Isoflavones Chemistry Analysis

Function and Effects 1st Edition Victor

R Preedy
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and Effects 1st Edition Victor R Preedy

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Edition Victor R. Preedy

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Second Edition Victor R. Preedy (Editor)

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 Food and Nutritional Components in Focus

Edited by Victor R. Preedy

Isoflavones
Chemistry, Analysis, Function and Effects
Isoflavones
Chemistry, Analysis, Function and Effects
Food and Nutritional Components in Focus

Series Editor:
Professor Victor R Preedy, School of Medicine, King’s College London, UK

Titles in the Series:

1: Vitamin A and Carotenoids: Chemistry, Analysis, Function and Effects
2: Caffeine: Chemistry, Analysis, Function and Effects
3: Dietary Sugars: Chemistry, Analysis, Function and Effects
4: B Vitamins and Folate: Chemistry, Analysis, Function and Effects
5: Isoflavones: Chemistry, Analysis, Function and Effects

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Isoflavones
Chemistry, Analysis, Function and Effects

Edited by

Victor R Preedy
School of Medicine, King’s College London, UK
Food and Nutritional Components in Focus No. 5
ISBN: 978-1-84973-419-6
ISSN: 2045-1695

A catalogue record for this book is available from the British Library

r The Royal Society of Chemistry 2013

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Apart from fair dealing for the purposes of research for non-commercial purposes or for
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Published by The Royal Society of Chemistry,

Thomas Graham House, Science Park, Milton Road,
Cambridge CB4 0WF, UK

Registered Charity Number 207890

For further information see our web site at www.rsc.org

Printed in the United Kingdom by CPI Group (UK) Ltd, Croydon, CR0 4YY, UK
Preface

In the past three decades there have been major advances in our under-
standing of the chemistry and function of nutritional components. This has
been enhanced by rapid developments in analytical techniques and instru-
mentation. Chemists, food scientists and nutritionists are, however, separated
by divergent skills, and professional disciplines. Hitherto this transdisci-
plinary divide has been difficult to bridge.
The series Food and Nutritional Components in Focus aims to cover in a single
volume the chemistry, analysis, function and effects of single components in the
diet or its food matrix. Its aim is to embrace scientific disciplines so that
information becomes more meaningful and applicable to health in general.
The series Food and Nutritional Components in Focus covers the latest
knowledge base and has a structured format.
Isoflavones has four major sections, namely:

Isoflavones in Context
Chemistry and Biochemistry
Analysis
Function and Effects

The first section covers phytoestrogens in health and plants, then material on
isoflavones in foods and the diet. The chemistry and biochemistry section
covers structures, bioconversion and biotransformation, the human estrogen
receptor, homonuclear NMR spectroscopy, genistein, daidzein, xenoestrogens,
methylated derivatives and non-natural isoflavonoids. The section on analysis
includes foods, beverages, nuts, traditional medicines, herbs, pharmacologically
active isoflavones, plasma and urine. Methodology encompasses microwave-
extraction, HPLC, LC-MS/MS and LC-UV/PDA and many other techniques.
Finally, the section on function and effects covers ingestion of isoflavones by

Food and Nutritional Components in Focus No. 5

Isoflavones: Chemistry, Analysis, Function and Effects
Edited by Victor R Preedy
r The Royal Society of Chemistry 2013
Published by the Royal Society of Chemistry, www.rsc.org

v
vi Preface
different populations, isoflavones in beverages, inherited metabolic diseases,
mucopolysaccharidoses, clinical trials, obesity, inflammation in adipose tissue,
menopausal vasomotor syndrome, estrogenic activity, testicular function,
thyroid function, gastric cancer, learning and memory, prenatal exposure, cell
proliferation, bone, NMDA and GABA receptors, and insulin secretion.
Individual isoflavones are also described, such as daidzein, genistein and gly-
citein, as well as their derivatives, such as equol and tetrahydroxyisoflavone. As
isoflavones occur within a complex plant matrix, other estrogenic and bioactive
compounds in isoflavones-rich foods, e.g. coumestrol, are described for com-
parative reference.
Each chapter transcends the intellectual divide with a novel cohort of fea-
tures namely by containing:

 Abstract
 Summary Points
 Key Facts (areas of focus explained for the lay person)
 Definitions of Words and Terms

It is designed for chemists, food scientist and nutritionists, as well as

healthcare workers and research scientists. Contributions are from leading
national and international experts, including contributions from world-
renowned institutions.
Professor Victor R Preedy
King’s College London
Contents
Isoflavones in Context
Chapter 1 Phytoestrogens in Health: The Role of Isoflavones 3
Rodney J. Baber

1.1 Introduction 3
1.2 Absorption, Metabolism and Excretion of Isoflavones 4
1.3 Mechanisms of Action of Isoflavones 5
1.4 Clinical Effects of Isoflavones 6
1.4.1 Cardiovascular Health 6
1.4.2 The Brain 6
1.4.3 Bone Health 7
1.4.4 Breast Cancer 7
1.4.5 Prostate Cancer 8
1.4.6 Menopausal Symptoms 8
1.5 Areas in Dispute 8
Summary Points 9
Key Facts 9
List of Abbreviations 10
References 10

Chapter 2 Phytoestrogens in Plants: With Special Reference

to Isoflavones 14
Franz Bucar

2.1 Characterization of Phytoestrogens 14

2.2 Distribution of Phytoestrogens in the Plant Kingdom 15
2.2.1 Phytoestrogens other than Isoflavones 15
2.2.2 Isoflavones 15

Food and Nutritional Components in Focus No. 5

Isoflavones: Chemistry, Analysis, Function and Effects
Edited by Victor R Preedy
r The Royal Society of Chemistry 2013
Published by the Royal Society of Chemistry, www.rsc.org

vii
viii Contents
2.3 Chemical Features of Plant Isoflavones 17
2.4 Biosynthesis of Isoflavones 18
2.5 Localisation of Isoflavones in Plants 19
2.6 Biological Function of Isoflavones in Plants 22
2.6.1 Interaction of Isoflavones with
Micro-organisms of the Rhizosphere 22
2.6.2 Isoflavones as Phytoalexins and Phytoanticipins 22
Summary Points 23
Key Facts 24
Definitions of Words and Terms 24
List of Abbreviations 25
References 26

Chapter 3 Isoflavones in Foods and Ingestion in the Diet 28

Baskaran Stephen Inbaraj and Bing Huei Chen

3.1 Introduction 28
3.2 An Overview of Structure and Analysis of Dietary
Isoflavones 29
3.2.1 Structure 29
3.2.2 Analysis 29
3.3 Isoflavone Content in Selected Foods 31
3.4 Growth, Variety, Environmental and Post-harvest
Storage Conditions Affecting Isoflavone Composition
in Soybeans 31
3.5 Isoflavone Composition as Affected by Processing 36
Summary Points 41
Key Facts 41
Definitions of Words and Terms 41
List of Abbreviations 42
References 43

Chemistry and Biochemistry

Chapter 4 The Chemistry/Biochemistry of the Bioconversion of

Isoflavones in Food Preparation 49
Kashif Ghafoor, Fahad Y. Al-Juhaimi and Jiyong Park

