PCR – Osnovni principi

tehhologije lančane reakcije

polimeraze
 PCR metodu je 1985. godine formulisao Karl Mullis,
veoma osetljiva i često se koristi u biologiji i medicini.
 Umnožavanje DNK putem PCR-a se bazira na
hibridizaciji specifičnih oligonukleotida (prajmera) i in
vitro sintezi kopija željenog fragmenta koji je oivičen i
obilježen datim prajmerima.
 Takvo umnožavanje je praćeno agaroznom gel
elektroforezom i prestavlja najednostavniju primjenu
PCR-a za identifikaciju vrsta.
 Za izvođenje PCR-a neophodni su:
 DNK matrica – dvostruki DNK lanac koji sadrži
informaciju koja se želi umnožiti, dužine 100-35000
baznih parova
 jednolančani prajmeri – sekvence oligonukleotida
dužine 20-30 nukleotida čije su sekvence
komplementarne krajevima one DNK sekvence koja se
želi umnožiti
 smješa slobodnih dezoksinukleotida u zasićenim
koncentracijama: 200 mM za svaki dNTP

 enzim DNK polimeraza koja vrši sintezu novih DNK

lanaca
 Mg2+ joni koji su neophodni za aktivnost enzima i
oni se dodaju u vidu MgCl2
 Pufer – standardni pufer koji se sastoji od 50 mM
KCl, 10 mM TRIS Cl, 1.5 mM MgCl2, pH 8.3, 21 Co
 U PCR metodi se koristi DNK polimeraza izolovana iz
bakterije Thermus aquaticus (nazvana Taq
polimeraza) koja živi u termalnim izvorima na
temperaturi oko 70 °C.
 Usljed toga je sposobna da na toj temperaturi vrši
replikaciju DNK molekula.

 Napravljena reakciona smješa se stavlja u aparat

nazvan Termocycler koji omogućuje tok reakcije.
 PCR se izvodi ponavljanjem u 20 – 30 ciklusa od kojih
se svaki sastoji iz tri osnovne faze.
 Zagrijavanje reakcione smješe na 94 – 96 °C pri
čemu dolazi do razdvajanja dvostrukih lanaca DNK
matrice.
 Ova faza traje oko jedan minut.
 Hlađenje reakcione smješe na 40 – 60 °C pri čemu
se vezuju prajmeri.
 Ova faza traje oko 30 sekundi u zavisnosti od
dužine prajmera, jer je dužim prajmerima
potrebno duže vrijeme za vezivanje.
 Zagrijavanje reakcione smješe na 72 °C, pri čemu
je Taq polimeraza započinje polimerizaciju i dostiže
maksimum aktivnosti.
 Trajanje ove faze zavisi od dužine fragmenta koji se
želi umnožiti i iznosi 1 – 2 minuta.
 Lančana reakcija polimeraze – PCR (polimerase chain
reaction) je postala nezaobilazna metoda u
molekularnim istraživanjima.
 Lahko se izvodi i obično zahtijeva manje vremena za
postizanje rezultata od mikrobioloških metoda.
 Vrijeme potrebno da se istarživač bez predznanja
osposobi za rad je oko nedelju dana, što je znatno
kraće od mikrobioloških tehnika gde je potrebno
veliko znanje i iskustvo.
 Proteklih godina reagensi za PCR su sve pristupačniji,
lakši za upotrebu i dugotrajniji.
 Većina reagenasa, izuzev prajmera i proba, se mogu
upotrijebiti u više ponavljanja.
 Real-time PCR tehnika pored detekcije omogućuje
kvantifikaciju produkta.
 I pored još uvijek skupe opreme za izvođenje PCR
tehnike, ona postaje sve zastupljenija zbog prednosti
u brzini, osjetljivosti i specifičnosti u odnosu na
mikrobiološke tehnike.
 Dok je za detekciju patogena u hrani mikrobiološkim
tehnikama potrebno do 6 dana, PCR može dati
rezultate za samo jedan dan.
 Pripremanje laboratorije za izvođenje PCR baziranih
testova
 PCR je veoma osetljiva i jednostavna metoda koja
može dati odgovore na mnoga genetička pitanja.
 Međutim, PCR može dati i lažne pozitivne ili
negativne reakcije ukoliko se ne vodi računa o
pravilnom postavljanju, standardizaciji i izvođenju
metode.
 Zbog toga je neophodno napraviti
standardizovane protokole za izvođenje PCR-a.
 Potrebno je voditi računa o opremanju i
postavljanu laboratorije, provjeriti ispravnost
opreme i reagenasa, pravilno čuvati i odabirati
reagense, ispravno birati sistem detekcije za PCR
produkte i imati dobro obučeno osoblje.
  Postavka PCR reakcije

