DETEKSI INFEKSI PENYAKIT

MENULAR
“Infeksi Menular oleh
Parasit”
Nurlaili Farida Muhajir, S.KM.,M.Sc.
STIKES GUNA BANGSA
• Deskripsi Sub Mata Kuliah :

(1)

Mata kuliah ini diberikan sebagai matakuliah keahlian

dasar tentang penyakit yang disebabkan oleh agent
infeksi parasit dan deteksi laboratorium untuk
penunjang diagnosa penyakit.
• Tujuan Mata Kuliah :
Peserta didik mampu :
Mampu memahami dan menjelaskan perbedaan
proses infeksi berbagai agen infeksius parasit serta
metode pemeriksaan terhadap spesimen yang
diperiksa dalam menunjang diagnosa penyakit yang
disebabkan oleh agent parasit.
 Common cause of infectious Diseases in the Worlds

Viruses
• Hepatitis (A,B,C)
• HIV/AID
• Influenza
• Rotavirus
• Dengue
Parasites
• Protozoa
• Helminths
Bacteria
• TBC
• Typhoid
• Streptococcus
 HELMINTHS AND
HELMINTHIC INFECTIONS
• Various species of Nematodes, Trematodes
and Cestodes infect human through different
ways.
• Human could be the definitive (i.e. Ascaris
lumbricoides) or intermediate host (i.e. Taenia
solium) or both (i.e. T. solium) of the infecting
helminths.
• Human could be the accidental host of
helminth (i.e. Toxocara canis).
HABITAT OF HELMINTHS INFECTING IN HUMAN

A. Small intestine:
a. Nematodes (i.e. Ascaris, Hookworms,
Strongyloides, Trichinella spiralis)
b. Cestodes (i.e. Taenia, Dipylidium,
Hymenolepis, Diphyllobothrium)
c. Trematodes (i.e. Fasciolopsis buski)
B. Large intestine:
a. Nematodes (i.e. Trichuris, Enterobius)
C. Liver:
a. Trematode (i.e. Clonorchis, Opisthorchis)
d. Lung:
a. Trematode (i.e. Paragonimus)
e. Blood vessels (i.e. Schistosoma)
 Life cycle of Ascaris lumbricoides
• Adult worms  live in the lumen of the small intestine.
• A female may produce up to 240,000 eggs /day, passed with the feces .
Fertile eggs embryonate and become infective after 18 days to several
weeks , (optimum: moist, warm, shaded soil).
• After infective eggs are swallowed , the larvae hatch , invade the intestinal
mucosa, and are carried via the portal, then systemic circulation to the
lungs .
• The larvae mature further in the lungs (10-14 days), penetrate the
alveolar walls, ascend the bronchial tree to the throat, and are
swallowed .
• Upon reaching the small intestine, they develop into adult worms . From
ingestion of the infective eggs to oviposition by the adult female takes
about 2 and 3 months.
• Adult worms can live 1 to 2 years.
 Human Nematodes in Small Intestine (1):
Ascaris and Hookworms (Ancylostoma & Necator)
 Soil-Transmitted Helminths
Soil-transmitted helminths do not reproduce within
the host: in order to be infective their eggs have to be
released into environment where they are
embryonated (roundworms, whipworms) or hatch
into infective larvae (hookworms). Usually the eggs
as well as the larvae do not enter the same host, who
released them. This feature is crucial for
understanding of the epidemiology and methods of
control (compare with pinworm,
Enterobius vermicularis,
 Human Nematodes in Intestine (3):
Enterobius vermicularis, the pinworm
LYMPHATIC FILARIASIS (caused by Wuchereria and Brugia), and
ONCHOCERCIASIS (caused by Onchocerca volvulus)
 Cestodes in Human (1):
Taenia saginata (Left); Diphyllobothrium latum (Right)
Taenia saginata
 Cestodes in Human (2):
Hymenolepis nana (Left); Hymenolepis diminuta (Right)
 Human Cestodes
Echinococcus granulosus
 Human Trematodes:
Adults (Left), and Eggs (Right)
Human Schistosomes in Blood vessels:
Schistosoma japonicum (Left); S. mansoni (Right)
Schistosomiasis
 Intestinal Protozoa
Flagellates: Giardia lamblia, Dientamoeba fragilis, Chilomastix
mesnili, Enteromonas hominis, Retortamonas intestinalis
Trichomonas hominis, Trichomonas tenax (oral) Trichomonas
vaginalis (urogenital)
Ameba: Entamoeba histolytica, Entamoeba dispar, Entamoeba
coli, Entamoeba hartmanni, Entamoeba gingivalis (oral)
Endolimax nana, Iodamoeba bütschlii
Apicomplexa: Cryptosporidium parvum, Cryptosporidium
hominis Cyclospora cayetanensis Isospora belli
Ciliata: Balantidium coli
Other: Blastocystis hominis,
 Giardia lamblia
Entamoeba histolytica

