcus que abriga as informacées genéticas especificando a sintese de uma cipsula tipo TI € fisicamente inserido no cromossomo da célula receptora tipo IIR durante o processo de trans- formacao. COMPROVACAO DE QUE O DNA ‘CONTEM AS INFORMAGOES GENETICAS NO BACTERIOFAGO T2 Outrae evidénciaa de que © DNA é 0 material genético fo ram publicadas em 1952 por Alfred Hershey (ganhador do Prémio Nobel de 1969) e Martha Chase. Os resulta- dos de seus experimentos mostraram que as informacdes genéticas de determinado virus bacteriano (bacteriéfago 2) estavam no DNA. Esses resultados tiveram grande impacto na aceitacdo pelos cientistas do DNA como ma- terial genético, em razao da simplicidade do experimen- to de Hershey e Chase. 05 virus so os menores organismos vivos; eles so se- res vivos, a0 menos no tocante ao controle da reprodu- gia par infrmag nucleicos por processos iguais aos observados nos orga- mn gyrniicas armisrenadan ern detdon 196 Fundamentos de Genética Cues tipo IR DNA de clas 1S dsruias pelo car DNAde——_Soroque cline lis prec destvidas elias IR bia too IR inca ashen DNAde — Soroqe shies, posite destnidas * céldas IR peor dametra ONAde ——_Soroque ceblesilS , preciate destnidas * lias IR pevcaur — danisure DNAde Sora + cdblasiS + precinta fctnidae ” falane Cues tipo IR pelo cal da misura > ‘Corie IR ~ ‘usenca e cobrias Colas MS Colas MS aa - => Colas MS 1m FICURA 9.2 Comprovaco por Avery, MacLeod e McCarty de que o “principio transformador" é 0 DNA. nismos celulares (Capitulo 8). Os virus, porém, so pa- rasitos acelulares que s6 se reproduzem em céllas hos- pedeiras apropriadas. A reproducao depende totalmente dy mecanisiny metabotice (ribusumus, sisteuas yerallo- res de energia e outros componentes) do hospedeiro. Os virus foram de enorme valia no estudo de muitos proces- sos genéticos em vista da estrutura e da composi¢io qui- mica simples (muitos contém apenas protefnas € acidos nuucleicos) € da reproducao muito rapida (alguns virus bacterianos reproduzem-se em 15 a 20 min em condicdes ideais). ‘A composicio do bacteri6fago T2, que infecta a Ee cherichia coli, um bacilo comum do c6lon, é aproximada- ‘mente 50% DNA e 50% protefna (Figura 9.3). Experimen- tos anteriores 2 1959 haviam mostrada que a reprodu de todos os bacteriéfagos T2 ocorre dentro das células de E.coli. Portanto, quando Hershey e Chase mostraram que o DNA da particula viral entrou na célula, enquan- to a maior parte das proteinas do virus permaneceram advorvidas a0 extctior da célula, a conclusio foi que as informacdes genéticas necessarias para a reproducio vi- ral estavam presentes no DNA. A base do experimento de Hershey ¢ Chase é a presenca de fésforo, mas nia de enxofre, no DNA, e a presenca de enxofre, mas ausén- ‘la quase total de f6sforo, nas protemas. Assim, Hershey € Chase conseguiram identificar especificamente (1) 0 DNA do fago por cultura em meio que continha 0 is6- topo radioativo do fésforo, "P. em ver do isétopo nor mal, "P; ou (2) a capsula proteica do fago por cultura meio que Continla enxofie radivativo, 8, is6topo normal, "S (Figura 9.3). ‘Quando as particulas do fago T2 marcadas com “S fo- ram misturadas a eélulas de E. coli por alguns minutos € a células infectadas por fagos foram submetidas a forcas de cisalhamento em homogeneizador Waring, 101 possi- vel retirar a maior parte da radioatividade (portanto, as proteinas) das células sem afetar a producao de fagos da prole. Quando se usaram particulas de T2 cujo DNA fora marcado com *P, porém, praticamente toda a radioativi- dade foi encontrada dentro das células; ou seja, o DNA. iio foi retirada por cisalhamento em homogeneizador. As cpsulas dos fagos removidas foram separadas das ccélulas infectadas por centrifugacao a baixa velocidade, ‘que causa a sedimentacao das células, mas deixa as parti- culas de fagos suspensas. Esses resultados indicaram que ‘© DNA dos virus entra na célula hospedcira, cnquanto a capsula proteica permanece fora da célula. Como os virus da prole sao produzidos dentro da célula, os resul- tacos de Hershey ¢ Chase indiearam que as informagies ‘genéticas que orientam a sintese das moléculas de DNA € das capstlas protelcas da prole dos virus esto no DNA, parental. Além disso, demonstrou-se que as particulas da veedu te oo Le ornare | fy ri aca expen: creme , cee son = = — 10 —~_ calase Feo chic es CW visura desagos — “tempo para we ohacteine cs fagos nfctem ss bacterin. Cpa de = Sprotena 2 + — > " 10min —_ x Clade FagoT2 Ceti infectada Ecol Capitulo 9 | DNAea Estrutura Molecular dos Cromossomos 197 Baixaracoatividade p no sobrenadante ® Vonage cont ee = 2 celia iectada. Closes Radostindace anlage vu sede “ r (pellet) de células ‘© hoicacto de forcas “© senaracto de bactras e ce csahamert no fags or contac, homogenate" Roclatvidade ro sobrenadante Célula infectada Cépsules Bata ratioatvidade no os fagos _sedimento (petit de células 1 FIGURA 8:3 DemonstragSo por Hershey e Chase de que as informactes genéticas do bacteriéfago T2 esto em seu DNA. prole continham parte do “P, mas nao tinham 0 S do fago parental Havia um problema com a comprovacio de Hershey Chase de que o material genético do fago T2 € DNA. Os resultados mostraram que uma quantidade significa tiva de S (portanto, de proteina) foi injetada nas célu- las hospedeiras com o DNA. Assim, seria possivel afirmar ‘que essa pequena fracéo das proteinas do fago continha as informagoes genéticas. Mais recentemente, os cientistas desenvolveram procedimentos nos quis prataplastos (eé Tulas cujas paredes foram removidas) de E. coli podem ser infectados pelo DNA puro do fago. Nesses experimentos, chamados de experiments de trensfeccéo, hd producto de prole infecciosa normal dos fagos, comprovando que o ‘material genético desses virus bacterianos é 0 DNA. COMPROVACAO DE QUE O RNA ARMAZENA AS INFORMACOES GENETICAS EM ALGUNS VIRUS A medida que um numero cada vez maior de virus fo1 identificado e estudado, tornou-se evidente que muitos deles continham RNA e proteinas, mas nao DNA. Em todas as cates extucadlos até hoje, esté clara que esses virus de RNA, assim como todos os outros onganismos, aarmazenam informagdes genéticas em acidos nucleicos, nao em proteinas, embora neles o dcido nucleico seja 0 RNA. Um dos primeiros experimentos que estabeleceu © RNA como material genético em virus de RNA foi 0 denominado experimento de reconstituicio de Heinz Fraenkel-Conrat e colaboradores, publicacio em 1957. O experimento simples, mas