BF3524

Phương pháp đánh giá

chất lượng thực phẩm
PHÂN TÍCH VI SINH VẬT THỰC PHẨM
TS. Nguyễn Chính Nghĩa – Khoa Kỹ thuật Thực phẩm
Email: nghia.nguyenchinh@hust.edu.vn
 MÔ TẢ HỌC PHẦN

Tên học phần: Phương pháp đánh giá chất lượng thực phẩm
Mã số học phần: BF3524
Khối lượng: 4(3-0-2-8)

- Lý thuyết: 45 tiết

- Bài tập/BTL:

- Thí nghiệm: 30 tiết

2
 MÔ TẢ HỌC PHẦN
CĐR được Tỷ
Điểm thành phần Phương pháp đánh giá cụ thể Mô tả
đánh giá trọng
[1] [2] [3] [4] [5]
A1. Điểm quá trình (*) Đánh giá quá trình 30%
A1.1. Kiểm tra giữa kỳ Kiểm tra viết M1.4; M2.6 30%

A2. Điểm cuối kỳ A2.1. Thi cuối kỳ Thi viết M1.1; M1.2; 70%
M1.3; M2.1;
M2.2; M2.3;
M2.4; M2.5

3
 CHUẨN ĐẦU RA
Mục CĐR được phân bổ cho HP/
Mô tả mục tiêu/Chuẩn đầu ra của học phần
tiêu/CĐR Mức độ (I/T/U)
[1] [2] [3]
M1 Hiểu được nguyên tắc các phương pháp phân tích dùng trong phân tích chất lượng thực 1.1.4; 1.1.5; 1.2.2
phẩm
M1.1 Nắm được nguyên tắc phương pháp và sơ đồ nguyên lý hoạt động của thiết bị dùng trong [1.1.4; 1.1.5] (I,T)
phân tích công cụ
M1.2 Nắm được nguyên tắc phương pháp và sơ đồ nguyên lý hoạt động của một số thiết bị dùng [1.1.4; 1.1.5; 1.2.2] (T)
trong phân tích chỉ tiêu hóa học của thực phẩm
M1.3 Nắm được nguyên tắc phương pháp phân tích cảm quan dùng trong đánh giá chất lượng thực [1.1.4; 1.1.5; 1.2.2] (I)
phẩm
M1.4 Nắm được nguyên tắc phương pháp phân tích vi sinh vật dùng trong đánh giá chất lượng [1.1.4; 1.1.5; 1.2.2] (T)
thực phẩm
M2 Vận dụng được các kiến thức lý thuyết trong phân tích chất lượng thực phẩm 1.1.4; 1.1.5; 1.2.2; 1.2.4;
1.5.2
M2.1 Các phương pháp và thiết bị sử dụng trong phân tích nước trong thực phẩm. Chọn phương [1.1.4; 1.1.5; 1.2.2; 1.2.4;
pháp phân tích phù hợp với từng đối tượng thực phẩm 1.5.2] (T,U)
M2.2 Các phương pháp và thiết bị sử dụng trong phân tích nguyên tố khoáng trong thực [1.1.4; 1.1.5; 1.2.2; 1.2.4;
phẩm. Chọn phương pháp phân tích phù hợp với từng đối tượng thực phẩm 1.5.2] (T,U)
M2.3 Các phương pháp và thiết bị sử dụng trong phân tích gluxit trong thực phẩm. Chọn phương [1.1.4; 1.1.5; 1.2.2; 1.2.4;
pháp phân tích phù hợp với từng đối tượng thực phẩm 1.5.2] (T,U)
M2.4 Các phương pháp và thiết bị sử dụng trong phân tích lipit trong thực phẩm. Chọn phương [1.1.4; 1.1.5; 1.2.2; 1.2.4;
pháp phân tích phù hợp với từng đối tượng thực phẩm 1.5.2] (T,U)
M2.5 Các phương pháp và thiết bị sử dụng trong phân tích protein trong thực phẩm. Chọn phương [1.1.4; 1.1.5; 1.2.2; 1.2.4;
pháp phân tích phù hợp với từng đối tượng thực phẩm 1.5.2] (T,U)
M2.6 Các phương pháp và thiết bị sử dụng trong phân tích vi sinh vật trong thực phẩm. Chọn [1.1.4; 1.1.5; 1.2.2; 1.2.4;
phương pháp phân tích phù hợp với từng đối tượng thực phẩm 1.5.2] (T,U)
M3 Thực hiện lập kế hoạch quản lý quá trình sản xuất và quản lý chất lượng thực phẩm 4.3.2; 4.3.3
M3.1 Chủ động lập kế hoạch quản lý quá trình sản xuất và quản lý chất lượng thực phẩm [4.3.2; 4.3.3] (T)

4
ĐỀ CƯƠNG MÔN HỌC

5
ĐỀ CƯƠNG MÔN HỌC

6
ĐỀ CƯƠNG MÔN HỌC

7
ĐỀ CƯƠNG MÔN HỌC

8
 CÁC BÀI THÍ NGHIỆM

• Bài 1. Phân tích chất lượng thực phẩm bằng phương pháp phổ hấp thụ hồng ngoại và cận
hồng ngoại (phương pháp nhanh)
• Giúp sinh viên tiếp cận với các phương pháp phân tích hiện đại trong phân tích chất lượng
thực phẩm
• Bài 2. Xác định hàm lượng tinh bột trong thực phẩm
• Nhằm giúp sinh viên hiểu biết các phương pháp thông dụng xác định tổng lượng tinh bột
trong nguyên liệu và sản phẩm thực phẩm
• Bài 3. Đánh giá mức độ thủy phân tinh bột
• Nhằm đánh giá mức độ thủy phân tinh bột dưới tác dụng của -amilaza
• Bài 4. Xác định hàm lượng đạm tổng trong thực phẩm
• Đánh giá chất lượng các sản phẩm thực phẩm (thịt, cá, nước mắm, sữa...) thông qua hàm
lượng đạm tổng
• Bài 5. Đánh giá chất lượng dầu mỡ
• Đánh giá chất lượng lipit thông qua các chỉ tiêu đặc trưng cho sự biến đổi thành phần
lipit, đặc biệt trong quá trình gia nhiệt.

9
 CÁC BÀI THÍ NGHIỆM

• Bài 6. Phân tích các chỉ tiêu dưới đây của một trong số
các sản phẩm thực phẩm (như sữa, thịt, patê, bia, rau quả,
bia…): Tổng số vi sinh vật hiếu khí, ưa ẩm; nấm men –
nấm mốc; Coliforms và E.coli;

10
Phần 4: Phân tích vi sinh vật thực phẩm

Chương 1: Vi sinh vật nhiễm tạp trong thực phẩm

1.1. Giới thiệu chung

1.2 Mục đích và ý nghĩa kiểm tra vi sinh vật trong các
sản phẩm thực phẩm
1.3. Vi sinh vật gây hỏng sản phẩm thực phẩm
1.4. Vi sinh vật gây bệnh và gây ngộ độc

11
Phần 4: Phân tích vi sinh vật thực phẩm

Chương 2: Các phương pháp định lượng vi sinh vật

trong thực phẩm
2.1. Nguyên tắc chung
2.2. Phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch
2.3. Phương pháp số xác xuất lớn nhất (MPN)
2.4. Phân tích một số vi sinh vật nhiễm tạp trong thực
phẩm
2.5. Các phương pháp phân tích dựa trên kỹ thuật
sinh học phân tử

12
 Các phương pháp đánh giá chất lượng thực phẩm

•Học cái gì?

•Học như thế nào?

13
Tài liệu tham khảo

• Lê Thanh Mai (chủ biên), Các phương pháp phân tích trong
ngành Công nghệ lên men. Nhà xuất bản Khoa học và kỹ
thuật, Hà nội 2007.

• Trần Linh Thước. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong
nước, thực phẩm và mỹ phẩm. Nhà xuất bản Giáo dục, Hà nội
2008

• S. Suzanne Nielsen. Food Analysis Laboratory Manual, Third

Edition. Springer, 2017

• Microbiology, Rice University, 2016

14
KHI ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THỰC PHẨM, TA CẦN ĐÁNH
GIÁ NHỮNG CHỈ TIÊU GÌ?

15
 Đại lượng đặc trưng thực phẩm
Chỉ tiêu hóa học Chỉ tiêu hóa lý

• Thành phần: protein, • Độ nhớt

lipid, carbohydrate, • Nhiệt độ nóng chảy
vitamin, phụ gia • Nhiệt độ kết tinh
• Giá trị dinh dưỡng • Độ cứng
…………….

Chỉ tiêu cảm quan

Tính độc và vệ
• Màu sắc sinh an toàn TP

• Mùi vị • Độc tố
• Cấu trúc • Vi sinh vật

16
17
18
CHƯƠNG 1: VI SINH VẬT
NHIỄM TẠP TRONG
THỰC PHẨM

1.1. GIỚI THIỆU CHUNG

19
van Leeuwenhoek Louis Pasteur Robert Koch
(1632-1723) (1822–1895) (1843–1910)

20
Microbiology, Rice University, 2016

21
Microbiology, Rice University, 2016

22
Vi sinh vật thực phẩm

23
Vi sinh vật thực phẩm

–Gây bệnh
–Gây hư hỏng sản phẩm – làm biến đổi chất lượng của
thực phẩm
–Có lợi – dùng cho chế biến thực phẩm, có sẵn trong
cơ thể

Streptococcus thermophilus Lactobacillus delbrueckii

subsp. bulgaricus.

24
 ẢNH HƯỞNG CỦA VSV GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM

31 mối nguy gây ra 32 bệnh

- 11 tác nhân gây tiêu chảy (1 virus, 7
vi khuẩn, 3 động vật nguyên sinh)
- 7 tác nhân gây bệnh truyền nhiễm
xâm lấn (1 virus, 5 vi khuẩn, 1 động
vật nguyên sinh)
- 10 loại giun sán
- 3 loại hóa chất

600 triệu ca ngộ độc

thực phẩm/năm

https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/food-safety
110 tỉ USD/năm

25
26
 ẢNH HƯỞNG CỦA VSV GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM

• 125 vụ ngộ độc thực phẩm (gia

tăng tại các bếp ăn tập thể)
• 2100 người ngộ độc
• 28 ca tử vong

https://commons.wikimedia.org/wiki/File https://tuoitre.vn/2-100-nguoi-ngo-doc-28-nguoi-chet-moi-nam-bao-
:Vietnam_Full_flag_map.svg dong-thuc-pham-ban-2024010318042087

27
VI SINH VẬT NHIỄM TẠP TRONG THỰC PHẨM

BẢO QUẢN,
NGUYÊN LIỆU PHÂN PHỐI,
SỬ DỤNG

SẢN XUẤT

Image Credit: GoodStudio/Shutterstock.com

28
BIỆN PHÁP ĐẢM BẢO VỆ SINH ATTP

29
 BIỆN PHÁP ĐẢM BẢO VỆ SINH ATTP

Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học hóa

học thực phẩm
QĐ 46/2007/QĐ-BYT
Luật an toàn thực
phẩm
Số 55/2010/QH12
Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với ô nhiễm vi
Nghị định số sinh vật trong thực phẩm
15/2018/NĐ-CP QCVN 8-3: 2012/BYT

TCVN

30
BIỆN PHÁP ĐẢM BẢO VỆ SINH ATTP

• In 2010, the Food Standards Agency introduced

the Food Hygiene Rating Scheme (FHRC) in UK.
• Reduction of 3700 cases/year
• Reduction of economic burden of 15.7 millions
USD/year

Fleetwood et al., 2023. “Foodborne illness, hygiene scores, and the “switch effect”. Food and Humanity 1

31
Vi sinh vật có lợi

Vi khuẩn lactic…..
Lactobacillus

Streptococcus lactis - Lactic

- Mốc Penicillium

32
Vi sinh vật có lợi
Pho mát Bleu de Gex, một loại pho
mát mốc bán mềm được sản xuất tại
vùng Jura, Pháp
Brevibacterium linens
để tạo hương vị
Pho mát mốc Gorgonzola
được sản xuất tại Italy
Mốc Penicillium
-Penicillium roqueforti
-Penicillium glaucum
33
Vi sinh vật có lợi

Nấm men

Nấm mốc

34
 Một số loại vi khuẩn có thể bổ sung chủ động vào SPTP

Loại vi khuẩn Đặc tính Môi trường thích hợp

Streptococcus lactic Cầu khuẩn, tạo axit ; topt : 30-350C
S. cremoris Cầu khuẩn, kết chuỗi dài, tạo axit ; topt :
250C
S. thermophilus Cầu khuẩn, kết chuỗi dài, tạo axit ; topt :
40 - 450C Sữa và các sản phẩm
L. bulgaricus Trực khuẩn, kết chuỗi dài, tạo axit ; topt : sữa
40 - 450C
L. casei Trực khuẩn nhỏ, topt : 30 - 350C
L. acidophilus Trực khuẩn dài, sinh bacterioxin, tạo
màng nhầy ; topt : 30 - 350C
L. delbrueckii Trực khuẩn, topt : 44 - 500C Hạt ngũ cốc, bột
L. plantarum Trực khuẩn nhỏ, kết đôi hoặc chuỗi, topt : Rau quả tươi và đã
L. brevis 300C muối
Propionibacterium Trực khuẩn, không sinh bào tử, topt : 30 - Sữa và các sản phẩm
350C, lên men propionic sữa

35
Why do we need to assess
VÌ SAO TA
microbiological quality of food
CẦN
ĐÁNH GIÁ VI SINH
products?
VẬT TRONG SẢN
PHẨM THỰC PHẨM?