Trichomonas vaginalis

Cryptosporidium
Pemeriksaan Spesimen Feses untuk Deteksi Parasit Usus
Pemeriksaan Spesimen Darah untuk Deteksi Filariasis
 CARA MIKROSKOPIS
METODE LANGSUNG (TINJA SEGAR)

CARA LANGSUNG • 1 tetes larutan garam

fisiologis/eosin/iodin
LARUTAN • Tinja diambil dengan
GRM FIS lidi
(1-2mg) diletakkan
pada objek glass
•dihaluskan/
dihomogenkan
LARUTAN • Tutup dengan deck
EOSIN glass
• Periksa dengan
objektif 10-40x
• diulang 2 atau 3 kali
LARUTAN
IODIN
Video
Video
Pemeriksaan Spesimen Sekret Vagina/Urethra untuk
Deteksi Trichomonas vaginalis
Pemeriksaan Spesimen Darah untuk Deteksi
Plasmodium sp dan parasit darah lainnya
(Trypanosoma sp)
 TEBAL DAN TIPIS
TERPISAH DALAM 2 OBJEK
GLASS
TEBAL

TIPIS

31
 TEBAL DAN TIPIS
Dalam 1 OBJEK GLASS
TEBAL

TIPIS

32
 PRAKTIKUM

Pengambilan
darah,
langsung
ditampung
dalam 1 objek
glass

33
Sediaan darah dalam objek glass dibuat hapusan tebal dan tipis
dengan langkah-langkah sebagai berikut:

Hapusan darah tebal: Tetesan darah 3 tetes (masing-masing 2

mikroliter) dibuat bulatan dengan diameter 1 cm, kemudian
dikeringkan dalam suhu kamar 20 menit-1 jam dan dilanjutkan
dengan pewarnaan Giemsa.

Hapusan darah tipis: satu tetes darah (2 mikroliter) dibuat

sediaan tipis, kemudian dikeringkan, difiksasi dan dilanjutkan
dengan pewarnaan Giemsa.

34
Cara pengecatan Sediaan Darah Malaria

1.Sediaan tipis difiksasi dengan methanol 1 menit, sedangkan

pada sediaan tebal tidak dilakukan fiksasi.
2.Sediaan tebal dan tipis tidak boleh bercampur.
3.Sediaan dituangi dengan Giemsa encer 3% (3 bagian giemsa: 97
bagian buffer phosphat pH 7,2). Warnai selama 20-30 menit. Cuci
dengan air mengalir, keringkan. Periksa dengan mikroskop lensa
objektif 100 x memakai oil imersi. Pastikan hasilnya

35
Development &
General
Morphology of
Malaria
Parasite
Pemeriksaan Spesimen Plasma darah/Serum untuk
Deteksi antibodi Toxoplasma gondii
 ELISA

