Elementos Genéticos Transponiveis PANORAMA Milho | Uma cultura basica com heranga cultural ‘© mitho é um dos produtos agricolas mais importantes do mundo, ‘2 ceticultivn eemeqnishé.n minima, § N02 anne na América Con tral. Quando Cristévo Colombo chegou a0 Novo Mundo, o cul- tivo de milho jé hava se disseminado até 0 Canad, 20 norte, e @ Argentina, 20 sul. As populagées nativas da América do Norte e do Sul desenvolveram muitas variedades de milho adaptadas a condi- bes especicas. Els desenvolveram variedades que tinham graos Elernentos transponiveis | Consideragdes gerais » Elementos transponiveis em bactérias © Transpdsons de “cortar e colar” em eucarivtus » Retrovirus e retrotranspésons > Elementos transponiveis em seres humanos > Significado genético e evolutivo dos elementos transponiveis »» a )) ey » ay 4 a Lj ‘Variagdo de cor ern grdus de mh, Etudes sobre a base yerética essa variacdo levaram & descoberta dos elementos transponives pres de se declocar de uma posigSo para outa, Eeresclomontor transponives ~ ou transpdsons ~ constituem uma fragdo cons derével do genoma, No mitho, por exerplo,repesentam 85% de ‘todo 0 DNA. Ao 2e deslocarem de urs local para outro os elemen tos transpontveis podem causar a quebra de cromassomos ou a mutacdo de genes e, por iso, tim grande significado genético,476. Fundamentos de Genética Elementos transpontveis | Consideragées gerais Os elementos transponiveis ~ transpdsons ~ esto pre- sentes nos genomas de muitos tipos de organismos; eles sao diferentes dos pontos de vista estrutural e funcional. Muitos tipos diferentes de elementos transponiveis fo- ram identificados em uma variedade de organises, en- tre eles bactérias, fungos, protistas, vegetais ¢ animais, Esses elementos sao componentes proeminentes dos ge- nomas por exemplo, mais de 40% do genoma humano ~€ tém fungdes evidentes na estrutura dos cromossomos, ‘© ma modulagao da expresso dos genes. Neste capitulo, exploraremos a diversidade estrutural e comportamental de diferentes tipos de elementos transponiveis ¢ investi- guremos seu significado genéuco e evolutivo. Embora cada tipo de elemento transponivel tenha suas préprias caracteristicas especiais, a maioria é classi- ficada em trés categorias de acordo com 0 mecanismo de transposi¢éo (Tabela 17.1). Na primeira categoria, a ‘wansposigao ocorre por exciso de um elemento de sua ;poxicao no cromossomo, com insercio em ontra posicio, Os processos de excisio e insercio sio catalisados pela euzima Wansposase, yeralin elemento. Os geneticistas denominam esse mecanismo transposicdo de “coriar¢ colar” porque o elemento € fisica- ‘mente cortado de um local no cromoscomo colado em ‘outro, que pode estar até mesmo em outro cromossomo. Designaremos os elementos dessa categoria transpésons de “cortare cola’ Na segunda categoria, 0 processo de transposi¢ao ‘ovorre por replicagao do DNA do elemento transponivel. Uma transposase codificada pelo elemento medeia a in- codificada pele proprio teracdo entre 0 elemento e um possivel local de insergao. Durante essa interacao ocorre replicagao do elemento; ‘uma e6pia é inserida no novo local ¢ outra continua, no local original. Os geneticistas denominam esse meca- ihismo franspasicdo mpiicativa, porque ha ganho de uma c6pia do elemento, Designaremos os elementos dessa ca- tegoria transpésons rplicativos. ‘Na werceira categoria, 0 processo de transposicao ocor- re por insercao de c6pias de um elemento sintetizadas a partir do RNA do elemento. A enzima transcriptase re- versa usa © RNA do elemento como molde para sintetizar moléculas de DNA, que sio inseridas em novos locais no ‘cromossomo. Por inverter o sentido habitual de fluxo das informagder genéticas nas células — isto é, as informagies fluem do RNA para o DNA em vez de fluirem do DNA para 0 KNA -, esse mecanismo € denominado retroerans- pasicdo pelos geneticistas. Designaremos os elementos dessa categoria retrotrenspésons. Alguns dos elementos com exe lipy de tanspusigde estde relacionades con ‘um grupo especial de virus que usam transcriptase reve sa 05 retrovirus; por isso, sio conhecidos como elementos, somelhantes a retrovirus. Outros elementos com atividade de retrotransposicao sio denominados apenas retropésons. Encontraremos muitos elementos transponiveis dife- rentes neste capttula, cada um crm sna pripria histaria peculiar. A Tabela 17.1 classifica esses elementos de acor do com seus mecanismos de transposicdo. Os transpo- sons de “cortar € colar” estio presentes tanto em proca- riotos quanto em eucariotos. Os transpésons replicativos io encontrados apenas em procariotos, ¢ os retrotrans- pésons, apenas em eucariotos. Tabela 17.1 Classificagao de elementos transponiveis de acordo com ‘0 mecanismo de transposicao. Categeria Exemplos Organisma haspedeiro |. Transpésons de “cortar e colar”. Elementos IS (p. ex, 1550) Bactérias Transpésons compostos (p.ex,Th5) | Bactrias Elementos Ac/Ds Miho Elementos P Drosophila Elementos hobo | Drosophila gga Moripose Sleeping Beauty salmso Il Transpésonsrepicatives Elements Tn3 Bacteras Ii RetrtranspSzons ‘A Elementos semethantes aretovius (também denominados | Ty? Levedura repeticio terminal longa, ou LTR, retrotranspésons) cop Drosophila oy Drosophila 8B Retropésons ElementosF, Ge! Drosophila Retropésonsteloméricos Drosophila UNE (5.6% 07) Seres humane SINE (p.ex, Alu) Seres humanosCoptulo 17 | Elementos Genéticos ansponivels 477 PONTOS ESSENCIAIS + Otranspison de “cortar e colar” extsado de wma posi no genoma einseidoem outra por tuna ensima, a transpose, gratmente codificada plo priprio transposon + 0 transposition dept dra o ne da trapasice + Ontrotranspson produ moléculas de RNA quedo origem a moléclas de DNA por transericaa revere em siguida, esas molecu de DNA so mserdas em novas posroes no genoma. Elementos transponiveis em bactérias (Os transpésons bacterianos deslocam-se dentro dos cro- mossomos e plasmidios e entre eles. Embora 0s elementos transponiveis tenham sido ori- ginalmente descobertos em eucariotos, os transpésons Uauterianus forain ur prinieinus a ser estuladloy eu vel ‘molecular. Existem trés tipos principais: as sequéncias de inser¢io, ou elementos IS, 0s transpésons compostos € os elementos semelhantes a Tn3. Esses trés tipos de transpé- sons diferem em tamanho ¢ estrutura. Os elementos IS do os mais simples ¢ contém apenas genes codificadores de proteinas participantes da transposicio. Os transpé- sons compostos € os elementos semelhantes a Tn3 sio ‘mais complexos e contém alguns genes que codificam produtos nao relacionados com 0 processo de transpo- sigao. ELEMENTOS IS (Os transpésons bacterianos mais simples so as sequéncias de insergéo, ou elementos, assim denominados porque po- dem se inserir em muitos locais diferentes nos cromosso- mos ¢ plasmidios bacterianos. Os elementos IS foram de- tectados pela primeira vez em algumas mutagoes lac de Ecol, Essas mutacoes tinham a propriedade incomum de alta taxa de reversio ao tipo selvagem. Anélises mo- leculares revelaram que essas mutac6es instaveis tinham DNA extra nos genes fac ou perio deles. Quando 0 DNA, dos revertentes de tipo selvagem dessas mutacées foi comparado ao das préprias mutacdes, constatou-se que ‘© DNA extra havia se perdido. Assim, essas mutagdes ge neticamente instaveis foram causadas por sequéncias de DNA inseridas nos genes de E. coli, e a reversio 20 tipo selvagem foi cansada par excicia desas xequincias Se quéncias de insercéo semelhantes foram encontradas em muitas outras espécies de bactérias. s elementos IS tém organizacdo compacta. Em geral. sio constituidos de menos de 2.500 pares de nucleot live © cunléan apeuas gence cujus produtus pasticipau da promocio ou regulacao da transposicao. Muitos tipos diferentes de elementos IS foram identificados. © me- nor, ISI, tem 768 pares de nucleotidios. Cada tipo de ele- mento IS é delimitado por sequéncias curtas idénticas, ‘ou quase idénticas, em suas extremidades (Figura 17.1). ‘Como essas sequéncias terminais esto sempre invertidas em rela¢ao uma a outra, sio denominadas repeticées vertidas terminals. Seu comprimento varia de 9 a 40 pares de nucleotidios. As repeti¢des invertidas terminais si0 ea racteristicas da maioria dos tipos de transpésons. A mu- tacao dos nucleotichos nessas repeticoes geralmente taz com que o transpéson perca a capacidade de se deslocar. Portanto, essas mutaces demonstram que as repetic&es invertidas terminais t@m papel importante no processo de transposicio. (Os elementos IS geralmente codificam uma proteina, a trancporsee, necestiria para transposigio. A transposase liga-se as extremidades do elemento ou a um local pré- ximo € secciona os dols filamentos de DNA. Essa cliva- ‘gem excisa o elemento do cromossomo ou plasmidio, de modo que possa ser inserido em uma nova posicao na mesma molécula de DNA ou em outra moléeula. Portan- to, os elementos IS sao transpésons de “cortar € colar”. Quando se inserem nos cromossomos ou plasinidios, os elements IS cansam a duplicacio de parte da sequéncia de DNA no local da insercao. Ha uma c6pia da duplica- io de cada lado do elemento. Essas sequencias curtas (2 18 pares de nucleotidios), diretamente repetidas, co- nhecidas como duplicagées de stio-alvo, so produzidas por clivagem em extremidade protuberante da molécula de DNA bifilamentar (Figura 17.2). Um cromossomo bacteriano pode conter varias copias de um tipo especifico de elemento IS. Por exemplo, so encontradas 6 a 10 cépias de ISI no cromossomo de E. colt Oy plastufaivy wanbéns podens wonier elementos 1S. plasmidio F, por exemplo, geralmente tem pelo menos dois elementos IS diferentes, IS2¢ IS3. Quando determi- Repencoes invervoas erminais ——_————_. 