36
1.2. MỤC ĐÍCH, Ý NGHĨA
KIỂM TRA VI SINH VẬT
TRONG THỰC PHẨM

37
 Chất lượng vi sinh
Chất lượng thương mại Chất lượng vệ sinh
(hư hỏng SPTP) (mức độ nguy hiểm)
- Lượng VSV gây hỏng SP -Lượng độc tố do VSV
-Lượng VSV gây bệnh

Đảm bảo được chất lượng vi sinh của thực phẩm

Giám sát, kiểm tra quá trình sản xuất, bảo quản & phân phối
Chống lại quá trình phát triển của vi sinh vật
Giảm đến mức tối thiểu sự nhiễm tạp

38
Mục tiêu và yêu cầu

Mục tiêu
 Đảm bảo ATVS & CLSP theo chỉ tiêu số lượng VSV
Khó khăn kiểm tra vi sinh :
➢ Cần nhiều thời gian phân tích vi sinh
➢ Chi phí cao
➢ Độ chính xác và an toàn thấp
Yêu cầu
 Phân tích nhanh + Chi phí thấp

Theo dõi, giải quyết Làm nhiều mẫu

sự cố trong SX tăng độ chính xác

39
CHỈ TIÊU VI SINH NÀO?

40
 LUẬT, QUY ĐỊNH, TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học hóa

học thực phẩm
QĐ 46/2007/QĐ-BYT
Luật an toàn thực
phẩm
Số 55/2010/QH12
Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với ô nhiễm vi
Nghị định số sinh vật trong thực phẩm
15/2018/NĐ-CP QCVN 8-3: 2012/BYT

TCVN

41
ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU CỦA CÁC NHÓM VSV

Microbiology, Rice University, 2016

42
VI SINH VẬT VÀ SẢN PHẨM THỰC PHẨM

43
VI SINH VẬT VÀ SẢN PHẨM THỰC PHẨM

44
 1.3. VI SINH VẬT GÂY
HƯ HỎNG THỰC PHẨM

45
Những biến đổi trong sản phẩm gây ra bởi VSV

• Giảm chất lượng cảm quan : Thay đổi màu sắc,

mùi vị, nhìn thấy nấm mốc trên bề mặt sản phẩm...
• Phá vỡ cấu trúc của SP : tạo khí CO2, H2, sản
phẩm mềm ra...
• Thay đổi pH ➔ ↓thời gian tồn tại của sản phẩm
• Giải phóng ra các độc tố

 Nấm men, vi khuẩn và nấm mốc

46
VSV gây hư hỏng sản phẩm

Nấm men (ở nhiệt độ thường):

• Sản phẩm có nồng độ đường cao, nước quả, nước ngọt hay mật,
siro, rượu vang, bia…. Saccharomyces hoặc Zygosaccharomyces
• Tạo màng nhày Pichia, Hansenula, Debaryomyces, Mycoderma,
Candida…
• Hoạt tính protease cao, tạo ra vị đắng: Mycoderma
• Tạo sắc tố là Rhodotorula
• Sản phẩm có nồng độ chất béo cao: Geotrichum

Saccharomyces cerevisiae
Credit: University of Basel/SNI/Nano Imaging Lab

47
Thực phẩm nhiễm nấm mốc

48
 CÁC LOẠI NẤM MỐC
Nấm mốc:
 Aspergillus
 Penicillium
 Fusarium
Điều kiện phát triển tốt:
 W :  0,8
 To : < 25oC
 Thoáng khí
 pH : 3 - 5,5 Aspergillus oryzae
 Môi trường giàu glucose
49
 CÁC LOẠI NẤM MỐC

Fusarium culmorum Aspergillus niger Penicillium expansum

50
 Một số loại nấm mốc nhiễm vào SPTP

Loại nấm mốc Môi trường thích hợp

Mucor cremosis - Các loại SPTP chứa đường, tinh bột
Mucor rouxii - Pho mát
Rhizopus nigricans Bánh mỳ, hoa quả, rau xanh
Aspergilus clavatus Trong môi trường có nồng độ đường và muối
Aspergilus ochraceus cao
Aspergilus flavus
Aspergilus oryzae
Aspergilus repens
Penicillium expansum Hoa quả (cam, chanh)
Penicillium italicum Pho mát
Penicillium camemberti
Penicillium roqueforti
Trichothecium roseum Hoa quả, gỗ, giấy
Geotricum candidum Sản phẩm sữa, kem, trứng

51
 1.4. VI SINH VẬT GÂY
BỆNH VÀ GÂY NGỘ ĐỘC

52
Vi khuẩn có hại gây bệnh

E. coli Listeria Pseudomonas

Salmonella Clostridium
Vibrio
perfringens
53
Ngộ độc thực phẩm (Food poisoning)

Chỉ tất cả các hiện tượng bất bình thường xảy

ra với cơ thể sau khi ăn hoặc uống. Hoặc nói
cách khác: ngộ độc thực phẩm là hiện tượng
xuất hiện phản ứng tiêu cực của cơ thể sau
khi tiêu dùng thực phẩm.

54
Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm

Lâm Quốc Hùng và cs,. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM Ở VIỆT NAM GIAI ĐOẠN 2002 – 2010. Tạp chí Khoa học
và Công nghệ 49 (6A) (2011) 86-92

55
Ngộ độc thực phẩm

⚫ Khoảng 31 bệnh do VSV gây bệnh hoặc

truyền qua TP:
⚫ 64% do vi khuẩn
⚫ Salmonella spp. (35%)

⚫ Campylobacter spp. (15%)

⚫ 27% do virus

⚫ 9% do ký sinh trùng

56
Các loại ngộ độc thực phẩm

Nhiễm trùng (Infection)

• Ăn phải thực phẩm có nhiễm mầm bệnh
Ngộ độc (Intoxication)
• Ăn phải thực phẩm nhiễm độc tố của vsv
• Ăn phải thực phẩm chứa độc tố hóa học hoặc sinh học,
liều lượng VSV quá cao
Toxin-mediated infection (Thực phẩm nhiễm độc tố trung
gian)
• Ăn phải thực phẩm có chứa VSV gây bệnh có thể phát
triển trong cơ thể và sinh độc tố

57
 NỘI ĐỘC TỐ VÀ NGOẠI ĐỘC TỐ
• Nội độc tố (enterotoxin):
- Tổng hợp bên trong tế bào nhưng không tiết ra khi VK còn sống
- Chỉ tiết ra và gây ngộ độc khi tế bào đã chết
- Thường bền nhiệt và độc tính yếu
• Ngoại độc tố (exotoxin)
- Tổng hợp bên trong tế bào và thải ra ngoài môi trường
- Có bản chất protein
- Dễ bị mất hoạt tính do nhiệt, axit
- Có độc tính mạnh

• Độc tố không bền với nhiệt (LT: Labile Thermo-toxic)

• Độc tố bền nhiệt (ST= Stable Thermo-toxic)

58
 Danh sách vi sinh vật gây bệnh chính trong thực phẩm tại Hoa Kỳ

Tỷ lệ nhập viện Tỷ lệ tử vong

Vi sinh vật Tổng cộng Tổng cộng

Tỷ lệ nhập Tỷ lệ tử vọng
(Khoảng tin cậy (Khoảng tin cậy
viện (%) (%)
90%) 90%)

Vi khuẩn
Bacillus cereus, foodborne 0.4 20 (0–86) 0 0
Brucella spp. 55.0 132 (79–197) 0.9 2 (1–4)
13,240
Campylobacter spp. 17.1 0.1 119 (0–523)
(6,770–23,827)
Clostridium botulinum, foodborne 82.6 42 (19–77) 17.3 9 (0–51)

Clostridium perfringens, foodborne 0.6 439 (45–2,015) <0.1 26 (0–163)

Shiga toxin–producing Escherichia coli
46.2 3,268 (844–7,052) 0.5 31 (0–173)
(STEC) O157
STEC non-O157 12.8 405 (0–1,451) 0.3 0
Enterotoxigenic E. coli (ETEC),
0.8 26 (0–119) 0 0
foodborne

E. coli gây tiêu chảy 0.8 26 (0–120) 0 0

(Scallan et al. 2011, Foodborne Illness Acquired in the United States—Major Pathogens)
 Danh sách vi sinh vật gây bệnh chính trong thực phẩm tại Hoa Kỳ

Tỷ lệ nhập viện Tỷ lệ tử vong

Vi sinh vật Tỷ lệ nhập Tổng cộng Tỷ lệ tử
Tổng cộng
(Khoảng tin cậy
viện (%) (Khoảng tin cậy 90%) vọng (%)
90%)
Listeria monocytogenes 94.0 1,520 (544–3,152) 15.9 266 (0–765)
Mycobacterium bovis 55.0 108 (79–140) 4.7 9 (8–11)
23,128
Salmonella spp., nontyphoidal 27.2 0.5 452 (0–1,210)
(10,221–44,860)
S. enterica serotype Typhi 75.7 623 (0–1,848) 0 0
Shigella spp. 20.2 5,491 (1,100–13,741) 0.1 38 (0–254)

Staphylococcus aureus, foodborne 6.4 1,067 (173–3,006) <0.1 6 (0–48)

Streptococcus spp. group A, foodborne 0.2 1 (0–6) 0 0

Vibrio cholerae, toxigenic 43.1 7 (0–16) 0 0
V. vulnificus 91.3 202 (120–303) 34.8 77 (43–120)
V. parahaemolyticus 22.5 129 (66–219) 0.9 5 (0–22)
Vibrio spp., other 37.1 163 (101–240) 3.7 16 (6–36)
Yersinia enterocolitica 34.4 637 (0–1,396) 2.0 34 (0–206)
50,673 1,093
Tổng cộng
(30,578–75,466) (358–2,247)
(Scallan et al. 2011, Foodborne Illness Acquired in the United States—Major Pathogens)
 Danh sách vi sinh vật gây bệnh chính trong thực phẩm tại Hoa Kỳ

Tỷ lệ nhập viện Tỷ lệ tử vong

Vi sinh vật Tổng cộng Tổng cộng

Tỷ lệ nhập Tỷ lệ tử
(Khoảng tin cậy (Khoảng tin cậy
viện (%) vọng (%)
90%) 90%)
Ký sinh trùng
Cryptosporidium spp. 25.0 2,725 0.3 46 (0–241)
(777–6,558)
Cyclospora cayetanensis 6.5 20 (0–190) 0.0 0
Giardia intestinalis 8.8 3,581 0.1 34 (18–51)
(2,414–4,822)
Toxoplasma gondii 2.6 8,889 0.2 656 (409–952)
(5,383–13,203)
Trichinella spp. 24.3 6 (0–18) 0.2 0
15,221 736
Tổng cộng
(10,617–20,867) (456–1,094)
 Danh sách vi sinh vật gây bệnh chính trong thực phẩm tại Hoa Kỳ