DASAR: Ikatan spesifik antara Ag-Ab

Teknik Qualitatif : Tiap Ab berikatan pada

Ag spesifik

Teknik Quantitatif : Jumlah Ikatan Ag-Ab

Ditentukan dengan nilai
Absorbansi

39
 Materials:
• Antigen
• Monoclonal Ab
• Microplate
• Blocking Buffer
• Serum sample
• Conjugate (secondary Ab + Enzyme)
• Subtrate
• Stop Sol.
40
 EQUIPMENTS:

96-Wells Microplate

Micropipettes Multichannel pipette

41
ELISA Test Kit
 Antibodi pada ELISA
• Ab disekresi oleh Sel Plasma (Sel B)

• Biasanya digunakan monoklonal Ab karena

lebih spesifik untuk epitop tertentu daripada
policlonal Ab

• Dpt dibeli terpisah atau dalam paket ELISA Kit

43
 Antibodi pada ELISA (2)

• Biasanya diprod. Dg cara induksi respon imun

humoral pada hewan coba ( rat, mouse) dg
cara injeksi Ag berulang, dilakukan ekstraksi
sel dan purifikasi Ab.

• Dpt juga diekstraksi dr human yg telah

diimunisasi dg Ag tertentu

44
 ABsorbsi pd Polystirene plate

 Kebanyakan diabsorbsi scr pasif

 Terjadi interaksi hidrofobik antara permukaan plate dan
molekul Ab.
 Dilakukan dg buffer sol. Dlm inkubator

 Permukaan polistyrene dpt dimodifikasi scr kimiawi

 Cincin Benzene dpt diganti atau dimodifikasi dg carboxyl atau
amina shg tjd ikatan covalen pada molekul

 Tipe teknik ELISA ditentukan oleh Ab atau Ag yang

diabsorbsi

45
 ELISA

• Basic parameters:
– Solid phase (microplate)  1 reactant
– Separation  bound & free reagent
– Color development  enzyme

46
 Immuno-serology technique

Indicator

+ + system /
detector

Antigen Antibody

47
 Systems :
• Direct
• Indirect
• Sandwich
• Capture

48
 Tipe ELISA
• Direct ELISA
– Biasanya digunakan dg kompetisi &Inhibisi ELISA
– Deteksi Ag
• Indirect ELISA
– Ag terikat pd Plate, Deteksi Ab
• Sandwich ELISA
– Ab terikat pada Plate, Deteksi Ag
• Capture ELISA
– Antihuman Ab terikat pada Plate, Deteksi Ab
49
 Direct EIA

substrat

Antibody + enzyme E

Ag

50
• Direct binding assay for Ab
or Ag
• The unlabeled component
is attached to solid support
• Specific binding is detected
by enzyme (ELISA) labeled
Ab/Ag
Ab
• Unbound labeled Ab is
removed by washing
• Bound Ab is detected by
an enzyme-dependent
color-change reaction.

51
 Indirect ELISA

substrat

Assay principle
Anti-human E
Ig+enzyme 1. wells coated with purified Ag
2. adding of sera incubation for 60
minutes, 37°С
3. adding of conjugate incubation for
Antibodi 30 minutes, 37°С
4. adding of chromogen incubation for
30 minutes, 18-25°С reaction
Ag termination result reading

52
Antibody Sandwich ELISA

53
Antibody Sandwich ELISA

54
 Capture ELISA

substrate Assay principle

1. wells coated with monoclonal

Antigen + antibodies to human IgM
enzyme E 2. adding of sera incubation for 30
minutes, 37°С

Antibody 3. adding of conjugate incubation for 30

minutes, 37°С
Anti- 4. adding of chromogen incubation for
human IgM 30 minutes, 18-25°С reaction
termination result reading

55
 Hal yang perlu diperhatikan pada
tahap persiapan reagensia
Reagensia bersuhu kamar sebelum dipakai
Pengerjaan tes sesuai dengan petunjuk dari
pembuat/ kit
Jumlah kontrol yang dipakai sesuai petunjuk
Waktu pembuatan larutan kerja
Penyimpanan larutan kerja :
Waktu
Suhu
Keadaan gelap
Penyimpanan reagensia : suhu
56
 Hal yang perlu diperhatikan pada tahap
penambahan spesimen / bahan pemeriksaan :

