8. UNIT.

AZIDO NUKLEIKOAK
SEKUENTZIATZEKO METODOAK
Miriam Aguado
 Unitate didaktikoaren eskema
8.1. AN-EN SEKUENTZIAZIOA

8.2. MAXAM ETA GILBERTEN METODO KIMIKOA

8.3. KATE BUKAERAKO METODO ENTZIMATIKOAK

8.4. LEHEN BELAUNALDIKO SEKUENTZIAZIO AUTOMATIKOA

8.5. BIGARREN BELAUNALDIKO SEKUENTZIAZIO MASIBOA

8.6. HIRUGARREN BELAUNALDIKO SEKUENTZIAZIOA

8.7. RNA SEKUENTZIAZIOA

 8.1. AN-EN SEKUENTZIAZIOA
AN-en sekuentziazioa prozesu bat da, DNA edo RNA molekula bat
osatzen duen nukleotido sekuentzia zehazten duena eta ematen
dituen base nitrogenatuen inizialen bidez irudikatzen dena.
 MAXAM ETA GILBERTEN METODO KIMIKOA
Erreakzio kimiko espezifikoen bidez base nitrogenatuak eraldatzean oinarritzen
da.

1. Molekularen muturretako bat 32P isotopo erradiaktiboarekin markatzea.

2. Base nitrogenatuen eraldaketa kimikoaren erreakzioak.
3. Elektroforesia bereizmen handiko polikrilamida gelean (%10-20)
4. Gelaren autoerradiografia
5. Autoerradiografiaren analisia

Maxam eta Gilbert (bideoa)

 8.3. Kate bukaerako metodo entzimatikoak
Sekuentziatu beharreko kate osagarrien polimerizazio erreakzioetan oinarritzen
dira.

SANGERen metodoa (bideoa)

1. Polimerizazio erreakzioak
2. Elektroforesia gelean
3. Autoerradiografia
4. Emaitzen analisia

Sanger metodoaren aldakuntzak (markaketentzako alternatibak)

- dNTP edo ddNTP markatuak.

- Erradioaktiboa 32P edo fluoreszentearekin
 8.4. Lehen belaunaldiko SEKUENTZIAZIO AUTOMATIKOA
Sangerren kate bukaerako metodo entzimatikoan eta lau fluorokromo markatzaile gisa
erabiltzean oinarritzen da.

8.4.1. PCR polimerizazioaren erreakzioak

-Hasle fluoreszente bidezko sekuentziazioa

- Bukatzaile fluoreszente bidezko sekuentziazioa

8.4.2. Fase automatizatuak sekuentziadorean

- Electroforesia→ Detekzioa→ Emaitzen interpretazioa

8.4.3. Eskala handiko sekuentziazioa: > 1000 base

- Paseo kromosomikoa
- Shotgun metodoa
 8.5. SEKUENTZIAZIO MASIBOA (2. belaunaldia)
8.5.1. DNA moldearen prestaketa fasea

- Molekula bakarreko DNA moldea

- DNA moldearen anplifikazio klonala
- PCRa emultsioan (emPCR)
- PCRa fase solidoan edo PCR zubia

8.5.2. Sekuentziazio erreakzioak (Illumina)

A. Bukaera itzulgarri ziklikoa

a. Bukatzaile itzulgarri markatu bat sartzea
b. Euskarriaren fluoreszentziaren irakurketa
c. Erreakzio kimiko baten bidez fluorokromoa eta agente blokeatzailea ezabatzea
B. Pirosekuentziazioa
a. Plakaren inkubazioa DNA polimerasarekin eta dNTP bakarrarekin
b. Bioluminiszentziaren neurria eta produkzioa
c. Erantsi gabeko gehiegizko dNTPa ezabatzea
 8.6. HIRUGARREN BELAUNALDIKO SEKUENTZIAZIOA
8.6.1. ION TORRENT sekuentziazioa

Polimerizazio erreakzio batean gertatzen diren pH mikroaldakuntzak detektatzen

ditu

Thermofisher bideoa Ion Torrent

8.6.2. NANOPORO bidezko sekuentziazioa

Denbora errealeko sekuentziazio metodoa ez polimerizazio erreakziorik ez

markaketarik gabe, biosentsoreetan oinarrituz

Nanoporetech bideoa
 8.7. RNA SEKUENTZIAZIOA
RNA sekuentziazioa egin daiteke zuzenean metodo entzimatikoen bidez, edo
zeharka, aurretik DNAo-ra pasatuta.

1. Zuzeneko RNA sekuentziazio metodo entzimatikoak

2. Zeharkako RNA sekuentziazio metodoak