4.1 Introduction 49
4.2 Bioconversion of Isoflavones from Glycosides to
Aglycones 53
4.3 Enzymatic Transformation of Isoflavone Isomers
in Fermented Soymilk 54
4.4 b-Glycosidase Reaction during Bioconversion of
Isoflavones 56
Contents ix
Summary Points 57
Key Facts 57
Definitions of Word and Terms 57
List of Abbreviations 58
References 59

Chapter 5 Chemistry and Synthesis of Daidzein and its Methylated

Derivatives: Formononetin, Isoformononetin, and
Dimethyldaidzein 61
Vincent M. Carroll, Jeffrey D. St. Denis, Kyle F. Biegasiewicz
and Ronny Priefer

5.1 Introduction 61
5.2 Synthesis of Daidzein (1) 63
5.2.1 Synthesis of Daidzein: BF3  OEt2-catalyzed
Friedel–Crafts Acylation and Ring Closure 63
5.2.2 Synthesis of Daidzein: RCM with Grubbs’
Catalyst 64
5.2.3 Synthesis of Daidzein: I2-Mediated Cyclization 64
5.2.4 Synthesis of Daidzein: Oxidative
Rearrangement with Thallium(III) Nitrate 67
5.3 Synthesis of Formononetin (2) 67
5.3.1 Carbonyls as One-carbon Electrophiles 69
5.3.2 Activated Aldehyde Surrogates as One-carbon
Surrogates 70
5.4 Synthesis of Isoformononetin (3) 73
5.4.1 Selective Methylation of Daidzein (1) 73
5.4.2 Suzuki-mediated Synthesis 74
5.5 Synthesis of Dimethyldaidzein (4) 74
5.5.1 Synthesis of Dimethyldaidzein:
Polymer-supported Iodobenzene Diacetate
(PSIBD)-promoted Oxidative Rearrangement 76
5.5.2 Synthesis of Dimethyldaidzein:
Organolead-mediated Arylation 76
Summary Points 78
Key Facts 79
Definitions of Words and Terms 79
List of Abbreviations 79
References 80

Chapter 6 Non-natural Isoflavonoids 83

Namita Bhan and Mattheos Koffas

6.1 Introduction 83
6.2 Phenylpropanoid and Isoflavonoid Pathways 83
6.3 Isoflavanoids 85
x Contents
6.4 Non-natural Isoflavonoids 85
6.4.1 Semi-synthesis of Non-natural Isoflavonoids 85
6.4.2 Chemical Synthesis of Non-natural Flavanones 86
6.4.3 ER Assay 86
6.4.4 Protein Engineering of Uridine Diphosphate
Glycoslytransferase (UGT) 89
6.5 Structural and Functional Studies of IFS 89
Summary Points 90
Key Facts 90
Definitions of Words and Terms 91
List of Abbreviations 91
References 92

Chapter 7 The Structure of Isoflavones by 1D and 2D Homonuclear

and Heteronuclear NMR Spectroscopy 94
Kristiina Wähälä, Somdatta Deb and Tapio Hase

7.1 Introduction 94
7.2 Structure Elucidation: Establishing Spectral
Correlations 96
7.3 Chromatography-NMR 101
7.4 Conformation and NMR 102
7.5 Substituent Effects and Prediction of Structures 103
7.6 Isoflavone Metabolites 103
7.7 Solvent Effects 107
Summary Points 110
Key Facts 110
Definitions of Words and Terms 111
List of Abbreviations 112
Acknowledgement 112
References 112

Chapter 8 Biotransformation and Transfer of Genistein: a Comparison

with Xenoestrogens and a Focus on the Human Placenta 115
Hsiu-Wen Chan, Greg E. Rice and Murray D. Mitchell

8.1 Biotransformation of Genistein Compounds in the

Gastrointestinal Tract 115
8.1.1 Deglycosylation of Genistin in the Small
Intestine 116
8.1.2 Glucuronidation and Sulfation of Genistein 117
8.1.3 Hydroxylation of Genistein in the Liver 119
8.1.4 Breakdown of Genistein and Luminal Excretion 119
8.1.5 Transfer of Genistein in Placenta 121
8.2 A Comparison with Other Xenoestrogens 122
8.2.1 Chemical Structure of BPA and NP 123
Contents xi
8.2.2 Biotransformation of Xenoestrogens 123
8.2.3 Placenta Transfer 124
8.3 Conclusion 125
Summary Points 125
Key Facts 126
Definitions of Words and Terms 126
List of Abbreviations 126
References 127

Chapter 9 The Biological Effects of Genistein and its Intracellular

Metabolite, 5,7,3 0 ,4 0 -Tetrahydroxyisoflavone 131
Giulia Corona and Jeremy P. E. Spencer

9.1 Genistein and its Biological Activities 131

9.1.1 Oestrogenic Activity 132
9.1.2 Anticancer Effects 133
9.1.3 Antioxidant Action 134
9.1.4 Anti-inflammatory Activity 134
9.2 Intracellular Formation of the Genistein Metabolite
5,7,3 0 ,4 0 -Tetrahydroxyisoflavone (THIF) 135
9.3 THIF and Cancer 137
9.4 THIF and Endothelial Function 139
9.5 Summary 140
Summary Points 141
Key Facts 141
List of Abbreviations 142
References 142

Chapter 10 Genistein Chemistry and Biochemistry 148

Francesco Squadrito and Alessandra Bitto

10.1 Introduction 148

10.2 Chemical Structure and Interaction with Estrogen
Receptors 149
10.3 Metabolism 152
10.4 Conclusion 153
Summary Points 153
Key Facts 154
Definitions of Words and Terms 154
List of Abbreviations 155
References 155

Chapter 11 Isoflavones and Human Estrogen Receptor: When Plants

Synthesize Mammalian Hormone Mimetics 157
Patricia de Cremoux and Yves Jacquot

11.1 Introduction 157

11.2 From Plant Biosynthesis to Mammalian Biosynthesis 158
xii Contents
11.2.1 Biosynthesis of Isoflavonoids in Leguminous
Cells 159
11.2.2 Biosynthesis of Isoflavonoids in ERs 163
11.3 Interaction of Isoflavonoids with ERs 163
11.4 Mammalian Metabolism and Bioavailability 165
11.5 Biochemical and Physiological Functions of
Isoflavonoids 167
11.5.1 Estrogenic-related Effects 168
11.5.2 Non-estrogenic-related Effects 169
11.6 Conclusion 170
Summary Points 170
Key Facts 171
Definitions of Words and Terms 172
List of Abbreviations 173
References 174

Analysis
Chapter 12 Continuous Microwave-assisted Isoflavone Extraction 179
Dorin Boldor and Cristina Mirela Sabliov