2 eiuacien aauauacas- 3 SC eACTENGM qrererere— es 880 Searrance dearraace TOAAMEG FGTAATTGG Duplicagdo do stioalo 'm FIGURA 17.1 Estrutura de um elemento IS50 Inserido, mostrando ‘suas repeticSes invertdas terminais e @ duplicacéo do stio-alvo, As repetigdesinvertidas terminals sto imperfltas porque o quarto par de nuceoticios (destacado) de cada extremidade é diferente.AB. Fundamentos de Genética WF 0 same do ONAaho 380 (Sindee ocas foros ea O elemento IS ¢ inserido a lacina criada pea clvagem em extemidade protuberante do DNRalv, 5 2 HicaTeaENT] a ls ocnsceste||| 2 sintase de DNA faueceira) Dreencie as lacunas de cada lad ‘elemento I, produzindo uma ‘uplicasao deta do stioaho, 5 a a ||| | Ficties 17 2 Produc de duplicacfies de cin-alva pala incercho do um elemento I. nado elemento IS est loralizado em dias moléculas de DNA diferentes, cria a oportunidade de recombinacao ho- mologa entre elas. Por exemplo, um elemento IS no plas- midio F pode emparelharse e recombinarse com 0 mex mo tipo de elemento IS no cromossomo de E, cli Tanto 0 cromossomo de E. coli quanto o plasmidio F sio moléculas Girculares de DNA. Quando um elemento IS medeia a re- combinagio entre essas moléculas, o plasmidio, menor, 6 integrado a0 cromossomo maior, com a criagio de uma molécula circular tinica, Esses processos de integracdo roduzem cepas Hir capazes cle transtenir seus cromosso- mos durante a conjuugacio. Essas cepas variam em relacdo 20 sitio de integracio do plasmidio F porque os elementos 15 mediadores da 1econtbinnacao Ocupan diferentes post des cromossbmicas em diferentes cepas de E, coli— uma consequéncia de sua capacidade de transposicao. ‘Os elementos IS também podem mediar a recombina do entre dois plasmidios diferentes. Por exemplo, con- sidere a situacio apresentada na Figura 17.3, na qual um Phemidin partadar de it prmteer els bena oc Bi si? @ Placisio R nao conjugativo conjugative RIF 'm FICURA 17.3 Formagdo de plasmidio R conjugativo por recombina- do entre elementos IS ico estreptomicina (si) recombinase com um plas midio que pode ser transferido entre células durante a conjuigacao (plasmidio conjugativo). A recombinacao & mediada por elementos IS7 presentes nos dois plasm ios e cria um grande plasmidlio que tem tanto 0 gene sh’quanto a capacidade de ser transferido durante a con= jugacdo. Esses plasmidios tém significado clinico porque possibilitam a transmissio horizontal do gene de resis- téncia ao antibistico entre individuos de uma populacio de bactérias, Por fim, todas ou quase todas as bactérias ailquinem u yene de resistencia, © v anndbidtien wrasse inttil no tratamento de infeccdes causadas por elas. Os plasmidios que transferem genes para resistencia a antihiéticas entre céluilas sia denominaclos plaemidiag R conjugativos. Esses plasmidlios tém dois componentes: 0 fator de transferencia de resistencia, ou RTE, que con- tém os genes necessarios para a transferéncia conjugativa entre células, € 0 determinant R, que contém o gene ou ‘os genes responsiveis pela resinténcia a antibisticos. Os plasmidios R conjugativos podem ser transferidos rapida- mente entre celulas em uma populacao de bacterias, mes- mo entre tipos celulares muito diferentes por exemplo, ‘um coco e um bacilo. Assim, depois de se desenvolverem ‘em uma parte do reine microbiano, cles podem 3€ disse- ar para outras partes com relativa facilidade. Alguns plasmiios R conjugativos tém varios diferentes, genes de resisténcia a antibioticos. Esses plasmitlios so formados pela sucessiva integracdo de genes de resistencia wiv de processus de recuunbinayae mediates por 1S. ‘O surgimento de resisténcia a miitiplos fairmacos ocorreu ‘em varias espécies patogénicas para seres humanos, entre clas cepas de Staphylococcus, Fnimacaceus, Neier, Shigella e Sabnonelta. O tratamento de muitas infeccdes bacterianas atuais causadoras ce doencas como disenteria, tuberculo- see gonorreia ¢ dificil porque o patégeno adauiriu resis {éncia a diferentes antibidticos. Explore o desenvolvimen- to destes plusmidios de resisténcia 2 miiliplos firmacos ‘em Resolval Aciimulo de genes de resistencia a farmacos TRANSPOSONS COMPOSTOS (Os transpésons compostos sito criadlos quando ha insercio de dois elementos IS proximos. Entio, pode haver transpo- Actmulo de genes de resisténcia a férmacos Uma célula de £, col tem um plasmidio R conjugativo portador do gene para resistencia & estreptomicina (st?) flanqueado por clomentesIf7. Outra eflla de f, eol/tam um plaemidie ne con Jugativo portador de um gene para resisténcia &tetracilina tet, ‘alg de uma edpia de IST. Explique won seria pusivel o surgi mento de um plasmidio R conjugativo com os genes sre tet. > Leia aresposta do problema nosite ‘np://gen-1o.grupogen.com.br.sigio da regizo entre os dois elementos IS quando os ele- ‘mentos atuam em conjunto. Na verdade, os dois elementos TS “capturam” uma sequéncia de DNA imével e dotam-na da capacidade de se deslocar. A Figura 17.4 apresenta trés ‘exemplos de transpésons compostos, indicados pelo sim- bolo Tn. Em Tn%, 09 clementos IS flanqucadores extio todos no mesmo sentido, enquanto em Tn5 ¢ Tn10, os sentidos sio invertidos. A regiao entre os elementos IS de ‘cada um desses transpésons contém genes sem qualquer relagao com a transposicao, Na verdade, em todos os trés wausposuus, us genes eHue Us elements IS flauyueade- res conferem resisténcia a antibi6ticos ~ uma caracteristica ‘eujo significado médico é Sbvio. Os transpésons compos- tos, assim como ax elementos IS que sie parte eleles, eriam uy de sitioalvo quando se inserem no DNA. As vezes, os elementos IS flanqueadores em um trans- péson composto ndo sio idénticos. Por exemplo, em ‘Tn5, o elemento a direita, IS50R, é capaz de produzir ‘uma transposase para estimular a transposicio, mas 0 ele- mento & esquerda, IS50 L, nao. Essa diferenca se deve & alteragao de um tnico par de nucteotidios que impede IS50L de codificar a transposase ativa. ELEMENTO In3 As baciésias contéin Guus giauiles Wansptsens que 10 tém elementos IS nas duas extremidades. Esses transpé- sons terminam em repeticoes invertidas simples de 38 a 40 pares de nucleotidios; porém, assim como oe transpé sons de “cortar ¢ colar”, eles criam duplicagdes de sitio-al- 05 9 “epi -2500 ae gone cam nf See | SP 768 pe 768pn 1.533 pn a 1.533 pn_ Yam Sy - ‘Opn peng a pepelies sera eras ‘eri erties A B Talo 2.300. ere te ee scan 2200 LF —_____ nepeces ———— ‘eros eras sm CURA 174 Organizactn genética de tarepdsons composts A ‘xentagdo e o comprmento (em pares de nulctiis, pr) das se- ‘quéncas constitutes so indieadas na figura. A.Ta9 constitu de ois elementos IS? que lanquetam um gene de resistencia 20 loran- fenicol.B. TS consttuldo de dois elementos 1S50 que fanqueiam genes de resistencia a caramicin,bleomicina e estreptomicina ‘Tail0 6 constitudo de dois elementos 1510 que flanquelam um gene de resistencia &tetraccina. Coptuio 17 | Elementos GenéticosTansponiveis 479 4.957 = | 1 =| Transposase Resohase/ betalactamase Repressor Repetigdes terinais, inertidse de 38 pn 1m FIGURA 17.5 Onganizacdo genética de Th3. Os comorimentos das ‘sequéncias de DNA slo apresentados em pares de nuclectdios (pn, vo quando s¢ inserem no DNA. O elemento conhecido como Tn3éo principal exemplo desse tipo de transpéson. ‘A Figura 17.5 mostra a organizacio genética de Tn3. Feistem trae genes, inpA, imp @ bla, que codificam, res pectivamente, uma transposase, um resolvase/repressor ea enzima betalactamase. A betalactamase contfere resis- téncia ao antibidtico ampicilina, e as outras duas protef- nas tém papéis importantes na transposicao. Tn3 é um transpéson replicativo cujo processo de deslocamento ocomre em dois estigios (Figura 17.6). No °F A wnsposis coat por {betas fomesto dean Conta ere os pasos dado acer Dra ee process, ena oe ele alceeat ‘elemento em cada jun¢o no conte aN “@ Krecowase produzida pelo ene inp did ocontegrado bor madacao da rocomtinacao frre os dos elementos Tn => ae ‘Separacdo dos WF ndin Sate receptor, cada um dele com uma copia de Tn. rit |B FIGURA 176 Transposicdo de Tn pela formacdo de ur cointegredo.480. Fundamentos de Genética primeiro estigio, a transposase medeia a fusio de duas ‘moléculas circulares ~ por exemplo, dois plasmidios, um que tem In3 (plasmidio doador) ¢ o outro que nao tem (plasmidio receptor). A estrutura resultante é denomina- a cointegrado. Durante a formagéo do cointegrado, Tn3é seplivady, © una UGpia € inserida ems vada pony de fas dos dois plasmidios; no cointegrado, essas duas cépias de Tn3 esto no mesmo sentido. No segundo estégio de transposicio, a resolvase codificada por Imp medeia uma recombinacao sitio-especifica entre as duas cOpias de ‘InJ. Ksse processo ocorre em uma sequéncia de In de- PONTOS ESSENCIAIS. nominada ms, 0 sitio de rsolucao, © quando conckuido 0 cointegrado é dividido em seus dois plasmidios consti tuintes, cada um deles com uma copia de'In3. produto do gene impR de Tn3 ainda tem outra fungao ~ reprimir a sintese das proteinas transposase € resulvase, A Leplessay ULUILE pUIyUe U siLU 19 etd Toe calizado entre os genes inp e inpR. Por ligacio a esse si- tio, a proteina npR interfere na transcricao de ambos os genes, causando a deficiéneia erénica de seus produtos. Por conseguinte, 0 elemento Tn3 tende a permanecer amovel. As sequéncias de insercdo (elementos IS) sdo transpisons de “cortar e colar” loeaizados em ‘cromoscomos« placmidioe bactarianos + Os elementos IS podem media a recombinagio entre diferentes moléculas de DNA + 0s plasmidios conjugatives podem mover genes de rsstincia a antibicticos de uma bactéria pore euira + Os transpésons compostos sao constituios de dos elementos IS que flangueiam uma regiéo que contém um ou mais genes de resisténcia a antibidticos + Tn3 é-um transpéson replicativo que fax wransposicio por fusio tompordria de moléoulas de DNA a um cointegrado; quando o cointegrado é dividido, cada wma das moléculas de DNA ‘consvtuintes emerge com uma copia de Tn3 + Os transpisons hactrrianos sito delimitadas or mpeiciesimvertidas trminaix: quando se inserem em uma molécula de DNA, criam wma duplicagdo de sequéncias no sitio de inser:io (uma duplicagdo do sitio abv) Transpésons de “cortar e colar” em eucariotos (05 elementos transponiveis foram descobertos por ané- lise de instabilidades genéticas no milho; as