definitivo, foi realizado com © virus do mosaico do tabaco (TMV), um pequeno virus conatituido de uma iniea molécula de RNA envolvida por uma capsula proteica, E possivel identificar diferen- tes linhagens de TMV pelas diferencas de composicao quimica das cépsulas proteicas. Fraenkel-Conrat ¢ colaboradores trataram particulas de TMV de dias Tals muimicas que dissociam as cpsulas proteicas virais das moléculas de RNA e separaram as proteinas do RNA. Em seguicla, misturaram as proteinas de uma linhagem cam as moléculas de RNA da outra linhagem em condigdes que ocasionam a reconstituicao de virus infecciosos com- pletos constituidos de proteinas de uma linhagem e RNA jon difecenitee cant eubalincian 198 Fundamentos de Gndtica te 7h decompose) | © Prolenade B Protsina de 8 Protsina do iv tp ae oe Vos Pre. Feorstna Se aA aa pero oi Zp Protena de A rol Sco TW tipo A > 1 FICURA8400 materia genético do virus do mossico do tabaco (TMV) & RNA, no protelna, O TMV no contém DNA: & consttuido apenas de RNA e pioteina. da outra. Quando as folhas de tabaco eram infectadas [por esses virus mistos reconstituidos, os virus da prole sempre tinham fendtipo e genstipo idénticos aos da li PONTOS ESSENCIAIS Estruturas do DNA e do RNA Em geral,o DNA é bifilamentar, com pareamento de ade- nina com timina e de guanina com citosina. © RNA geral- mente é unifilamentar e contém uracila no lugar da timina, As informacoes genéticas de todo os organisms vi- vos, com excecio dos virus de RNA, séo armazenadas no DNA. Qual é a estrutura do DNA, em que forma so armazenadas as informacées genéticas? Que carac- teristicas da estrutura do DNA facilitam a transmissio prociea das informagé ‘outra? As respostas sio, sem diivida, trés dos componen- tes mais importantes de nossa compreensao da natureza davida. genéticar de uma geragio para NATUREZA DAS SUBUNIDADES QUIMICAS NO DNA E NO RNA Os acidos nucleicos, principais componentes da nuclei- na de Miescher, sio macromoléculas constituidas de subunidades repetidas, os nucleotides. Cada nucleotidio € eonstiuutdy de (1) uu grupo fostaw, (2) un agar com cinco étomos de carbono, ou pentose, e (3) um ‘composto nitrogenado cfclico chamado base (Figura 9.5). No DNA, o agiicar € a 2dlesoxirribose (daf o nome acido desoxirribonucleico); no RNA, o aciicar é a ribose (daf, Acido ribonucleico). Quatro bases diferentes sio comu- ‘mente encontradas no DNA: adenina (A). guanina (G).timina nhagem parental doadora do RNA (Figura 94). Portanto, as informacoes geneticas do IMY sao armazenadas no RNA, € nao nas proteinas, As tmjormagoes genéteas da matoria des organismos vives so armavenadas mo acide desoxtr- ribonucleico (DNA) Emm alguns virus, as informagées genétcas esto no dcido ribonucleco (RNA). (7) ctosina (¢). 0 RNA geralmente também contém ade- nina, guanina e citosina, mas tem uma base diferente, vracila (U), no lugar da timina. A adenina ¢ a guanina s40 Ihases de anel duplo chamaclas eauracila sio bases de anel simples chamadas pirimiginas. Portanto, tanto 0 DNA quanto 0 RNA tém quatro dife- rentes subunidades, ou nucleotidios: dois nucleotidios purinicos ¢ dois nucleotidios pirimidinicos (Figura 96). Em polinucleotidios, como 0 DNA o RNA, essas subuni- dades so unidas em longas cadeias (Figura 9.7). O RNA. geralmente € um polfmero unifilamentar constitufdo de uma sequéncia longa de nucleotidios. O DNA tem um nivel de organizacao a mais - e muito importante: geral- ‘mente ¢ uma molécula bifilamentar. urinak: a citosina, a timina ESTRUTURA DO DNA | A DUPLA HELICE ‘Um dos avancos mais empolgantes na histéria da biologia ‘ocorreu em 1953, quando James Watson e Francis Crick (Figura 98) deduzizam a est.utura corteta do DNA. Esse modelo em dupla hélice da molécula de DNA sugeriu imediatamente um refinado mecanismo de transmissio das informagSes genéticas. A estrutura em dupla hi de Watson e Crick baseou-se em dois tipos principais de cevidéncias: 1. Quando analisaram a composigao do DNA de muitos organismos diferentes, Erwin Chargaff e colaboradores 0c decider nucloicor edo oonctituidos do Capitulo 9 | DNAea Estrutura Molecular dos Cromossomos 199 eubunidados ropotidae donominadae ‘nucleotidios. Cada nucleotidio é composto de trés unidades. t o—F=0 o (@) No RNA: (6) No DNA: ribose 2desoxirribose 9 ou SCH, oon CH oH t i r i i n i Hl H HI H ee OH OH OW OH Auséncia de ‘grupo hidrovila (@) 86.19 RNA (Tanto no RNA () 86 10 DNA (com raras exceeées!: quanto no DNA: (com raras excegdes): 1 OURA9.s Comportriteseatrulureis dus dcidosnuleives. Os sinker ‘atoms de carbono e nitrogénio nos anéis das bases so mostrados em ‘eas bases com anet duplo s4o purnas constataram que a concentracio de timina era sempre igual a de adenina e que a concentracio de citosina era sempre igual 2 de guanina (Tabela 91). O» sesullades sugeriram fortemente que a timina e a adenina, bem como a citosina e a guanina, estavam presentes no DNA em algum tipo de intertelacio fixa. Os dados também mostraram que a concentragao total de pirimidinas (1i- ‘muna mais citosina) era sempre igual a concentracao to- tal de purinas (adenina mais guanina; ver Tabela 9.1). Nh ody Ho =. oenra I - oN ad eH M88 BH Guanina Parnas uous be nunre oyu deo Stas de vebuny ies pentuses eds (2) € (3) repectivamente. As bases com anel simples siopirimidinas, 2. Quando incidem através de filamentos de moléculas urificadas, os raios X sao defletidos pelos étomos das iuviéculas cin pailides eoperitives, desusuiuades par drées de difracéo, que oferecem informagdes sobre a organizagao dos componentes das moléculas. Esses padries de difragéo de raios X podem ser registrados em filme sensfvel aos raios X exatamente como os padres de luz podem ser registrados com uma cimera e filme fotossensivel. Watson ¢ Crick usaram dados de difra- 200 Fundamentos de Genética Nucleotidioepirimidinicos ' q 0 oF 4 soon heey 4 4 f ed ein esoxtnidna, €TMP sesoxeitiéna, COMP hens puro ei \ 3 | HA ie " nea v" P i is Ls moa Te 4 ¥ a seri Miia ds desoxiadenosina, dAMP sesoxiguanosina, (GMP | FICURA 90 Estruturas dos quatro desoxiribonucleotidios comuns preseites no DNA Os atomos de carbono enitrogento nos anéls das bases so numnerados de 1a 6 (pirimidinas) e de 1a 9 (purinas).Portanto, os dtomos de carbono nos acicares dos nucleotios s8o numerados de 1” £25 para distingui-los dos &tomos de carbono nas bases. Extromidade 5’ NH Timina Cosine Go de raios X sobre a estrutura do DNA (Figura 89) apresentados por Maurice Wilkins, Rosalind Franklin (Figura 9.8) ¢ seus colaboradores. Esses dados in- dicaram que o DNA era uma estrutura bifilamentar, altamente onganirada, cam subestritiras repeticas a intervalos de 0,34 nanémetro (1 nm = 10° metro) ao longo do eixo da molécula. ‘Cour base nus dates quiusitus de Chargalf, nus dads de difracdo de raios X de Wilkins e Franklin, e nas infe- réncias a partir da construcio do modelo, Watson ¢ Crick propuseram que o DNA é uma hélice dupla dextrégira na qual as duas cadeias polinucleotidicas sio espiraladas ao redor uma da outra (Figura 9.10). Watson, Crick Wilkins receberam 0 Prémio Nobel de Fisiologia ou Me- dicina de 1962 pelo modelo de dupla hélice. Infelizmen- te, Franklin teve morte prematura (aos 87 anos de idadc) ‘em 1958, e nao ha concesséo péstuma do Prémio Nobel. Cada uma das duas cadeias polinucleotidicas em uma dupla hélice comsiste em 1 unidos por ligacées fosfodiéster, associando desoxirribo- ses adjacentes (1abela ¥.