12.1 Introduction 179

12.2 Microwave Extraction System Designs 181
12.3 Microwave-assisted Extraction Process 183
12.4 Oil Separation and Isoflavone Purification 183
12.5 Significant Results and Discussion 184
12.5.1 Isoflavones (and Oil) Yields 184
12.5.2 Influence of Time and Temperature
on the Oil and Isoflavones Extraction
Yield – Reaction Kinetics 186
12.6 Conclusion 189
Summary Points 190
Key Facts 190
Definitions of Words and Terms 191
List of Abbreviations 192
Acknowledgements 192
References 192

Chapter 13 Isoflavones: High-performance Liquid Chromatographic

Analysis of Glucuronic Acid- and Sulfuric Acid-conjugated
Metabolites of Daidzein and Genistein in Human Plasma
and Urine 196
Kazuo Ishii, Kaori Hosoda and Takashi Furuta

13.1 Introduction 196

13.2 Conventional Methods 198
Contents xiii
13.2.1 Selective Enzymatic Hydrolysis 198
13.2.2 Fractionation by Ion-exchange
Chromatography 203
13.2.3 Direct Assay 204
13.3 A Simple Direct Assay of Conjugated Metabolites
Using HPLC-UV 205
13.3.1 Reference Compounds 206
13.3.2 SPE 207
13.3.3 Chromatographic Conditions 209
13.3.4 Application 210
Summary Points 212
Key Facts 213
Definitions of Words and Terms 213
List of Abbreviations 215
References 216

Chapter 14 High-throughput Quantification of Pharmacologically Active

Isoflavones using LC-UV/PDA and LC-MS/MS 218
Wahajuddin and Sumit Arora

14.1 Introduction 218

14.2 High-throughput HPLC-UV/MS
Analytical/Bioanalytical Methods 222
14.2.1 High-throughput HPLC Methods using UV
Detection 222
14.2.2 High-throughput HPLC Methods using MS 224
14.3 Conclusions 238
Summary Points 238
Key Facts 239
Definitions of Words and Terms 239
List of Abbreviations 240
References 240

Chapter 15 Methods for Isoflavones: A Focus on Beverage Analysis 244

Rita C. Alves and M. Beatriz P. P. Oliveira

15.1 Introduction 244

15.2 Methods of Extraction 245
15.2.1 Direct Extraction 245
15.2.2 Hydrolysis 255
15.2.3 Internal Standards 257
15.3 Chromatographic Methods 258
15.4 Conclusion 258
Summary Points 259
Key Facts 259
xiv Contents
Definitions of Words and Terms 260
List of Abbreviations 260
Acknowledgements 260
References 260

Chapter 16 The Determination of Isoflavones in Supplemented Foods:

An Overview 263
Alberto Zafra-Gómez, Sonia Capel-Cuevas and
Noemı´ I. Dorival-Garcı´a

16.1 Introduction 263

16.2 Isoflavone Isolation 266
16.3 Techniques for the Analysis of Isoflavones in
Supplemented Food 268
16.3.1 Liquid Chromatography (LC) 269
16.3.2 Gas Ghromatography (GC) 271
16.3.3 Capillary Electrophoresis (CE) 271
16.3.4 Mass Spectrometry (MS) 272
16.3.5 Immunoanalysis 273
16.4 Conclusions 273
Summary Points 274
Key Facts 274
Definition of Words and Terms 275
List of Abbreviations 276
References 276

Chapter 17 Isoflavones: LC-MS/MS Profiling of Isoflavone Glycosides

and Other Conjugates 280
Piotr Kachlicki and Maciej Stobiecki

17.1 Introduction 280

17.2 Chromatographic Separation of Flavonoids 281
17.3 Mass Spectrometry (MS) as a Tool for Identification
of Isoflavone Glycoconjugates 281
17.4 Sources of Structural Variability of Flavonoid
Compounds 283
17.5 Differentiation of Isoflavone and Flavone
Glycoconjugates with Instrumental Methods 285
17.6 Differentiation of C-Glycosides and O-Glycosides of
Isoflavonoids 287
17.7 Differentiation of Acylated Glycoconjugates
of Isoflavonoids 288
Summary Points 291
Key Facts 291
Definitions of Word and Terms 291
Contents xv
List of Abbreviations 292
References 292

Chapter 18 Puerariae radix Isoflavones 294

Lei Wan and Chia-Hung Lin

18.1 Introduction 294

18.2 Use of Resources 296
18.3 Chemical Composition 296
18.4 Pharmacology and Potential Applications 298
18.4.1 Anti-tumor Activity 298
18.4.2 Anti-inflammation 302
18.4.3 Anti-hypertension 302
18.4.4 Anti-atherosclerosis 303
18.4.5 Neuroprotection 304
18.4.6 Anti-allergy 305
18.4.7 Anti-hyperglycemic Effect 306
Conclusions 307
Summary Points 308
Key Facts 308
Definitions of Words and Terms 309
List of Abbreviations 310
References 310

Chapter 19 Pattern Profiling and Quantitative Determination of

Isoflavones in Herbal Chemotypes using Liquid
Chromatography Tandem Mass Spectrometry 316
Lakshmi Manickavasagam, Smriti Mishra and
Girish Kumar Jain

19.1 Introduction 316

19.2 Herbal Preparations for Osteoporosis 317
19.2.1 Pattern Profiling and Quantitative Analysis
of Herbal Fractions 317
19.2.2 Osteogenic Herbal Fractions and
Compounds of Butea monosperma 317
19.3 LC-MS/MS Method for Qualitative and
Quantitative Analysis of Herbal Fractions 319
19.3.1 Chromatographic Conditions 319
19.3.2 Mass Spectrometric Conditions 321
19.3.3 Validation of the LC-MS/MS Method 322
19.3.4 Pattern Profiling and Quantitative Analysis
of Isoflavones 325
19.4 Conclusion 325
Summary Points 326
xvi Contents
Key Facts 327
Definition of Words and Terms 327
List of Abbreviations 329
Acknowledgements 329
References 329
Chapter 20 Analysis of Novel Isoflavone Digycoside in Nuts 333
Kazuhiro Nara

20.1 Introduction 333

20.2 Isoflavones 334
20.3 Isoflavones in Groundnuts 334
20.3.1 Plant Material and Preparation of
Groundnut Extract 334
20.3.2 HPLC Analysis of Isoflavones 334
20.3.3 Isolation and Purification of a Novel
Isoflavone from Groundnut Extract 335
20.3.4 Content of a Novel Isoflavone in Groundnuts 335
20.4 Analytical Profiles of Groundnuts 336
20.4.1 Isoflavone Profile of Groundnuts 336
20.4.2 Influence of the Extraction Temperature on
the Isoflavone Composition of Groundnut
Extract 337
20.4.3 Purification of a Novel Isoflavone (Peak-1)
from the Groundnut Extract 339
20.4.4 Structural Analysis of a Novel Isoflavone
from the Groundnut Extract 340
20.4.5 Content of a Novel Isoflavone from the
Groundnut Extract 341
20.5 Conclusion 342
Summary Points 343
Key Facts 343
Definitions of Words and Terms 344
List of Abbreviations 345
References 345
Function and Effects
Chapter 21 Isoflavone Ingestion by Multiethnic Populations: Implications
for Health 349
Baskaran Stephen Inbaraj and Bing Huei Chen