andlises ge- néticas também mostraram elementos transponiveis em Drosophila. Os geneticistas encontraram muitos tipos diferentes de transpésons em eucariotos. Esses elementos variam em tamanho. estrutura € comportamento. Alguns sio abun- dantes no genoma, outros sio raros. Nas segbes subse- quentes, analisarcmos alguns dos transpésons cucarié- ticos que se movem por um mecanismo de “cortar € co- lar”. Todos esses elementos tém repeticdes invertidas em 1 terminagiies # rriam duplicaghive de eitiealun quan do se inserem nas moléculas de DNA. Alguns codificam ‘uma transposase que cavalisa a passagem do elemento de uma posicao para outra. ELEMENTOS Ac E Ds NO MILHO 5 elementos Ace Ds no milho foram descobertos pela ientista americana Barbara McClintock. Com o aux lio da analise genética, McClintock mostrou que as ati vidades desses elementos so responsaveis pelas listras #2 panting nne grins de mith Mnitne anne depois, Nina Federoff, Joachim Messing, Peter Starlinger, Heinz Sae- ler, Susan Wessler € seus colegas isolaram 03 elementos identificaram sua estrutura molecular. “McClintock descobriu os elementos Ace Ds por estudo da quebra cromossimica. Fla uson marcadares genéticos que controlavam a cor dos graos de milho para detectar a quebra, Quando determinado marcador era perdido, ‘McClintock concluia que o segmento cromossémico em ‘que estava localizado também havia se perdido, uma indi- cagio de quebra, A perda de um mareador era detoctada por alteracao na cor da aleurona, a camada externa do ‘endosperma triploide dos graos de mitho. Em um grupo de experimentos, 0 marcador genético acompanhado por McClintock era um alelo do lacus Cno nage curty do cromiossomo 9. Como exe alelo, © € ut inibidor dominante da coloracéo da aleurona, todo grao que 0 contém é incolor. McCiintock fertilizou espigas CC com pélen de penddes CC, produzindo grios cujo en- dosperma era CCC. (O endosperma triploide recebe dois alelos da planta feminina ¢ um da planta masculina; ver Capitulo 2.) Embora McClintock tenha constatado que a maioria desses grios era incolor, conforme esperado, alguns apresentavam éreas de pigmento roxo-acastanha- do (Figura 17.7). McClintock supds que nesses mosaicos © alelo C’inibidor havia se perdido em algum momento durante o desenvolvimento do endosperma, levande 20 surgimento de um clone de tecido capaz de produzir pig-= MOURA 17,7 Grao de mitho (vista superior) mostrando perda do alelo C para inibigao da pigmentacSo na aleurona. As eas r0- x0-amarronzadas 0 CC, enquanto as éreas amarelas séo CCC. mento. O genduipo desse clone seria -CG, onde 0 trago indica o alelo Cfaltante. (O mecanismo proposto por McClintock para explicar aperda do alelo ('é apresentado na Figura 17.3. Uma que- bbra no local indicado pela seta desprende um segmento do cromossomo de seu centrémero, com a criacéo de um fragmento acéntrica. Fate fragmenta tende a ser perdido durante a divisio celular; portanto, todos os descenden- tex dessa célula nao ter20 parte do cromossomo de ori- gem paterna. Como o fragmento perdido tem o alelo C, ° Gamers oF Gametsfto ¢ ae aoe Ds Feriizarao © ito de conwsar0s ‘aternos e paternos para produir 0 endosperiia tripe. éemento Ds. “@ Parda do fragmento Fragmento cromossémico que tem 0 acento itose 80°88 pamenaese e formagéo de um clone de ‘ble pigmontadac. Clone do clus pigmentadas (gendtpn Cc) | FICURA 178 Quebra no cromassomo causada pelo elemento ‘ransponivel Ds na milho. © alelo C no braco curto do cremassoro 9 produz pigmentagdo normal na aleurona; 0 alelo C'inibe essa pig- mmentacdo. CCoptulo 17 | Elementos Genéticos ransponvels 481 niio hé inibigio da produgio do pigmento em nenhuma das células nesse clone. Se alguma delas produzir uma parte da aleurona, havera uma area de tecido roxo, com © surgimento de um grao em mosaico semelhante a0 mostrado na Figura 17.7. McClinwck Coustaiwu que 4 yuebia Lespousdvel por esses grios em mosaico ocorreu em um sitio especifico do cromossomo 9. Ela nomeou o fator causador dessas quebras de Ds, de Dissociagio. No entanto, esse fator so- zinho era incapaz de induzir a quebra cromossémica. ‘Na verdade, McUiintock constatou que era preciso que Ds fosse estimulado por outro fator. denominado Ac. de ‘Ativador (do inglés, Activator). O fator Ac estava presente em alguns cstoques de milho, mas auscnte cm outros. O cruzamento de diferentes estoques possibilitava a combi- nagio de Ac com Ds para criar a condicéo que resultava fom quehra cromassAmica Esse sistema Ac/Ds de dois fatores explicou a instabi- lidade genética que McClintock observara no cromoss0- mo 9. Outros experimentos demonstraram que essa era apenas uma das muitas instabilidades presentes no ge- noma do milho. McClintock constatou outros casos de quebra em diferentes sitios do cromossomo 9 ¢ também em outros cromossomos. Como a quebra nesses sitios de- pendia da ativacie por Ae, ela concliin que também hae via participacao dos fatores Ds. Para explicar todas essas observagées, McClintock propos que Ds poderia existir em muitos sitios diferentes do genoma e que poderia se deslocar de um sitio a outro. usa explicagio foi corroborada por andlises eubse quentes. Os elementos Ace Ds pertencem a uma familia de transpésons. Hsses elementos apresentam relacao es trutural entre si e podem inserirse em muitos sitios di- ferentes nos cromossomes. Com frequéncia, o genoma du unity tein yéiias CGpias dus elementos Ale Ds. Gout © auxilio da analise genética, McClintock demonstrou que tanto Ac quanto Ds podem se deslocar. Quando um desses elementos se insere em um gene ou perto dele, McClintock constatou que a funcio do gene é alterada = as vezes totalmente suprimida. Assim, Ac e Ds podem induzir mutacdo por insercio nos genes. Para enfatizar a expresso génica, McClintock nomeou os transpésons Ac © Ds de elementes controladores. ‘Osequenciamento do DNA mostrou que os elementos Acsio constitufdos de 4.563 pares de nucleotidios limita- dos por repetigées invertidas com 11 pares de nucleoti- dios (Figura 17.94); essas repeticdes invertidas terminais io essenciais para a transposicao. Cada elemento Ac também é flanqueado por repeticdes diretas com 8 pares de nucleotidios. Como as repeticdes diretas sio criadas no momento em que 6 clemento ¢ inserido no cromos- somo, elas so duplicagdes de sitio-alvo, nao partes inte- grantes do elemento. ‘Aa cantriria de Aq, os elementos Ds tém estrutura heterogénea. Todos apresentam repeticdes terminais in- vertidas iguals 4s dos elementos Ac, demonstrando que pertencem & mesma familia de transpésons, mas as se- quéncias iniernas variam. Alguns elementos Ds parecem482. Fundamentos de Genética Elemento Ae eoquénei omplota. 4563 pn —————_—_, L_— Repotigdes torminaisimortidas do 11 pa A Elementos Ds andmalos ~ auséncia de sequéncias Intornas néo relacionadas com Ac. Ko Ds inserido > ( FICLIRA 179 Organizacn estan dex memos ea Farin Ae/De de elementos transpontvels no milho.As repeticSesinvertdas termi- ‘nats (sctascurtas embaino) © 0s comprimentor da zequéncia de ONA {er pares de nucteoticos, pr) s8o incicados na figura. ter sido originados nos elementos Ac pela perda de se- quéncias internas (Figura 17.08). As delegdes desses ele- mentos podem ter sido causadas por sintese incompleta do DNA durante a replicagio ou transposicao. Outros elementos Ds contém DNA nio pertencente a Ac entre suas repeticdes terminais invertidas (Figura 17.9C). Esses membros incomuns da familia A¢/Ds sio denominados elementos Ds andmalos. Uma terceira classe de elemen- tos Ds € caracterizada por arranjo de superposicao pecu- liar (Figura 17.90); um elemento Ds é inserido em ontro, porém com sentido invertido. Esses elementos Ds duplos parecem ter sido responséveis pela quebra do cromosso- ‘mo que McClintock observou em seus experimentos. [As atividades dos elementos Ac/Ds ~ excisio e trans- origio, ¢ todos on seus correlates genéticos, inclusive mutacdo € quebra cromossOmica — sao causadas por uma transposase codificada pelos elementos Ac. A transpo- sase Ac interage com sequéncias nas extremidades dos elementos Ace Ds ou préximas delas, catalisando seu movinemo, Delegoes ou mutages do gene codificador da transposase abolem essa funcio catalisadora. Assim, elementos Ds, que tém essas lesdes, nao podem se ativar. No entanto, podem ser ativados se houver um elemen- to Ac produtor de transposase em algum ponto do ge- noma. A transposase produzida por esse elemento pode difundirse através do miicleo. ligarse a um elemento Ds ¢ ativélo, Portanto, a transposase de Ac é uma proteina de acdo trans, (Os transposons relacionados com os elementos Ac/Ds foram encontrados em outras espécies, inclusive de ani- mais. Talvez 0 elemento mais bem estudado seja 0 hobo, (que recebeu esse HOME ExtravayANILe por sued Capac de transposi¢ao. O elemento habo € encontrado em algu- mas espécies de Drosophila, Explore outros efeitos genéti- ‘0s dos elementos A¢/Ds em Problema resolvido: Andlise da atividade de transpésons no milho. ELEMENTOS P E DISGENESIA HIBRIDA EM DROSOPHILA Algumas das pesquisas mais extensas sobre elementos transponiveis concentraram-se nos elementos P de Draso- phila melanogaster. Esses transpésons foram identificados pela conperacia de geneticisiae de virins laharatdrins diferentes. Em 1977, Margaret e James Kidwell, traba- Ihando em Rhode Island, ¢ John Sved, na Austria, des cobriram que cruzamentos entre determinadas cepas de Drosophila produzem hibridos com tracos aberrantes va- Hiados, entre cles mutagio frequente, quebra de cromor somos ¢ esterilidade. O termo éisgenesia (do grego, que significa “deterioracao da qualidade”) hibrida foi usado para designar esea sinerome dle anormalidades. Kidwell © seus colegas constataram que poderiam Classificar cepas de Drosophila em dois tipos principais de acordo com a producio ow nao de hibridos disgénicos ‘em cruzamentos de teste. Os dois tipos de cepas sio de- signados M e P. Apenas eruzamentos entre as cepas Me P produzem hibridos disgénicos, ¢ isso 86 acontece se 0 