Veoma selektivna

Pogodna za izdvajanje komponenata iz

biohemijskih smea
za preiavanje molekula iz smee
prednost: visoka efikasnost ak i kada su u
pitanju niske koncentracije eljenog biomolekula u
sloenoj smei (krv, serum)
Razdvajanje se zasniva na interakciji izmeu
specifine vrste molekula iz rastvora i molekula
koji su imobilisani na stacionarnoj fazi

BIOSELEKTIVNA ADSORPCIJA

- unoenje uzorka
- adsorpcija
- ispiranje
- desorpcija

Protein

Ligand

hormon receptor

hormon

antigen

antitelo
supstrat analog

enzim

inhibitor
kofaktor

Ligand: monospecifian ili specifian za grupu jedinjenja

Specifian molekul u
smei vezuje se za
kompatibilan molekul
kovalentno vezan za
stacionarnu fazu
Ostali molekuli
prolaze kroz
kolonu

Afinitetni matriks
Gel ekskluziona stacionarna faza ima veliku primenu u
afinitetnoj hromatografiji:
- fiziki i hemijski je stabilna pod veinom eksperimentalnih
uslova
- uglavnom se ne pojavljuju nespecifine hidrofobne interakcije
- veliki prenik pora
- ima reaktivne funkcionalne grupe za povezivanje sa ligandom
- ima uniformnu strukturu to omoguava neometan protok kroz
kolonu
agaroza (sefaroza 4B)
polivinil
poliakrilamid (bio-gel A 150)

aktivacija

kuplovanje

cijanogen bromidna aktivacija

aktivacija

Epoksidna aktivacija

ja
i
c
a
v
i
t
k
a
ka
s
n
i
z
a
i
r
t
Trihloro
i ja
c
a
v
i
t
k
a
a
n
t
a
d
Perjo

a
j
i
c
a
z
i
l
i
b
o
im
a
n
d
i
h
e
d
l
a
r
Gluta
Divinilsulfonska aktivacija

e
j
n
a
r
i
v
i
kt
a
o
k
s
n
Hino

a
d
i
m
a
l
ri
k
a
i
l
o
p
e
j
n
a
r
vi
i
t
k
a
ko
s
n
i
z
a
Hidr

 Enzim analog supstrata, inhibitor, kofaktor

Antitelo antigen, virus, elija
Lektin polisaharid, glikoprotein, receptor na povrini elija,
elija
Nukleinska kiselina komplementarni lanac, histoni, NK
polimeraze, NK vezujui proteini
Hormoni, vitamini receptor, transportni protein (nosa)
Glutation Glutation-S-transferaza ili GST fuzioni proteini
Joni metala Poli(His) fuzionisani proteini, proteini bogati
His, Cys, Trp ostacima na povrini

 Bioloke interakcije izmedju liganda i ciljnog

molekula mogu biti rezultat elektrostatikih
ili hidrofobnih interakcija, van der Waalsovih sila i vodoninih veza.
Elucija ciljnog molekula se obino vri
korienjem kompetitivnog liganda
(biospecifino) ili nespecifino promenom pH,
jonske sile ili polarnosti.

HPAC

High performance affinity

chromatography
primena pumpi kao kod HPLC
primena stacionarne faze manjih estica
vea efikasnost
npr. silika-gel kao vezana faza
veliina estica 10 mikrona
veliina pora 300 angstrema
pritisak ok 2500 psi (172 bar,
17200 kPa)

IMAC
Immobilizied Metal Affinity Chromatography
zasniva se na formiranju slabih koordinativnih
veza izmeu metalnih jona koji su vezani na
koloni i odreenih grupa na proteinu (uglavnom
histidinskih ostataka)

 Adsorbens se formira vezivanjem

odgovarajueg helatnog reagensa, najee
iminodiacetatnih struktura (IDA, NTA, TED).
Za njih se vezuju joni metala, najee
dvovalentnih prelaznih metala (Fe, Co, Ni, Cu,
Zn, Mn, Mg).
Imobilizovani joni metala najvie privlae His
ostatke, ali i Trp i Cys (na neutralnom pH).
Ovi ostaci ili rezidue moraju biti na povrini
proteina, to je retko u sluaju Trp.

 Helati su negativni, joni metala pozitivni.

Njihova naelektrisanja se ne potiru uvek.
Zato se IMAC radi pri visokim jonskim silama
(npr. 1 M NaCl).
To poveava kapacitet i jainu vezivanja
esto se u pufer za nanoenje dodaje malo
imidazola (10 mM) da bi se spreilo
nespecifino vezivanje tj. vezivanje His koji
se nalaze u nerekombinantnom proteinu.
Eluiranje se vri puferom sa viom
koncentracijom imidazola.

IDA = iminodiacetic acid

(tridenate)
NTA = nitrilo triacetic acid
(tetradenate)
TED = tris(carboxymethyl)
ethylene diamine
(pentadenate)

Cu i Zn kompleksiraju histidin, imidazol i

cistein

HiTrap kolone

HiTrap kolone za afinitetnu hromatografiju

pakovane sa 1mL ili 5mL derivatizovane Sepharose