Tỷ lệ nhập viện Tỷ lệ tử vong

Vi sinh vật Tổng cộng

Tỷ lệ nhập viện Tổng cộng Tỷ lệ tử
(Khoảng tin cậy
(%) (Khoảng tin cậy 90%) vọng (%)
90%)
Virus
Astrovirus 17,430
0.4 < 0.1 5 (1–9)
(10,203–21,573)
Hepatitis A virus 31.5 2,255 2.4 171 (94–299)
(1,250–3,953)
Norovirus 0.03 56,013 < 0.1 571 (331–881)
(32,197–86,569)
Rotavirus 1.7 69,721 < 0.1 32 (23–40)
(55,958–84,348)
Sapovirus 0.4 17,430 < 0.1 5 (1–9)
(13,990–21,087)
162,850 783
Tổng cộng
(130,126–199,658) (522–1,112)
Vi sinh vật gây bệnh và gây ngộ độc

1. Coliforms và Escherichia coli,

2. Staphylococcus aureus,
3. Salmonella (thương hàn),
4. Shigella (kiết lị)
5. Clostridium (Clostridium tetani uốn ván),
6. Bacillus cereus,
7. Vibrio (Vibrio cholerae bệnh tả),
8. Pseudomonas aeruginosa,
9. Listeria monocytogenes (sảy thai),
10. Streptococcus faecalis

63
1. Coliforms

Xác định lượng Coliforms và E. coli cho biết mức độ ô nhiễm và

tình trạng vệ sinh trong phân xưởng sản xuất

Đặc điểm Coliforms

• Trực khuẩn
• Gram (-), không tạo bào tử, không di động
• Yếm khí không bắt buộc
• Lên men lactoza, sinh khí
• Nhiệt độ: -2 đến 500C
• pH: 4 – 9
• Escherichia, Citrobacter, Klebsiella và Enterobacter

64
E. coli = Coliforms ưa nhiệt

1885 : Theodor Escherich đã phân lập từ phân trẻ em bị bệnh

1971 : Xếp nhóm VSV gây bệnh trong thực phẩm

 Chỉ tiêu này để đánh giá mức độ nhiễm phân mới

Coliforms

Coliforms
E. coli
chịu nhiÖt

65
Escherichia coli

Đặc điểm
• Có tất cả các đặc tính của Coliform
• Nhiệt độ thích hợp 42- 440C
• Bền với phenol 0,085%
• Sinh indole ở 42- 440C
• Tạo độc tố mạnh (tùy chủng)
• Có thể di động hoặc không di động

66
Đéc tè E.coli

5 nhóm E.coli sinh độc tố:

• EnteroToxigenic (ETEC) gây ngộ độc

• EnteroHemorrhagic (EHEC) tiêu chảy ra máu
• EnteroInvasive (EIEC): tróc niêm mạc gây tiêu chảy
• EnteroPathogenic ( EPEC) gây bệnh
• EnteroAggregative ( EAggEC)

67
EnteroToxigenic ( ETEC)

- Thường có ở đường ruột trẻ em hoặc khách du lịch

- Tạo enterotoxin rất độc và gây bệnh nặng cho người
- Có cả 2 loại LT và ST
- LT là loại protein, gây hoạt hóa adenylcyclase trong tế
bào biểu mô ruột, tăng lượng AMP, kích thích bài tiết
Cl- và ức chế tái hấp thụ Na+ làm tiêu chảy và mất
nước trầm trọng
- ST : hoạt hóa guanylcyclase, tăng lượng GMP kích
thích bài tiết nước và muối, gây tiêu chảy

68
Enterohemorrhagic ( EHEC)

- Sinh độc tố Shiga  SLT (Shiga like toxin) , 2 loại

- SLT1 (Stx1) : verotoxin
- SLT2 (Stx2) : verocytotoxin
- Tế bào có khả năng chịu nhiệt tốt
- Gây đi ngoài chỉ toàn máu hoặc có kèm cục máu
- Gây đau bụng thắt cơ bụng.

69
Enteroinvasive ( EIEC)

- Không tạo enterotoxin

- Có khả năng phát triển nhanh và rất nguy hiểm

- Gây đau đầu, nôn mửa

- Sèt , n«n möa, co rót c¬ b¾p

- Đi ngoài ra máu, có mủ, có đờm

- Đau bụng dữ dội, đau bụng thắt cơ bụng.

70
EnteroPathogenic ( EPEC)

- Không tạo enterotoxin

- Có khả năng gây bệnh cho người, đặc biệt các

em nhỏ <1 tuổi

71
Enteroaggregative ( EAggEC)

- Giống loại EPEC nhưng tế bào kết dính tạo thành khối
lớn
- Tạo enterotoxin rất độc và gây bệnh nặng cho người
- Tạo độc tố ST

72
Bệnh do E.coli gây ra

• Viêm ruột, tiêu chảy

• Viêm thận: bệnh đường tiết niệu (đi tiểu lắt nhắt,
đau, ra máu)
• Trong trường hợp cơ thể yếu, sức đề kháng gảm sẽ
vào máu gây nhiễm khuẩn máu
• Viêm màng não (khoảng 40%, đặc biệt nguy hại cho
trẻ em)

73
Các thực phẩm dễ nhiễm E.coli

• Thịt tươi hoặc thịt gia nhiệt chưa đủ

• Sữa và các sản phẩm sữa không qua thanh trùng
• Các loại sản phẩm TP cần nhiều công đoạn chế biến
không gia nhiệt (lây từ người chế biến)
• Nước nhiễm phân

Cách phòng ngừa:

- Nấu kỹ và làm lạnh nhanh các SPTP
- Đảm bảo an toàn vệ sinh TP

74
Giới hạn cho phép đối với vi sinh vật cho thịt tươi TCVN 7046:2019

Introduction 75
 2. Staphylococcus aureus

1894: J. Denis nghiên cứu Staphylococcus và độc tố

1914: tìm thấy trong sữa, 31 loài

Staphylococcus: tụ cầu khuẩn dạng

chùm nho
aureus: màu vàng (khuẩn lạc)
Độc tố không gây mùi khó chịu,
chịu được 100oC, 30 phút và
phóng xạ

76
 Đặc điểm Staphylococcus aureus
• Cầu khuẩn, tế bào liên kết thành chùm nho
• Gram (+), không tạo bào tử, không di động
• Sinh coagulase làm đông huyết tương
• Tạo sắc tố trắng tới màu vàng đậm
• Yếm khí không bắt buộc

Cần xác định để biết mẫu SPTP

phân tích có mang mối nguy hiểm
cho người tiêu dùng hay không

77
 Đặc điểm Staphylococcus aureus
• Topt tạo màu 20-25oC,
• Topt phát triển 37oC
• Topt tạo độc tố 40oC
• Chịu khô hạn (aw 0,83-0,86), nóng (50oC trong 30phút),
• Chịu mặn (9-10 % NaCl, thậm chí 15-18%)
• pH 4 - 9 (6-7)

Nuôi cấy trên môi trường Chapman chọn lọc có chứa manitol và
nồng độ muối cao cho khuẩn lạc màu vàng

78
 Độc tố Staphylococcus aureus

• Tạo nội độc tố enterotoxin và nội độc tố này chịu nhiệt tốt (600C trong 16h)
• Tạo ngoại độc tố:
- α : phân giải hồng cầu
- β : thoái hóa và tiêu diệt tế bào
• Sinh enzyme gây độc cho người:
- Catalase (chuyển hydrogen peroxit thành nước và oxy)
- Coagulase (đông huyết tương)
- Hyaluronase (làm tan axit hyaluronic, giúp VK vào cơ thể)
- Proteinase
- Lipase
• Có tính kháng nguyên tốt
• Cư trú ở da, đường hô hấp (khoang mũi), quần áo, giường chiếu

79
 Bệnh do Staphylococcus aureus

• Sau 4-6h bị tiêu chảy, nôn mửa kéo dài từ 6 – 8h

• Gây nhiều bệnh nhiễm trùng, làm thương tổn các vết xước, tạo
mụn nhọt, đông sợi huyết
• Gây viêm phổi, viêm màng não, viêm thận, viêm tủy, xương
• Gây buồn nôn, ói, mửa, tiêu chảy dữ dội
• Viêm khớp ở người và gia cầm
• Lượng enteroxin gây độc: 2mg hoặc số tế bào > 106

80
 Các thực phẩm dễ nhiễm S. aureus

• SP từ sữa, sữa tươi, kem, pho mát, sữa bột

• SP thịt nấu chưa chín hoặc các loại thịt lên men
• Các SP từ đậu tương

Các biện pháp phòng ngừa:

• Làm lạnh nhanh và đầy đủ
• Nấu chín kỹ (VK chết sau khi thanh trùng 650C trong
12’, độc tố chịu đến 1000C trong 30’)
• Axit hóa sản phẩm (pH < 4,1)

81
 3. Salmonella
• Tìm ra năm 1885 trên lợn

• Được đặt tên theo Daniel Elmer Salmon

• Đã tìm thấy > 2000 chủng gây bệnh

cho người và động vật

82
Các nhóm Salmonella

Đã tìm thấy > 2000 chủng Salmonella

• Nhóm Salmonella gây bệnh cho người
S. Typhimurium, S.paratyphi, S.paratyphic
• Nhóm Salmonella gây bệnh cho động vật
S. gallinarum (gà); S. dublin (mèo)
S. abortus (ngưạ); S. choleraesuis (lợn)
• Nhóm Salmonella gây bệnh cho cả người và động vật

83
Đặc điểm Salmonella
• Trực khuẩn, tế bào nhỏ
• G (-), không tạo bào tử, có khả năng di động
• Yếm khí không bắt buộc
• Lên men glucose, không lên men lactose và sacarose
• Không sinh indol
• Không phân giải ure
• Sinh H2S
• Topt 37oC
• Không chịu mặn

84
Đặc điểm Salmonella

• Nhạy cảm với quá trình thanh trùng và tia bức xạ

• Bị ức chế ở nồng độ muối 3,5% , môi trường pH< 4 và

bởi hệ vi khuẩn lactic

• Không sinh sản ở nhiệt độ 5-12oC . Vi khuẩn này không

gây mùi vị khó chịu cho thực phẩm .

• Sống tốt ở môi trường bên ngoài , có thể sống được ở cả

điều kiện bảo quản , ít nước . Nó có khả năng chịu được
kháng sinh.

85
Độc tố Salmonella
• Tạo độc tố enterotoxin: max ở pha cân bằng, 37oC,
pH = 7
• Tạo độc tố cytotoxin: phá vỡ tế bào, giúp vi khuẩn
xâm nhập vào cơ thể nhanh chóng
• Chủ yếu phát triển ở đường tiêu hóa của người,
động vật và côn trùng

86
 Bệnh do Salmonella

o Bệnh thương hàn : ủ bệnh lâu (2 tuần), kéo dài (2-4

tuần) gây sốt cao, yếu toàn thân, đau đầu, tiêu chảy ra
máu, tử vong khá lớn
o Phá huỷ ruột, đi vào máu và các cơ quan khác (tim,
não, lá lách…)
o Trong dạ dày ; tiêu chảy, sốt, buồn nôn, nhức đầu…(2-
3 ngày)

87
GANTOIS, I, DUCATELLE, R, PASMANS, F, HAESEBROUCK, F, GAST, R, HUMPHREY, TJ and VAN IMMERSEEL, F (2009)
Mechanisms of egg contamination by Salmonella Enteritidis. FEMS Microbiol Rev. 33: 718-738

88
Ngộ độc do Salmonella
• Salmonella gây bệnh yếu nên cần nhiệt độ cao và
lượng vi khuẩn lớn
• Thường phát sinh vào mùa hè (tháng 6-9)
• Thức ăn gây ngộ độc phần lớn có nguồn gốc động
vật, có giá trị dinh dưỡng cao, nhiều nước

89
 Các thực phẩm dễ nhiễm Salmonella

Bệnh lây từ vật và người bị bệnh (bệnh thương hàn

còn là bệnh của động vật, VK sống trong ruột và
lông)
▪ SP thịt gia cầm và thịt lợn
▪ Trứng và các SP trứng
▪ Sữa và các SP sữa
▪ Nước bị nhiễm phân
▪ Hoa quả và rau xanh
▪ SP ngũ cốc
▪ Các thực phẩm ăn nhanh

90
 Các biện pháp phòng ngừa Salmonella
• Axit hóa sản phẩm (pH < 4)
• Kịp thời phát hiện và cách ly tránh gây lây
nhiễm
• Nấu chín kỹ thực phẩm :vi khuẩn này không
chịu được thanh trùng pasteur (66o trong 12
phút).
• Làm lạnh thực phẩm : vi khuẩn này sinh sản
chậm trong khoảng nhiệt độ 5-12oc và nhanh ở
nhiệt độ thường → không nên để lâu trong tủ
lạnh và ở nhiệt độ thường.
91
 Các biện pháp phòng ngừa Salmonella
• Vệ sinh sạch sẽ để giảm độ nhiễm tạp
• Bức xạ tần số cao và axít hoá: chiếu tia bức xạ vào
thịt gia cầm là biện pháp hiệu quả nhằm phá huỷ,
tiêu diệt Salmonella. Vi khuẩn này không sinh sản ở
pH< 4.