in- dividuo masculino for da cepa P. Cruzamentos entre duas copas P diferentes, cn entre duzem hibridos normais. Podemos resumir os fenstipos da prole hfbrida a partir desses diferentes cruzamentos ‘em uma tabela simples: sre M ifr a Gesitorferinino M P « eral Geaitor rmascuino P ‘oral Portanto, os genitores das diferentes cepas contribuem ‘como maeou como pai para a formacio de hibridos dis _geusicus — daf suas desigunayoes Me F. Para Kidwell ¢ seus colegas, esses achados sugeriram que os cromossomos de cepas P tém fatores genéticos que so ativados quando entram nos ovécitos produzi- dos por fémeas Me que, uma ver ativados, esses fatores induzem mutacées € quebra do cromossomo. Inspirado or esse trabalho, William Engels. estudante de gradua-Anilise da a PROBLEMA [No milho, allo selagem do gene C é necessio para a coloracio escura da aleurona nos grdos. Sem esse alelo, a aleurona é amare- lo-dara. & uma mutacdo recessiva causada pela insercao de um. elemento Ds na regido 5 nda traduzida do gene C, isto na regléo fete ftv Ue su a tantra ev prinneiv wSUUn na neque codifcadara do polipeptidio.Cepas endogdmicas de milho homozigo- tas para essa mutaggo produzem grdos amarelo~laros, assim como a8 capas endogimicas homenigotss para delagto do gene Cc!) Um ‘melherista de milho crzza uma cepa endogimica cc como genitor feminino com uma cepa endogamica cc camo gentor mascul! no. Entre os gras da F., ele vé muitos que tém dreas de teido ro- xxo-amarrenzago na aleurona amarelo-clar. (a) Explique 0 fenétipo der. (b] Voce esperar esse fenstipo seo elemento Ds fos insesido tem algum ponto da sequéncia codifcadora do gene C? FATOS E CONCEITOS 11, Ds, o membro no auténomo da familia de transpdsons Ac/Ds, 56 se desloca na presenca de Ac. 0 membro autdnomo.. 2, A regldo 5’ nao traduzida de um gene nao contém cédons para aminoseidos no polipeptidio eepecifieade pelo gene. 3, Ainsergéo de um transpéson em um gene pode interferir com. a expressao dos genes. 4, exciséo de um transpéson geralmente dexa no minimo uma parte da duplicacio do sito-alvo criada quando o transpdson foi inserido. ANAUSEE SOLUGAO a Para explicaro fendtipo Fy obseramos que a expresso do alelo € perurbade por'uma Inserao de Os na reglto 5° ‘do da University of Wisconsin, comecoua estudar muta- ‘Ges induzidas em hibridos disgénicos. Em 1979, Engels constatou uma mutagio especifiea com alta frequéncia de reversio para o tipo selvagem. Essa instabilidade, que € reminiscente do comportamento de mutacoes induzi- das por IS em E. col, foi um forte indicio da participacao le um elemento transponivel. A descobenta por Michael Sisnmious ¢ Jolug Lin as mutacdes induzidas por disgenesia no gene white pos sibilitou teste da hipétese do transpéson, Em 1980, Simmons © trabalhando, respectivamente, em. Minnesota e Wisconsin, enviaram as mutacdes while re- cemedescoberias a Paul Bingham, geneticista da Caroli na do Norte. Bingham e seu colaborador, Gerald Rubin, ‘um geneticista de Maryland, haviam acabado de isolar 0 DNA do geue white, Usanly ee DNA wing sunt, Dit _gham e Rubin conseguiram isolar 0 DNA dos alelos white mutantes € compariclo ao DNA white de tipo selvagem. Em cada mutacio, eles constataram que um pequeno elemento havia sido inserido na regido codificadora do gene while, Vutros experimentos mostraram. que esses elementos esto presentes em miiltiplas c6pias e em dife- 483, ‘Coptul 17 | lementos Genéticos Fansponivels Brean ‘a jade de transpdsons no milho nin tarhtida dn gone (Se acse element Ne facca evrcadn, a expressdo dos genes padera ser restaurada, Quando cruzou 19s dues cepas endogémicas, © melhoriate de milho cruzou involuntariamente uma cepa com inser¢8o Ds no gene C com uma cepa que tinna um elemento Ac criptico, A aleurona triploide nos grdos da F, era necessariamente c%c%c* (Ac). As ‘duas cépias do alelo c eram derivadas da parte feminina,e a tien efpa dn alola eam dalecdin oS a ica epi de Areca derivadas da parte masculina. Nesse gentipo hbrido, Ac pode ativar 0 elemento Ds, causanda sua exciséo da gene C. Como ‘elemento foi inserido no DNA néo codificador, espera-se {que sua excisdo restaure a expresso do gene C. Portanto, se as células nas quais ocortem essas excisoes derem origem 20 tecido da aleurona, esse tecido seréroxo-amarronzado em um {gro amaralo.claro, b, As excisdes de Ds raramente s8o_precisas. £m geral, varios inucleotidis na sequéricia de genes eo redor Uo sfiv de inser ‘0 Ds so duplicados ou deletados quando o elemento Ds & ‘excisado. Por exemplo, com frequéncia 0 elemento Ds deixa 2 duplicacdo do sitio-aivo gerada quando ¢ inserido em um gene ~ um tipo de marca do transpéson. Esses nucleotidios adiclonale no tendem 2 intercompar a exprestSo giniea co estiverem localzados na regio 5’ no traduzida dos genes, que ny contérn esihura inforinacdo Codiicadota. No entanto, se estiverem localzadas na regio codificadara dos genes, endem ‘8 causar graves problemas. Eles paderiam alterar 0 compri- mento ou a composicao do polipepticio codificado pelo gene Assim, a excisio de um elemento Ds da sequéncia codificadora ‘do gene C provavelmente no restaurard a fungio desses genes. Com essa insercao Ds, néo esperariamas ver éreas de tecido roxo-amarronzado nos gra0s dF rentes locais nos genomas de cepas P; no entanto, estio totalmente ausentes dos genomas das cepas M. Portanto, fos geneticistas comecaram @ denominar esses transpé sons ceparespecificos de elementos P. A anallise da sequéncia de DNA mostrou que os ele- ‘mentos Pvariam de tamanho. Os maiores elementos tm 2.907 pares de nucleotidios, entre eles repeticdes inverti- tas teiiminais de 91 pares de uuclevtidios. Exes eleven tos Pcompleostém um gene que codifica uma transposase. Quando a transposase dle P cliva o DNA perto das extre- midadles de um elemento Peompleto, pore deslocar este elemento para um novo local no genoma. Os elementos P meompletos (Figura 17-10) nao sao capazes de produzir a transposase porque algumas de suas sequéncias internas sio deletadas; no entanto, suas sequéncias terminais © subteriinais sau recuuieridlas pela Uaispurase, COL quentemente, esses elementos podem ser mobilizados se houver um elemento completo produtor de transposase em algum ponto do genoma. Em hibridos disgénicos, s6 ha transposicdo de ele- mento nas celulas da Imhagem germmauva. Bssa res tricio se deve a incapacidade das células somaticas de484 Fundamentos de Genética Elomento P completo —todae ae eo 2.907 on = Gene da trgnsposase SSS \_— Rapotigies trinsic ivortidac do 31 pr ——! | FICURA 17.10 Estrutura de elementos P em Drosophila mostrando 15 orientesées © 03 comprimentos ern peres de nucestidis, pa) des sequéncas de DNA, remover um dos introns do prémRNA do elemento P. Quando traduzido, esse RNA incompletamente recom posto produz um polipeptidio que nao tem a capacidade a transposase de catalisar 0 movimento do elemento P. PEQUENOS RNA REPRIMEM A ATIVIDADE DO ELEMENTO P brida suscita duas questdes bisicas. Por aue a diseenesia indo ocorre nos tecidos samaticos? E por que no ccorre fem mosces cues nes sav originales de ue cepa PP Os geneti= cistas responderam 8 primeira questdo em 1986, quando apren- eram que a transposase do elemento P néo é produzida em cé&- lulas sométicas. Sem transposase para catalisar 0 movimento, os elementos P continuam inativos nas céulas sométicas. A segunda {questdo foi respondida ha menos tempo, quando os genetcistas aprenderam que as moscas de cepas P produzem pequenos RNA que interferer na atividade do elemento. As andlises geneticas mostiaram que @ repressao da disgenesia Iibrida na Unkagem germinativa esté correlacionada com a pre- ‘senca de um elemento P em um sitio no genama de Drosophila -0 ‘sl6mero eequerdo do eromoscome X. Multae moecae em popu- laces naturais tém esse tipo de elemento P e reprimem muito bem a disgenesia.Portanto, um elemento P teloméricoligado a0 X parece ter um poder quase magico de controlar todos os outros elementos P no genoma, onde quer que estejam lacalizados. No lenny rr eererio F velometea igado a0 30 er felt se fr herdado da mae. Um elemento Ptelomérico herdado do pal perde a capacidade de evitar a disgenesia hibrida. Por que o elemento Ptelomérico herdado da mie & 80 expe- al? O elemento € inserido em um sitio na genama que produz PIRNA. Muitos loci diferentes produzem piRNA, mas o tel6mero esquerdo do cromossomo X é uma fonte importantissima. Quando A descoberta de que os elementos P causam disgenesia hi- Por conteguinte, at células romiticas si0 poupacas dos anos decorrentes da atividade do elemento P. A disge- nesia hibrida é, portanto, um tendmeno que s6 ocorre na linhagem germinativa. As células da linhagem getminativa de Drosophila amber 2 auecaisinos pata izat us hanius que podem ser causados pelos elementos P.O mecanismo mais eficaz conta com a participacio de moléculas de RNA derivadas dos préprios elementos P. Esses RNA formam complexos com um grupo especial de protet nas, que recebem 0 estranho nome de proteinas Prwi; portanto, sio designados como RNA de interacio com @ proteina Piwi ou piRNA. As fémeas das cepas P pro- dluzem esses piRNA € transmitem-nos para a prole no citoplasma dos ovécitos. Uma vez na prole, os piRNA reprimem a atividade do elemento P na linhagem ger minativa « impedem a diegenotia hihrida, Portantn, 4 transmissio materna dos piRNA repressores explica por {que as proles de eruizamentos entre femeas P € machos Mc entre fémeas P € machos P nao sio disgénicas. O texto no quadro O futuro: Pequenos RNA reprimem a atividade do elemento P destaca algumas das desco- bertas recentes sobre esse mecanismo de regulacdo de transpésons. a toplasma de ovdcitos de Drosophila. Assim, uma fémea que tem pte a tec tenet npc Homo iopm pian co et waste en pen ent Sroecpean ite ates toacrenen pe celal cratic nt ne poi et bent ab bor ve ht ak spelt oasmtPONTOS ESSENCIAIS - de Drosophila Retrovirus e retrotranspdésons Os retrovirus e 0s elementos transponiveis relacionados usam a enzima transcriptase reversa para copiar