21.1 Introduction 349

21.2 Isoflavone Ingestion by Multiethnic Populations 350
21.2.1 Australia and the UK 350
21.2.2 Brazil 351
21.2.3 Canada 354
Contents xvii
21.2.4 China and Hong Kong 354
21.2.5 Italy 355
21.2.6 Japan 356
21.2.7 Korea 356
21.2.8 Singapore and Indonesia 357
21.2.9 Taiwan 358
21.2.10 USA 358
Summary Points 359
Key Facts 360
Definitions of Words and Terms 360
List of Abbreviations 361
References 361

Chapter 22 Isoflavones in Beverages 365

Rita C. Alves and M. Beatriz P. P. Oliveira

22.1 Introduction 365

22.2 Isoflavone Sources 366
22.2.1 Beverages as Isoflavone Sources 367
22.3 Conclusion 376
Summary Points 376
Key Facts 377
Definitions of Words and Terms 377
Acknowledgements 378
References 378

Chapter 23 Use of Isoflavones in Inherited Metabolic Diseases:

A Focus on Mucopolysaccharidoses 381
Daniel Scherman, Audrey Arfi and Corinne Marie

23.1 General Introduction 381

23.2 Introduction on Mucopolysaccharidoses (MPS) 382
23.2.1 Clinical Information, Genetics and
Biochemistry 382
23.2.2 Pathophysiology 383
23.3 Introduction on Glycosaminoglycan (GAGs) and
Isoflavone Families 384
23.3.1 GAGs: Structure, Function and Life Cycle 384
23.3.2 Isoflavone Family: Structure, Function and
Life Cycle 387
23.4 Use of Isoflavones for Substrate Reduction Therapy
(SRT) 387
23.4.1 Substrate Reduction Therapy (SRT):
Definition 388
23.4.2 Isoflavones and Analogs are Potent Agents
for SRT 388
xviii Contents
23.4.3 Isoflavone Action on GAG Synthesis and
GAG Accumulation 391
23.5 Conclusions and Perspectives for the Clinic 392
Summary Points 394
Key Facts 394
Definitions of Words and Terms 394
List of Abbreviations 395
References 395

Chapter 24 Optimizing Isoflavone-rich Food Delivery Systems for

Human Clinical Trials 399
Jennifer Ahn-Jarvis, Steven Schwartz and Yael Vodovotz

24.1 Introduction 399

24.1.1 Delivery of Isoflavone Dosage without
Compromising Palatability 400
24.1.2 Processing Effects on Soy Isoflavones 401
24.1.3 Relevance of Isoflavone Chemical
Composition 402
24.2 Materials and Methods 403
24.2.1 Preparation of Fermented and Thermally
Treated Soy Ingredients 403
24.2.2 Soy-almond Bread (SAB) Preparation 403
24.2.3 Isoflavone Analysis 404
24.2.4 Physicochemical Experiments 405
24.2.5 Characterization of Organoleptic Properties 406
24.3 Results and Discussion 407
24.3.1 Process of Selecting the Optimal
Phytochemical Delivery Vehicle 407
24.3.2 Isoflavone Analysis 409
24.3.3 Physicochemical Properties 410
24.3.4 Characterization of Organoleptic Properties 413
24.4 Conclusions 416
Summary Points 417
Key Facts 417
Definitions of Words and Terms 418
List of Abbreviations 419
References 420

Chapter 25 Isoflavones and Thyroid Function: An Overview 423

Francesco Squadrito and Alessandra Bitto

25.1 Introduction 423

25.1.1 Goitrogenic Effects of Flavonoids 425
25.2 The Case of Genistein 425
25.2.1 Genistein and Thyroid Function 426
Contents xix
25.3 Conclusions 430
Summary Points 431
Key Facts 432
Definitions of Words and Terms 433
List of Abbreviations 433
References 434

Chapter 26 Isoflavones against Gastric Cancer: Function and Effects 438

Sue K. Park and Kwang-Pil Ko

26.1 Introduction 438

26.2 Absorption, Metabolism, and Excretion 439
26.3 Function and Effect of Isoflavones against Gastric
Cancer 441
26.3.1 Anti-bacterial Effects 441
26.3.2 Antioxidant Activity 442
26.3.3 Anti-inflammation Effect 442
26.3.4 Inhibition of Enzymes 444
26.3.5 Inhibition of Angiogenesis 444
26.3.6 Enhancement of Apoptosis 445
26.3.7 Evidence from Population Studies 445
Summary Points 447
Key Facts 447
Definitions of Words and Terms 447
List of Abbreviations 448
References 448

Chapter 27 Dietary Isoflavones and Learning and Memory 451

Craige C. Wrenn

27.1 Introduction 451

27.2 Pre-clinical Studies of the Deleterious,
Endocrine-disrupting Effects of Dietary Isoflavones
on Learning and Memory 452
27.3 Pre-clinical Studies of the Beneficial Effects of
Dietary Isoflavones in Rodent Models of
Age-associated Cognitive Deficits 454
27.4 Pre-clinical Studies of Beneficial Effects of Dietary
Isoflavones in Ovariectomized Rats 455
27.5 Human Clinical Studies of Beneficial Effects of
Dietary Isoflavones on Learning and Memory 457
27.6 Summary 459
Summary Points 459
Key Facts 460
Definition of Words and Terms 460
xx Contents
List of Abbreviations 461
References 461

Chapter 28 Glycitein in Health 465

Brian R. Stephens and Joshua A. Bomser

28.1 Introduction 465

28.2 Absorption 466
28.3 Glycitein and Bone Health 467
28.4 Glycitein and Cancer 467
28.5 Glycitein and Cardiovascular Health 470
28.6 Glycitein as an Estrogen Receptor (ER)
Agonist 471
28.7 Glycitein and Memory and Mood 471
28.8 Glycitein and Oxidative Stress 472
Summary Points 473
Key Facts 474
Definitions of Words and Terms 474
List of Abbreviations 475
References 476

Chapter 29 Isoflavones and Prenatal Exposure to Equol 480

Edwin D. Lephart

29.1 Background: Polyphenols and Isoflavonoids 480

29.2 Isoflavonoid Metabolism in Mammals:
Postnatal Development 481
29.3 Equol: Biosynthesis (Plants and Mammals),
Antioxidant Activity, and Safety Data in Postnatal
Development 482
29.4 Comparison between Human and Rat: Newborn and
Adult Parameters 485
29.5 Perinatal Studies and Transplacental Transport of
Isoflavonoids 487
29.5.1 Isoflavonoids: Perinatal Rodent
Studies 487
29.5.2 Equol: Perinatal Rodent Studies 488
29.5.3 Isoflavonoids: Perinatal Human
Studies 490
29.6 Summary and Considerations 492
Summary Points 493
Key Facts 494
Definition of Words and Terms 495
List of Abbreviations 496
References 496
Contents xxi
Chapter 30 Genistein: GABAA and NMDA Receptors 500
Renqi Huang and Glenn H. Dillon