¢). O8 dois filamentos polinucte- otidicos sio mantidos juntos em configuracao helicoidal por ligacdes de hidrogénio (Tabela 9.2) entre bases em filamentos opostos; os pares de bases resultantes sio em- pilhados entre as duas cadeias perpendiculares ao eixo da molécula, como os degraus de uma escada espiral (Fi- gira 9.10). O pareamento de hases é esp eatidio ico: adenina 1m FICURA 9,7 Estrutura de uma cadela polinucleotidica. A cadela de ‘etranuceotidios mostrada é uma cadeia de ONA que contém o aci- car ?'-deconirbane. As cadeias de RNA conti 0 acteaerbace. Ox rudeotdios em cadeias de poliucleotidios so unidos por ligacBes fostodiéster(C © P © C).Note que 0 poinucleotidio mostrado tem polaridade qutmica no sentido 5" em cm) para 3 (eibaixo) porque ‘ada ligagao fostociéster une o carbone 5” da2’-desoxiribose de um rucleotdio ao carbono 3' da2’-desoxribase do nucleottioadjacen- ‘te Portanto, a cadeia tern uma terminagdo de carbono 5 no topo e uma terminacéo de carbono 3’ na parte inferior. Capitulo | DNAea Estrutura Molecular dos Cromossomos 201 1m FiCURA9.8 Os quatro protagoristasprincipsis— Francis Crick, Maurice Wilkins James Watson e Rosalind Franklin (am sentido horétio a partir de cima a esquerda) — na descoberta da estrutura em cupla hélice do DNA. bela 9.1 ‘Composicdo de bases do DNA de varios organismos. | Razdes molares Asc | Ast Fephcia Shdeadenina | %de guanina | % dacitocinn % Tse Gee Virus Bacteristago N zo | 238 243 258 99 1108 Dactesfogo T2 zee] en) Ge || Herpes simples 138 377 356 18 1.06 036 M.Bactérias achericia col zo [| ea | se [104 [100 Micrococcus tysodeiticus 144 373 346 107 038 Ramibacterium ramosum 351 149 152 1100 232 ‘ Euceriotos Saccharomyces cerevisiae 37 183 174 326 1.00 10 Zea mays (lho) 256 245 246 253 1,00 1104 Drosophila melanogaster 307 136 zoz 2338 1.01 131 Homo sapiens (ser humano) 302 198 196 303 101 133 202 Fundamentos de Genética '& GUM 3.9 Fotogratia do padréo de difragbo de raios X obtido com DDNA.O padro cruciforme central indica cue 2 molécuia de DNA tem estruturahelicoidal, eas bandas escuas nas partes superior e inferior indicam que as bases esto empithadas perpendicuarmente ao eixo 3',com itura a esquerda para a arena, ual ea sequenciaruceotcica do flamento de DNA complementar nessa regio do gene HA? ‘Qualéapolridade quimica do lament complementar? Qual 0 comprimentodesse segmento do gene HBB quando pesen- teem uma clu como DNA biflamentar? Quantas moléclas 14:2 deaoviboc eter nese segmente de DMA? Quantas moléuls de primidinaexstem nese sepmento do gene HE? > Leia aresposta do problema nosite ttp:1/gen-io.grupogen.com.br. «as moléculas de DNA presentes nos protoplasmas aque- sos clas célullas vivas. O modelo espacial mostra também ‘que 08 dois aulcos de uma dupla héliee de DNA niio aio idénticos; um deles, 0 sulco maior, € muito mais largo que 0 outro, 0 sulco menor. A diferenca entre o sulco maior ¢ ¢ sulea menor & importante quando se examic nam as interacées entre DNA e proteinas reguladoras da cexpressdo génica, Alguimas proteinas ligamse ao sulco maior; outras, ao sulco menor, Leia Resolva! Cite algu- ‘mas caracteristicas importantes do DNA bifilamentar e avalie a compreensio da estrutura do DNA, responden- do as perguntas. ESTRUTURA DO DNA; FORMAS ALTERNATIVAS DA DUPLA HELICE A estrutura de dupla hel chamada 8-DNA. BDNA é a conformacio adquirida pelo DNA em condicdes fisioligicas (em solucdes aquosas contendo baixa concentracio de sais). A grande maioria «as moléculas de DNA presentes no protoplasma aquoso «lay células vivas existe ma conformacio B. © DNA, po- rém, nao é uma molécula estatica e invariavel. Ao contré- rio, as moléculas de DNA apresentam grande flexibilida- de de conformagio. AAs estruturas das moléculas de DNA variam em fun- io do ambiente, A conformacao exata de determinada molécula ou segmento de molécula de DNA depende da natureza das moléculas com as quais esta interagindo. Wa verdatle, o BDNA inuacelutar parece tes, en media, 10,4 pares de nucleotidios por volta, e ndo exatamente 10 como mostra a Figura 9.10. Em alias concentragoes de sais ou em estado de desidratacio parcial, o DNA existe na forma de ADNA, que é uma hélice dextrégira, como ‘© BDA, mas com II pares de nucleotidios por volta (Tabela 9.3). O ADNA € uma hélice dupla mais espessa € -¢ de Watson ¢ Crick descrita € Formas alternativas de DNA. Forma da | Direcéo da | Paresde bases Diémetro da hice hice porvolta hice A Dextrégira | 11 23.nm B Dextrégira_| 10 ign z Levogie | 12 3enm mais curta com didmetro de 2,9 nm, E quase certo que as moléculas de DNA nunca existem como A-DNA in vivo. No entanto, a conformacao A-DNA ¢ importante porque heterodaplex DNA-RNA (hélices duplas constituidas de filamento de DNA cujas bases formam pares com um fi- Jameuty de RNA cumpleincuta:) vu déplea RNA-RNA cexistem em estrutura muito semelhante in vivn, ‘Algumas sequéncias de DNA existem em uma forma hhelicoidal dupla levigira denominada 7-DNA (Z por cave sa do zigue-zague dos arcabougos de acticarfosfato da es trutura). © Z-DNA fol descoberto por andlise de difracao de raios X de cristais formados por oligémeros de DNA. contendo pares de bases G:C e C:G alternados. O Z-DNA ‘at presente cm hélices duplas que aio ricas em O:C e ‘contém residuos purinas ¢ pirimidinas alternados. Além da estrutura helicoidal levégira exclusiva, o Z-DNA (Ta- Ihela 9 8) diflore das conformagies Ae R por ter 19 pares de bases por volta, um didmetro de 1,8 nm ¢ um tinico sulco profundo. A fung4o do Z-DNA em