o RNA ‘em DNA. Em seguida, as c6pias de DNA sao inseridas em diferentes posigGes no DNA gendmico. Além dos transpésons de “cortar e colar", como Ace P, 08 genomas eucariéticos contém elementos transpo- niveis cujo movimento depende da transcrigio reversa de RNA em DNA. Essa inverséo do fluxo de informa- Ses genéticas levou os geneticistas a denominarem cesses elementos retrotranspésons, cijo prefixo originado do latim significa “para tras”. A transcricao reversa tam- bém tem um papel crucial nos ciclos vitais de alguns virus. Os genomas desses virus so constituidos de RNA unifilamentar. Quando um desses virus infecta uma cé- ula, seu RNA 6 copiado em DNA biflamentar. Como as informacées genéticas passam do RNA para o DNA, ‘esses virus sao denominados retrovirus. Iniciaremos nossa investigacio dos retrotranspésons com uma andlise dos retrovirus. Mais tarde, analisaremos as duas principais aac Ue 1euULLaiI9pOSUIIS. RETROVIRUS 5 retrovirus foram descobertos pelo estudo das causas de alguns tipos de tumores em galinhas, gatos e camun- dongos. Em cada caso, um virus de RNA foi implicado na .geracdo do tumor. Um avanco importante na compreen- sao dos ciclos vitais desses virus ocorreu em 1970, quan- do David Baltimore, Howard Temin e Satoshi Mizutani descobriram uma DNA polimerase RNA-dependente — sty uina Wansuiptase reves, yue pussibilila que esses virus copiem RNA em DNA. Essa descoberta deu origem A pesquisa sobre 0 processo de transcrigao reversa e possi- bilitou vislumbrar o que poderia ser denominado “retro- mundo” ~ a vasta colecio de sequéncias de DNA deriva- das da transcricao reversa. Agora sabemos que a transcri- cao reversa € responsavel pelo povoamento dos genomas ‘com muitos tipos de sequéncias de DNA, entre elas, € claro, os retrovirus. Portanto, a descoberta da transcrip- tase reversa abriu uma visio para um componente dos ‘genomas nunca explorado. Mites tipoe diferentes de retreuirne foram ienta- dos e identificados. No entanto, o epitome é 0 virus da ‘Coptulo 17 | Elementos Genéticos Tansponivels 485 Oclemento transponivelDs do milo, descoberta por causa de sua copacidade de quebrar cromossomas, éativado por outro elemento transpontvel Ac, que codifia wma transpasase + Oc lementasP transpontenis so rspomsézvis pola disgenesia hirida, uma siden de ‘anormaliades da linhagem germinativa que ocr na pole de crazamentos entre cepas Pe M + Na linhagem germinativa, a atvidade do elemento P é controlada por peruenos RNA (BiRNA) derisados dos prprias elementos P. Imunodeficineia humana (HIV), causador da sindrome de imunodeficiéncia adauirida (NDS), doenca que acomete deze- nas de milhes de pessoas. A AIDS foi detectada pela pri- sucina vee nu dliny quaria do seuuly 20. E ais docsiga grave do sistema imune. A medida que avanga, a pessoa perde a capacidade de combater infeccdes por diversos patdgenos, entre eles organismos que normalmente s0 benignos. Sem tratamento, os individuos infectados su- Ccumbem a essas infecgoes € acabam por morrer, A AIDS € transmitida de um individuo para outro por liquidos cor- porais, como sangue ou sémen, contaminados pelo HIV. Os sintomas iniciais da doenga assemelhamse acs da ¢gripe. Os individuos infectados apresentam dor, febre € fadiga. Apés algumas semanas, esses sintomas diminuem easaiide aparentemente & rertaurada. Ease estado assin- tomatico pode durar virios anos. O virus, porém, conti- nua a se multiplicar € a se disseminar por todo 0 corpo, direcionado para células especializadas que tém papéis importantes no sistema imune. Por fim, a deplecdo des- sas eélulas pela agio destruidora do virus é tio intensa, que 0 sistema imune falha € os pat6genos oportunistas se impem. Pode haver muitos tipos de doengas, como apnenmonia, A AIDS é uma importante cansa de morte em subpopulacdes de muitos paises ~ por exemplo, em usuarios de drogas intravenosas e profisionais do sexo ~ as Atiiea: Subetariana,,&-ua ieaportania Gana da morte na populagao em geral. Por omioa dessa letalidade © do catado pandémico, © HIV/AIDS foi objeto de numerosissimas pesquisas. Um resultado desse estorco foi a compreensio detalhada do Ciclo vital do HIV (Figura 17.11). O virus esférico entra em uma célula hospedeira por interacZo com os recep- lies CD4, protetitas reveploras espectficas localizaas na superficie celular. Essa interacao € mediada por uma glicoproteina (uma proteina ligada a agticares) denomi- nada gp120, inserida na membrana lipidiea que cireun- daa particula viral. Depois que gp120 liga-se ao receptor (C4, ha fusto das membranas viral e celular e a particu- Ja viral entra na célula, Dentro da célula. a membrana lipidica e a cépsula proteica que circundam a particula viral sio removidas, ¢ as substancias do cerne viral si0 liberadas no citoplasma celular. Esse cee contém duas moléculas de RNA unifilamentares idénticas ~ o genoma viral —o um pequeno niimero de proteinas que facilitam a replicacao do genoma, o que inclui duas moléculas da486 Fundamentos de Genética transcriptase reversa viral, uma ligada a cada filamento de RNA viral. A transcriptase reversa do HIV ~ ¢ outras transerip- tases reversas ~ converte o RNA unifilamentar em DNA bifilamentar. As moléculas de DNA bifilamentares si0 juseridas eu pusigGes aleatSrias uus Crumussumius da & lula infectada, efetivamente povoando o genoma dessa célula com muitas cépias do genoma viral. Essas c6pias podem ser transcritas pelas KNA polimerases celulares ‘comuns para produzir uma grande quantidade de RNA viral, que serve para orientar a sintese de proteinas virais © tuubém ufereve RNA yeudiniey para « asuutagent de Cerne viel MET 7.530% $B ova ieo sc cea sho porters ee 3 ron va gp20 oa ro tor call COK, SG vite ues etna al ve, var yates Wt le $@ ome es prtenesssscass sober do cen ve © manera reveracatta asus oe UNA ral ilarestr part ao wal unter octopus “WF Niegrase catalina nsereio do DNA val NA cellar ono, "Ware porrase coir anserev 0 ONA lem RNA el oy Parte do RNA viral serve como mRNA para a sintese de proteinas virais. Gre do val ome os gens dvs da roe “6 bs parcuas ves de roles moras peto da maran eka. GF ns caress ves da pole so excels da cia pr bot, “Gs arcu vias pro ext es para inectar odes cis 1 FIGURA 17.11 O ciclo vital do HIV. © detalhe mostra particulas viras brotando de uma célulanovas particulas virais. Essas particulas sio expelidas da <élula por um processo de brotamento através da mem- brana celular. As particulas expelidas podem infectar ou- tras células por interacdo com os receptores CD4 em suas superficies. Desse modo, o material genético do HIV é replicady © disseiinally ens uae pupulayau de celules imunes suscetiveis. O genoma do HIV, que tem um pouco mais de 10 qui: lobases, contém varios genes. Trés desses genes, denomic nados gag, pole env, sio encontrados em todos os outros retrovirus. O gene gag codifica proteinas da particula viral; 0 gene fol codifica a transcriptase reversa € outra ‘enzima denominada integrase, que catalisa a insercao da forma DNA do genoma do HIV nos cromossomos de uma élula hospedeira; € 0 gene env codifica as glicoproteinas inseridas no envoltério lipidico do virus. ‘Vamos analisar mais de perto a replicacio da genoma do HIV (Figure 17.12). Esse provesso, catalisado pela trans- taipuse reverss, Comey cout a siutese de ui Giant tinico de DNA complementar ao RNA unifilamentar do genoma viral. E iniciado por um tRNA complementar a ‘uma sequéncia denominada PBS (primerbindingsite sitio de ligacio do iniciador) situada 4 esquerda do centro no KINA do HIV (etapa I na Figura 17.12). ksse tNA é em- pacotado ja ligado a PBS no cerne do HIV. Depois que a transcriptase reversa catalisa a sintese da extremidade 3" do DNA viral, a ribonuclease H (RNasc H) degrada 0 RNA gendmico no diiplex de RNA-DNA (etapa 2). Essa degradacio deixa a sequéncia repetida (R) do filamento de DNA nascente livre para se hibridlizar com a sequéncia R na extremidade 3’ do RNA do HIV. O resultado final € que a regido R do filamento de DNA mascente “salt” da extremidade 5’ do RNA do HIV para a extremidade 3" do RNA do HIV (etapa 3). Em seguida, a transcriptase reversa estende a eépia do DNA usando como molde a regio 5’ do RNA do HIV (etapa 4), ‘Na etapa 5, a KNaseH degrada todo 0 KNA no diiplex de RNA-DNA. exceto uma pequena regio, 0 trato de polipurina (PPT), constitu‘do principalmente das puri- nas adenina e guanina. Esse trato de polipurina é usado para iniciar a sintese do segundo filamento de DNA de parte do genoma do HIV (etapa 6). Depois que o tRNA. ©. RNA gendmico presentes nos diiplex de RNA-DNA io removidos (etapa 7), ha um segundo “salto” do DNA. durante o qual o PBS na extremidade 5° do segundo fila- mento de DNA hibridiza-se com o PBS complementar na extremidade 5’ do primeiro filamento de DNA (etapa 8). ‘As terminagSes 8! hidroxila dos dois filamentos de DNA ssio usadas para iniciara sintese de DNA fim de concluir asintese do DNA bifilamentar do HIV (etapa 9). Obser- ve que a conversio do RNA viral em DNA viral produz sequéncias de assinatura nas duas extremidades da mo- lécula de DINA. Essas sequentclas, deriomnimradas repengoes ‘terminais longas (LTR), sio necessérias para integracio do ‘genoma viral ao DNA da célula hospedeira. ‘A integracio (Figura 17.13) do DNA viral é catalisada ppela enzima integrase, que tem atividade de endonucle- ase. Primeiro, a integrase produz o recuo das extremida- des 3° no DNA do HIV por cortes unifilamentares perto CCoptulo 17 | elementos Genticos Tansponiveis 487 das extromidades das duas LTR (etapa 1). Em seguida, essas extremidades recuadas so usadas para ataques ca- talisados por integrase das ligacoes fosfodiéster em uma sequéncia-alvo no DNA da célula hospedeira, Esse pro- cesso resulta na formacio de novas ligacoes fosfodiéster cule ay extuieniidatles 3° do DNA do FIV € os fosfawws 5° no DNA do hospedeiro (etapa 2). No estagio final da i tegracio, as enzimas de reparo do DNA da célula hospe- deira preenchem as lacunas unifilamentares e produzem um genoma do DNA do