30.1 Introduction 500

30.2 GABAA Receptor Function and Structure 501
30.2.1 GABAA Receptor Function 501
30.2.2 GABAA Receptor Structure 502
30.2.3 GABAA Receptor Modulation 503
30.3 Genistein Modulation of GABA Receptors 503
30.3.1 Genistein as an Inhibitor of Protein Tyrosine
Kinases (PTKs) 503
30.3.2 Direct Inhibition of GABAA Receptors 504
30.4 NMDA Receptor Function, Structure and
Modulation 505
30.4.1 NMDA Receptor Function 505
30.4.2 NMDA Receptor Structure 506
30.4.3 NMDA Receptor Modulation 508
30.5 Genistein Modulates NMDA Receptor Modulation 508
30.5.1 Genistein as an Inhibitor of Protein Tyrosine
Kinases (PTKs) 508
30.5.2 Direct Inhibition of NMDA Receptors 509
30.6 Genistein Modulation of GABAA and NMDA
Receptors via the Estrogenic Pathway 509
30.7 Functional Implications 511
30.8 Conclusion 511
Summary Points 512
Key Facts 512
Definitions of Words and Terms 512
List of Abbreviations 513
References 513

Chapter 31 Estrogenic Activity and Molecular Mechanisms

of Coumestrol-induced Biological Effects 518
Kenneth Ndebele, Barbara Graham and Paul Tchounwou

31.1 Introduction 518

31.2 Animal Studies 519
31.3 Mechanisms of the Toxic Action 520
31.4 Human Studies 521
31.5 Interpretation of Data in Relation to Human Exposure 524
Summary Points 525
Key Facts 525
Definitions of Words and Terms 526
List of Abbreviations 526
Acknowledgements 526
References 526
xxii Contents
Chapter 32 Genistein and Insulin Secretory Function 529
Dongmin Liu

32.1 Introduction 529

32.2 Genistein may have Anti-diabetic Effects 530
32.3 Genistein at Physiological Concentrations Augments
Glucose-stimulated Insulin Secretion (GSIS) in
Beta-cells and Pancreatic Islets 532
Summary Points 537
Key Facts 537
Definitions of Words and Terms 537
List of Abbreviations 538
References 538

Chapter 33 Prevention and Management of Obesity by Isoflavones 541

Barbara B. Doonan, Erxi Wu and Joseph M. Wu

33.1 Introduction 541

33.2 Evidence that Dietary Factors and Soy Isoflavones
Play a Role in Obesity 543
33.2.1 Introduction to Soy Phytochemicals and
Isoflavones 543
33.2.2 Population-based Studies 544
33.2.3 Animal Studies 545
33.2.4 Laboratory Studies 546
33.3 Identification and Mechanism of Soy Isoflavones
with Anti-obesity Activities 547
33.3.1 Modulation of Fat Deposition and
Adipogenesis by Soy Isoflavones 547
33.3.2 A Facile Strategy for the Identification of
Soy Isoflavones with Potential for
Regulating Visceral Fat 549
33.3.3 Discovery of Proteins Targeted by Soy
Isoflavones with a Regulatory Role in
Adipogenesis 551
33.3.4 Candidate Molecular Targets and
Mechanisms of Anti-obesity Isoflavones:
Interplay Between NQO1 and p53 in
Regulation of Adipogenesis 552
33.3.5 Role of PPARa, PPARg, C/EBPa and Other
Candidate Molecular Sensors/Effectors of
Adipogenesis 553
33.4 Conclusions 555
Summary Points 555
Key Facts 555
Contents xxiii
Definitions of Words and Terms 556
List of Abbreviations 556
References 557

Chapter 34 Soy Isoflavones and Testicular Function 562

Benson T. Akingbemi

34.1 Introduction 562

34.2 Dietary Sources of Isoflavones 563
34.3 Hormonal Regulation of Reproductive Tract
Development 563
34.4 Regulation of Gonadal Function 565
34.5 Isoflavone Action in Testicular Cells 566
34.5.1 Effects on Steroidogenesis 567
34.5.2 Effects on Sperm Production 568
34.5.3 Effects on Developing versus Mature Stages
of Development 569
34.6 Mechanisms of Isoflavone Action 570
34.7 Isoflavone Action in the Human Testis 572
34.8 Conclusion 573
Summary Points 574
Key Facts 574
Definitions of Words and Terms 574
List of Abbreviations 575
References 575

Chapter 35 Equol and Cell Proliferation 580

Zhong Li, Caiyun Zhong and Chunyan Hu

35.1 Introduction 580

35.2 Equol and Hormone-positive Cell Proliferation 581
35.2.1 Equol Binds to ERs with a Greater Affinity
than Daidzein 581
35.2.2 Estrogenic Activity and Breast Cancer 581
35.2.3 Equol and Prostate Cancer 583
35.2.4 Equol and the Reproductive System 586
35.2.5 Equol and Neuroprotection 586
35.3 Equol and Other Cancer Cell Proliferation 586
35.3.1 Equol and Pancreatic Cancer 586
35.3.2 Equol and Colon Cancer 587
35.4 Equol and CVDs 587
35.5 Equol and Immune Functions 588
35.6 Equol and Genotoxicity 588
35.7 Equol and Cell Invasion 589
35.8 Equol and Cancer Chemoprevention 589
xxiv Contents
35.9 Equol and Drug Metabolism 590
35.10 General Conclusions 591
Summary Points 591
Key Facts 592
Definitions of Words and Terms 592
List of Abbreviations 593
References 593

Chapter 36 Bone, Genistein, Daidzein and Equol 597

Marina Komrakova, Ewa Klara Stuermer,
Klaus Michael Stuermer and Stephan Sehmisch

36.1 Introduction 597

36.2 Bone and Estrogen 598
36.3 Bone and Soy Isoflavones 599
36.4 Bone and Purified Genistein, Daidzein and Equol 600
36.5 Conclusion 605
Summary Points 606
Key Facts 606
Definition of Words and Terms 606
List of Abbreviations 607
References 607

Chapter 37 Isoflavones and Inflammation in Adipose Tissue and

Implications for Health 611
Maria Teresa Blay, Montserrat Pinent and Anna Arde´vol

37.1 An Introduction to Inflammation in Adipose Tissue 611

37.2 An Overview of Isoflavones as Anti-inflammatory
Agents 615
37.2.1 Isoflavones can Modulate Proinflamatory
Factors in Macrophages and Adipocytes
and Down-regulate Gene Expression of
Proinflammatory Mediators 616
37.2.2 Isoflavones can Modulate Proinflamatory
Factors in Adipose Tissue by a Decrease in
Adipose Tissue Mass and/or Number 617
37.3 What We Know from Animal Models and
Isoflavone Effects on Adipose Tissue Inflammation
and Health 619
37.3.1 The Effects of Isoflavones in Animal
Models of Obesity: Effect of Isoflavones in
Rats with High-fat Diet (HFD)-induced
Obesity/Insulin Resistance and the Analysis
of Inflammatory Factors 619
Contents xxv
37.4 What We Know from Human Studies and the Effects
of Isoflavone on Adipose Tissue Inflammation 621
37.4.1 Studies in Obese Postmenopausal Women 621
37.4.2 Studies with Genistein (Gen) in Human Cell
Inflammation 621
Summary Points 622
Key Facts 622
Definitions of Words and Terms 623
List of Abbreviations 624
References 624

Chapter 38 Isoflavones for Menopausal Vasomotor Syndrome 627

Rafael Bolaños Diaz and Juan Carlos Zavala Gonzales

38.1 Pharmacology Aspects 627

38.2 Clinical Evidence 630
38.3 Conclusions 640
Summary Points 640
Key Facts 640
Definition of Words and Terms 641
List of Abbreviation 641
References 641

Subject Index 646

Isoflavones in Context
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 Canción.
La alma de alegría salte;
que en tener mi bien
presente
no hay descanso que me
falte,
ni dolor que me atormente.