cétulas vvas ain- dando esta clara. ESTRUTURA DO DNA | SUPER-HELICES NEGATIVAS IN VIVO ‘Todas as moléculas de DNA ativas em células vivas apre- sentam outro nivel muito importante de organizacdo a superchélice. As super-hélices sao introduzidas em uma ‘molécala de DNA quando ha clivagem de um de scus filamentos, ou ambos, e quando os filamentos comple- ‘mentares em uma extremidade sio rodados ou torcidos a0 redor um do ontro, enquanto a outra extremidade € mantida fixa e, portanto, nao gira. Essa superhelicoi- dizacao causa 0 colapso de uma molécula de DNA em estrutura muito espiralada, semelhante a um fio de tele- fone em espiral oua um anel eldstico torcido (Figura 9.13, ‘embaixo, & dircita). As superhélices slo introdusidas ¢ removidas das moléculas de DNA por enzimas que tém Papéis essenciais na replicagio do DNA (Capitulo 10) ‘em outros processos. ‘A superhelicoidizacéo ocorre apenas em moléculas de DINA com extremidades fixas, que mao giram livre mente. E claro que as extremidades das moléculas cir culares de DNA (Figura 9.13) presentes na maioria dos cromossomos procaristicos e nos cromossomos de orga nelas eucariticas, como as mitocOndrias, sio fixas. As grandes moléculas lineares de DNA presentes em cro- ‘mossomos eucariéticos também sio fixadas por ligacées Capitulo 9 | DNA ea Estrutura Molecular dos Cromossomos 205 Own 1 FIGURA 9.13 Comparacdo entre as estruturas relaxadas e negative mente cuperespiraladas de DNA A estruturaenlaxada & B-DNA com “1044 pares de bases por volta da hélice. A estrutura negativamente -zuperezpialada surge quando hi cubenrolamento do 8 ONA, com ‘menos de uma volta da hélice para cada 10,4 pares de bases, espagadas € nas extremidades aos componentes nao DNA dos cromoziomos. Esvas ligagdes poibilitam que enzimas introduzam super-hélices nas moléculas linea- res de DNA presentes em cromossomos eucaridticos, da mesma maneira que sao incorporadas as moléculas cit culares de DNA presentes na maioria dos cromossomos procaridticos. Talver seja mais fécil visualizar a superhelicoidizacio analisando uma molécula circular de DNA. Se clivarmos um filamento de uma dupla hélice de DNA circular, fe- chada por ligacdo covalente, e girarmos 360° (uma volta completa) uma extremidade do filamento clivado em tomo do filamento complementar. enquanto mantemos fixa a outra extremidade, introduziremos uma super-hé- live ua molécula (Figura 9.14). Se giratmos a exuemidade livre na mesma direcio em que é girada a dupla hélice de DNA (para a direita), seré produzida uma superhélice (DNA superespiralado) positiva. Se girarmos a extremi- dade livre na direcio oposta (para a esquerda), sera pro- ‘duzida uma super-hélice (DNA superespiralado) negati- va. Embora essa seja a maneira mais simples de definir a superhelicoidizacio no DNA, nio é o mecanismo de produgdv das superhélices uv DNA in uiua Esse meca- nismo € discutido no Capftulo 10. ‘As moléculas de DNA de quase todos os organismos, detde os menores virus até os maiores eucariotos, apre ‘sentam super-helicidizagio negativa in vivo, e muitas funcdes ioldgicas dos cromossomos 6 podem ser realizadas quando as moléculas de DNA participantes tém super-he- licoidizacao negativa. (O DNA de alguns virus que infec- tau arqueubacitrias vein superceticuidizayay positive.) Ha muitos dados indicativos de que a superhelicoidiza- io negativa participa da replicacdo (Capitulo 10), re- combinacio, expressio géniea e regulagio da expresso .génica. Existem graus semelhantes de superhelicoidiza- Gio negativa nas moléculas de DNA presentes em cro- ‘mossomos bacterianos e eucariéticos. 206 Fundamentos de Genética Exeonéade Cort etaratr Sacmue | Scouser via roto espa carte de Teste jum filamento ligacao ‘Undo das cite dun ee cans ie rotacao de 360° naa PMA earn naira sonia ena cra eto Superttice negli de DNA, ‘echada por igacao covalente 1m FIGURA 9.14 Defiicdo visual de DNA superespiralado negativamente, Embora a estrutura das super-hélices de DNA sea lustrada com mais clareza pelo mecanismo mastrado aqui, 0 métada de sua producéo in viva 6 diferente (ver Captula 10) PONTOS ESSENCIAIS ODNA geralmente€ uma tupla helice, com os dots fllamentos unides por igacoes de hidro- ‘ginio entre as bases complementares: pareamento de adenina com timina e de guanina com itosina + Essa complementaridade dos dois flamentos de uma dupla héice toma o DNA exeepeional- ‘mente adequado ara armazenar e transmit informacies genéticas + Os dois flamentas de uma duplahélice de DNA tém polaridades quimicas opastas + ORNA geratinente é wma molécula unifilamentar que contin uracila om vex de timina + As moléculas de DNA funcioncis nas clulas apresentam superhelicoidizagdo negativa Estrutura do cromossomo em procariotos e virus As moléculas de DNA de procariotos e virus séo orga- nizadas em dominios com super-helicoidizacdo negativa. Grande parte das informagGes sobre a estrutura do DNA foi obtida pelo estudo de procariontes, principalmente porque sio menos complexos, tanto do ponto de vista genético quanto bioquimico, que 0s eucariotos. Os pro- cariotos so monoploides (mono~ um); 56 tém um con- junto de genes (uma cépia do genoma). (Nao se deve ‘confundir “monoploide” com “haploide,” que se refere especificamente ao niimero de cromossomos redhidos nos gametas.) Na maiotia dos virus e procariotos, 0 con- Jjunto tinico de genes ¢ armazenado em um s6 cromosso- ‘mo que, por sua vez, contém uma s6 molécula de acido nuucleico (RNA ou DNA). ‘Os menores virus de RNA conhecidos tém apenas trés genes, € sio conhecidas as sequéncias de nucleotidios completas dos genomas de muitos virus. Por exemplo, a ‘molécula tinica de RNA no genoma do bacteriéfago MS2 €constitufda de 3.569 nucleotidios e contém 4 genes. Os menores virus de DINA conliecidos tem apemas 94 11 ge- nes. Mais uma vez, as sequéncias completas de nucleott dios so conhecidas em varios casos. Por exemplo, o ge- noma do bacteriéfago ®X174 é uma molécula de DNA com 5.386 nucleotidios de comprimento que contém 1 genes. Os maiores virus de DNA, como o bacteriétiago T2 € os poxvirus animais. contém cerca de 150 genes. Bactérias como a E, coli tem 2.500 a 3.500 genes, a maio- ria em uma tinica molécula de DNA. No passado, cromossomos procariéticos eram fre- quentemente denominados *moléculas nuas de DNA”, proteinas associadas e morfologia complexa. Essa ideia cerrada surgiu em parte porque (1) as imagens publicadas de “cromossomos” procaristicos eram, em sua maioria, tmlerografian