92
 4. Shigella

Tương tự như Salmonella

• Trực khuẩn, tế bào 0,5 – 3 µm
• Gram (-)
• Không tạo bào tử
• Có khả năng di động
• Yếm khí không bắt buộc
• Lên men glucose
• Không sinh khí
Credit: Centers for Diseases Control and Prevention
• Không sinh H2S
• Không có enzyme lysine decarboxylase

93
 Bệnh do Shigella

- Liều lượng gây ngộ độc thấp

- Bệnh kiết lỵ cho người và lừa

Nguồn nhiễm:
• Từ nguyên liệu, nước, công nhân chế biến
• Thịt và các SP từ thịt
• Hải sản
• Rau quả

94
5. Clostridium

• Vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm thuộc loại A

• Trực khuẩn Gram (+), không di động

• Yếm khí tuyệt đối

• Tạo bào tử và bào tử chịu nhiệt tốt

• Nhiệt độ phát triển tối ưu là 37 – 470C

• pH 5,0 – 7,0

• Bị ức chế bởi NaCl 5%

95
Đặc điểm Clostridium

 Clostridium botulinium
- Tìm thấy 1973
- Tạo độc tố hệ thần kinh
(Neurotoxin S)
- nhiều độc tố khác rất độc

Clostridium perfringens
(trước đây gọi là welchii) :
- Tìm thấy từ năm 1892 (người Mỹ
tên là Welch tìm ra)
Vi khuẩn gram (+),
kích thước 1 x 3 m
yếm khí tuyệt đối
Clostridium = hình thoi
96
 Đặc điểm Clostridium perfringens

- pH 6,0 – 7,5

- pH opt 5,0

- T0 = 12 – 500C

- Aw tối ưu là 0,95 – 0,97

- Bị ức chế ở nồng độ NaCl 6%

97
 Độc tố Clostridium

Có 5 loại độc tố chia theo nhóm từ A đến E

- A là độc nhất

- Mức độ nhiễm độc của các type ở người Type A > B > E
Hình ảnh phân tích
độc tố Ty pe A
( 1978)

98
 Bệnh do Clostridium

✓ Bệnh uốn ván, gây hoại tử (Clostridium tetani)

✓ Gây biến chứng các vết thương
✓ Gây ngộ độc TP: Tiêu chảy, đau bụng, đầy khí, sốt,
nôn mửa, nhức đầu…(2-3 ngày)
✓ Hoại tử gan…

99
Triệu chứng bệnh do Clostridium

 Độc tố này hầu như không làm rối loạn hệ tiêu hóa mà tác
dụng đến hệ thần kinh não bộ:
• Liệt thần kinh do tổn thương thần kinh trung ương và hành
tủy.
• Sớm nhất là liệt mắt, liệt cơ mắt
• Liệt vòm họng, lưỡi, hầu (mất tiếng, mất phản xạ nuốt)
• Liệt dạ dày, ruột dẫn đến táo bón, chướng bụng, giảm tiết dịch đôi
khi tiểu tiện khó.
- Có sự phân lý mạch và nhiệt độ : Mạch tăng nhanh trong khi
nhiệt độ cơ thể vẫn bình thường.
 Bệnh thường kéo dài 4 đến 8 ngày, nếu không điều trị sớm có
thể bị chết vào ngày thứ 3 do liệt hô hấp và liệt tim mạch.

100
 Các thực phẩm dễ nhiễm Clostridium

✓ SP thịt gia cầm tươi (động vật máu nóng)

✓ SP thịt, cá đóng hộp
✓ Gia vị và các SP khô
✓ SP từ đậu tương

Các biện pháp phòng ngừa:

- Làm lạnh nhanh và đầy đủ
- Nấu chín kỹ

101
Các biện pháp phòng tránh ngộ độc

Làm tốt khâu ướp lạnh, nhất là các thức ăn nguội làm bằng thịt, cá
đóng hộp, ướp muối xông khói.
• Tất cả các sản phẩm có dấu hiệu ôi thiu thì không được dùng
làm thức ăn nguội cũng như đem di đóng hộp.
• Với đồ hộp khi có dấu hiệu phồng phải coi là nhiễm trùng nguy
hiểm(trừ khi phồng lý hóa). Muốn phân biệt phải phải nuôi cấy
vi khuẩn..
• Với thức ăn khả nghi phải đem đi đun sôi trong khoảng 1 h.
• Đối với cá phải lưu ý: phải bỏ nội tạng rửa sạch sau đó đem đi
ướp lạnh ngay và tốt nhất lên đem đi chế biến ngay khi còn tươi.
• Biện pháp tích cực nhất là đun sôi thức ăn trước khi sử dụng.

102
6. Bacillus cereus

Đặc điểm:
• Trực khuẩn hình que, Gram (+)
• Kích thước tế bào (0,25-0, 5) x (1-10) µm
• Yếm khí tùy tiện, sinh sản rất nhanh
• Tạo bào tử, bào tử chịu được cả nhiệt độ lạnh và nóng
• pH rộng: 4 - 9

103
 Độc tố Bacillus
• Bacillus cereus
- Diarrheal toxin: gây tiêu chảy
- Emetic toxin: gây nôn mửa

• Bacillus anthracis
- độc tố gây bệnh than

• Bacillus thuringensis
- độc tố kết tinh gây bệnh cho côn trùng

→ Nhiễm vào người

- gây nôn nao, khó chịu, buồn nôn
- gây bệnh tiêu chảy và đau co thắt vùng bụng

104
BÖnh do Bacillus

• Nhiễm vào người

- gây nôn nao, khó chịu, buồn nôn
- gây bệnh tiêu chảy và đau co thắt vùng bụng

• Bệnh than
• Bệnh than nhiệt
• Viêm phù
(tích mụn mủ ác tính dưới da)

Bacillus anthracis

105
Thực phẩm dễ nhiễm Bacillus cereurs
❖Sữa và các SP sữa
❖SP ngũ cốc
❖Các loại gia vị

106
Các biện pháp phòng Bacillus cereurs

- Lµm l¹nh nhanh vµ ®Çy ®ñ

- NÊu chÝn kü

107
7. Vibrio

• Vibrio cholerae lần đầu tiên được

Pacini tìm thấy trong ruột của bệnh nhân bị tả vào
năm 1854.
• 1883 Robert Koch tìm thấy vi khuẩn hình cong
tương tự khi nghiên cứu bệnh tả ở Ai Cập.

108
Các chủng gây bệnh củaVibrio

• Có 28 loài,thường gặp:

V. vulnificus

V. alginolyticus

V. cholerae

V. parahaeolyticus

109
Vibrio

• Trực khuẩn vòng = phẩy khuẩn

• Gram (-)

• Di động nhanh

• Không tạo bào tử

• pH 7,0 – 7,3

• Chịu đến NaCl 7%

110
Đặc điểm sinh lý của Vibrio cholerae

- Trực khuẩn vòng hay phẩy khuẩn.

- Gram (-)
- pH thích hợp 8,4
- Có khả năng di động
- Chịu được nồng độ muối NaCl 7%.
- bệnh nhiễm trùng đường ruột, tiêu chảy nặng

111
Đặc điểm sinh lý của Vibrio cholerae

• Yếm khí tuỳ tiện

• Không tạo bào tử

• Có khả năng lên men cacbohydrat

• Khử nitrat thành nitrit.

• Sinh oxydase.

112
Vibrio cholerae (bệnh tả)

• Vibrio cholerae có nhóm huyết thanh O1 có khả năng sinh

độc tố
• Mới đây ở đại dịch 7 xuất hiện nhóm huyết thanh mới
O139 có khả năng sinh độc tố gây bệnh và dịch tả.

113
 Độc tố Vibrio
Vibrio cholerae:
• Không chịu môi trường axit
• Độc tố cholerae toxin:
- Độc tính mạnh, gây tiêu chảy mấy nhiều nước.
- Biểu hiện lâm sàng: tiêu chảy ồ ạt, đau bụng, chán ăn,
mất nhiều nước (500 – 1000 ml/h), mạch nhanh, huyết áp hạ,
hoặc có thể mất mạch mất huyết áp
- Gây bệnh tả (dịch tả)
• Hemolysin, tetrodo toxin, shiga toxin (độc tố cá nóc)
• Có khả năng tổng hợp nhiều enzyme: làm hỏng biểu mô
ruột

114
ĐỐI TƯỢNG DỄ MẮC BỆNH

• Phẩy khuẩn tả chỉ gây bệnh ở người.

• Mọi lứa tuổi đều có thể mắc bệnh tả.

• Tuy nhiên, tính cảm thụ bệnh phụ thuộc vào mỗi cá
thể và liều nhiễm khuẩn

• Người có nhóm máu O mắc bệnh nặng hơn.

• Người có độ toan dịch vị thấp mắc bệnh nặng hơn.

115
LÂY TRUYỀN DỊCH TẢ

• Nước là yếu tố lây truyền chủ yếu,sau đó là thức ăn chưa nấu

chín hoặc ở dạng gỏi.

• Nguồn truyền nhiễm: người bệnh và người lành mang bệnh.

• Bệnh nhân bị tả cấp tính đào thải 107-108 VK tả trên 1 gam phân.

116
TRIỆU CHỨNG VÀ CÁCH ĐIỀU TRỊ

• Triệu chứng:
• Bệnh nhân tả nhẹ: khó phân biệt với các bệnh tiêu chảy khác.

• Bệnh nhân tả nặng: tiêu chảy ồ ạt, đau bụng, phân có màu trắng
như nước vo gạo.

• Cách điều trị:

• Bù nước và nước muối kịp thời.

117
 8. Pseudomonas aeruginosa
Đặc điểm:

• Trực khuẩn hình que, Gram (-)

• Kích thước tế bào (0,5 – 2,5) x (1 x 10) µm

• Hiếu khí bắt buộc (nếu có NO3 thì kỵ khí)

• Di động nhanh

• Khuẩn lạc tạo sắc tố

118
 Bệnh do Pseudomonas aeruginosa

• Viêm màng trong tim, viêm màng não và màng ruột, tạo mủ

• Viêm đường hô hấp, viêm phổi, viêm tủy xương

• Nhiễm trùng da, nhiễm trùng đường máu, đường tiết niệu

• Suy giảm hệ thống miễn dịch

• Bệnh hóa sừng ở mắt

• Ít kháng sinh có tác dụng (Gentamycin, Fluoroquinolen)

119
 9. Listeria monocytogenes

• L. monocytogenes được lấy tên theo nhà phẫu thuật người

Anh: Lord Joshep Lister
• Trực khuẩn hình que, thẳng, cân đối, hai đầu tròn
• Gram (+)
• Không bào tử, hô hấp yếm khí
• Catalase (+)
• Oxydase (-)
• Có khả năng phân giải esculin
• Làm tan huyết trên môi trường thạch máu
• Di động nhanh nhờ tiêm mao

120
BÖnh do Listeria monocytogenes

➢ Bệnh cho cả người và động vật, đặc biệt nguy hiểm

➢ Bệnh listeriosis = hiện tượng sảy thai của người và
động vật
➢ Tích mủ ở hệ thần kinh trung ương
➢ Hoại tử gan, tim, đường sinh dục

• Đặc biệt nguy hiểm người già và trẻ em

• Nhiễm vào thực phẩm mọi công đoạn, đặc biệt to thấp
• Nhiễm mọi loại sản phẩm thực phẩm

121
Chương 2: Các phương
pháp định lượng vi sinh vật
trong thực phẩm
2.1. Một số nguyên tắc chung
2.2. Phương pháp đếm khuẩn lạc
trên đĩa thạch
2.3. Phương pháp số xác xuất lớn
nhất (MPN)
2.4. Phân tích một số vi sinh vật
nhiễm tạp trong thực phẩm

