C¸C KH¸NG SINH NHÓM

BETALACTAM
 Môc tiªu d¹y - häc

Mục tiêu

Sau khi học xong chương này, sinh viên phải trình bày được:

1. Tên các chủng vi sinh vật được dùng trong sản xuất các
kháng sinh nhóm beta-lactam.

2. Quy trình lên men và chiết xuất penicillin G và V.

3. Các phương pháp sản xuất nguyên liệu để điều chế các
beta-lactam bán tổng hợp.
 Đ¹i c­¬ng
 Lịch sử:
 1928 Flemming tìm ra Penicillin
1941: các nhà bác học Anh là Abraham, Chain và Florey
mới tinh chế được penicillin dưới dạng ổn định và đã sản
xuất penicillin bằng phương pháp lên men.
 1943: penicillin đã được sản xuất ở quy mô lớn ở Mỹ
 Cấu trúc hóa học:
 betalactam (amid) N
O O
 dị vòng chứa S, O
S
S
 ph©n lo¹i
Theo nguồn gốc, cấu trúc và cơ chế tác dụng:
• Các Penicillin
- tự nhiên
- bán tổng hợp
• Các Cephalosporin
- thế hệ 1
- thế hệ 2...
• Các Cephamycin
• Các chất kháng betalactamase
• Các Carbapenem
• Các Monobactam : aztreonam
 ph©n lo¹i

Theo cÊu tróc ho¸ häc chung:

 C¸c Penicillin
 C¸c Cephalosporin
 C¸c Carbapenem
 C¸c Monobactam
 c¸c nh©n c¬ b¶n cña nhãm betalactam

nh©n CÊu tróc K/ sinh ®¹i diÖn

Penam S
C¸c Penicillin tù nhiªn vµ b¸n
N tæng hîp
O
O
Clavam C¸c Pe kh¸ng -lactam -ase
N
O (acid clavulanic)
O O
S
C¸c Penicillin kh¸ng -
lactamase (sulbactam ,
N
O tazobactam)
Carba- C¸c KS b¸n tæng hîp tõ
penem O
N
thienamycin (imipenem,
meropenem)
 c¸c nh©n c¬ b¶n cña nhãm betalactam

nh©n CÊu tróc K/ sinh ®¹i diÖn

mono- Aztreonam (tù nhiªn)
bactam O
N

S
Cephem C¸c Cephalosporin vµ
O
N Cephamycin
R2
S R2 = H: Cephalosporin
R1 CONH

N
CH2 R3
R2 = OCH3: Cephamycin
O
COOH Cefoxitin, Cefmetazole
 c¬ chÕ t¸c dông

- thµnh tÕ bµo VK g¾n kÕt víi protein g¾n Pe (PBP)

øc chÕ tæng hîp peptidoglycan
- x©m nhËp vµo mµng tÕ bµo VK
c¬ chÕ kh¸ng thuèc
- enzym penicillinnase ph¸ vì vßng betalactam

R-COCN S CH3
CH3
N
O COOH
Betalactamase
 phæ kh¸ng khuÈn

Phæ hÑp: Chñ yÕu trªn VK G (+)

- Penicillin G, V - bÞ betalactamase ph¸ huû
- Methicillin - kh«ng bÞ betalactamase ph¸ huû

Phæ réng: C¶ VK G (+) vµ G (-)

- Ampicillin, Amoxicillin - bÞ betalactamase ph¸ huû
- C¸c Cephalosporin - kh«ng bÞ betalactamase ph¸ huû
 ĐẠI CƯƠNG

Ưu:

- Hiệu quả điều trị cao, ít độc, giá rẻ nhất

- Sản lượng lớn nhất (KS -lactam bán TH)

Nhược:

- Dị ứng, sốc  thử test

- Phổ hẹp

- Nhanh kháng thuốc

 ĐẠI CƯƠNG

Cấu trúc hóa học của các penicillin

 ĐẠI CƯƠNG
C¸c Penicillin tù nhiªn t¹o ra trong MT lªn men:
Gèc R Tªn gäi gèc Tªn penicillin
CH3(CH2)5 - CH2 -
HeptylPe Penicillin K (IV)
CH3 - CH2CH = CH -
2-pentenylPe Penicillin F (I)
CH2
CH3 - (CH2)3 - CH2 -
AmylPe DihydroPe F
C6H5 - CH2 -
BenzylPe Penicillin G
C6H5 - O - CH2 -
ParaoxybenzylPe Penicillin X (III)
HO - C6H5 - CH2 -
PhenoxymetylPe Penicillin V
HOOC-CH(CH2)2-CH2- 1-amino-4-cacboxy-
Penicillin N
NH2 butylPe
 ĐẠI CƯƠNG

TÝnh chÊt:
- Pe G Na, K dÔ tan trong n­íc
- kh«: bÒn
- Èm: dÔ ph©n huû
- Pe G: kh«ng bÒn trong acid  tiªm (TM)
- Pe V : uèng (hÊp thu 60%)
PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN VI SINH VẬT
 Cơ sở công nghệ vi sinh vật: là quá trình sinh tổng hợp
bằng kỹ thuật lên men nhờ vi sinh vật trong các bình phản
ứng sinh học.
 Môi trường dinh dưỡng + Vi sinh vật → Sản phẩm + Vi sinh
vật + Cơ chất còn xót + Các sản phẩm phụ + Nhiệt năng
 Các hình thức lên men:
 Lên men hiếu khí
 Lên men kị khí
ƯU, NHƯỢC ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN

Ưu điểm:
 Có khả năng tạo các phân tử phức tạp như protein, kháng

sinh.
 Biến đổi sinh học cho năng suất cao hơn

 Sinh tổng hợp ở điều kiện ôn hòa

 Sản phẩm thu được không có đồng phân

Nhược điểm:
 Dễ bị nhiễm trùng

 Sản phẩm thường lẫn trong phức hợp

 Cần xử lý một môi trường lớn

 Quá trình lên men cần có thời gian dài

PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN VI SINH VẬT
Quá trình sản xuất dược phẩm bằng phương pháp lên men vi
sinh vật gồm 4 giai đoạn chính:
 Lựa chọn môi trường thích hợp

 Tuyển chọn giống vi sinh vật

 Lên men ở điều kiện tối ưu

 Thu nhận và tinh chế sản phẩm

 CHñNG GIèNG
 Penicillium notatum vµ P. baculatum

Chủng penicillium được nuôi cấy trên đĩa petri

Chủng penicillium ở các giai đoạn phát triển khác nhau

 CHñNG GIèNG

 Tõ nÊm mèc Penicillium chrysogenum thuéc hä nÊm cóc

(Aspergillaceace), chi mèc xanh (Penicillium) ®­îc b¶o qu¶n
®«ng kh«, hoÆc siªu l¹nh -70oC hay nit¬ láng.

Penicillium chrysogenum
 m«i tr­êng dinh d­ìng

SH
O
HOOC CHNH2 CH2 CH2 CH2 C NH CH CH2 CH (CH3)2
CO NH CH COOH

Acid aminoadipic Cystein Valin

MT cÇn giµu amino acid ®Ó XD nªn ph©n tö Penicillin

 m«i tr­êng dinh d­ìng

Hydratcacbon:
‐ Glucose (48h ®Çu ®ång ho¸ hÕt)
‐ bæ sung Lactose (G : L = 1 : 1)
‐ tinh bét, dextrin, saccharose
‐ acid h­ò c¬ (a. lactic, a. acetic...)
Nit¬:
- N v« c¬: amon, nitrat
- N hữu c¬: giµu a. amin  cao ng«, bét l¹c
 MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG
Lưu huỳnh: (thiazolidin)
- sulfat K, Na, amon, Na2S2O3
Kim loại vi lượng:
- Mg, Mn, Fe, Zn, Na, Cu v.v... (sunfat, nước
máy)
Chất tiền thể:
- acid phenylacetic phenyl etylamin : Pe G
- acid phenoxyacetic : Pe V
- cao ngô (2%)
 QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP PENICILLIN