clerOess de maldculasde.DNA leclaciny nao de cromossomos metabolicamente auivos ou tuncio- nais, e (2) a maioria das fotografias publicadas de cro- ‘mossomos eucariéticos era de cromossomos meidticos ‘ou mitéticos altamente condensados — mais uma vez, cestados cromoss6micos metabolicamente inativos. Ago- ra se sabe que 05 cromossomos procaristicos ativos, ou nucleoides (nucleoides, em vez de nticleos, porque no sio envolvidos por membrana nuclear), tém pouca seme- thanca com as moléculas isoladas de DNA viral e bacteria- no observadas em micrografias eletrénicas, assim como ‘05 cromossomos em intérfase metabolicamente ativos de ‘euvarivwws teu puta seimettianya ‘mosomos na metifie mitiea ou meiSica, perimetro total da molécula circular de DNA pre- sente no cromossomo da bactéria Exchchia coli é de aproximadamente 1.500 pm. Como o didmetro de uma ccélula de K: coli € de apenas 1 a2 wm, preciso que a grande molécula de DNA presente em cada hactéria fuldgica coun Go PAN Toe (a) Cromossomo (6) Cromossomo dobrado, na Circular, néo dobrado_verdade, com 40.250 akas (0) Cromossomo brado superhelicidal Capitulo 9 | DNAea Estrutura Molecular dos Cromossomos 207 (@ Cromossomo parciaimente desespiraiado DNA cortado (@)Cromossome parciamente desespralado —covtado 1 FIGURA 9.15 Diagrama da estrutura do estado ativo do cromassomo de E. cll esteja altamente condensada (dobrada ou espiralada). Quando cromossomos de E. colisio isolados por procedi- enitos cuidadiosos sem empiegy de devergentes iOuicos (usados com frequéncia para lise das células) e mantidos na presenca de alta concentracao de cétions como polia- minas (pequenas proteinas basicas ou de carga positiva) ‘ou sal 1M para neutralizar os grupos fosfato de carga ne- gativa do DNA, os cromossomos se mantém altamente condensados. com tamanho comparavel ao do nucleoide in viva. Essa estrutura, 0 genoma dobrado, € 0 estado ativo de um cromossomo bacteriano. Embora menores, 03 cro" mossomos intracelulares ativos de virus bacterianos so muito semelhantes aos genomas de bactérias. No genoma dobrado, a grande molécula de DNA em, um cromossomo de E.coli é onganizada em 50 a 100 do- PONTOS ESSENCIAIS ‘ménios ov alcas, todos com superhelicoidizacéo negativa independente (Figura9.15). Tanto RNA quanto as protef- nas Siv conmpouciiics do genonra dobrado, que pode set parcialmente relaxado pelo tratamento com desoxirri- ‘bonuclease (DNase) ou ribonuclease (RNase). Como a superhelicoidizagio de cada dominio do cromossomo € independente, a introdugao de “cortes” unifilamenta- res no DNA por tratamento dos cromossomos com uma DNase que cliva o DNA em sitios internos s6 relaxa o DNA nos dominios cortados, e todas as aleas nao cortadas per manecem superhelicoidais. A destruicio dos conectores de RNA pela RNase desdobra parcialmente o genoma do- brado, pois elimina a organizacao da molécula de DNA em 50 a 100 algas. No entanto, 0 tratamento com RNase nao afetaa superhelicoidizacio dos dominios do cromossomo. + As moléculas de DNA nos cromossomos de procariots ¢ virus sao organizadas em dominios com super helicoidizagio negation (0s eromossomas bacteranas contim moléculas circulars de DNA divididas em aproximada- smente 50 dominios. Estrutura do cromossomo em eucariotos Os cromossomos eucariéticos contém enormes molécu- las de DNA altamente condensadas durante 2 mitose e a meiose. Os centiOmeros € telOrneros de cromossornos eucariéticos tém estruturas exclusivas. Us genomas eucarioticos tem nivers de complexida- de nao encontrados em procariotos. Ao contrario dos procariotos, a maioria dos eucariotos é diploide, com dois conjuntos completos de genes, um de cada geni- tor. Como discutimos no Capitulo 6, alguns vegetais angiospermas sao poliploides, ou seja, tém varias cé- pias do genoma. Embora os cucariotos tenham ape- nas 2 a 15 vezes mais genes que a E. coli, a quantidade de DNA € ordens de magnitude maior. Além disso, grande parte desse DNA nao contém genes, pelo me- 208 fundamentos de Genética nos nio genes codificadores de protefnas ou moléeu- las de RNA. ‘A maioria dos eucariotos nao so contém muitas vezes a quantidade de DNA existente em procariotos. como esse DNA também esté empacotado em varios cromos- suulus, € Laila CLUIUSSUID Eola preseiite eis Uuas LOpias (diploides) ou mais (poliploides). Lembre-se de que 0 cromossomo de E. coli tem perimetro total de 1.500 ym, ou cerea de 1,5 mm. Agora considere que 0 complemen. to cromossémico haploide, ou genoma, de um ser hue ‘mano contem cerca de 1,000 mm de DNA (ou cerca de 2.000 mm por célula diploide). Além disso, esse metro de DNA é subdividido entre 23 cromossomos de tama- mhos ¢ formatos variéveis, ¢ cada cromossomo contém 15a 85 mm de DNA. No pasado, os geneticistas tinham poucas informacées sobre a organizacao desse DNA nos cromonssamne Os prcariatns tim rma moléenla de TNA or cromossomo ou muitas? Caso sejam muitas, como organizacao das moléculas em relagao umas as outras? ‘Como 0s 85 mm (85.000 jum) de DNA no maior cromos- somo humano séo condensados em uma estrutura da metifase mitética com cerea de 0,5 um de difmetro 10 um de comprimento? Quais so as estruturas dos cro- ‘mossomos interfisicos metabolicamente atives? As res- pottas de algumas deseas questdes sin apresentadas nas préximas secdes. COMPOSIGAO QUIMICA DE CROMOSSOMOS EUCARIOTICOS Os cromossomos interfisicos geralmente no sio visi veis a microscopia dptica. No entanto, a andlise quimica, a microscopia eletrénica e os estudos de difracio com raios X da eromatinaisolada (o complexo de DNA. protei- nas cromoss6micas € outros constituintes cromossémicos isolados dos nticleos) proporcionaram informagSes titeis sobre a estrutura dos cromossomos eucaristicos. ‘Quando a cromatina ¢ isolada dos nticleos interfési- cos, nao & possivel reconhecer os cromossomos indivi- dais. Em vez disso, observa-se um agiomerado irregular de nucteoprotefna. A andlise qutmica da cromatina iso- ada mostra que é constituida principalmente de DNA e proteinas com menor quantidade de RNA. (Figura 9.16). As proteinas so de duas classes prineipais: (1) proteinas basicas (carga positiva em pH neutro) denominadas his- tonas ¢ (2) um grupo heterogéneo de proteinas, em sua maioria acidas (carga negativa em pH nentro). coletiva- ‘mente denominadas proteinas cromossBmicas no histénicas. AAs histonas desempentam um papel estrutural im portante na cromatina, Esto presentes na cromatina de todos os eucariotos em quantidade equivalente a quanti- dade de DNA. Essa relagio sugere uma interagio entre as histonas ¢ o DNA que é conservada em eucariotos. As hhistonas de todos os vegetais e animais constam de cinco lasses de protefnas. Esses cinco principais tipos de his- tonas, denominados HI, H2a, H2b, H3 e H4, estio pre- Seles el quase tudlus Us lipus Celulates. Existens aligue ‘mas excecées, sobretudo em alguns gametas masculinos, / Corsttnes ( racket 89 cromaticns Wass® | FICURA 9.16 Composigdo quimica da cromatina em funcéo do ‘contedde nucler total. 