122
2.1. Một số nguyên tắc chung
• Kiểm tra công nghiệp (trong sản xuất)
• Kiểm tra sản phẩm
• Nguyên tắc lấy mẫu
• Vi sinh vật chỉ thị
• Chỉ tiêu so sánh
• Tiến hành phân tích
• Xử lý số liệu, báo cáo kết quả

123
Thực hiện kiểm tra công nghiệp
• Chọn điểm kiểm tra
• Chọn chỉ tiêu vsv để kiểm tra
• Chọn tiêu chuẩn cần xác định
• Chọn phương pháp phân tích

124
Thực hiện kiểm tra công nghiệp

Kiểm tra các điểm nguy hiểm trong SX: Chọn điểm
kiểm tra
SP
Nguyên liệu, nước,
sản phẩm trung
gian, đường ống, Lấy mẫu
thiết bị, không khí,
người vận hành
Điều chỉnh
Phân tích

So sánh

125
BIỆN PHÁP ĐẢM BẢO VỆ SINH ATTP

126
Chọn chỉ tiêu VSV nào để kiểm tra?

127
Chọn chỉ tiêu VS kiểm tra

Vi sinh vật chỉ thị vệ sinh TP:

• Định nghĩa : Là nhóm hoặc loài có mặt trong TP ở một giới
hạn nhất định
• Ý nghĩa : Biểu hiện điều kiện vệ sinh trong sản xuất, mức độ
ô nhiễm của môi trường→ đánh giá an toàn về vi sinh và chất
lượng thực phẩm

• Vi khuẩn chỉ thị VSTP : VSV hiếu khí / yếm khí ưa nhiệt độ
trung bình/lạnh ; Coliform và E.coli; cầu khuẩn đường ruột,
Tụ cầu khuẩn

128
Vi sinh vật chỉ thị vệ sinh TP

1.Vi sinh vật hiếu khí ưa ấm :

 Tổng số vi sinh vật ưa ấm, hiếu khí : đánh giá
nguyên liệu và SP TP có bị nhiễm hay không?
2. Vi sinh vật yếm khí ưa ấm :
 Số lượng cho biết khả năng bị nhiễm Clostridium

3. Vi sinh vật ưa lạnh :

 Tổng lượng VSV ưa lạnh cho biết khoảng thời gian
cần thiết để bảo quản lạnh đảm bảo sự an toàn TP
4. Coliforms :
 Số lượng cho biết TP được sx trong điều kiện đảm
bảo vệ sinh hay khong?

129
Vi sinh vật chỉ thị vệ sinh TP

5. E.coli :
 là vi khuẩn chỉ thị vệ sinh TP rõ nhất, cho phép xác
định mức độ nhiễm phân

6. Tụ cầu khuẩn :
- Sự có mặt Staphylococcus aureus, có trong TP là có
nguồn gốc từ da, miệng hoặc mũi công nhân chế biến TP.
- Có nhiều loại này chứng tỏ vệ sinh trong chế biến và
nhiệt độ diệt khuẩn chưa tốt

130
Chọn chỉ tiêu chuẩn để so sánh
❖ Chỉ tiêu chuẩn (standard) = chỉ tiêu quy định có tính quy chế
•  Lượng VSV xác định bằng các phương pháp chuẩn

❖Chỉ tiêu đặc biệt (specification) = có cùng bản chất với chỉ tiêu chuẩn, không
bắt buộc, yêu cầu kỹ thuật
•  sử dụng tuỳ theo các hợp đồng giữa người bán và người mua

❖Chỉ tiêu theo yêu cầu (recommendation) = có bản chất như các chỉ tiêu trên,
nhưng không theo quy định hay hợp đồng (không có tính quy chế hợp pháp) và
không có tính đối kháng với các chỉ tiêu nói trên (nằm trong giai đoạn chuẩn bị
để đưa ra một chỉ tiêu tiêu chuẩn mới)

❖Chỉ tiêu giới hạn (limit): = sử dụng trong phạm vi hẹp (phục vụ cho cơ sở kinh
doanh hay xí nghiệp nhất định)

131
Đặc điểm của mẫu

• Mật độ VSV trong nước, thực phẩm ít hơn vài chục

đến vài triệu lần với bệnh phẩm
• VSV bị tổn thương, chết, giảm sức sống trong chế
biến
→ Nuôi tăng sinh làm tăng mật độ để phát hiện

132
PHƯƠNG PHÁP THU MẪU

Đảm bảo đúng Đại diện cho

Có độ tin mẫu cần xác
tình trạng vi sinh cậy định

Đủ số lượng

Không bị nhiễm hoặc

không có sự phát
triển thêm của vi
sinh vật

133
PHƯƠNG PHÁP THU MẪU

• Có tính đại diện

• Bình chứa vô trùng
• Tránh nhiễm tạp trong thu mẫu, bảo quản và vận
chuyển mẫu

134
Bạn là nhân viên QA, công ty
cần phân tích chất lượng VSV
của sản phẩm mới, bạn sẽ phải
làm gì?

135
Các chỉ tiêu

• Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học
trong thực phẩm (46 /2007/QĐ-BYT ngày
19/12/2007 )
• QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA ĐỐI VỚI Ô
NHIỄM VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM. QCVN
8-3: 2012/BYT.

136
Quy chuẩn kỹ thuật (ví dụ)
• QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA ĐỐI VỚI CÁC SẢN PHẨM ĐỒ
UỐNG CÓ CỒN (QCVN 6-3:2010/BYT)

PHỤ LỤC IV
CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT CỦA ĐỒ UỐNG CÓ CỒN
(trích)

Tên chỉ tiêu Giới hạn Phương pháp thử Phân loại
tối đa chỉ tiêu 1)

I. Bia hơi

1. Tổng số vi sinh vật hiếu khí, CFU/ml 1000 TCVN 4884:2005 (ISO A
4833:2003)

2. E.coli, CFU/ml Không TCVN 6846:2007 (ISO A

được có 7251:2005)

3. Cl.perfringens, CFU/ml Không TCVN 4991:2005 (ISO A

được có 7937:2004)

137
 Chọn phương pháp phân tích

Xác định số lượng tế bào (phương pháp “cổ điển”): kết quả
chưa đáp ứng yêu cầu
- thời gian phân tích quá lâu
- sai số lớn

Đánh giá chất lượng sản phẩm: (kỹ thuật hiện đại)
- Tốc độ sinh độc tố
- Sự phân giải cơ chất (gluxit, protein)
- Khả năng tạo sản phẩm chuyển hoá
- Sự thay đổi mầu sắc, độ nhớt

138
Các phương pháp định lượng VSV

1.Phương pháp đếm trực tiếp

a. Đếm bằng buồng đếm hồng cầu
b. Đếm bằng buồng đếm Breed
c. Đếm bằng kính hiển vi huỳnh quang
2.Phương pháp đếm khuẩn lạc
3.Phương pháp màng lọc
4.Phương pháp MPN
5.Phương pháp đo độ đục

139
CÁC NGUYÊN TẮC CƠ BẢN

1.Pha chế môi trường

2.Vô trùng môi trường o
121 C, 30
3.Vô trùng dụng cụ chứa phút
4.Chuẩn bị ống thạch hoặc đổ đĩa
5.Các thao tác vô trùng:
a. Vô trùng không gian thí nghiệm
b. Vô trùng que cấy
c. Xịt cồn tay
d. Chuyển giống vô trùng
e. Đèn cồn

140
Xử lý kết quả phân tích
1. Chọn giá trị kiểm chứng

2. Chọn phương pháp xử lý

141
Xử lý kết quả phân tích

Chọn giá trị kiểm chứng : thoả mãn 4 điều kiện

1. Có tính chính xác cao
2. Có tính đại diện cao
3. Phù hợp với điều kiện cho phép, nhanh, dễ thao tác
4. Hiệu quả sử dụng cao

142
Chọn giá trị n và N phụ thuộc

✓ Loại sản phẩm

✓ Kỹ thuật (tính chất SP, điều kiện SX và hoàn
thiện SP)
✓ Thương mại (phân phối và thời hạn sử dụng)
✓ Thống kê (chỉ số nhiễm tạp, sai số pp, cách lấy
mẫu.. .)
✓ Điều kiện vệ sinh, sức khoẻ

143
Kiểm tra các mẫu TP

Số mẫu kiểm nghiệm và giá trị giới hạn

Mẫu Chỉ tiêu kiểm nghiệm n c m M
Thịt tươi gia 1. VSV hiếu khí, ưa ấm 5 3 106 107
súc 2. Salmonella 5 0 0

Thịt gia 1. VSV hiếu khí, ưa ấm 5 3 106 107

cầm 2. Salmonella 5 1 0

144
Xử lý kết quả

n: số mẫu phân tích

c: số mẫu pt tối đa có giá trị nằm giữa m và M
m : gi¸ trÞ ngưìng (khoảng chấp nhận khi mật độ vi sinh vật nằm
dưới một trị số m)
M : gi¸ trÞ mµ trªn ®ã SPTP cÇn lo¹i bá (khoảng không chấp nhận
khi mật độ vsv cao hơn giá trị M)
Khoảng lân cận giới hạn: m<vsv<M

- Tuỳ theo giá trị c mà đánh giá chất lượng mẫu kiểm nghiệm
- Có sự phân biệt giá trị nằm giữa m & M hoặc >M

145
Qui ước kết quả

- Khoảng chấp nhận khi mật độ vi sinh

vật nằm dưới một trị số m
- Khoảng không chập nhận khi mật độ
vsv cao hơn giá trị M
- Khoảng lân cận giơi hạn: m<vsv<M

146
Xử lý kết quả

Kết quả theo 2 mức : Chấp nhận hoặc huỷ bỏ

 n = 5 /10 ; c = 0 Chỉ chấp nhận khi 5 hoặc 10 mẫu đã

được kiểm nghiệm không được một mẫu nào dương tính (có
VSV). Nếu có thì toàn bộ mẫu bị hủy bỏ

 n = 5 /10 ; c = 1-2 Chỉ chấp nhận khi 5 hoặc 10 mẫu đã được

kiểm nghiệm chỉ có 1-2 mẫu dương tính (có VSV). Nếu có trên
1-2 mẫu thì phải hủy bỏ cả lô hàng

147
Xử lý kết quả

Kết quả theo 3 mức : Chấp nhận hoàn toàn,

chấp nhận một phần hoặc loại bỏ

 Có sự phân biệt giá trị giữa m và M và giá trị trên M

n = 5 /10 ; c = 0/1/2
- Sản phẩm được chấp nhận khi kết quả >m mà số đơn vị
đó không được lớn hơn c
- Sản phẩm được chấp nhận 1 phần hoặc loại bỏ khi kết
quả >m mà số đơn vị đó không được lớn hơn c

148
Ví dụ:

Tiêu chuẩn về VSV tổng số trong sản phẩm

trứng được quy định:

n=5; c=2; m=5x104; M=106cfu/25g

Trong đó n là số mẫu thử nghiệm.

C là số mẫu nằm trong khoảng lân cận tới

hạn

149
 Số mẫu kiểm nghiệm và giá trị giới hạn

Mẫu Chỉ tiêu kiểm nghiệm n c m M

Cá tôm 1. VSV hiếu khí, ưa ấm 5 3 106 107
tươi, đông 2. Coliform 5 3 4 4. 102
lạnh
3. Staphylococcus aureus 5 3 103 5.103
4. Salmonella 5 0 0
Cá hun 1. VSV hiếu khí, ưa ấm 5 3 106 107
khói tôm 2. Coliform 5 3 4 4. 102
luộc trước
3. Staphylococcus aureus 5 3 103 5.103
đông lạnh,
sò… 4. Salmonella 5 0 0
5. V. parahaemolycicus 5 0 102

150
Số mẫu kiểm nghiệm và giá trị giới hạn

Mẫu Kiểm nghiệm n c m M

Sữa thanh 1. VSV hiếu khí, ưa ấm 5 2 2,5. 104 2,5.105

trùng 2. Coliform 5 2 2 102
3. Staphylococcus aureus 5 2 10 102
4. Salmonella 5 0 0 0
Bánh bích 1. Coliform 5 2 2 20
quy 2. Salmonella 10 0 0

Sản phẩm 1. VSV hiếu khí, ưa ấm 5 2 103 104

khô ăn 2. Coliform 5 1 2 20
liền 3. Salmonella 10 0 0

151
Số mẫu kiểm nghiệm và giá trị giới hạn

Mẫu Kiểm nghiệm n c m M

Rau quả 1. VSV hiếu khí, ưa ấm 5 2 2,5. 104 2,5.105

tươi, ướp 2. E.coli 5 2 10 102
lạnh, khô

Rau quả 1. E.coli 5 2 2 10

khô
Cùi dừa 1. Nấm mốc 5 2 102 104
2. Coliform 5 1 10 103
3. Salmonella 10 0 0

152
 Số mẫu kiểm nghiệm và giá trị giới hạn

Mẫu Chỉ tiêu kiểm nghiệm n c m M

Thức ăn 1. VSV hiếu khí, ưa ấm 5 A 105 106
để lạnh, 2. Coliform 5 2 102 104
ăn liền
(món khai 3. E.coli 5 2 2 10
vị, xà lách, 4.Staphyloccocus aureus 5 2 10 102
thức ăn
4. Salmonella 10 0 0
tráng
miệng

153
Một số phương pháp định lượng vi sinh vật
Pha loãng mẫu

• Các dung dịch pha loãng

• Tại sao không dùng nước cất?

