MATERIALS

.Sodium hypochlorite solution (10–13%)—Bleach (Sigma, cat. no. 425044) ! CAUTION

Alkaline, may cause skin irritation; wear protective clothes and
. gloves.
.Water, HPLC–grade (Sigma, cat. no. 270733)
.EDTA disodium salt dihydrate (Sigma, cat. no. E5134) .Proteinase K (Sigma, cat. no.
P6556)
GuSCN (Sigma, cat. no. G9277) ! CAUTION Harmful; wear protective .clothes and gloves.
.Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris base) (Sigma, cat. no. T1503) .Sodium chloride
(Sigma, cat. no. S7653)
.Silicon dioxide (Sigma, cat. no. S5631) (see REAGENT SETUP)
HCl (Fluka, cat. no. 17077) 30% w/v ! CAUTION Acidic, may cause skin
.irritation; wear protective clothes and gloves. .Absolute ethanol (Merck, cat. no.
1.00983.2500) .TE buffer, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0
Extraction solution (see REAGENT SETUP)
Binding buffer (see REAGENT SETUP)
(see REAGENT SETUP)
. Washing buffer
EQUIPMENT

.Two separate rooms with one hood in the first and two hoods (laminar flow
hoods are recommended) in the second room; the minimum requirement
is at least two hoods in one room to separate the dust-producing bone
preparation from the buffer preparation, extraction procedure and setup
of PCR, as these latter processes are very susceptible to contamination .
(see EQUIPMENT SETUP)
Drilling/cutting equipment with exchangeable cutting blades, discs and/or
drilling bits (e.g., MICROMOT 40/E from Proxxon, cat. no. NO28515, and
.grinding and cutting discs from Proxxon, cat. nos. NO28812 and NO28830)
Mortar and pestle (one set per sample) or alternatively a freezer mill
(e.g., Spex 6770 freezer mill from Spex SamplePrep, cat. no. 6770-230) with
accessories (cat. no. 6751) m CRITICAL A sufficient number of grinding vials
are required to prepare more than one sample per day. Grinding vials need
to be thoroughly cleaned before reuse (see EQUIPMENT SETUP).
Liquid nitrogen, if using a freezer mill ! CAUTION Wear protective clothes .and
gloves to prevent freeze burning.
Rotary wheel, or similar equipment to keep the tubes agitated during .incubation,
with holders for different sized tubes (2-, 15- and 50-ml tubes)
Two balances, one for chemicals and one for samples m CRITICAL To prevent
contamination of chemicals with sample material, the balance for the .chemicals
must not be used for weighing the samples and vice versa.
Table top centrifuges: one suitable for the use of 15- and 50-ml conical tubes with
speed up to 5,000g (e.g., Multifuge 3 S from Heraeus), another for
1.5- and 2-ml tubes with speed up to 16,000g (e.g., Microcentrifuge 5415D
.from Eppendorf)
Filter tips are recommended to minimize the risk of cross-contamination
.owing to DNA aerosols.
.pH indicator strips (e.g., pH-Fix 3.6-6.1, Macherey-Nagel, art. no. 921 30)
Standard laboratory equipment such as different sized tubes, freezer and
refrigerator for storing extracts and chemicals.
 PROTOCOLO
Preparación de la muestra de hueso o un diente 
1

Eliminar la suciedad de la superficie

de la muestra, humedecer el tejido
con agua de grado HPLC (evitar
sustancias que disminuya la
sensibilidad).

Eliminar la superficie exterior de la de la

muestra con una herramienta de una sola
molienda (Elimina la contaminación
introducida durante la excavación y el
almacenamiento).
3
En dientes, cortar la raíz
o utilizar una parte de la
dentina (contiene más
ADN).