0 conteddo de DNA e histone da cromatina €relativamente constante, mas a quantidade de proteinas ndo histo nicas presentes depence do procedimento usado para solar a croma- tina (seta tracejada). nas quais as histonas sio substitufdas por outra classe de protefnas basicas pequenas denominadas protaminas. ‘Ox cinco tipos de histona estio precentes em propor ‘ces molares de aproximadamente 1 HI:2 H2a:2 H2b:2 H3:Z 14. Quatro dos cinco tipos tormam complexos es- ppecificos com o DNA e produzem as subunidades estru- turais bisicas da cromatina, contas elipsoides pequenas (aproximadamente 11 nm de diémetro por 6,5 nm de altura) chamadas nucleossomes. As histonas foram muito ‘conservadas durante a evolugao ~ quatro dos cinco tipos de histonas sio semelhantes em todos os eucariotos. A maioria dos 20 aminoscidos nas proteinas tem carga neutra, isto é, ndo tém carga em pH 7. Algumas espé- cies, porém, sio basicas € outras so acidas. As histonas sao basicas porque contém 20 a 30% de arginina ¢ lisina, dois aminoscidos de carga positiva (ver Figura 12.1). Os ‘grupos -NH,’ expostos de arginina e lisina possibilitam a aco das histonas como policitions. Os grupos laterais de ‘carga positiva nas histonas so importantes na interacio ‘com 0 DNA, que é polianiénico em razio dos grupos fos- fatos de carga negativa. A notavel constincia das histonas Ha, H2b, H3 e H4 ‘em todos os tipos celulares de um organismo ¢ até mes mo em espécies muito divergentes é compativel com a ideia de que so importantes na estrutura da cromatina (empacotamento do DNA) e tém participacio apenas inespecifiea na negulacin da expression ga to, como seré analisado adiante, modificacées quimicas das historas podem alterar a estrutura do cromossome, ‘que, por sua vez, pode aumentar ou diminuir o nivel de expresso de genes localizados na cromatina modificada. ‘Jia fragio de protefnas nio hioténieas da cromatina € constituida de um grande mimero de proteinas hete- Noentan- rogéneas. Além disso, a comporigio da fragio de protes nas cromossémicas nio histénicas varia muito entre os diferentes tipos celulares do mesmo organismo. Assim, provavelmente as proteinas cromossémicas nao histor cas no tém papéis decisivos no empacotamento de DNA, ‘nos cromossomos. Em vez disso, € provavel que sejam candidatas a papéis na regulacio da expressio de genes ‘ou conjuntos de genes especificos, UMA GRANDE MOLECULA DE DNA POR CROMOSSOMO ‘Um cromossomo eucaristico tipico contém 1 a 20 cm (10'a2 x 10° um) de DNA. Durante a metifase da meio- se € mitose, esse DNA é empacotado em um cromossomo {que tem apenas | a 10 um de comprimento. Como todo esse DNA é condensado nos cromossomos compactos Presentes durante a mitote e a meiose? As muitas molé- culas de DNA seguem paralelas por todo 0 cromessomo =o modelo multinemico ou “multifilamentar” — ou ha ape- nas uma dupla hélice de DNA que se estende de uma ex- tremidade & outra do cromossomo ~ 0 modelo uninémico vu uniflawenta? (Observe yue, esse Last, “flasnento™ referee a dupla hélice de DNA, nao as cadeias polinu- cleotidicas individuais de DNA.) ‘Arualmente ha dados consideraveis indicativos de que ‘cada cromossomo contém uma tinica molécula gigante de DNA que se estende de uma extremidade outra do cromossomo passando pelo centrémero. No entanto, como discutimos na secio anterior, essa molécula de DNA gigante esté allamente condensada (espitalada © dobrada) no cromossomo. TRES NIVEIS DE EMPACOTAMENTO DO DNA EM CROMOSSOMOS EUCARIOTICOS 0 maior cromossomo do genoma humane contém cerca de 85 mm (85.000 um ou 8,5 X 107 nm) de DNA, que se acredita ser uma molecula gigante. De alguna maneira, essa molécula de DNA € empaco- tada em uma estrutura metafisica com diémetro aproximado de 0,5 jum ¢ comprimento aproxima- do de 10 jum—uma condensacao de quase 10! vezes entre o comprimento da molécula de DNA desnu- do © © cromosiomo metafisico, Como ocorre essa condensacao? Que componentes dos cromossomos participa dos processos de empacotamento? Kxiste jum método universal de empacotamento? Existem diferentes niveis de empacotamento? E. claro que os auImUSSUMIUS MHEIGLLUS € WGLILUS S20 mule sais condensados que os cromossomos interfisicos. Que B ‘outros niveis de condensacéo ocorrem nessas estru- turas especiais destinadas a garantir a correta segre- gacdo do material genético durante as divisdes celu- ares? O empacotamento das sequéncias de DNA de genes que estio sendo expressos € diferente do em Capitulo 9 | DNA ea Estrutura Molecular dos Cromossomos 209 pacotamento de genes que nao extio sendo expretsos? ‘Vamos investigar alguns dados que estabelecem a existén- cia de trés niveis diferentes de empacotamento de DNA (O exame ao microscépio eletrénico da cromatina iso- Jada de Células eu intésfave musta que € woustiuuida de uma série de contas elipsoides (cerca de 11 nm de dié- metro e 6,5 nm de comprimento) unidas por filamentos finos (Figura 9.17A). Outros dados sobre o empacotamen- to periddico e regular de DNA vieram de estudos sobre a digestao da cromatina por varias nucleases. A digesta parcial de cromatina por essas nucleases produziu frag- mentos de DNA em uma série de tamanhos variados que cram miiltiplos inteiros do menor fragmento. Esscs resultados sio bem explicados se a cromatina tiver uma estrutura com repeticdes, supostamente as contas obser- varias por microsenpia elatefinica (Figura 7A), dentrn das quais o DNA é empacotado em uma forma resistente A muclease (Figura 9.178). Essa “conta” ou subunidade de cromatina é denominada nudeossome. De acordo com 0 conceito atual de estrutura da cromatina, os ligadores, ou filamentos de DNA entre 0 nucleossomos de DNA, so suscetiveis ao ataque da nuclease. [Apés digestao parcial do DNA na cromatina por uma endonuclease (enzima que eliva o TNA internamente), © DNA com comprimento aproximado de 200 pares de nnucleotfdios € associado a cada nucleossomo (produzido por clivagem de cada regido