 Từ ba tiền chất ban đầu là α-aminoadipic, cystein và

valin sẽ ngưng tụ lại thành tripeptit .
 Khép mạch tạo vòng β-lactam và vòng thiazolidin để tạo
thành izopenicillin N
 Trao đổi nhóm α-aminoadipyl với phenylacetic (hay
phenooxyacetic) tạo thành sản phẩm penicillin G (hay
penicillin V)
 ĐIỀU KIỆN LÊN MEN

pH: 6,0 - 6,5

CaCO3 æn ®Þnh pH
CÊp khÝ: rÊt hiÕu khÝ
1,2 - 1,5 VVM
NhiÖt ®é: 24OC
Thêi gian: 6 - 7 ngµy.
 PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN

Lªn men bÒ mÆt: (r¾n hoÆc láng)

‐ r¾n: h¹t hoÆc c¸m
‐ láng: chai Roux (V¸ng : lªn men lÇn 2)
‐ tO: 24OC
‐ thêi gian: 6 - 7 ngµy
‐ thæi khÝ v« trïng
‐ H/suÊt thÊp (<200UI/ml)
‐ dÞch läc Pe: röa vÕt th­¬ng
 PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN

Phương pháp lên men chìm

SX lần đầu tiên: 1947
phát triển theo 2 pha
Pha sinh trưởng:
- đồng hoá glucose với tốc độ cao
- nguồn HC: Glucose/lactose = 1/1
- Nhu cầu oxy lớn
- phát triển hệ sợi  S/khối tăng
- pH tăng làm giảm hiệu suất  chỉnh pH
 PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN

Phương pháp lên men chìm

Pha sinh Kháng sinh:
- sợi phát triển chậm
- bổ sung lactose nếu hết glucose
- pH tăng 7,0 – 7,5
- tiền chất:
 chiÕt xuÊt vµ tinh chÕ
C«
DÞch lªn men
4OC
TÈy mµu
läc
Than ho¹t
Lo¹i SKhèi
lo¹i n­íc
Acid hãa - 20OC
H2SO4 30% KÕt tinh
pH 2,5
Acetat Na, K
ChiÕt
Pe G, V (Na, K)
Butyl acetat Röa = butanol
SÊy 50OC
 c¸c penicillin b¸n tæng hîp

1941: Pe G: td hÇu hÕt c¸c S. aureus

1947: phÇn lín kh¸ng Pe G
B¸n tæng hîp tõ 6-APA
3 nhãm chÝnh:
- Phæ hÑp, bÞ t¸c dông bëi penicillinase
- Phæ hÑp, kh¸ng penicillinase
- Phæ réng, cã hoÆc kh«ng kh¸ng penicillinase
 ĐẠI CƯƠNG VỀ 6 - APA

S CH3
H3 N
CH3
N
O COO
-

acid 6 - aminopenicillanic (6-APA)

 ®¹i c­¬ng vÒ 6 - APA
LÞch sö:
- 1953 tìm ra 6 - APA trong m«i tr­êng nu«i P.
chrysogenum
- 1959 Batchelor & cs: chiÕt 6 - APA (cuèi pha 2)
 VSV ®­êng ruét: E. coli, B. megatherium

Penicillinamidase
Penicillin G 6-APA + a. phenylacetic
 ĐẠI CƯƠNG VỀ 6 - APA

Định hướng SX Pe bán TH

- acyl hoá nhóm NH2 ở vị trí số 6
- ester hoá nhóm -COOH ở vị trí số 3.
Tính chất
- không có hoạt tính KS với tụ cầu
- bị phá huỷ bởi penicillinase
- tinh thể trắng, bền
- độ chảy 209 - 210OC
- Tan ít trong nước và d/môi hữu cơ.
 s¶n xuÊt 6 - APA

Phương pháp hoá học

- 1970: từ Pe G
- hiệu suất cao ( 90 - 95%)
- điều kiện p/ứ rất khó (-40C)
- hoá chất đắt tiền
- tiêu hao năng lượng
- tốn dung môi
- nguy cơ ô nhiễm môi trường
 s¶n xuÊt 6 - APA

Phương pháp sinh học

- Phổ biến trong CN
- Lên men: HS thấp (+ Pe tự nhiên khác)
- Thuỷ phân bằng enzym VSV: chủ yếu