Cortar una parte de la

muestra, si es posible, de
una parte de hueso
compacto (el ADN se
conserva mejor).  
4 5 Liberación ADN con
la solución de
Triturar la
extracción, se
muestra con un
incuba con
mortero y
agitación suave de
obtener un polvo
16-24 .
de grano fino.
No pesar mas
de 500 mg de Dia siguiente
polvo. 1-3 h a 56 ° C

6 Purificación de ADN mediante la 7 Centrifugar las muestras y

unión a la sílice: centrifugar las rescatar sobrenadante y añadir
muestras. tampón de unión al sílice.
Recuperar el sobrenadante a la
de la suspensión de sílice y Centrifugar y eliminar el
ajustar el pH a 4.0 (HCl), sobrenadante y añadir
 incubar 3 h. tampón de lavado.
8 9
Centrifugar y eliminar Se seca la sílice a
sobrenadante y eliminar el temperatura ambiente
resto de líquido con una durante ~ 15 minutos.
pipeta (duplicado).

11
10
Añadir tampón TE a la sílice
seca y se resuspende, se
incuba con agitación.
12
Utilizar este extracto, o una dilución, para
aplicaciones posteriores. Si es necesario,
determinar la concentración de ADN en el
extracto como se indica en el cuadro 1.
Centrifugar y rescatar
sobrenadante a un tubo nuevo
(duplicado). Por lo tanto, la
combinación de ambos eluciones
aumentará la cantidad total de
ADN, pero disminuir la
concentración de ADN en el
extracto. También es posible
almacenar las eluciones (primera y
segunda) por separado, de manera
que el primero no se diluye con la
segunda.
 Preparación de silice: 5 h 
 Preparación de Buffer : 30-60 min 
 Preparación de la muestra de hueso o diente:
15-30 min por muestra.
 Liberación de ADN: 1 día (sólo 10 min de trabajo
necesario).
 Purificación de ADN mediante la unión a la
sílice:
unión al ADN: min 30.
 Purificación de ADN mediante la unión a la
sílice: incubación: 3 h.
 Purificación de ADN y la elución: 1-2 h.
 METHODS FOR MEASURING DNA QUANTITY

(A) Estimación de ADN y la distribución del tamaño en un gel de agarosa

Por electroforesis en gel de agarosa.El inconveniente de este método es que, debido a

la mayor parte del ADN normalmente se origina a partir de otras fuentes, los
resultados pueden ser engañosos. Tenga en cuenta también que la cantidad de ADN
diana en extractos de DNA antiguo puede ser muy baja y no es visible en geles de
agarosa, por lo tanto usar bromuro de etidio.

(B) Medir la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro

Mide el ADN endógeno y también la contaminación de ADN de origen bacteriano o

fúngico (260 nm), pueden no ser lo suficientemente sensible, por lo tanto, las
mediciones se pueden usar colorantes fluorescentes.

(C) Mediante PCR cuantitativa

Sólo se obtiene información acerca de la cantidad de ADN de un locus específico y la

longitud de fragmentos, sin embargo, se puede extrapolar a la cantidad total de
ADN.
 Problema Posible causa Solución
• Incluir un control positivo para confirmar que el procedimiento funcionó
• Use una dilución del extracto de ADN o espiga-limpio para aclarar si el extracto
Fallo aplicación Sustancias inhibidoras
es inhibitorio. 
aguas abajo coextraídas • Usar más enzima (por ejemplo, Taq ADN polimerasa para PCR) 
• Repetir la extracción con pequeñas cantidades de polvo de la muestra

• Incluir un control positivo para confirmar que el procedimiento funcionó 

La muestra contiene
• Use más extracto en la aplicación posterior 
poco o ninguna • Repetir la extracción con más muestra : tome más de la cantidad recomendada
cantidad de ADN de polvo de la muestra (por lo menos el doble).

Repita el paso obligatorio en el búfer original vinculante, añadir sílice nueva y

La unión a la sílice fue
ajustar el pH de nuevo, y si el pH es demasiado bajo, el ADN se han degradado y
ineficiente hay que empezar desde el principio.

 Soluciones, tampones
y / o sílice demasiado
Preparar nuevos reactivos
vieja

La extracción
Reactivos Si la diferenciación entre la contaminación y el ADN endógeno es posible,
está continuar o repetir la extracción total con soluciones recién preparadas.
contaminados
contaminada

Contaminación
cruzada durante el Repetir la extracción con soluciones recién preparadas
procedimiento de
GRACIAS