ligadora). Depois da ampla digestio por nuclease, resta em cada nucleossomo um segmento de DNA com 146 pares de nucleotidios de comprimento. Essa estrutura resistente a nuclease é de- nominada ceme do nucleessomo. A estrutura ~ praticamen- te invaridvel em eucariotos - é constituida de um trecho de DNA com 146 pares de nucleotidios e de duas molé- uls de Gaile histone Ha, H2L, H9 © FH, As lusts protegem o segmento de DNA no centro do nmucleosso- mo contra a clivagem por endonucleases. Estudos fisicos pam Centra do nciossom, NA ear, exp 16 pares de nutes compimerto varie aA erie om ae Rat id por Teva em toro de de miceotsos um octémero de histonas 1m FIGURA 9.17 Micrografia eletrBnica (A) e lustragSo ern baa resolucéo (6) da subestrutura de contas em um cordao dos nucleossomos na co- ‘matina isolada de ndcleos em intérfase. In vivo, os DNA ligadores prove velmente estio entrelacades com 0 nucleossomos, formando uma fibra condensada de 11 nm. 210 Fundamentos de Genética (difragio por raios X e anilises semethantes) de cristais do centro do nucleossomo mostraram que o DNA é en- rolado como 1,65 volta de uma superhelice ao redor da parte externa de um octimero de histonas (Figura 9.18A). ‘A subunidade de cromatina completa é composta de we du sutleusuiny, DNA ligadur © proteinas uo mossémicas nao histénicas associadas, todos estabiliza- os pela ligagao de uma molécula de histona H1 a parte externa da estrutura (Figura 9.188). O tamanho do DNA ligador varia de acordo com a espécie e com 0 tipo celu- lar. Ha relatos de ligadores curtos, com apenas oxto pares de nucleotidios. e longos, com até 114 pares de nucleo- tidios. Os dados sugerem que 0 nucleossomo completo (a0 contratio do ccrne do nuclcossomo) contém duas voltas completas de super-hélice do DNA (um trecho de DNA com 166 pares de nucleotidios de comprimento) na euperfirie da actimenn de histanae » a estahilizagin dessa estrutura pela ligacio de uma molécula de histona HU (Figura 9.18B), Core do nucleossomo Octamero de histonas 2 Has 2HOb + 2H3+ 244 | 146* par de nucleotidios Cauda de fistona satentes 15par denucleetidos ety A — unm 'Nucloossomo completo Octamero — ehistonas “Srastora HI DNA com comprimento de B 166 pares de rucleotisios 1 FicuRA 9.18 tistracties da extra total eo (A) evene de mielens- somo edo (8) nuceossomo completo. © ceme do nuceossomo con- ‘tém 146 pares de nuceotidios enrolades em 7,65 volta de DNA em super-hélce negativa emi tomo de um octamero de histonas — duas ‘molécias de cada histona: H2a, H2b, H3 € H4, O nucleossorno com- pleto tem 166 pares de nucleotiias que forma quase duas voltas Leia aresposta doproblemano site /tp://gen-io.grupogen.com.br. 2n Capitulo | DNA ea fstrutua Molecular ds Cromossomos Fibra de ‘cromatina & de30nm 100mm I FIGURA 920 Micrografiaeletrnica de um cromossomo metafésico humane mastrando a presenga de fibras de cromatina de 30 nm. O= dados disponives indicam que cada cromatide tem uma fibra grande de 30.am, altamence espiralada ou éobrada, 6 solenoide (Figura 821€) € o zigue-rague (Figura 9.210). In-vivo, ha clara interacio entre os nucleossomos para condensar 0s nucleossomos de 11 nm em fibras de cro- matina de 30 nm. Ainda nio se sabe ao certo se a ester tura é solenoide, ziguezague ou ambas, dependendo das condicdes. O que € certo & que a estrutura da cromatina iio é estitiea; a cromatina pode se expandir & contr em resposta a modificacdes quimicas da histona Hl e as caudas ca histona que se salientam los nucleossomos. ‘Os cromossomos metafisicos sio os mais condensados dos cromosomos eucariéticos normais. Sem diivida, 0 papel dees cromosomos altamente condensados & or ganizar € empacotar as moléculas de DNA gigantes dos Cromossomos eucaristicos em estruturas que facilitem a segregacio entre os niicleos das célulasfilhas sem que haja entrelacamento das moléculas de DNA de diferentes Cromossomos € consequente quebra durante a separacao dos cromossomios na anfase. Conforme observamos nia seco anterior, a unidade estrutural bisica do cromosso- ‘mo metafisico é a fibra de eromatina de 30 nm. Mas como essa fibras de 30 nm condensam-se ainda mais na estrutu- ra observada nia metatase? Infelizmente, até agora nao hit resposta clara para essa pergunta. Ha evidéncias de que a 212 Fundamentos de Genética Modelo solenoid Expandica Contrada D Modelo ziguezague noua 92) Miuugefta eens (A) e niuugratas uiveleLOnis (8) Ue fbi Ue Uutnting Ue SO rn er UUIRASUIILD EuLaELLLs ‘Aestrutura das fibres de cromatina de 30 nm parece variar de acordo com os procedimentos usados para isola €fotograté-as.(C) De acor- do com um modelo popular, fibra de 30 nm € produzida par helicidizagdo da fibre do nucieossoma de 11 nm em uma estruturasolenoide ‘om sels nucleossomos por volta, (D) No entanto, quando observada apés criopreservagdo (congelamento répide) sem fixagdo, a cromatina cexigeestrutura ern zigue-zague cuja densidade — expancida versus contraida — varia com a fora ini e com as modificagbes quimicas das smoléculat de hietona. estrutura total dos cromossomos metafésicos nao depende de histonas. Micrografias eletrdnicas de cromossomos me- {affisicns ignladas enjas histonas foram remowidas mostram ‘um esqueleto, ou cere central, circundado por um enor ‘me pool ou Nialo de DINA (Figura v.22). Esse esqueleto cro- moss6mico é constituido de proteinas cromossémicas no hhistonicas. Observe a auséncia de extremidades aparentes de moléculas de DNA na micrografia da Figura 9.22; esse achado respalda, mais uma vez, 0 conceito de uma molé- cla de DNA gigante por cromossomo. Rim resumn, ein neceeséring pala manne trBe nfunie de ‘condensacao para empacotar os 10° a 10° um de DNA em ‘um cromossomo eucariético em uma estrutura metafis- cacom alguns micra de comprimento (Figura 9.23). 