 Pri izboru mjesta u laboratoriji za izvođenje PCR-a

veoma je bitno voditi računa o izvorima
kontaminacije.
 Idealno bi bilo koristiti četiri do pet različitih
prostorija za različite faze PCR-a.
 Prva faza je priprema uzorka koja obuhvata pripremu
reagenasa i izolaciju DNK.
 Zatim slijede postavka PCR reakcije, tok reakcije
(thermocycler) i detekcija PCR produkata.
 S obzirom da je veoma teško obezbijediti ovoliko
prostorija, fizička odvojenost se može postići
postavljanjem opreme tako da se pri izvođenju
metode osoblje i oprema kreću samo u jednom
smjeru.
 Ukoliko je moguće, proces bi trebao da se kreće u
smjeru iz čistijih i sterilnijih dijelova laboratorije,
ka onima gde je veća mogućnost pojave zagađenja u
vidu aerosola.
 Osoblje treba uvijek da nosi mantil i rukavice, čime
se smanjuje mogućnost kontaminacije.
 Za svaku fazu PCR-a treba promijeniti rukavice.
 Priprema uzorka je najosetljivija faza PCR-a i
najpodložnija kontaminaciji.
 Zbog toga bi trebalo imati tri odvojena mesta za:

 pripremu uzoraka
 pripremu reagenasa za DNK ekstrakciju
 ekstrakciju DNK iz uzorka
 PCR može detektovati i svega nekoliko ćelija koje su
kontaminirale negativan uzorak i dati lažno pozitivan
rezultat.
 Da bi se to izbjeglo neophodno je brisati spoljašnjost
kivete dezinfekcionim sredstvom radi uklanjanja
bakterija i DNK-aza (Borst, 2004).
 Mogućnost kontaminacije se smanjuje i ukoliko se
supernatant usisava, umjesto da se odliva.
 Upotreba UV lampe za dekontaminaciju mjesta za
izvođenje PCR-a može smanjiti opasnost od
kontaminacije uzoraka.
 Samo mjesto za detekciju produkata PCR-a, gde
se kivete pipremaju za detekciju i premeštaju na
agarozni gel, takođe može biti izvor
kontaminacije uzorka.
 Da bi se sve to izbjeglo mora se pažljivo rukovati
sa uzorcima i voditi računa da se na svaki mogući
način smanji mogućnost kontaminacije.
  Oprema za PCR

 Na prvom mjestu se nalazi PCR aparat (termocycler)

koji reguliše uslove za odvijanje same reakcije.
 Iako je to najskuplji dio opreme mora se imati u vidu
i ostali potrebni pribor.
 Potrebno je nekoliko setova pipeta (najmanje četiri),
oprema za elektroforezu, mikrotalasna rerna za
topljenje agaroze, zamrzivač za čuvanje reagenasa (-
20oC), UV svjetlo za čitanje i fotoaparat za snimanje
rezultata očitanih sa gela (Wellinghausen i sar 2004).
 Pri odabiru PCR aparata portebno je uzeti u obzir nekoliko
faktora.
 Cijena aparata, nažalost, može biti jedan od presudnih
faktora.
 Cijena aparata zavisi od mogućnosti kojima raspolaže:
kapacitet – 48 ili 96 uzoraka, da li se uzorci stavljaju u
kivete ili mikroploču sa više jamica, ili koja je potrebna
zapremina PCR reakcije.
 Vrijeme potrebno da se izvrši 30 ciklusa reakcije (10 ili 90
min), takođe utiče na izbor PCR aparata.