HIV inserido de maneira cova- lente no DNA cromossomico da célula hospedeira (etapa 3). Observe que a sequéncia-alvo no local de integracao € duplicada no processo. O genoma do HIV integrado tomase parte permanente do genoma da céhila hospe- deira, replicando-se como qualquer outro segmento do DNA do hospedeiro. Retrovirus integrados de muitos tipos diferentes extio presentes nos genomas dos vertebrados, inclusive no nos- So proprio, Como sao replicados junto com o restante do DNA. esses retrovirus sio transmitidos para as célulasi- has durante a divisio, e se forem integrados as cétulas da linhagem germinativa, também serao transmitidos & geracdo seguinte por meio dos gametas. Os geneticistas chamam de retrovirus endégenos as sequéncias de DNA he- reditirias derivadas da transcrigio reversa e integragio de genomas virais. A maioria dessas sequéncias perdeu a capacidade de produzir particulas virais infecciosas; por tanto. elas so remanescentes inécuos de antigas infec- es virais. O HIV nao é um retrovirus endégeno, mas podria se tornar um caso perdesse seu potencial letal fosse transmitido na forma integrada pela linhagem ger minativa. Agora voltemos 2 atengio para duas classes de retro- transpésons: 0s elementos semelhantes a retrovirus, que se assemelnam a formas integradas de retrovirus, € 0s retropésons, que sio c6pias de DNA do RNA poliadeni- lado. ELEMENTOS SEMELHANTES A RETROVIRUS Os elementos semelhantes a retrovius sio encontrados em muitos eucariotos diferentes, inclusive em leveduras, vegetais € aninmais. Apesar das diferengas de tanmanbo & de sequéncia nucleotidica, a estrutura basica € igual em todos: uma regido codificadora central flanqueada por repetigSes terminais longas (LTR) no mesmo sentido. As sequéncias repetidas geralmente tém algumas centenas de pares de nucleotidios. Por sua ver, cada LIK € limita- da por repeticées invertidas curtas como aquelas encon- tradas em outros tipos de transpésons. Em vista de suas LTR caracterfslcas, os elementos semelizantes a rewove rus ds vezes so denominados retrotranspdsons LTR. A regio codificadora de um elemento semelhante a retrovirus contém um pequeno ntimero de genes, geral- mente apenas dois. Esses genes sio homélogos aos genes ‘gag e fol encontrados em retrovirus; gag codifica uma proteina estrutural da cépsula viral, e fol codifica umaABB. Fundamentos de Genética Iniciar RNA, ae Pas pains rr Bese cre we” pol ew U3 RTA > “@ircio da sintese de ONA Ueando RNA com iniiador Y DNA 3 us rs, eT SUR. US PBS gag” pol ew us RTA 3 spe “@ race degrada o RNA gensinicn em diplex de RNADNA. Y DNA 3 By US 123 56 i —<—— ra 5 SPS" gag” pohew "us "R '~® an ase, 8 “@tiorcizapio da copia de DNA de sequencia epetda IR) RED) lntermedrio? Y com a sequela remanescerte do RNA gendmic. 73 jpeBape Uy TOS RNA genbmico 5 Bag gag” param TR 5 Wo tanesto ve DNA ested Y ona 3p 28S gow, 13 4 ty ws 5 seageoe S R a “@ vase 1 cegrada 0 KNA no Gipex de RNALNA, txceta tat de palpurna, y vin SEES Lea em, 3, US m8 SX wa geromico ee “@ricio da stese do segundo feento de ONA usando RNA dotrato de popurne como iniador, Y ona 9 PBS eee othe UR US mee Sey tos Pe Pos Pres 13 DNA ee, “@ "Retrada co irciador de RNA e do tRNA, Y TN Ry) U3 Rus’ pas 13 DNA a PBS SD nriivarin da camidaria PRS na : -extremidade 3' com PBS na extremidade 5’ Y Intermediaric? sown ape fB tel f SPs TR’ us’ pas | 3 DNA > “GFA sintese de DNA nas extremidades 3’ de ambos os flamentos completa © genoma de DNA GolIW com LR nas duas extremidades apt RE PS Eppes sg TR up Pas” ae ae is RT? oR oR 1m FIGURA 17:12 Corversdo de RNA genémico do HIV em DNA biflamentar. 8, sequéncia repetida; US, sequéncia nica pert da terminagdo 51: U3, sequéncia nica perto da terminacéo 3: PBS sto deligacSo do iniciador A, cauda poi(A)sequéncias gag, po e env, coificadora de proteinas do HIV; PP, trato de polipurin rico em adenina guanina; LTR repeticdo terminal longa. As setastracejadas indicam a diregSo da zintoze de DNA em cada etapa do proceso.proteina transcriptase reversa/integrate, Os retrovirus tém um terceiro gene, env, que codifica uma proteina componente do envoltorio viral. Nos elementos seme- Ihantes a retrovirus, as proteinas gag ¢ pol tém papéis importantes no proceso de transposicao. ‘Um dos elementos semellautes 4 reuuviius mais bewt estudados é 0 transpéson TyI da levedura Saccharomyces cerevisiae. Esse elemento tem aproximadamente 5,9 qui- lopares de bases; suas LTR tém cerca de 340 pares de ba- DNA bifilamentar do HIV ‘tio de civagem a 3 xz, Sto de civagem ‘© integrase civa 0 DNA do HN perto da otvoridade 3 da cada flamerto. 8 3 Sitio de civager \. ‘Nucletiios de Sto de civagem ‘sequérciaaho de DNA we "Gs itcarace civ 0 DNAaKo eure sues exreidades 5 as extrenidades 3° do DNA do HW. e ‘As enzimas celares integram totalmente DNA do HV 20 DNAaho, ciando uma duplcacéo do stile. NA DNA do HIV Duplcacio do tio | FICURA 17.13 Integragio do DNA biflamentar do HIV 20 DNA cro- rmossémico da célula hospedeira. CCeptulo 17 | Elementos Geéticos Tansponivels 489 ‘isso cria uma duplicagio do sitio-alvo de 5 pb apés a insercio em um cromossomo. A maioria das cepas de levecturas tem por volta de 35 copias do elemento Ty/em seu genoma. Os elementos 71 36 tém dois genes. TpA € T)B, que sio homdlogos aos genes gag e pol dos retro- Vitus. Estudlus bivgutuicus musta ai que us produios desses dois genes podem formar particulas semelhantes 1a virus no citoplasma das células de levedura. A trans posicio de elementos 7) implica transcri¢io reversa de RNA (Figura 17.14). Depois que o RNA é sintetizado a par fr do DNA de 11, uma transcriptase reversa codihcada pelo gene 7)B usa-o como molde para produzir DNA bi- filamentar, provavelmente nas particulas semelhantes a virus. Depois, 0 DNA recémsintetizado é transportado para 0 mticleo ¢ inserido em algum ponto do genoma, criando um novo elemento Ty1. ‘Também foram encantradae slementns semethantes 3 retrovirus em Drasophila. Um dos primeiros identificados €denominado copia porque produz quantidades copiosas de RNA. O elemento copia € estruturalmente semelhante ao elemento TyI de levedura. O elemento gypsy, outro retrotranspéson de Drosophila, € maior que o elemento ‘copia porque contém um gene semelhante ao gene env de retrovirus. Os elementos copia e gypsy formam particu- lag kemethantes a virus dentro das eéhlas de Drosophila: no entanto, somente as particulas que contém RNA gypsy podem deslocarse através das membranas celulares, pos- sivelmente porque também contém o produto do gene encu de gypsy. Portanto, 0 elemento gypsy parece ser um re- trovirus genuino. Muitas outrae familias de tranepésone semelhantes a retrovirus foram encontradas em Drosophi- 1a, mas suas atividades sA0 pouco compreendidas. Enzima Prowina —ransenprase contra “reverse @ @ A 4 Gene TyA Gene TyB UR ore © renscntow | tienen ht para pear wna See, ly “Transcrgdo reversa do RNA TyI RNA em DNA por uma enzima coéiticada pelo gene TsB. Mh SBF nsercio do DNA no eromessamo, com a ciao de uma nova cénia do elemento Ty. | FIGURA 17-14 Transposicdo do elemento Ty1 de levedura.490. Fundamentos de Genética RETROPOSONS (Os etropésons, ou retrotranspésons nio LTR, sio uma classe grande e de distribuicéo ampia de retrotranspésons, entre les os elementos F Ge I de Drosophila ¢ varios tipos de ele- ‘mentos em mamiferos. Esses elementos moverse através de uma molécula de RNA que é transcrita de maneira re- versa em DNA, geralmente por uma proteina cochticaca pelos préprios elementas. Embora criem uma duplicacio do sitio-alvo quando se inserem em um cromossomo, nido tem repetigdes innvertidas nen ditetas conio parte integrate tes de suas terminacdes. Em vez disso, séo distinguidos por ‘uma sequéncia homogénea de pares de bases A:T em uma extremidade. Essa sequéncia é derivada da transcri¢io re- versa da cauda poli(A) acrescentada perto da extremidade 8 do RNA do retropéson durante sua maturacio. Portanto, ‘98 retrapéeone integracioe apresentam nim vestigia de sia crigem como transcritos reversos de RNA poliadenilados. Em Drosophia, hd rewopdsons especiais nas extremt- ‘dades (telémeros) dos cromossomos, que desempenham a fungdo crucial de repor 0 DNA perdido por replicago incompleta do cromossomo. A cada ciclo de replicagao do DNA, um cromossomo tornase mais curto. O encur PONTOS ESSENCIAIS - Lipiion do vires) foe ser fatal retrpeson um sentido, acrescentando nucleotidios 4 extremidade 3 de um iniciador (Capitulo 10). Em geral, 0 iniciador € RNA e quando ¢ retirado resta uma regio unifilamentar na extremidade do diiplex de DNA. No préximo ciclo de replitayau, v filament deficiewe prudue uss ddples iials corto qué o-criginal, Aomedida quis ewe proces continua, ciclo apés ciclo, o cromossomo perde material de sua extremidade. Para compensar essa perda, a Drosophila desenvolveu ‘um mecanismo cunioso com a particrpacao de no minimo dois retropésons diferentes. um denominado HéF-A ¢ 0 outro, TART (do inglés, elomere-associated retro trans- poson, retrotranspéson associado ao telémero). Mary Lou Pardue, Robert Levis, Harald Biessmann, James Ma- son € seus colegas mostraram que esses dois elementos transp3em-e preferencialmente para as extremidades dos cromossomos, alongando-os em varias quilobases. For fim, as sequencias transpostas sio perdidas por re- plicacio incompleta do DNA, mas depois hé uma nova transposicao para restauré-los. Portanto, os retropésons HePAc TART tém a importante Fangio de regencrar as cextremidades cromossOmicas perdidas. (Os genomas das retrovirus so consitwidos de RNA uniflamentar que formam tis genes: 2g (codificacio de proteinas estruturais da particula viral), pol (codifcacéo de uma pro 1a transcriptase reersa/integrase enw (odificacio de uma protina inserida no envoltrio + Oretrovirus HIV humano infectacélulas do sistema imune e causa AIDS, uma doenga que + Os elementos semethantes a retrovirus tom genes homélogos a gag epol, mas ndo aenv + Os elementos semelhantes a retrovirus eas formas de DNA de retrovirus inseridas