No pienso en viejos cuidados;

que agravia nuestros
amores
tener presentes dolores
por los olvidos passados.
Alma, de tu dicha valte;
que con bien tan excelente
no hay descanso que te
falte,
ni dolor que te atormente.

En tanto que Diana dijo su

canción, llegó á la fuente una
pastora de extremadíssima
hermosura, que en aquella hora á
la casa de Felicia había venido, é
informada que la sabia estaba en
el jardín, por verla y hablarla, allí
había venido. Llegada donde
Felicia estaba, arrodillada delante
della, le pidió la mano para se la
besar, y después le dijo: Perdonar
se me debe, sabia señora, el
atrevimiento de entrar aquí sin tu
licencia, considerando el deseo
que tenía de verte y la necesidad
que tengo de tu sabiduría. Traigo
una fatiga en el corazón, cuyo
remedio está en tu mano; mas el
darte cuenta della lo guardo para
mejor ocasión, porque en
semejante tiempo y lugar es
descomedimiento tratar cosas de
tristeza. Estaba aún Melisea, que
este era el nombre de la pastora,
delante Felicia arrodillada, cuando
vido por un corredor de la huerta
venir un pastor hacia la fuente, y
en verle dijo: Esta es otra
pesadumbre, señora, tan molesta
y enojosa, que para librarme della
no menos he menester vuestros
favores. En esto el pastor, que
Narcisso se decía, llegó en
presencia de Felicia y de aquellos
caballeros y damas, y hecho el
debido acatamiento, comenzó á
dar quejas á Felicia de la pastora
Melisea, que presente tenía,
diciendo cómo por ella estaba
atormentado, sin haber de su
boca tan solamente una benigna
respuesta. Tanto que de muy lejos
hasta allí había venido en su
seguimiento, sin poder ablandar
su rebelde y desdeñoso corazón.
Hizo Felicia levantar á Melisea, y
atajando semejantes
contenciones: No es tiempo, dijo,
de escuchar largas historias; por
agora, tú, Melisea, da á Narcisso
la mano, y entrad entrambos en
aquella danza, que en lo demás á
su tiempo se pondrá remedio. No
quiso la pastora contradecir al
mandamiento de la sabia, sino
que en compañía de Narcisso se
puso á bailar juntamente con las
otras pastoras. A este tiempo la
venturosa Ismenia, que para
cantar estaba apercebida, dando
con el gesto señal del interno
contentamiento que tenía
después de tan largos cuidados,
cantó desta suerte:

Canción.
Tan alegres sentimientos
recibo, que no me espanto,
si cuesta dos mil tormentos
un placer que vale tanto.

Yo aguardé, y el bien tardó,

mas cuando el alma le
alcanza,
con su deleite pagó
mi aguardar y su tardanza.
Vengan las penas á cuentos,
no hago caso del llanto,
si me dan por mil tormentos
un placer que vale tanto.

Ismenia, al tiempo que cantaba, y

aun antes y después, cuasi nunca
partió los ojos de su querido
Montano. Pero él como estaba
algo afrentado del engaño en que
tanto tiempo, con tal agravio de
su esposa había vivido, no osaba
mirarla sino á hurto al dar de la
vuelta en la danza, estando ella
de manera que no podía mirarle,
y esto porque algunas veces, que
había probado mirarla en el gesto,
confundido con la vergüenza que
le tenía y vencido de la luz de
aquellos radiantes ojos, que con
afición de contino le miraban, le
era forzoso bajar los suyos al
suelo. Y como en ello vió que
tanto perdía, dejando de ver á la
que tenía por su descanso,
tomando esto por ocasión,
encaminando su cantar á la
querida Ismenia, desta manera
dijo:

Canción.
Vuelve agora en otra parte,
zagala, tus ojos bellos;
que si me miras con ellos
es excusado mirarte.

Con tus dos soles me tiras

rayos claros de tal suerte,
que, aunque vivo en solo
verte,
me matas cuando me miras.
Ojos, que son de tal arte,
guardados has de tenellos:
que si me miras con ellos,
es excusado mirarte.

Como nieve al sol caliente,

como á flechas el terrero,
 como niebla al viento fiero,
como cera al fuego ardiente:
Ansi se consume y parte
la alma en ver tus ojos
bellos:
pues si me miras con ellos,
es excusado mirarte.

¡Ved qué sabe hacer amor,

y la Fortuna qué ordena!
que un galardón de mi pena
acresciente mi dolor.
A darme vida son parte
essos ojos sólo en vellos:
mas si me miras con ellos,
es excusado mirarte.

Melisea, que harto contra su

voluntad con el desamado
Narciso hasta entonces había
bailado, quiso de tal pesadumbre
vengarse con una desamorada
canción, y á propósito de las
penas y muertes en que el pastor
decía cada día estar á causa
suya, burlándose de todo ello,
cantó ansí:

Canción.
Zagal, vuelve sobre ti;
que por excusar dolor
no quiero matar de amor,
ni que Amor me mate á mí.

Pues yo viviré sin verte,

 tú por amarme no mueras,
que ni quiero que me
quieras
ni determino quererte.

Que pues tú dices que ansi

se muere el triste amador,
ni quiero matar de amor
ni que Amor me mate á mi.

No mediana pena recibió

Narcisso con el crudo cantar de
su querida, pero esforzándose
con la esperanza que Felicia le
había dado de su bien, y
animándose con la constancia y
fortaleza del enamorado corazón,
le respondió añadiendo dos
coplas á una canción antigua que
decía:

Si os pesa de ser querida,

yo no puedo no os querer,
pesar habréis de tener,
mientras yo tuviere vida.

Sufrid que pueda quejarme,

pues que sufro un tal
tormento,
ó cumplid vuestro contento
con acabar de matarme.
Que según sois descreída,
y os ofende mi querer,
pesar habréis de tener,
mientras yo tuviere vida.
 Si pudiendo conosceros,
pudiera dejar de amaros,
quisiera, por no enojaros,
poder dejar de quereros.
Mas pues vos seréis querida,
mientras yo podré querer,
pesar habréis de tener,
mientras yo tuviere vida.