 Svi instrumenti u PCR laboratoriji se moraju kalibrisati i

obilježiti u skladu sa važećim institucionalnim standardima.
Za većinu institucija kalibracija se vrši jednom godišnje.
  Reagensi i prateći materijal
 Reagensi za PCR se dijele na one koji su potrebni za
izvođenje same reakcije i one koji su potrebni za
detektovanje proizvoda reakcije.
 Preporučuju se reagensi (prajmeri, probe i Taq
polimeraza) samo od pouzdanih proizvođača.
 Treba koristiti najbolje proizvode i pri rukovanju njima
uvijek koristiti rukavice.
 Voda je veoma bitan sastojak PCR-a.
 Treba koristiti vodu oslobođenu od DNK i DNK-aza.
 Ona se dobija autoklaviranjem i filtriranjem
(0,22µm).
 Ukoliko ima dovoljno novca može se kupiti
fabrički proizvedena.
 Treba koristiti vodu oslobođenu od DNK i DNK-aza.
 Ona se dobija autoklaviranjem i filtriranjem
(0,22µm).
 Ukoliko ima dovoljno novca može se kupiti
fabrički proizvedena.
  Kontrola kvaliteta

 Prehrambene laboratorije izvode analize u skladu sa

stanardnom radnom procedurom.
 Njom je tačno definisano kako se izvode procedure i
kako i kada vršiti kontrolu kvaliteta.
 Kontrola kvaliteta obuhvata testiranje svih reagenasa
i produkata svakog seta za analizu, da bi se utvrdilo
da ispunjavaju sve standarde kao i prethodni setovi i
da su pogodni za upotrebu.

 Poželjno je, nakon kontrole kvaliteta, sve reagense
razliti u bočice tako da se jedna bočica koristi za
jednu analizu.
 Još je pogodnije odmah pripremiti smješe potrebne
za PCR čime se smanjuje kontakt sa hemikalijama, a
time i mogućnost greške.
 Kupovni setovi se prodaju sa prethodno testiranim
reagensima, što treba da bude naznačeno na
pakovanju.
 Standardna radna procedura mora da sadrži
informacije o pozitivnim ili negativnim
kontrolama.
 Osnovne PCR kontrole su: kontrola DNK
ekstrakcije, uzorka uzetog iz organizma od
interesa, drugog uzorka uzetog iz nesrodnog
organizma, PCR kontrolu čiste poznate količine
DNK iz organizma od interesa i kontrolu bez DNK.
 Za svaku laboratoriju je neophodno da vodi
evidenciju o svemu što radi.
 Piše se laboratorijska sveska sa datumima i
detaljima o protokolima, reagensima, kontrolama
i rezultatima (Macrina 1995).
  Nekomercionalni testovi za patogene u hrani
 Laboratorija može odlučiti da komercijalni testovi
ne zadovoljavaju njene potrebe i da želi da koristi
nedavno objavljene prajmere ili čak da razvije
sopstvene.
 Ukoliko se koriste podaci i metode drugih
laboratorija mora se imati u vidu da se mogu javiti
problemi usljed različitih uslova i opreme u
laboratorijama.
 Zbog toga se prethodno mora izvršiti provjera
metode koja treba da pokaže da je nova metoda
jednaka ili bolja od do tada korišćene.
 Za komercijane metode to je već urađeno i
naknadna provjera nije potrebna.
 Pri odabiru PCR formata, veoma je bitno voditi
računa i o tehničkim i kadrovskim mogućnostima
laboratorije.
  Potvrda ispravnosti metode i standardizacija

 Prije nego što se nova metoda PCR-a prihvati za

upotrebu, mora se izvršiti provjera ispravnosti,
specifičnosti, osetljivosti i ponovljivosti date metode.
 Da bi riješila ovaj problem Evropska komisija je
pokrenula projekat pod nazivom FOOD-PCR sa ciljem
da se izvrši provjera i standardizacija PCR metoda za
detekciju bakterijskih patogena u hrani.
 Projekat je krenuo u martu 2000. godine i trajao do
juna 2003. godine.
 Napravljen je konzorcijum od 35 instituta, kompanija i
univerziteta iz 21 zemlje da radi na ovom projektu.
 Projekat je bio usmjeren ka razvoju metoda za
detekciju pet najvažnijih patogena: Salmonella
enterica, termofilna Campylobacter spp., Eschericia
coli, Listeria monocztogenes i Yersinia enterocolitica.
 Razvoj standardizovanih metoda se odvijao u tri faze.
 U prvoj fazi su birani definisani DNK uzorci i metode
PCR-a koje bi mogle biti pogodne za upotrebu.
 Projekat je takođe obuhvatao i pripremu uzoraka.
 U drugoj i trećoj fazi je vršena provjera efikasnosti i
upotrebljivosti odabranih PCR metoda.
 Vršene su kompletne provjere procedure pripreme
uzoraka i PCR metode da bi se dobili verifikovani PCR
protokoli za otkrivanje patogena u hrani.
 Pored toga cilj projekta je bio i da se obezbijede
biohemijski setovi za testiranje različitih tipova
PCR aparata i izolaciju DNK iz bakterijskih
kultura, proizvodnja odgovarajućih DNK prajmera,
internet bazu podataka sa PCR protokolima,
organizovanje obuke i pravljenje standardizovanih
uputstava u saradnji sa Evropskim komitetom za
standardizaciju (Anon, 1999A, Anon, 2000).
 Priprema internacionalnih standarda može biti dugačak
i glomazan posao i može trajati do nekoliko godina.
 Posebno su dugačke standardizacije metoda za
otkrivanje genetički modifikovanih organizama.