em. ‘romossomas celulares sao demarcados or sequéncias de rept terminal longa (LTR) + Os reupisons ny tom LTR, ww entanty, cos unis eatinsided cs tov wis sequdneia de pares de bases A:T derioada da transcrigéo revesa de una cauda poli(A)fixada ao RNA do Os wtipiions HETA 6 TART sin componontes das etme des emassomas de Heese, Elementos transponiveis em seres humanos ‘© genoma humano & povoado por uma diversidade de elementos transponiveis que, juntos, representam 44% de todo o DNA humano. Com o sequenciamento do genoma humano, agora € possivel avaliar 0 significado dos elementos transponiveis ‘em nossa prépria espécie. No minimo 44% do DNA hu- mano é derivado de elementos transponiveis, inclusive de elementos seurcthiantes a reuuviius (6% do genviia sequenciado), retropésons (33%) ¢ varias familias de elementos cuja transposicao ocorre pelo mecanismo de “cortar e colar” (8%). principal elemento transponivel € um retropéson co- nhecido como LJ. Esse elemento pertence a uma classe ce sequéncias conhecidas como elementos nucleares intercalados longoe (Ne). Os elementos LJ completos tém cerca de 6 kb, cles tém um promotor interno que é reconhecido pela RNA polimerase Ile tém duas matrizes abertas de leitura: ORF. que codifica uma protefna de ligacio a dcidos n= cleicos, ¢ ORF2, que codifica uma proteina com atividades de endonuclease e transcriptase reversa. O genoma huma- ‘no contém entre 3.000 ¢ 5.000 elementos 1 completos. Além disso, contém mais de 500.000 elementos LI trunca- dos nas extremidades 5'; cases clementos Zt incompletos nio tém atividade de transposicao. Cada elemento LI no genoma, completo ou incompleto, geralmente é flanque- ado por uma curta duplicagio do sitioalvo. A transposi¢ao de L requer a transcricio de um ele- ‘mento L.1 completo em RNA e a transcricio reversa desse RNA em DNA (Figura 17.15). Os dois processos ocorremCoptuio 17 | Elementos Genéticos Tansponivels 491 |e Wood Ee oe ee im | 3 <8 Citoplasma | A Gun elenerto Lt completo inser em un su cOmossano 6 rrr ene RMA LL “G rare sem nie —__ $G Passage do RN de LI poadeiao para copes, Be °@ otro co A dL em dis ponents corespondntes a cada ORF Ess poles conta assocados a0 RNA de L1 se Gow ve Lie seu pobeyllin sola eta ns ce Go ooinentdio oRF2 carta um famento de wna macula de DNA cromossmic, ea etremicade 3'da aude po no RNA spa G0 LL 6 staosta a lado 5 do DNA cota ‘0 polieattio ORF2 exerce sua alvdade de transcriptase reversaesintetza um famento simples de DNA usando o RNA de LI sya, com MOE. Rextemidade 0! do DNA cromosséico cortado serve come nied dessa sintese de DNA. “G0 fiamento simoles de DNA recémsintetzado encaixase entre os dos lados do DNA cromassimico cortado. Simutaneamente. RNA de LI 6 elminado, eo curoflamento de DNA cromossbmico & cortado para possibitarasintese de um segundo fiamento de DNA Tina tracejada), complementar & sequbncia de L1,na draco indcada pela seta fina, Todos os cartes so reparados. para lgar 0 elemento LI recéminserido ao DNA cromassémico. | FICURA 17.15 Mecanisma hipotética de transposicdo de elementos L1 no genoma humano.© elemento L de apreximadamente 6 kb contém ‘use matrioe abortoe do litura, ORF» ORE2,tranccritae 9 parti de um promator comuim (0). 0 palipeptidia cadficede por ORF1 continua associado ao RNA de L1 € pode ser responsavel pelo retorno do RNA 20 nicleo. © polipeptigio codficado por ORF2 tern no minimo duas ‘ungbes catalticas.Primeiro, € capex de clivaros filamentes de DNA, portanto, € ume endonuclease. Em segundo luger, € capaz de sintetizer [DNA a partir de uri molde de RNA; portanto é uma transcriptase reversa.O tamenho da nova insergao de LT dependeré da distancia percorida pela transcriptase reversa ao longo do molde de RNA de L7. Se néo chegar a extremidace 5’, ainsercdo sera incompleta. InsergBes incompletas -eralmente néo tém promotoresfuncionals e, portanto, n8o produzem RNA de L1 para futuras transposicdes.492 Fundamentos de Genética no mticleo. No entanto, antes da trantcrigio reversa, © RNA de LI atravessa o citoplasma, onde é traduzido em polipeptidios que aparentemente permanecem associa- dos a ele quando volta ao niicleo. O polipeptidio codif cado por ORF? tem funcao de endonuclease que catalisa a divagem de uu Glamenw du ddples de DNA eu uit futuro sitio de insercao em um cromossomo. Entio, a ex- tremidade 3" desse filamento de DNA clivado atua como iniciador da sintese de DNA usando 0 RNA de LI como molde e a atividade de transcriptase reversa do polipep- tidio ORF, Desse modo, ¢ sintetyada uma sequencia de DNA de LI no ponto do cromossomo em que o polipepti- dio ORF? introduziu um corte unifilamentar. O DNA de L1 reeém-sintetizado € duplicado por sintese adicional de DNA, e o produto bifilamentar é integrado de modo covalente ao cromossomo para criar um novo elemento 11 Aeweres a regiéa 8! da RNA de TI nin é capiada em DNA. Quando isso acontece, a insercio de L1 no tem se- quéncias 5’, o que inclui o promotor, ¢ € incapaz.de gerar RNA por transcricéo comum, Assim, esses elementos LI incompletos nao terdo atividade de transposic ‘As c6pias transpostas de determinados clemento LI completos foram descobertas pela analise de indivi- duos com doencas genéticas como hemofilia e distrofia muscular A raridade desses casos sngere que a frequéncia da transposigao de L1 em seres humanos € baixa. Dois ‘outros tipos de sequéncias LINE, £2 (315.000 c6pias) € 3 (87.000 cépias), sio encontrados no genoma huma- no; no entanto, nenhur desses elementos tem atividade de transposicio. Os elementos nucearesintercaladoscurts (SINE) so a segun- da ciasse mais abundante de elementos transponiveis no genoma humano. A maioria desses elementos tem me- nos de 400 pares de bases e nao codifica proteinas. Assim PONTOS ESSENCIAIS como todot os retropésons, eles tém uma sequéncia de pares de bases A:T em uma extremidade. O processo de transposicao dos SINE requer a transcrigao reversa de um RNA transcrito a partir de um promotor interno. Embo- ra nao se compreendam bem os detalhes do processo de Wausposi¥av, pareve que 4 WaLiscsipiase 1everna HeLESsé ia para a sintese de DNA a partir do RNA do SINE é forneci- da por um elemento tipo LINE. Assim, os SINE dependem dos LINE para se multiplicar e inserir no genoma. Nesse aspecto, eles podem ser considerados retropésons que io pparasitos dos retroposons autenticos e de funcao autono- ‘ma como LI. O genoma humano contém trés familias de SINE, os elementos Alu, MIR © Ther2/MIR3. Entretanto, somente os clementas Alu—que reecbem 0 nome de uma cenzima que reconhece uma sequéncia nucleotidica espe- cifica neles — tém atividade de transposicio. CO genama humana tem mais de 410,100 saquénciae derivadas de elementos semelhantes a retrovirus. A. matoria dessas sequencias € constitufda de LTR solitarias. Embora mais de 100 diferentes familias de elementos semelhantes a retrovirus tenham sido identificadas no DNA humano, apenas algumas parecem ter apresentado atividade de transposicio na histéria recente da evolu- ‘cao. Assim como 05 LINE ¢ SINE inativos, quase todas as \cias semelhantes a retrovirus hnimanas sin fésseis genéticos remanescentes de um tempo em que apresen- ‘avam atividade de transposicio. Os transpésons de “cortar e colar” so um pequeno componente do genoma humano. O sequenciamento de DNA identificou dois elementos que tém relagio distan. te com os elementos A¢/Ds do milho, bem como alguns ‘outros tipos de elementos. lodos os dados disponiveis in- dicam que esses tipos de transpésons nao tém atividade de transposicao ha milhdes de anos. + Ogenoma humano tem quatro tipes basics de elements transpontors: LINE, SINE, elementos semelhaantes a retrovirus ¢ ranspésons de “cotar e colar” + OLINELL e oSINE Alu tim atividade de transposigdo; outros transpécons humanos arecem ser inativs. Significado genético e evolutivo dos elementos transponiveis Os elementos transponiveis so usados como instrumen- tos pelos geneticistas. Na natureza, participam da evolu Ao do genoma. TRANSPOSONS COMO MUTAGENOS Com frequéncia, as mutagdes espontineas sio conse- ‘quéncia da atividade do elemento transponivel. km Dro- sophila, por exemplo, muitos alelos mutantes espontane- 05 do gene white sio produzidos por insergdes de trans- pOvons. Na verdade, U primeitfssime wlely mutate de white, w, descoberto por T. H. Morgan, foi produzido por ‘uma insercao de transpéson. Essas observagdes sugerem {que 0s transpéxons so mmutigenos intringecos natnrais. A medida que percorrem o genoma, causam mutagio de genes € quebran cromossomos. s geneticistas exploraram 0 potencial mutagénico dos transpésons para romper genes. A mutagénese por transpé- con iniciow se nas décadas de 1070 © 1080 com oe clemen tos Pde Drosophila. Cruzamentos entre machos de cepas Pe emeas de cepas M produzem hibridos disgénicos nos quais ‘6 elementos P herdados do pai tornamse extremamente ativos. A medida que hi transposicao desses elementos nas (élulas da linhagen yerusinativa da pole hifbvid, veuirent mutagdes que podem ser recuperadas pelo cruzamentoapropriado dos hibridos. Um pesquisador poderia, por ‘exemplo, usar a técnica CIB de H. J. Muller (Capitulo 13) [para Tecuperar mutacoes letais recessivas induzidas por # no cromossomo X. Seguindo essa estratégia geral. 