Tan puesta estaba Melisea en su

crueldad, que apenas había
Narcisso dicho las postreras
palabras de su canción, cuando
antes que otro cantasse, desta
manera replicó:

Canción.
Mal consejo me parescs,
enamorado zagal,
que á ti mismo quieres mal,
por amar quien te
aborresce.

Para ti debes guardar

esse corazón tan triste,
pues aquella á quien le
diste,
jamás le quiso tomar.
A quien no te favoresce,
no la sigas, piensa en ál,
y á ti no te quieras mal,
por querer quien te
aborresce.

No consintió Narcisso que la

canción de Melisea quedasse sin
respuesta, y ansí con gentil gracia
cantó, haciendo nuevas coplas á
un viejo cantar que dice:

Después que mal me

quesistes
nunca más me quise bien,
por no querer bien á quien
vos, señora, aborrescistes.

Si cuando os miré no os viera,

ó cuando os vi no os amara,
ni yo muriendo viviera,
ni viviendo os enojara.
Mas bien es que angustias
tristes
penosa vida me den,
que cualquier mal le está
bien
al que vos mal le quesistes.

Sepultado en vuestro olvido

tengo la muerte presente,
de mí mesmo aborrescido
y de vos y de la gente.
Siempre contento me vistes
con vuestro airado desdén,
aunque nunca tuve bien
después que mal me
quesistes.

Tanto contento dió á todos la

porfía de Narcisso y Melisea, que
aumentara mucho en el regocijo
de la boda si no quedara
templado con el pesar que
tuvieron de la crueldad que ella
mostraba y con la lástima que les
causó la pena que él padescía.
Después que Narcisso dió fin á su
cantar, todos volvieron los ojos á
Melisea, esperando si replicaría.
Pero calló, no porque le faltassen
canciones crueles y ásperas con
que lastimar el miserable
enamorado, ni porque dejasse de
tener voluntad para decirlas; más,
según creo, por no ser enojosa á
toda aquella compañía. Selvagia
y Belisa fueron rogadas que
cantassen, pero excusáronse,
diciendo que no estaban para
ello. Bueno sería, dijo Diana, que
saliéssedes de la fiesta sin pagar
el escote. Esso, dijo Felixmena,
no se debe consentir, por lo que
nos importa escuchar tan
delicadas voces. No queremos,
dijeron ellas, dejar de serviros en
esta solemnidad con lo que
supiéremos hacer, que será harto
poco; pero perdonadnos el cantar,
que en lo demás haremos lo
possible. Por mi parte, dijo
Alcida, no permitiré que dejéis de
cantar ó que otros por vosotras lo
hagan. ¿Quién mejor, dijeron
ellas, que Sylvano y Arsileo,
nuestros maridos? Bien dicen las
pastoras, respondió Marcelio, y
aun sería mejor que ambos
cantassen una sola canción, el
uno cantando y el otro
respondiendo, porque á ellos les
será menos trabajoso y á
nosotros muy agradable.
Mostraron todos que holgarían
mucho de semejante manera de
canción, por saber que en ella se
mostraba la viveza de los
ingenios en preguntar y
responder. Y ansí Sylvano y
Arsileo, haciendo señal de ser
contentos, volviendo á proseguir
la danza, cantaron desta suerte:

Canción.
Sylvano. Pastor, mal te está
el callar:
canta y dinos tu
alegría.

Arsileo. Mi placer poco sería

si se pudiesse
contar.

Sylvano. Aunque tu ventura

es tanta,
dinos de ella alguna
parte.

Arsileo. En empresas de tal

arte
comenzar es lo que
espanta.

Sylvano. Acaba ya de contar

la causa de tu
alegría.

Arsileo. ¿De que modo

acabaría
quien no basta á
comenzar?

Sylvano. No es razón que se

consienta
tu deleite estar
callado.

Arsileo. La alma, que sola ha

penado,
ella sola el gozo
sienta.

Sylvano. Si no se viene á
tratar
no se goza una
alegría.

Arsileo. Si ella es tal como la

mía
no se dejará contar.

Sylvano. ¿Cómo en esse

corazón
cabe un gozo tan
crescido?

Arsileo. Téngole donde he

tenido
mi tan sobrada
passión.

Sylvano. Donde hay bien no

 puede estar
escondido todavía.

Arsileo. Cuando es mayor la

alegría
menos se deja
contar.

Sylvano. Ya yo he visto que tu

canto
tu alegría publicaba.

Arsileo. Decía que alegre

estaba,
pero no cómo ni
cuánto.

Sylvano. Ella se hace

publicar,
cuando es mucha
una alegría.

Arsileo. Antes muy poca

sería
si se pudiesse
contar.