Một số dung dịch pha loãng đặc biệt cho sữa

• Dung dịch Natri citrat (dùng cho phomat, phomat

chế biến, sữa sấy màng)

• Na3C6H5O7.2H2O 20 g/L
• Dung dịch dikali hidro phosphat 20g/L
• pH7,5: caseinat, phomat, phomat chế biến, váng sữa chua
• pH8,5: casein axit, casein lactic
- Microbiology Serial Dilution

https://www.youtube.com/watch?v=rqsR6jMZkGQ
Đếm trực tiếp tế bào bằng buồng đếm hồng cầu
2.2. Phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch

• Đơn vị hình thành khuẩn lạc (cfu) là gì?

Phương pháp đếm khuẩn lạc
2.2. Phương pháp đếm khuẩn lạc
Tính số lượng vi sinh vật

• Quan sát và đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa (30-300).
• Tính tổng số VSV theo công thức :

• ΣC - tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa

• n1 - số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 1
• n2 - số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 2
• f1 - Hệ số pha loãng của đĩa đếm thứ 1
• v - thể tích mẫu cấy vào mỗi hộp petri
 v=?

Độ pha loãng

10-4 n1 = ?

n2 = ?
10-5
f1 = ?

163
 BÀI TẬP

1. Giả sử độ pha loãng 10-3 đếm được 168 và 215

khuẩn lạc; độ pha loãng 10-4 đếm được 14 và 25
khuẩn lạc → tính số cfu trong 1 ml mẫu ban đầu?
 BÀI TẬP

1. Giả sử độ pha loãng 10-3 đếm được 168 và 215

khuẩn lạc; độ pha loãng 10-4 đếm được 14 và 25
khuẩnlạc → tính số cfu trong 1 ml mẫu ban đầu?

168+215+14+25
N= −3 = 1,92 x 106 CFU/ml
2+0,1 ×2 ×10 ×0,1
Báo cáo kết quả

• Theo TCVN 6264:1997:

• Giữ lại đĩa có số khuẩn lạc từ 10-300

• Tính số khuẩn lạc theo công thức

• Nếu tất cả đều ít hơn 10 khuẩn lạc?

• Nếu tất cả đều nhiều hơn 300 khuẩn lạc?
• Đơn vị của N?
Phương pháp đếm số xác suất lớn nhất (MPN)
Nguyên tắc:
• Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng và có
khả năng thể hiện các đặc tính lên men (đục, đổi màu,
sinh khí, mùi…)
• Pha loãng mẫu liên tiếp theo bội số của 10 cho tới khi
kết quả âm tính
• Mỗi độ pha loãng cần nuôi cấy 3 ống lặp lại ở điều kiện
thích hợp
• Kiểm tra vi sinh vật có phát triển hay không, tính số
ống có kq (+)
• Xử lý số liệu theo bảng Mac Grady, và từ đó tính ra số
lượng VSV
2.3. Phương pháp số xác suất lớn nhất (MPN)
Chuẩn bị và pha loãng mẫu

Cấy mẫu vào trong ống nghiệm chứa

môi trường (mỗi độ pha loãng 3 ống)

Nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp

Đọc kết quả, xác định số đặc trưng,

tra bảng Mc Grady, tính kết quả
Phương pháp MPN
Chọn số đặc trưng
Tính số tế bào
Ví dụ

• Số đặc trưng 3 ống 321

• Độ pha loãng thấp nhất 10-2
• Tra phụ lục 14 Mac Grady, MPN tương ứng 15
• Vậy số lượng tế bào sống trogn 1g hay 1 ml mẫu sẽ là
• N=Chỉ số MPN/Giá trị nồng đọ pha loãng thấp nhất = 15/10-
2=1500

• Tra giới hạn tin cậy và số lượng ống nghiệm cấy lặp lại (n=3,
P0.95% là 5 và 51).
• →Lượng tế bào sống trong 1g mẫu trong khoảng: 5/10-2 và
51/10-2=500-5100 tế bào/g

173
Bài tập

Độ pha loãng mẫu phân tích 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 Số đặc trưng

Số ống đã cấy cho mỗi độ pha

3 3 3 3 3
loãng

Số ống dương tính (Mẫu 1) 3 3 2 1 0

Số ống dương tính (Mẫu 2) 3 2 0 1 0
Số ống dương tính (Mẫu 3) 2 2 1 0 0
Số ống dương tính (Mẫu 4) 2 2 2 2 2
Số ống dương tính (Mẫu 5) 3 2 2 1 1

174
Bài tập

Độ pha loãng mẫu phân tích 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 Số đặc trưng

Số ống đã cấy cho mỗi độ pha

3 3 3 3 3
loãng

Số ống dương tính (Mẫu 1) 3 3 2 1 0 321

Số ống dương tính (Mẫu 2) 3 2 0 1 0 320
Số ống dương tính (Mẫu 3) 2 2 1 0 0 221
Số ống dương tính (Mẫu 4) 2 2 2 2 2 222
Số ống dương tính (Mẫu 5) 3 2 2 1 1 322

175
Bài tập

• Cho số đặc trưng 311 với độ pha loãng thấp nhất

10-2. Ta có chỉ số MPN tương ứng là 7,5 (theo phụ
lục 14) và độ tin cậy P0,95% là 2 và 28 (theo phụ lục
15). Tính số lượng tế bào sống có chứa trong 1g
mẫu ban đầu và khoảng tin cậy của số lượng tế bào
sống đó

176
Bài tập

• Số lượng tế bào sống có trong 1g mẫu ban đầu sẽ là:

N = chỉ số MPN/giá trị độ pha loãng thấp nhất = 7,5:
10-2 = 750 tế bào/g
• Khoảng tin cậy: 2:10-2 đến 28: 10-2 = 200 đến 2800
tế bào/g

Introduction 177
2.4. Định lượng một số vi sinh vật trong thực phẩm

Môi trường dinh dưỡng

chung (nutrient
medium/culture media)
Môi trường chọn
lọc (Selective
medium)
Môi trường phân
biệt (differential
medium)
Môi trường tăng sinh
chọn lọc (enrichment
medium)

178
1. Định lượng tổng số vi sinh vật

• Tổng số VSV = VSV tồn tại và phát triển được trên môi
trường dinh dưỡng chung, ở 300C, 24 - 72 giờ.
• Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí, ưa ấm có trong SPTP
để đánh giá mức độ nhiễm tạp, tinh trạng vệ sinh, điều kiện
bảo quản và dự đoán khả năng hư hỏng của ẩn phẩm

Phương pháp chuẩn : kỹ thuật đếm khuẩn lạc

1. Nguyên tắc:
- Nuôi cấy môi trường thạch dinh dưỡng, 3010C, hiếu khí,
48–72 giờ
- Đếm tất cả số khuẩn lạc mọc trên đó ➔ số lượng tế bào
sống có trong mẫu phân tích.

179
Quy trình chung

Chuẩn bị và pha loãng mẫu

TGA (Trypton Glucoza Agar)

Trypton(pepton) 5 g;
 Glucoza 4 g;
Nuôi cấy trên/ trong môi trường thạch  Cao nấm men 2,5 g; 1 lit
(30oC, 24-72 h).  Thạch 15 g;

Số KL : 30-300
Quan sát và đếm khuẩn lạc

N (khuẩn lạc/g, ml) =

C
(n 1 + 0,1n 2 ).f 1 .v

180
Quy trình xác định tổng vi khuẩn hiếu khí trong thực phẩm

Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có độ pha

loãng 10-1, 10-2, 10-3 ….

Rót vào mỗi đĩa petri 10 – 15 ml môi trường TGA đã được

làm nguội đến 450C

Chọn 2 nồng độ pha loãng thích hợp, chuyển 1 ml mẫu vào

đĩa petri vô trùng (mỗi nồng độ cấy 2 đĩa)
Ủ 300C trong 72h

Chọn các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng

10 – 300 khuẩn lạc/đĩa để đếm

Tính kết quả: tổng vi sinh vật hiếu khí trong mẫu
(CFU/g hoặc CFU/ml)

181
Khuẩn lạc vi sinh vật tổng số

182
 2. Định lượng tổng số nấm men, nấm mốc

Phương pháp chuẩn : kỹ thuật đếm khuẩn lạc

1. Nguyên tắc:
Môi trường chứa chất ức chế vi khuẩn (Oxytetracyclin hoặc
Chloramphenicol, (Yeast Glucose Chloramphenicol - YGC)
- Nuôi cấy 301oC, hiếu khí, thời gian 48 - 72 giờ.

- Đếm số khuẩn lạc mọc trên đó ➔ tổng số nấm men-nấm

mốc có trong mẫu phân tích.

183
2. Định lượng tổng số nấm men, nấm mốc

Chuẩn bị và pha lo·ng mẫu

(Yeast Glucose chloramphenicol)
Glucoza 20 g;
Nu«i cÊy trªn / trong m«i trưêng th¹ch Cao nÊm men 5
(30oC, 24-72 h). 1 lit
Th¹ch 15
Chloramphenicol (0,1)
(Tetracyclin, Oxytetracyclin)
Quan s¸t vµ ®ếm khuẩn lạc

N (khuÈn l¹c/g, ml) =

C
(n 1 + 0,1n 2 ).f 1 .v

184
Khuẩn lạc nấm men, nấm mốc

185
Bài tập 15 phút

- Theo nhóm
1. Tìm các môi trường sử dụng để xác định vi sinh vật đó?
2. Thành phần của môi trường?
3. Môi trường đó là môi trường gì (chọn lọc, phân biệt, tăng sinh)?

1. Listeria monocytogenes 6. Staphylococcus aureus

2. E. coli 7. Clostridium botulinum
3. Pseudomonas 8. Vibrio cholera
4. Bacillus cereus 9. Shigella
5. Salmonella

Introduction 186
 3. Định lượng Coliforms và E. coli

 2 phương pháp tiêu chuẩn:

- Đếm khuẩn lạc
- MPN

Môi trường đặc hiệu :

- Endo
- BGBL (Brilliant Green Bile Lactose)
- VRB (Violet Red Bile)
- EC

187
Môi trường xác định Coliform và E.coli

Môi trường Endo

Pepton 10 g; lactoza 10 g; K2HPO4 2,5 g; sulfit natri 3,3 g;
fucshin kiềm 0,3 g; thạch 15 g; H2O cho đủ 1000 ml; pH
=7,5

Nguyên tắc
Natri sulfit và fucshin = phức chất fuchsin-sulfit
coliform lên men đường lactoza tạo thành aldehyt và axit,
Aldehyt tác động đến phức chất fuchsin-sulfit và giải
phóng fuchsin,
Fuchsin tự do nhuộm khuẩn lạc thành màu hồng đến màu
đỏ cánh sen, có thể có ánh kim hoặc không.