1. O primeiro nivel de condensacio é o empacotamento do DNA em superhélice negativa nos nucleossomos, produaindo uma fibra de cromatina interfisiea com 11 nm de diémetro, Evidentemente, hi participacao de um octamero de moléculas de histona, duas de cada: H2a, H2b, H3 e HA. 2. O segundo nivel de condensacio é o dobramento ou superhetivvidizayau adicioual da ftbra do sucteusso- mo de 11 nm, que produz.a fibra de cromatina de 30 nom. A histona Hl participa dessa super-helicoidizacao, da fibra do nucleossomo de 11 nm para produzir a fibra de cromatina de 30 nm. 3. Por fim, as protefnas cromossomicas no hist6nicas formam um esqueleto que participa da condensacio da fibra de cromatina de 30 nm em. cromossomos metafisicos densamente empacotados. Esse terceiro nivel de condensacao parece incluir a separacio de segmentos das moléculas gigantes de DNA presentes em cromossomos eucarioticos em dominios ow aicas com superhelicoidizacao independent. O mecanismo desse terceiro nivel de condensacio € desconhecido. CENTROMEROS E TELOMEROS Conforme fol comentady no Gapfulo 2, os dols cre mossomos homélogos (cada um deles contendo duas cromatides-irmas) de cada par separam-se em polos ‘opostos do fuso meistico durante a andfase I da meiose. Da mesma maneira, durante a andfase II da meiose ea anéfase tinica da mitose, as cromatidesirmas de cada ‘cromossoma segnem para palat apastas da fia ¢ tor. ‘nam-se cromossomos das célulasfillias. Esses movimen- tos na anafase dependem da ligacio de microtibulos do fuso a regides especificas dos cromossomos, 08 centré- meros. Como todos os centrémeros tém a mesma fun- Siu bésiva, € ualutal que ue ventioucius de diferentes cromossomos de uma espécie contenham componentes cestruturais semelhantes. (© centrémero de um cromossomo em metifase ge- ralmente pode ser reconhecido como uma regiio cons- tringida (Figura 9.20). Na verdade, a producao de dois centrémeros ativos & uma etapa essencial na transicio da Capitulo 9 | DNAea Estrutura Molecular dos Cromossomos 213 CGreunda um “esqueleto" central constituldo de proteinas cromassémicas nao histOnicas. Observe que o esqueleto tem aproximadamente o ‘mesmo formato do cromossomo metafésico antes da retirada das histonas. Observe também a ausencia de extreridades das moléculas de DNA no hale de DMA que crcunda © exquoleto, Cromossomo metefsico / B FICURA 325 lustragdo mostrando os diferentes niveis do ernpacotamento de DNA nos cromossomos. Primeiro, a molécula dé ONA de 2 im € condensada em nucleossomos de 11 nm, que sZo ainda mais condensados em fibras de cromatina de 30 nm, Em seguida, as fibras de 30 nm sdo segregadas em dominios ou alas super-helicoidas por meio da igagdo 20s esqueetos do cromossomo constituidos de proteins ‘cromossBmicas nao histnicas. 214 Fundamentos de Genética ‘metéfase para a anéfase, ¢ tem de haver um centrmero ativo em cada cromossomo da célulafilha para evitar os efeitos danosos da nao disjuncao. Os fragments cromos- sOmicos acéntricos geralmente so perdidos durante as divides mit6tica e meistica. ‘As estrututas dus LeuuGuieres eur vegeuais © aus multicelulares variam muito de uma espécie para ou- tra. A tinica caracteristica em comum é a presenca de sequéncias de DNA especificas que sio repetidas mui- tas veres, frequentemente em longas séries. Outras se- quenaias de DNA sao encontradas muttas vezes inseridas nessas séries. Cada centrémero de cromossomos hu- ‘manos, por exemplo, contém 5.000 a 15.000 c6pias de ‘uma scquéncia com 171 pares de bases denominada sc- quéncia satélite alfa (3s vezes “alfoide”) (Figura 9.24). As sequéncias satélites formam bandas “satélites® distintas durante a contrifugagia om gradionte de densidade (ver Capitulo 10). Huntington Willard e colaboradores mos- traram que um segmento de 450.000 pares de bases do centrémero do cromossomo X humano € suficiente para a funcio do centrémero. Esse segmento é constituido principalmente de sequéncias satélites alfa, mas eontém sitios de ligacao da proteina centromérica (CENP) inter postos, denominados boxes CENP-B. Os dois componen- tes sin essenciais para a fincia da centréimera, Ha varias décadas se sabe que 0s tel6meros (do grego, telos © meros, que significam “extremidade™ © “parte”, respectivamente), ou extremidades dos cromossomos eucariéticos, tém propriedades exclusivas. Hermann J. Muller, que cunhou o termo taldmoro em 1088, mostrou que 0s cromossomos de Drosophila sem extremidades na- turais ~ produzidos por quebra dos cromossomos com raios X - nao foram transmitidos a prole. Em um estu- do classico de cromossomos do milho, Barbara McClin- ek musuou que 4s uOvas ExtLEmidattes dus CLOUIUSSO- mos quebrados sao aderentes ¢ tendem a se fundir. Jé as extremidades naturais dos cromossomos normais (in- tegros) so estaveis € ndo exibem tendéncia de fusio a Sum | FICURA 9.24 A localzagao das sequéncias de DNA satélites alfa (amarelas) nos centrémeros de cromossomos hurnanos (yermelhos). Ver Apéndice C: Hibridizacao in stu. ‘outrat extremidades quebradas ou nativas. Os resultados de McClintock indicaram que os telémeros tém estrutu- ras especiais diferentes das extremidades produzicas por juebra dos cromossomos. + Oui tio parm oxigen tele ten etre turras exclusivas € que 0s mecanisimos conhecidos de re- \¢ao de moléculas lineares de DNA nao possibilitam a duplicacao de ambos os filamentos de DNA nas extre- midades das moléculas (Capitulo 10). Portanto, os teld meros tém obrigatoriamente estruturas especificas que facilitam sua replicacdo, ou é preciso que haja alguma fenrima especial cle replicacan que resolva esse enigma Qualquer que seja a estrutura, os telémeros desempe- nham no minimo wés funcbes importantes. Eles tém de (1) impedir que desoxirribonucleases decomponham as cextremidades das moléculas lineares de DNA, (2) impe- dir 2 fusio das extremidades com outras moléculas de DNA € (3) facilitara replicacio das extremidades das mo- léculas lineares de DNA sem perda de material. (Os telémeros de cromossomos eucaristicos tém estrutu- ras exclusivas que incluem sequéncias nucleotidicas curtas presentes como repeticoes em série. Embora as sequencias variem um pouco em diferentes espécies. a unidade de repeti¢ao basica tem o padrao 5’ T, A, ,G, .3" em qua- se tutlas as copérics. Po: caciply, « seyuucia 1epetida ‘em seres humanos ¢ outros vertebrados é TTAGGG, a do protozorio Tetrahymena thermophila € TIGGGG, e a do vogetal Arabidopsis thaliana é TTTAGGG, Na maioria das cespécies, ha outras sequéncias de DNA repetitivas adja- ccentes aos telomeros denominadas sequéncias associadas atelémeros. Em vertebrados, a repetigdo TIAGGG ¢ altamente conservada; foi identificada em mais de 100 expécies, que incluem mamfferos, aves, répteis, anfibios e peixes. O miimero de c6pias dessa unidade de repeti¢ao basica em telémeros varia de uma espécie para outra, de um cro mossomo para outro na mesma espécie, e até no mesmo ‘cromossomo em diferentes tipos celulares. Em células so- rmaticas humanas narmais (no cancerosas), 08 teldmé ros geralmente contém 500 a 3.000 repeticdes TTAG encurtam aos poucos com a dade. Ja os telomeros de

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