08 gene~ ticistas obtiveram insergdes do elemento Pem uma grande parcela dos genes io genoue de Dravida Outros tipos de transpésons foram usados para induzir mutagdes nos genomas de nematédeos, peixes, camun- dongos e varios vegetais. A mutagénese com transpésons tem uma vantagem em relacio aos métodos tradicionais de induzir mutagoes porque um gene que sotreu muta- ‘Go pela insercio de um elemento transponivel é “marca- do” com uma sequéncia de DNA conhecida. Em seguida, ‘vmarcador wanspésou pode ser usado pata isolar 0 ene de uma grande mistura heterogénea de DNA usando ‘uma sonda derivada de uma verso clonada do transpé- con, Portanto, a mutagénese por marcagse por trancpécan & uma técnica genética de referéncia. TRANSFORMAGAO GENETICA COM TRANSPOSONS Alguns transp6sons bacterianos — por exemplo, os trans P6sons compostos e Tn3 — levam genes cujos produtos Coptulo 17 | Elementos GenéticosTansponiveis 493 rio estio relacionados com a transpotigio. Essa o cio sugere que os transpésons poderiam ser usados para deslocar diferentes tipos de genes no genoma~ na verda- de, 08 genes tornam-e carga do transpéson. Também se- ria possivel usar transpésons para transferir genes entre Oorgautismios—isuw €, para tansforiar un organsisino Cont DNA obtido de outro organismo. Essas ideias inspiraram Gerald Rubin e Allan Spra- dling a investigar se um transpéson poderia levar um «gene clonado a um organismo. Gomo caso de teste, eles escolheram um dos muitos genes que determinam a cor dos olhos em Drasophila. Esse gene. denominado rosy (simbolo 1y), codifica a enzima xantina desidrogenase. As moseas que nao tém essa enzima isto é, mutantes 19 homozigotos — tém olhos castanhos, ao passo que moscas homorigotas para o alelo selvagem 7y" tém olhos verme- hos. Rubin e Spradling usaram técnicas de recombina do do DNA para inserir 0 gene ry" em um elemento P incompleto que fora clonado em um plasmidio bactena- no (Figura 17.16). Vamos designar esse elemento recom- binante de P(ry’). Em outro plasmidio, eles clonaram um clemento P completo capaz. de codificar a transposase do elemento P. Rubin e Spradling entdo injetaram uma mistura dos dois plasmidios em embrides de Drosophila « Vlor de mera P «-Eloert Peoplto-; Mitra Ge dis pasos mela 7 \, pNAetigtno / ‘Gone ta transposase (erminacoes dq + ) to 4 a 9 nseri0 do ONA exdgon om “BY insergdo de um elemento P “Mitra dos dis plasmios UneenanoPheenoktnen <> condo em ure asm. em soso pusnif © eno tne Eenism um gan ar cor dos alos (ry) como marcador, Em motes ese een edz los vere. ~ Cromossomo toeniee oO \ eehasane x 9 Nicnogse da icra do plasms em um emi de Drocophi mutant ry Ae imascas com muaeao ry ttm chs castantos os ‘lomanto P bs Na tntagum germinate do SG teary da clomente P ninade tembrn, a ransposese do femur cromossomo na inhagem completo cataica germinativa do embrigo 2 excsio do elemento P Incompleto do seu plasmisi. | FICURA 17.16 Transformagdo genética de Drosophila usando vetores do elernento P. O DNA exdgeno inserido entre terninagdes do elemen- to P€ integrado ao genoma por meio da acio de umia transposase codificada pelo elemento P completo, As moscas com esse DNA em seus ‘genomas podem ser ropagadas em culturas de laboratério.494 Fundamentos de Genetica homozigotos para um alelo ry mutante. Eles experavam que a transposase produzida pelo elemento P completo catalisasse 6 salto do elemento incompleto de seu plas- ‘midio para os cromossomos da linhagem germinativa e levasse 0 gene 79° como carga. Depois do amadurecimen- ty dus atiimaiy que 1ecebe 1 © Spa dling cruzaram-nos com moscas mutantes 7). Na prole, eles encontraram muitas moseas de olhos vermelhos. A anilise molecular subsequente demonstrou que essas ‘moscas de olhos vermelhos tinham 0 elemento P(ry*). Na yerdade, Kubin e Spradiing haviam corngido a cor dos ‘olhos do mutante pela insercio de uma cépia do gene rmsy selvagem no genoma da mosca — isto é, eles haviam transformade gencticamente moseas mutantes com DNA le moscas de tipo selvagem. A técnica desenvolvida por Rubin e Spradling agora & ueada ratine’ 4 injeviv, Rub mente para traneformar Drosophila com DNA clonado. Um elemento P incompleto serve como welor de transformacao, © umn elemento P completo serve como fonte de transposase necessaria para inserir 0 vetor nos cromossomos do embriio que recebe a injecdo. O termo welor provém do latim ¢ significa “o que leva". E usado nesse contexto porque o elemento P incompleto eva um fragmento de DNA ao genoma. Praticamente qualquer sequéncia de DNA pode ser pasta ne vetor ¢, por fim, inserida no animal. Infelizmente, os elementos P no sio eficazes como vetores de transformacio em outras espécies. No entan- to, of geneticistas idemtificaram varios transpésons que podem ser usados em seu lugar. Por exemplo, o trans poson piggBac de uma mariposa pode servir como ve- tor de transtormacdo em muitas espécies diferentes, € 0 transpdson Sleping Beauty do salmao tem boa atividade em vertebrados, inclusive em seres humanos, nos quais sud sendy desenvolvidy Coy possivel agente pata terse pia génica. TRANSPOSONS E ORGANIZACAO DO GENOMA Algumas regides genomicas sa0 espectaimente ricas em sequiéncias de transpésons. Em Drosophila, por exemplo, ‘5 transpésons so concentrados na heterocromatina ‘eéntvica € na heterocromatina eontigua & eucromatina de cada braco do cromossomo. Muitos desses transpé- sons, porém, sofreram mutacao até 0 ponto em que nao podem ser mobilizados: geneticamente, é 0 equivalente a estarem “mortos”, Portanto, a heterocromatina parece ser um tipo de cemitério com elementos transponiveis degenerados. Alguns dados, principalmente de estudos citol6gicas com Drosophila feitoe por Johng Lim, sugerem que ot elementos transponiveis participam da evolucio da es- trutura do cromossomo. Varios transposons de Drosophila foram implicados na formacio de rearranjos cromossé- micos, e alguns parecem rearranjar os cromossomos com alts fieyuéncia, Us mecasisuiy possivel & v casing aver entre transpésons homélogos localizados em diferentes | $B 0 conossona maura apa para que possa haver pareamento dos transpésons. i Regio deletada do BW Arecombiarioenveos transosrs oaeads deta a eps merposta Roo ‘romossomo com aelesao aa regao CDE fm FicUnA 17:17 Formagéo de uma delegSo per recombinagSe ints ‘romassémica entre dos transpésons no mesme sentido, posi¢des em um eromossomo, Se houver pareamento € ‘oonssing over de dois transposons de sentidos idénticos, ‘0 segmento entre eles sera deletado (Figura 17.17). Vocé pode explorar as consequéncias do. emssing mer entre dois transpésons em sentidos opostos em um. cromos somo em Resolva! Reatvanjos cromussuicus snediados por transpésons, ‘Também pode haver omssing over entre transpésons, ocalizados em diferentes cromossomos. Na Figura 17.18 analisamos um caso em que duias cromitides-irmas parti ‘ipa do crossing over: Cada cromatice tem dois transpo- sons vizinhos no mesmo sentido. O transpéson 4 esquer «laem uma cromatide emparelhouse com o transpéson a liteita na Gutta, Unt ersing yor? ELLE ENE Lan9pOLIN ‘emparelhados produz duas cromatides com alteracdes cestruturais, uma nao tem o segmento entre os dois trans- pésons ea outra tem tuma e6pia extra desse segmento. O ‘xmssing aver entre transpésons vizinhos pode duplicar ou deletar segmentos cromossomicos — ou seja, pode expan- dir ou contrair uma regido do genoma, Rearranjus cromussdmicus mediados por transpésons Suponha que um cromassomo tenha duas cépias de um trans- péson em sentidas opostas. ordem dos genes no cromasso- mo AB CDEFG; um transpéson esté lecaizado entre 05 ‘genes Be C,e0 outro esté entre os genes Ee F. Se houver pare- ‘amento dos dots transposons, seguido de um crossing over, qual ‘serd a ordem dos genes no cromassomo resultante? A resposta Leia aresposta do problema nosite ‘tp:1/gen-io.grupogen.com.br.Ceptulo 17 | Elementos Genéticos Tansponivels 495, CCromossomo cam dois ‘ranspbsons vzinhos ‘no mesmo sentido “© viene 6 cromossno eat Cronies’ 7 “ores cone aaa \ So, Hé paeamento desigal das cromabes ima, e 2 ‘ecombacaomedada Efamassomo com ana elec e outro com uma ‘inicacao =o=> CCromossorno com regio deltada 1m FIGURA 17.18 Origem de duplicagSes « delegdes por crossing over desigual mediade por transpésan entre cromitides-irmis PONTOS ESSENCIAIS. penomas 1+ Os ranspisons so usados em pesquisa genética para indusir mutagies + Os transpesons so usados como vetoes para mover o DNA dentro dos genomas e entre + Ocrossing over entre transpisons parades de criar rearvanjos cromossimicos. Exercicios 1. Desenhe um elemento IS bacteriano inserido em tum plasmidio circular. Indique as posicoes de (a) gene da transposase, (b) repeticies invertidas ter inais e (c) duplicacio do sitio-alvo, epencoes ‘vertidas tera, Gene da transposase Dubicacao de stoavo 2 Que fator tem de estar presente no mitho para mo- Dilizar um elemento Ds inserido em. um braco do Resposta: O elemento Ds é mobilizado quando a transpo- sase codificada por um elemento Acatua sobre ele. Portanto, € preciso que haja wn elemento Ac em, algum ponto do genoma do milho. 3. Um geneticista tem das cepas de Drosophila. Uma, ‘um estoque antigo do laboratério com olhos bran- cos, nao tem elementos P.a outa, recentemente de- rivada de moscas de tipo selvagem coletadas em um ‘mercado de frutas, tem elementos em seu genoma. Qual dos cruzamentos.a seguir deveria produzir pro- le hibrida dlisgénica: (a) femeas de olhos brancos x machos de upo selvagem, (b) machos de othos bra- cos X fémeas de tipo selvagem, (c) femeas de olhos brancos X machos de olhos brancos, (dl) fémeas de tipo selvagem % machos de tipo selvagem? Respuste, (a) feueay de ullius bianco » selvagem. As femeas de olhos brancos nao tém ele- ‘mentos Pem seus genomas e também sio incapazes de produzir © transmitir os piRNA que poderiam reprimir os elementos P na linhagem germinativa da prole. Os machos de tipo selnagem tém elemen- tos Pom sour genomas, o também so capasee da produit piRNA repressores, No entanto, os piRNA nao sio transmitidos @ prole pelos espermatozoi- des. Assim, quando 0s machos de tipo selvagem sio cruzadios com fémeas de olhos brancos, a prole her da elementos Pdo pai e nao herda a capacidade de reprimir esses elementos da mae, Essa combinacio de fatores possibilita a ativacao de elementos P de heranga paterna nos tevidos de Tinhagem germina tiva da prole, com consequente disgenesia hibrida. macho de spo 4. Quais sio as semelhancas ¢ as diferencas entre re- trovirus, elementos semelhantes a retrovirus e re- tropésons? Resposta: Os trés tipos de retraelementos usam transerie Gio reversa para inserir c6pias de DNA de seu RNA «em novos sitios no genoma da célula, Alem disso, a enzima (transcriptase reversa) que catalisa a trans-