188
Môi trường xác định Coliform và E. coli

Môi trường BGBL

Pepton 10; lactoza 10; mật bũ 20; Brilliant green 0,0133; H2O
cho đủ 1000 ml; pH =7,2

Môi trường VRB

Pepton 10; lactoza 5; NaCl 5; muối mật 1,5; tinh thể tím
0,002; Đá trung tính 0,03; thạch 15 g; H2O cho đủ 1000 ml;
pH =7,5

Môi trường EC
Tryptose 20 g; lactoza 5 g; muối mật No3 1,5 g; K2HPO4 4
g : KH2PO4 1,5g; NaCl 5 g; H2O cho đủ 1000 ml; pH =7

189
Hình ảnh KL trên môi trường đặc hiệu

-Khuẩn lạc màu hồng đến mầu đỏ

đậm
-d >0,5 mm

Môi trường Endo

Môi trường VRB

190
Quy trình định lượng Coliform và E.coli = MPN
Chuẩn bị và pha loãng mẫu (100, 10-1, 10-2, 10-3)

Cấy mt tăng sinh -TLS

(37oC, 48 h, 9 ống).
Khí → ống (+)
Coliforms
chịu nhiệt

Cấy mt EC
Coliforms
Cấy mt khẳng định (42-44oC, 48 h).
phân
BGBLB (37oC, 48 h)
ống (+)
ống (+) Cấy dd Trypton Thử nghiệm
(42-44oC, 48 h).
 Indol
Coliforms

Thử nghiệm E.coli

IMVCi 191
Phép thử khẳng định IMViC

I= Thử nghiệm sinh Indol (+)

M= Thử nghiệm MR (Methyl Red) (+)

V= Thử nghiệm VP (Voges-Proskauer) (-)

iC= Thử nghiệm Citrat (-)

192
Quy trình định lượng Coliform và E.coli = đếm KL
Chuẩn bị và pha loãng mẫu (100, 10-1, 10-2, 10-3)

Cấy mt VRB
(37oC, 48 h, 9 ống).
Đếm KL mầu
Coliforms
đỏ, chọn 5KL
chịu nhiệt

Cấy EC lỏng
Coliforms
Cấy vào BGBL lỏng (44oC, 24-48 h).
phân
(37oC, 24-48 h)
ống (+)
ống (+) Cấy dd Trypton Thử nghiệm
(42-44oC, 48 h).
 Indol
Coliforms

Thử nghiệm
IMVCi E. coli
193
Quy trình phân tích E. coli
Phương pháp đếm khuẩn lạc
Chuẩn bị và pha loãng mẫu

Cấy trên mt thạch

(42-44oC, 24-48 h).

Môi trường Endo

Nuôi cấy trong nước Trypton
( 42oC, 48 h)

I :Indol; M: methyl Vi :
Thử nghiệm IMViC
C
Tính tỷ lệ khẳng định E. coli (n 1 + 0,1n 2 ).f1 .v . R
194
Phép thử khẳng định IMViC

a. Thử nghiệm sinh Indol (+)

b. Thử nghiệm MR (Methyl Red) (+)

c. Thử nghiệm VP (Voges-Proskauer) (-)

d. Thử nghiệm Citrat (-)

195
a. Thử nghiệm sinh Indol
Thử nghiệm sinh Indol (I) (+)
tryptophanaza
Tryptophan Indol
+ DMABA
p-DMABA

quinon (mÇu ®á)

1. MÉu đối chứng

2. Phản ứng (+) E.coli

DMABA : 4-DiMethylAminoBenzAldehyt

➔Phân biệt E.coli (+) với các loại coliform khác (-)
196
Chủng E.coli NC10

197
Hình ảnh test indol của khuẩn lạc E. coli NC10

198
Phép thử khẳng định E. coli trong rau cải muối chua

(-) Mẫu không sinh Indol

(+) Mẫu sinh Indol.

(-) (+)

199
b.Thử nghiệm Methyl Red

Thử nghiệm Methyl Red (MR) (+)

- (+) có mầu đỏ (hồng) khi pH<4,4
(-) có mầu cam khi pH 5,0-5,8
(-) có mầu vàng khi pH>6

Khuẩn lạc nghi ngờ => môi trường Glucoza

Photphat => 370C, 2-5 ngày => + thuốc thử MR

1. Mẫu đối chứng

2. Phản ứng (+) E.coli

➔Phân biệt E.coli (+) với các loại coliform khác (-)
200
 c. Thử nghiệm VP (Voges-Prouskauer)
Nguyên tắc : Glucoza

Axit pyruvic
Hỗn hợp axit (formic, axetic,
2,3-butanediol succinic, ethanol, CO2…)

(O2, OH-) Thuốc thử (O2, OH,

Axetoin -naphthol, guanidin)

-naphthol
Không đổi mầu ➔ (-)
Diaxetyl
guanidin
E.coli (-)
Diaxetyl-guanidin

Mầu đỏ ➔ (+) Klebsiella, Enterobacter

201
Thử nghiệm VP
Cách tiến hành :
- Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm 0,2 ml môi trườngVP.
Nuôi 37oC, 24 h.

-Cho 2 giọt dung dịch creatin, 3 giọt 1-naphton pha trong cồn
và sau đó cho 2 giọt dung dịch KOH, lắc đều.

- Phản ứng (+) khi xuất hiện màu hồng đến màu đỏ tươi trong
vòng 15 phút

Môi trường VP
Pepton 7g; glucoza 5 ; K2HPO4 5; H2O cho đủ 1l; pH =6,9

202
 d. Thử nghiệm khả năng phân giải citrat

Nguyên tắc :
pH kiềm ➔ Axetat + Format
+ ACoA
Citrat pH trung tính ➔ Axetat + CO2
pH axit ➔ Axetoin + Lactat

Citrat + NH3  pH kiềm

+ chỉ thị ➔ quan sát mầu

➔Phân biệt E.coli (-) với các loại coliform khác (+)
như Klebsiella và Enterobacter

203
 d. Thử nghiệm khả năng phân giải citrat

Chọn KL nghi ngờ E.coli

CÊy trªn mt SCA hoặc CCSA

(35oC; 24-48 h, 4 ngày)

Quan sát mầu thạch

SCA (Simmons Citrate Agar) / Bromth. blue
CCSA (Christensens Citrate Sulfit Agar)/ phenol
đỏ

-Na hoặc K xitrat

(-) (+)
-Bromothymol blue (pH 6,9)
-pH<6 vàng
-pH=7 xanh lục E.coli (-)
-pH>7 xanh dương 
204
 4. Định lượng Staphylococcus aureus

Phương pháp đếm khuẩn lạc :

Nguyên tắc :

Nuôi cấy trên các môi trường thạch chọn lọc

Chapman(KL vàng) hoặc Baird-Parker (đen)

Khẳng định = thử nghiệm coagulaza

205
Môi trường đặc trưng cho S. aureus

Môi trường Chapman: Pepton 10 g; Cao thịt 1 g; Manitol 10; NaCl 75

g; Thạch 15 g; pH 6,8; H2O cho đủ 1000 ml.

 tạo khuẩn lạc màu vàng

206
Môi trường đặc trưng cho S.aureus
- Môi trường Baird-Parker: Pepton 10 g; Cao nấm men 1 g; Cao thịt 5 g; Pyruvat
natri 10 g; Glycocol 12 g; dịch nhũ lòng đỏ trứng 50 ml; Tellurit kali 0,1 g; LiCl 5 g;
K2TeO3 0,1 g; Thạch 20 g; pH 7,2; H2O cho đủ1000 ml.

 tạo khuẩn lạc màu đen có

vòng sáng rộng
Khử tellurit thành tellure

Sau 24 h
KL màu đen, 0,5-1 mm
Lồi, có vòng sáng rộng 1-2 mm
Sau 48 h
Màu đen, 1-1,5 mm
Lồi, vòng sáng đục 2-4 mm

207
Quy trình phân tích Staphylococcus aureus (PP đếm khuẩn lạc)

Chuẩn bị và pha loãng mẫu

Cấy trên môi trường thạch chọn lọc - Chapman

(37oC, 24-48 h) - Baird-Parker
Chän 5 khuÈn l¹c nghi ngê
Cấy vào TSA
(37oC, 24-48 h)
N=
 C .R
Phép thử khẳng định n.f .v

Thử nghiệm ngưng kết

coagulaza

Tính tỷ lệ khuẩn lạc đặc trưng

208
Quy trình định lượng S. aureus (PP MPN)

Chuẩn bị và pha loãng mẫu (100, 10-1, 10-2, 10-3)

Cấy mt tăng sinh MSB Mannitol Salt Broth

(37oC, 48 h)

Đục → ống (+)

Cấy mt khẳng định

BPA (37oC, 48 h)

Chọn KL đặc trưng


Thử nghiệm khả
Tra bảng MPN và tính
năng đông tụ

209
 Thử nghiệm coagulase

S.aureus có khả năng tiết enzym coagulase làm đông tụ các thành
phần huyết tương

PhÐp thö kh¼ng ®Þnh :

- Chän khuÈn l¹c nghi ngê ➔ èng nghiÖm 0,5 ml dÞch huyÕt
tương thá, l¾c ®Òu ➔ tñ Êm 370C, 2 - 24h➔ đông tụ huyết
tương?

➔ S. aureus (+)

210
5. Định lượng Salmonella

Phương pháp đếm khuẩn lạc:

Nguyên tắc :
• Nuôi cấy trên các môi trường tăng sinh sơ bộ
• Nuôi cấy trên các môi trường tăng sinh chọn lọc
• Nuôi cấy trên các môi trường rắn đặc hiệu
• Khẳng định = phép thử kiểm tra đặc tính sinh hoá của các
khuẩn lạc nghi ngờ

211
 Môi trường đặc trưngSalmonella

- Trên môi trường thạch đỏ phenol-lục sáng :

khuẩn lạc nghi ngờ có mầu đỏ

- Môi trường XLD (Xylose Lysine Desoxycholate) :

➔ khuẩn lạc nghi ngờ có mầu hồng trong suốt

- Môi trường BSA (Bismuth Sulfit Agar):

➔ mầu xám đen, môi trường xung quanh mầu nâu đen
có ánh kim

-Môi trường HEA (Hektoen-Entric Agar ):

→ mầu xanh lá cây hoặc xanh da trời với tâm mầu đen
hoặc không

212
Khuẩn lạc Salmonella

Trên mt BSA

Trªn mt XLD Trên mt HEA

213
Quy trình phân tích Salmonella
Đồng nhất (25g) và nuôi cấy tăng sinh dd đệm peptone
(225 ml dd đệm peptone,370C, 24 h)

Cấy trên mt tă ng sinh chọn lọc - RV (Rappaport-Vassiliadis)

(RV, 42oC; SX, 37oC, 24-48 h). - SX (Selenit – Xystin)

Thạch đỏ phenol - lục sáng

Cấy trên môi trường thạch nhận XLD (Xylose Lysine Desoxycholate)
dạng (37oC, 24-48 h) BSA

Chọn KL đặc trưng

Nuôi cấy BHI/TSA BHI (Brain Heart Infusion)

Phép thử khẳng định  (+) hay (-) trong 25/250 g

214
 PhÐp thö kh¼ng ®Þnh Salmonella

Phép thử sinh hóa Phản ứng Tỷ lệ Salmonella có phản

ứng (%)
a. Trong môi trường TSI :
• Axit từ glucoza + 100
• Sinh khí từ glucoza + 91,9
• Lên men lactoza - 99,2
• Lên men sucroza
- 99,5
• Sinh H2S
+ 91,6
b. Phân giải urê
- 99
c. Phân giải LDC(Lysin DeCacboxylaza)
+ 94,6
d. Phản ứng - galactosidaza
- 98,5
e. Phản ứng VP
- 100
f. Phản ứng Indol
- 98,9
g. Phản ứng Citrat
+

215
 a. Phép thử khẳng định trong môi trường TSI (Triple Sugar Iron)

Nguyên tắc :
Salmonella : - lên men Glucose, không LM Lactose, Sucrose
- Sinh H2S
Cách tiến hành :
- cấy trên bề mặt và cấy sâu xuống đáy ống thạch nghiêng mt TSI
-Nuôi 37oC trong 24 h.
- Quan sát :
• Lên men glucose ➔ trên bề mặt nghiêng màu hồng, đỏ
• Sinh H2S : xuất hiện các vệt màu đen, tạo khí hoặc vỡ thạch

216
Thử nghiệm TSI

1. Mẫu đối chứng

2. Salmonella Typhimurium
3. E.coli
4. Shigella
5. Salmonella typhi

217
b.Thử nghiệm phân giải ure
Nguyên tắc :
ureaza
Urê NH3 + CO2 ➔  pH và đổi mầu

Cách tiến hành :

- Cấy vào mt có ure, 37oC trong 2-24 h, chỉ thị
phenol đỏ
-Quan sát :
• MT không đổi màu (màu vàng) ➔
không phân giải ure ➔ (-)
(-) (+)
•MT đổi màu (màu tím) ➔ phân giải ure
➔ (+)
 Salmonella có phản ứng (-)
218
 c.Thö nghiÖm ph©n giải LDC
Nguyên tắc :
Lysin LDC
Cadaverin + CO2 ➔  pH mt

Cách tiến hành :

-Cấy vào mt có ure, 37oC trong 24 h- 4 ngay
-Chỉ thị Bromocresol tím
-Quan sát :
• Mt kh«ng đổi mầu (mầu vàng) ➔ (-)
•Mt đổi mầu (mầu tím) ➔ (+)

 Salmonella có phản øng (+)

219
 Lisin (+) Citrat (+)

Mẫu nem
chua

220
d. Phản ứng -Galactosidase

+ Thử nghiệm -Galactosidase (-):

Vi khuẩn lên men lactoza cần có 2 enzyme : -Galactosidase và

permease mà hoạt tính xác định nhờ ONPG(0-nitrophenyl-D-
galactopyranoside).