Otra copla querían decir los

pastores en esta canción, cuando
una compañía de Nymphas, por
orden de Felicia, llegó á la fuente,
y cada cual con su instrumento
tañendo movían un extraño y
deleitoso estruendo. Una tañía su
laúd, otra un harpa, otra con una
flauta hacía maravilloso
contrapunto, otra con la delicada
pluma las cuerdas de la cítara
hacía retiñir, otras las de la lira
con las resinosas cerdas hacía
resonar, otras con los albogues y
chapas hacían en el aire
delicadas mudanzas, levantando
allí tan alegre música que dejó los
que presentes estaban atónitos y
maravillados. Iban estas
Nymphas vestidas á maravilla,
cada cual de su color, las
madejas de los dorados cabellos
encomendadas al viento, sobre
sus cabezas puestas hermosas
coronas de rosas y flores atadas y
envueltas con hilo de oro y plata.
Los pastores, en ver este
hermosíssimo coro, dejando la
danza comenzada, se sentaron,
atentos á la admirable melodía y
concierto de los varios y suaves
instrumentos. Los cuales algunas
veces de dulces y delicadas
voces acompañados causaban
extraño deleite. Salieron luego de
través seis Nymphas vestidas de
raso carmesí, guarnecido de
follajes de oro y plata, puestos
sus cabellos en torno de la
cabeza, cogidos con unas redes
anchas de hilo de oro de Arabia,
llevando ricos prendedores de
rubines y esmeraldas, de los
cuales sobre sus frentes caían
unos diamantes de
extremadíssimo valor. Calzaban
colorados borzeguines,
subtilmente sobredorados, con
sus arcos en las manos, colgando
de sus hombros las aljabas.
Desta manera hicieron una danza
al son que los instrumentos
hacían, con tan gentil orden que
era cosa de espantar. Estando
ellas en esto, salió un
hermosíssimo ciervo blanco,
variado con unas manchas
negras puestas á cierto espacio,
haciendo una graciosa pintura.
Los cuernos parescían de oro,
muy altos y partidos en muchos
ramos. En fin, era tal como Felicia
le supo fingir para darles regocijo.
A la hora, visto el ciervo, las
Nymphas le tomaron en medio, y
danzando continuamente, sin
perder el son de los instrumentos,
con gran concierto comenzaron á
tirarle, y él con el mesmo orden,
después de salidas las flechas de
los arcos, á una y otra parte
moviéndose, con muy diestros y
graciosos saltos se apartaba.
Pero después que buen rato
passaron en este juego, el ciervo
dió á huir por aquellos corredores.
Las Nymphas yendo tras él, y
siguiéndole hasta salir con él de
la huerta, movieron un regocijado
alarido, al cual ayudaron las otras
Nymphas y pastoras con sus
voces, tomando desta danza un
singular contentamiento. Y en
esto las Nymphas dieron fin á su
música. La sabia Felicia, porque
en aquellos placeres no faltasse
lición provechosa para el orden
de la vida, probando si habían
entendido lo que aquella danza
había querido significar, dijo
Diana: Graciosa pastora,
¿sabrásme decir lo que por
aquella caza del hermoso ciervo
se ha de entender? No soy tan
sabia, respondió ella, que sepa
atinar tu subtilidades ni declarar
tus enigmas. Pues yo quiero, dijo
Felicia, publicarte lo que debajo
de aquella invención se contiene.
El ciervo es el humano corazón,
hermoso con los delicados
pensamientos y rico con el
sossegado contentamiento.
Ofréscese á las humanas
inclinaciones, que le tiran
mortales saetas; pero con la
discreción, apartándose á
diversas partes y entendiendo en
honestos ejercicios, ha de
procurar de defenderse de tan
dañosos tiros. Y cuando dellos es
muy perseguido ha de huir á más
andar y podrá desta manera
salvarse; aunque las humanas
inclinaciones, que tales flechas le
tiraban, irán tras él y nunca
dejarán de acompañarle hasta
salir de la huerta desta vida.
¿Cómo había yo, dijo Diana, de
entender tan dificultoso y moral
enigma si las preguntas en que
las pastoras nos ejercitamos,
aunque fuessen muy llanas y
fáciles, nunca las supe adevinar?
No te amengues tanto, dijo
Selvagia, que lo contrario he visto
en ti, pues ninguna vi qne te
fuesse dificultosa. A tiempo
estamos, dijo Felicia, que lo
podremos probar, y no será de
menos deleite esta fiesta que las
otras. Diga cada cual de vosotros
una pregunta, que yo sé que
Diana las sabrá todas declarar. A
todos les paresció muy bien, sino
á Diana, que no estaba tan
confiada de sí que se atreviesse á
cosa de tanta dificultad; pero por
obedescer á Felicia y complacer á
Syreno, que mostró haber de
tomar dello placer, fué contenta
de emprender el cargo que se le
había impuesto. Sylvano, que en
decir preguntas tenía mucha
destreza, fué el que hizo la
primera, diciendo: Bien sé,
pastora, que las cosas
escondidas tu viveza las
descubre, y las cosas
encumbradas tu habilidad las
alcanza; pero no dejaré de
preguntarte, porque tu respuesta
ha de manifestar tu ingenio
delicado. Por esso dime qué
quiere decir esto:

Pregunta.
 Junto á un pastor estaba una
doncella,
tan flaca como un palo al sol
secado,
su cuerpo de ojos muchos
rodeado,
con lengua que jamás pudo
movella.
A lo alto y bajo el viento vi
traella,
mas de una parte nunca se
ha mudado,
vino á besarla el triste
enamorado
y ella movió tristíssima
querella.
Cuanto más le atapó el pastor
la boca,
más voces da porque la
gente acuda,
y abriendo está sus ojos y
cerrando.
Ved qué costó forzar zagala
muda,
que al punto que el pastor la
besa ó toca,
él queda enmudecido y ella
hablando.

Esta pregunta, dijo Diana, aunque

es buena, no me dará mucho
trabajo, porque á ti mesmo te la oí
decir un día en la fuente de los
alisos, y no sabiendo ninguna de
las pastoras que allí estábamos
adevinar lo que ella quería decir,
nos la declaraste diciendo que la
doncella era la zampoña ó flauta
tañida por un pastor. Y aplicaste
todas las partes de la pregunta á
los efectos que en tal música
comúnmente acontescen.
Riéronse todos de la poca
memoria de Sylvano y de la
mucha de Diana; pero Sylvano,
por desculparse y vengarse del
corrimiento, sonriéndose dijo: No
os maravilléis de mi desacuerdo,
pues este olvido no paresce tan
mal como el de Diana ni es tan
dañoso como el de Syreno.
Vengado estás, dijo Syreno, pero
más lo estuvieras si nuestros
olvidos no hubiessen parado en
tan perfecto amor y en tan
venturoso estado. No haya más,
dijo Selvagia, que todo está bien
hecho. Y tú, Diana, respóndeme á
lo que quiero preguntar, que yo
quiero probar á ver si hablaré más
escuro lenguaje que Sylvano. La
pregunta que quiero hacerte dice:

Pregunta.
Vide un soto levantado
sobre los aires un día,
el cual, con sangre regado,
con gran ansia cultivado
muchas hierbas producía.
De allí un manojo arrancando,
y sólo con él tocando
una sabia y cuerda gente,
 la dejé cabe una puente
sin dolores lamentando.

Vuelta á la hora Diana, á su

esposo dijo: ¿No te acuerdas,
Syreno, haber oído esta pregunta
la noche que estuvimos en casa
de Iranio mi tío? ¿no tienes
memoria cómo la dijo allí
Maroncio, hijo de Fernaso? Bien
me acuerdo que la dijo, respondio
Syreno, pero no de lo que
significaba. Pues yo, dijo Diana,
tengo dello memoria: decía que el
soto es la cola del caballo, de
donde se sacan las cerdas, con
que las cuerdas del rabel tocadas
dan voces, aunque ningunos
dolores padescen. Selvagia dijo
que era ansí y que el mesmo
Maroncio, autor de la pregunta, se
la había dado como muy
señalada aunque había de
mejores. Muchas hay más
delicadas, dijo Belisa, y una
dellas es la que yo diré agora. Por
esso apercíbete, Diana, que desta
vez no escapas de vencida. Ella
dice deste modo:

Pregunta.
¿Cuál es el ave ligera
que está siempre en un
lugar,
y anda siempre caminando,
 penetra y entra do quiera,
de un vuelo passa la mar,
las nubes sobrepujando?
Ansi vella no podemos,
y quien la está
descubriendo,
sabio queda en sola un
hora;
mas tal vez la conoscemos,
las paredes solas viendo
de la casa donde mora.

Más desdichada, dijo Diana, ha

sido tu pregunta que las
passadas, Belisa, pues no
declarara ninguna dellas si no las
hubiera otras veces oído, y la que
dijiste, en ser por mí escuchada
luego fué entendida. Hácelo, creo
yo, ser ella tan clara, que á
cualquier ingenio se manifestará.
Porque harto es evidente que por
el ave, que tú dices, se entiende
el pensamiento, que vuela con
tanta ligereza y no es visto de
nadie, sino conoscido y
conjeturado por las señales del
gesto y cuerpo donde habita. Yo
me doy por vencida, dijo Belisa, y
no tengo más que decir sino que
me rindo á tu discreción y me
someto á tu voluntad. Yo te
vengaré, dijo Ismenia, que sé un
enigma que á los más avisados
pastores ha puesto en trabajo; yo
quiero decirle, y verás cómo haré
que no sea Diana tan venturosa