 Pri opisivanju i provjeravanju metode mora se voditi

računa o izrazima koji se upotrebljavaju.
 Poseban problem predstavlja izraz osetljivost koji se u
PCR laboratorijama, pored praga detekcije, može
odnositi i na uticaj inhibitora prisutnih u uzorku na
polimerazu.
 Na osnovu međunarodno priznatih protokola i
uputstava predložene su definicije koje bi trebalo
da budu opšte prihvaćene.
 Već je spomenuto da razvoj i verifikacija metoda za
detekciju patogena zasnovanih na PCR-u treba da se
odvija u tri faze.
 Razvoj i testiranje prajmera je prva faza u
uspostavljanju standardne PCR.
 Laboratorije koje imaju iskustvo sa prajmerima i
datim patogenom predlažu koje prajmere bi trebalo
koristiti.
 Laboratorije zatim prave spisak ćelijskih linija
patogena koji se ispituje.
 Iz svake linije se ekstrahuje DNK i analizira sa
serijom PCR-ova koji sadrže ispitivane prajmere.
 Svaka PCR treba da sadrži što uniformnije
reagense i kalibrisane termociklere.
 PCR zatim treba da bude optimiziran i
uspostavljen prag detekcije (broj ćelija koje će
detektovati sa vjerovatnoćom od 99 %).
 Druga faza obuhvata veliki broj interlaboratorijskih
testova koji treba da potvrde specifičnost PCR-a.
 Na tom poslu bi trebalo da bude uključeno 10 – 12
partnerskih laboratorija (Anon, 1999).
 Svaka laboratorija dobija standardnu proceduru,
uzorke DNK iz ćelijskih linija, i reagense.
 DNK uzorci treba da budu obilježeni kodovima tako da
njihov identitet zna samo vodeća laboratorija.
 Potrebno je izračunati odnos pravih i lažnih pozitiva i
pravih i lažnih negativa.
 Kod preciznih i tačnih PCR-ova, u oba slučaja odnos je
100 %.
 PCR treba da bude robustna, odnosno da se može
izvoditi sa reagensima različitih proizvođača.
 Ovo je najpovoljnije provjeriti tokom probnih testova
druge faze.
 Robustnost se provjerava ponavljanjem provjere
specifičnosti, ali sa upotrebom reagenasa i enzima od
različitih proizvođača.
 Treća i posljednja faza uključuje provjeru validnosti
kompletne metode u poređenju sa standardnom
metodom.
 To se takođe postiže interlaboratorijskim testovima
koji uključuju 10-12 partnera.
 Laboratojijama se šalju uzorci sa različitim brojem
prisutnih ćelija.
 Po Nordvalovom uputstvu trebalo bi imati nula, 1-10
i 10-100 ćelija/25 g uzorka (Anon, 2001).
 Uzorci se zatim inkubiraju i bilježe rezultati.
 Istovremeno se uzorci ispituju i konvencionalnom
metodom.
 Vodeća laboratorija poredi rezultate dobijene
svakim metodom.
 Rezultati najmanje osam laboratorija moraju biti
obrađeni da bi bili potpuni (Anon, 1999).
 Specifičnost, osetljivost i preciznost uopšte, svake
metode trebaju da budu utvrđeni i upoređeni.
 Robustnost i efikasnost metoda koje se zasnivaju na
PCR-u treba da budu barem na nivou standardnih
metoda.