-Galactosidase
Lactose + ONPG 0-nitrophenol
(màu vàng)

 Salmonella có phản ứng (-)

221
 d. Phản ứng -Galactosidaza

+ Các tiến hành thử nghiệm -Galactosidase :

Hòa một vòng que cấy từ khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm có
chưá 0,25 ml dung dịch muối 0,85%. Thêm một giọt toluene, lắc
đều và đặt ống nghiệm vào nồi cách thủy ở nhiệt độ 370C trong
vài phút. Sau đó cho 0,25 ml dung dịch thử -Galactosidase, lắc
đều và đặt lại ống nghiệm vào nồi cách thủy vẫn ở nhiệt độ 370C
trong 24h. Phản ứng dương tính cho màu vàng, thường xuất
hiện sau 20 phút.

 Salmonella có phản ứng (-)

222
e. Thử nghiệm VP (Voges-Prouskauer)

Salmonella (-)

f. Thử nghiệm sinh Indol

Salmonella (-)

223
Salmonella spp.

• Mẫu nghiên cứu:

• 10 mẫu nem chua ở Hà Nội

• Phương pháp:
ISO 6579:2002 (≡ TCVN 4829:2005)

224
ISO 6579 25 g mẫu Tăng sinh lần 1 (không chọn lọc)

225ml nước peptone (24h)

Tăng sinh lần 2 Kiểm tra khả năng di động

(có chọn lọc)
Mueller Kauffmann (24h) MRSV (24-48h)

XLT4 (24h) Rambach (24h)

Các khuẩn lạc đặc trưng

Thạch nghiêng Kligler (glucose, lactose, H2S, khí)

Xét nghiệm hoá sinh (ure, lysine, simon citrate)

Xác định serotype 225

Kết quả 25 g mẫu
Tăng sinh lần 1 (không chọn lọc)
225ml nước peptone (24h)

Tăng sinh lần 2 Kiểm tra khả năng di động

(có chọn lọc)
Mueller Kauffmann (24h) MRSV (24-48h)

XLT4 (24h) Rambach (24h)

Các khuẩn lạc đặc trưng

Thạch nghiêng Kligler (glucose, lactose, H2S, khí)

Xét nghiệm hoá sinh (ure, lysine, simon citrate)

Xác định serotype 226

6. Clostridium và Cl.perfringens

•Clostridium là trực khuẩn, có thể đứng riêng rẽ hoặc thành chuỗi, là

vi khuẩn Gram (+), yếm khí bắt buộc, bào tử hình trứng và chịu nhiệt
cao tới 75-800C.

•Clostridium có thể khử sulfit thành sulfua:

SO32- + 6 H+ + 6e → S2- + 3 H2O

•Clostridium perfringens rất bền với cycloserin.

227
Môi trường xác định Clostridium và Cl.perfringens

Môi trường Winson Blair:

Glucoza 20 g; pepton 5 g; Cao nấm men 2,5 g; Cao thịt 1 g;
NaCl 5 g; Thạch 20 g; H2O cho đủ 1000 ml, Na2SO3 20% và
NH4Fe(SO4)2 5%.

Môi trường thạch TSC (Trypton Sulfit Cycloserin):

Trypton 15 g; cao nấm men 5 g; Soyton 5 g; Sắt ammonium
xitrat 1 g; Natri metabisulfat l g; thạch 20 g; H2O cho đủ 1000
ml. Hoà tan các chất và hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C trong
15 phút, pH cuối = 7,6 ở nhiệt độ 25oC

-Môi trường lỏng Thioglycollat +Resazurin natri:

-Trypton 15 g; Cao nấm men 5 g; L-cystin 0,5 g; Dextoza 5 g;
NaCl 2,5 g; Natri thioglycollat 0,5 g ; Dung dịch Resazurin natri
mới pha (1:1000) 1 ml; Thạch 0,75 g; H2O cho đủ 1000 ml.
228
Nuôi cấy trong ống thạch
Chuẩn bị mẫu (10-1 và 10-2)
dd đệm peptone
25g mẫu + 225 ml dd trypton muối

Đun tan chẩy mt Winson Blair

+ Na2SO3 và NH4Fe(SO4)

Cho mẫu, đun 75oC vµ 10-15

Chọn KL nghi ngờ

Nuôi cấy
(37/42oC, 24-72 h).
Phép thử khẳng định

Tính lượng Clostridium

Clostridium perfringens
229
Xác định Clostridium perfringens trong dưa cải

230
Phép thử khẳng định

Xác định hình thể và tính chất:

- Chọn khuẩn lạc điển hình (màu đen, tròn, lồi, bờ đều và nhẵn) và
cấy vào ống nghiệm có chưá môi trường lỏng Thioglycollat +
Resazurin natri. Nuôi cấy 37oC, 24 h, hoàn toàn yếm khí. Sau 24h
thu được canh trường thuần nhất.

- Lấy mẫu quan sát hình dáng tế bào và nhuộm Gram

 Clostridium : Trực khuẩn, G(+)

231
 Phép thử khẳng định
- Thử tính chất lên men đường Lactose-
Gelatin:

Từ canh trường thuần nhất nói trên, lấy 1

vòng que cấy cho vào ống nghiệm có chứa
môi trường Lactose-Gelatin

Nuôi cấy ở nhiệt độ 37oC trong 24h

Quan sát khả năng lên men đường lactose

sinh khí trong quá trình lên men và khả năng
hóa lỏng gelatin

A (+) : bị hóa lỏng

B (-) : mt đông đặc
232
Phép thử khẳng định Clostridium perfringens trong dưa cải

(+) Mẫu có C. perfringens

KC: Mẫu kiểm chứng
Hình 3.9. Phép thử khẳng
định Clostridium perfringens

(+) KC

233
Nu«i cÊy trong ®Üa th¹ch

ChuÈn bÞ mÉu (10-1 vµ 10-2) dd đệm peptone

(Xử lý mẫu 80oC, 15-20’)

(Trypton Sulfit Cycloserin)

Cho 1ml mẫu vào đĩa thạch, đổ
10-15ml mt TSC
(37/42oC, 24-48 h).

Đổ lớp 2

Nuôi trong bình kín

(37/42oC, 24-48 h). Chọn KL nghi ngờ

Đếm KL đen, tròn, lồi Phép thử khẳng định

Tính lượng Clostridium

 Clostridium perfringens
234
7. Bacillus cereus

Nguyªn t¾c:

Môi trường chọn lọc Mannitol-Egg-Yolk-Polymyxin (MYP) có

polymyxin làm chất chỉ thị đặc hiệu cho khuẩn lạc màu hồng. Iếp
tục khẳng định dựa trên các đặc tính sinh học.

235
Quy trình phát hiện Bacillus cereus

Chuẩn bị và pha loãng mẫu Đếm khuẩn lạc

Cấy trên môi trường thạch chọn lọc KL đỏ hồng, 2-3 mm, dẹt, bờ
(30oC, 24-48 h, MYP ➔  hồng răng cưa

Chọn 5 KL nghi ngờ

Phép thử khẳng định

G (+) Glucoza Nitrat VP (+)

phenol đỏ ➔nitrit

236
 Quy trình phát hiện Bacillus cereus

Chuẩn bị và pha loãng mẫu

MPN

Cấy ống nghiệm mt TSP Trypticase Soy

(30oC, 48 h,  9 ống ➔ Polymyxin

 Đục, có khí

Cấy trên môi trường thạch chọn lọc

(30oC, 24-48 h, MYP ➔

Chọn KL
nghi ngờ

Phép thử khẳng định

Glucoza Nitrat VP (+)

G (+) phenol đỏ ➔nitrit
(+) (+) 237
Phép thử khẳng định

Khả năng lên men đường glucose phenol đỏ:

Môi trường có pH 7,4, màu đỏ
Lên men => pH giảm => màu vàng pH < 6,8

Cách tiến hành:

• Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào

• Nuôi cấy ở nhiệt độ 300C trong 24h

• Quan sát sự đổi màu của ống thử từ đỏ sang vàng

238
Phép thử khẳng định

Khả năng khử nitrat thành nitrit:

Nguyên tắc : Vi khuẩn có enzyme nitratase khử nitrat thành nitrit
và nitơ phân tử (NO2-, NH3, N2)

Cách tiến hành :

- Dùng mt lỏng chứa nitrat, sau đó bổ sung chất chỉ thị
- Nitrit + Sulphanilamide
Màu hồng
N-naphthylethylendiamine đến đỏ tím
pH axit

239
Phép thử khẳng định

Khả năng khử nitrat thành nitrit:

Cách tiến hành:

• Cấy các khuẩn lạc nghi ngờ vào môi
trường chứa nitrat
• Nuôi cấy 300C, 24h
• Cho 0,3 – 0,5ml thuốc thử A và B
• Nếu màu hồng, đỏ tìm -> có nitrit
(+)
(-) (+) ĐC
 Bacillus cereus (+)

240
Thử nghiệm VP (Voges-Prouskauer)

Bacillus cereus VP (+)

241
 8. Pseudomonas aeruginosa

Nguyên tắc :

Nuôi cấy mẫu trên môi trường thạch chọn lọc Pseudomonas ở nhiệt

độ 42oC. Chọn khuẩn lạc màu xanh điển hình và tiếp tục khẳng định

dựa trên các đặc tính sinh hóa như lên men glucose, không lên men

glucose và không sinh khí….

242
Quy trình ph¸t hiÖn Pseudomonas aeruginosa

Chuẩn bị và pha loãng mẫu

Cấy trên mt thạch Pseudomonas

(42oC, 48 h, 2 f, 4 hộp ➔

Chọn KL
nghi ngờ

Phép thử khẳng định

G (-) Glucoza (+) Không sinh Oxydaza( Khả năng di Khử nitrat
Lactoza (-) Indol +) động (+) (+)
Không sinh H2S
243
Phép thử khẳng định

Nguyên tắc : Có enzyme oxydase

Thử nghiệm Oxydaza ( +)

Indophenol
Cytochrome oxydaza (màu xanh)

+ p-phenylenediamin

244
 9. Định lượng Vibrio

Nguyên tắc :
• Nuôi cấy trên các môi trường tăng sinh
- APW (Alkalin Pepton Water) :V. cholerae,V. alginolyticus, V. vulnificus
- Colistine (Colistine Polymicine Broth) :V. parahaemolyticus

•Phân lập trên môi trường chọn lọc: TCBSA (Thiosulphat Citrat Bile
Sucrose Agar)
V. cholerae,V. alginolyticus: d=2-3mm, màu vàng, tâm đục
V. parahaemolyticus, V. vulnificus : d=3-4 mm, màu xanh

•Khẳng định = kiểm tra đặc tính sinh hóa của các khuẩn lạc nghi ngờ

245
 Quy trình phát hiện Vibrio
Nuôi cấy tăng sinh
(APW/CPB, 37oC, 6-8 h)

Cấy trên mt thạch chọn lọc

KL đỏ hồng, 2-3 mm, dẹt
(TCBSA, 37oC, 18-248)
 Bờ hình răng cưa
Chọn KL đặc trưng
Nuôi cấy thu sinh khối (37oC, 10-12h)

Phép thử sinh hóa và khẳng định

G (-) LM Sac H2S (-) Oxydaza (+) LDC (+)

(+)

V.cholerae,V.parahaemolyticus Thử nghiệm kháng huyết thanh

246
THANK YOU !

247