• Jenis spesimen sesuai petunjuk

• Spesimen bersuhu kamar sebelum dipakai
• Perhatikan identitas spesimen : urutan sesuai
lembar kerja

57
 Cara pemipetan :
 Satu tip untuk satu spesimen :
ganti tip untuk spesimen
berikutnya
 Tip tertancap erat pada ujung
pipet
 Posisi pemipetan tegak lurus
 Volume spesimen sesuai petunjuk
 Lebih baik memakai cara reverse
pipetting
 Ujung tip tidak menyentuh dasar
dan tepi sumur / tabung

 Spesimen harus homogen :

vortex

58
Hal yang perlu diperhatikan pada
tahap inkubasi :
• Homogenisasi sebelum inkubasi

• Suhu dan keadaan lingkungan inkubasi

sesuai petunjuk

• Waktu inkubasi sesuai petunjuk

59
Hal yang perlu diperhatikan pada
tahap pencucian :
Alat pencuci bekerja dengan baik : tidak
ada yang tersumbat atau tumpah keluar
Volume larutan pencuci sesuai petunjuk
Jumlah pencucian dan lamanya kontak
larutan pencuci sesuai petunjuk
Keringkan setelah pencucian dengan cara
menetakkan di atas beberapa lapis kertas
penyerap / tissue
60
 Hal yang perlu diperhatikan pada tahap
penambahan reagensia
(konjugat / substrat / larutan stop) :

Volume reagensia sesuai petunjuk

Cara pemipetan
Lebih baik bila menggunakan multi-channel pipette
Pembuatan dan penyimpanan larutan kerja sesuai
petunjuk

61
 Hal yang perlu diperhatikan pada
tahap pembacaan hasil :
• Panjang gelombang pembacaan sesuai
petunjuk
• Homogenisasi sebelum pembacaan
• Nilai validitas tes sebelum interpretasi hasil :
– Serapan kontrol negatif
– Serapan kontrol positif
– Nilai cut-off
– Bila hasil tidak valid / sah, jangan lakukan
interpretasi

62
ELISA Test Kit

63
Mouse IFN- ELISA Test Kit

64
 ELISA
• Target : IFN- dalam Serum/ Plasma

• Test Kit : mouse IFN- Instant ELISA

• Prinsip : ELISA sandwich

65
 Protokol Uji
Inkubasi Pertama

Monoclonal
Coating Ab

mIFN-

Biotin -
Conjugat
e

Streptavidin-
Conjugate

66
 Protokol Uji
Inkubasi Kedua

Substrat

67
 Protokol Uji
Stop Reaksi

Substrat
bereaksi

68
 Bahan Tersedia Dlm Kit :

• Microwell plate telah di coat mAb (rat) thd murin

IFN-; Biotin conjugate (anti-mIFN- mAb);
Streptavidin-HRP dan Lyophilized sample diluent.
• Microwell dg mIFN- standart
• Wash buffer (20x): PBS dg 1% Tween 20
• Substrat Sol. (Tetramethyl-benzidine)
• Sample diluent
• Stop Sol. (1M phosphoric Acid)
• SEDIAKAN : Aquadest steril

69
 Test plate

mIFN-
Sampel Uji
Standart
Duplikat

Blanko Bl Bl

70
 Pengukuran kadar IFN-
secara ELISA

Standart Sample Standart Sample

Sebelum stop reaksi Setelah stop reaksi

71
 Interpretasi Hasil-1

Kurva Standart

2
Adsorban pada 450 nm

1.5

0.5

0
0 200 400 600 800 1000 1200
Kons.mIFN-gamma (pg/mL)

72
 Interpretasi Hasil-2
Hasil :
Cut off = NCx + 0.100 (NCx=mean Negative control)
Jika nilai OD < C.O = Non Reactive
nilai OD > C.O = Reactive

Ketentuan interpretasi hasil:

Ikuti petunjuk pada Kit

73