Dra. M. L. Ortiz. Dep.

Microbiología y Parasitología Tema 6

INVESTIGACIÓN Y RECUENTO DE Enterobacteriaceae LACTOSA +

(COLIFORMES)
Las Enterobacteriaceae lactosa-positivas o grupo coli-aerogenes constituyen un grupo
de bacterias que se definen más por las pruebas usadas para su aislamiento que por
criterios taxonómicos. Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae y se caracterizan por
su capacidad para fermentar la lactosa con producción de ácido y gas, más o menos
rápidamente, en un periodo de 48 horas y con una temperatura de incubación
comprendida entre 30-37ºC.
Fermentación ácido mixta, produce una
Oxidasa - Glucosa mezcla de ácidos orgánicos: láctico,
Acido y
gas acético, fórmico y etanol, CO2 y H2.
Prueba del Rojo de Metilo +.

Fermentación butanodioica: acetil metil

carbinol o acetoína precursor
intermediario del butanodiol. prueba de
Voges Proskauer +

Indol + RM + VP - Citrato -

Reacciones en KIA Pruebas del INViC

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Investigación y recuento de Enterobacterias lactosa +

Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales, pero también en otros ambientes:
suelo, plantas, cáscara de huevo, etc.

Aunque su especificidad como indicadores no es buena, se suelen usar como índice de

contaminación fecal por:

- Su frecuencia en heces.
- Su fácil detección en el laboratorio.
- Sus características semejantes, en algún aspecto, a las de algunos miembros patógenos de la
familia Enterobacteriaceae.

Dentró, de este grupo, son los coliformes fecales los que tienen significado sanitario y, por
consiguiente, los que más interesan en el análisis microbiológico de alimentos.

Se considera a los coliformes fecales como presuntos Escherichia coli. Sus principales
características son:

- Capacidad para desarrollarse entre 43,5-45,5 ºC.

- Capacidad para crecer en presencia de sales biliares.
- Facultad para producir indol en agua de peptona.

En general, niveles altos de Enterobacteriaceae lactosa-positivas (coliformes) indican

manipulación y elaboración deficientes de los alimentos.
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Investigación y recuento de Enterobacterias lactosa + Caldo lactosado biliado verde brillante

(Brilliant Green Bile Lactose: B.G.B.L)
Peptona 10 g
Método en medio líquido Lactosa 10 g
Bilis de buey 20 g
Verde brillante 0,0133 g
Suspension madre 1:10 TW Agua destilada 1.000 ml

Disolver. Ajustar el pH a 7,4. Distribuir en tubos de

1 ml 1 ml 1 ml ensayo con campana Durham a razón de 10 ml.
Esterilizar en autoclave a 121 ºC 20 minutos.

Lectura: En las tablas del N.M.P. (tres series de tres tubos). Son
positivos los tubos que presentan gas en la campana Durham

10-1 10-2 10-3

B.G.B.L

Incubación a 31ºC durante 24-48h.

+ + + + - - - - -
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Investigación y recuento de Enterobacterias lactosa +

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Investigación y recuento de Enterobacterias lactosa +

Agar biliado-rojo neutro-cristal violeta

Suspension madre 1:10 TW (Violet Red Bile Agar: VRBA)

Extracto de levadura 3g
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml Peptona 7g
10 ml Cloruro sódico 5g
Sales biliares 10g
Lactosa 5g
Rojo neutro 0.03g
Cristal violeta 0.02g
Agar 15g
Agua destilada 1000ml
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

1ml

VRBA

- Después de depositada la siembra, verter, en cada placa 15 ml de

agar VRBA atemperado a 45 ºC.Mezclar, solidificar y añadir una
Las sales biliares y el cristal violeta del medio inhiben la flora
capa de VRBA en la superficie.
Gram+. La fermentación de la lactosa hace que vire el indicador
-Incubar a 31ºC durante 24 horas..
rojo neutro a un color rojo púrpura. También se produce una
-Observación y recuento de colonias típicas: rojo púrpura, rodeadas
precipitación de las sales biliares.
de una zona de precipitación color violeta
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Investigación y recuento de Escherichia coli

Oxidasa - Glucosa +
Lactosa +
SH2 -

Son bacilos Gram-, rectos, móviles, por flagelos peritricos o algunos inmóviles. La gran
mayoría poseen fimbrias para conjugación
Indol + RM + VP - Citrato -
Presenta una serie de pruebas bioquímicas
características: IMViC (++--). No forma SH2,
oxidasa- y catalasa-. Fermenta lactosa y glucosa
con gran producción de ácido y gas.
Se eliminan por las heces y son bastante resistentes a
las condiciones ambientales por lo que se utilizan
Pruebas del INViC como índice de contaminación fecal en aguas y
alimentos
Tiene el inconveniente de vivir poco
tiempo en el ambiente, por lo que su
presencia en los alimentos indica
contaminación reciente.
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Investigación y recuento de Escherichia coli

Cepas enterotoxigénicas (ECET).

Elaboran una toxina termolábil (LT) que se inactiva a 60ºC durante 30 minutos
y/o una toxina termoestable (ST) que resiste a más de 100ºC durante 30 minutos.
La toxina termolábil es estructuralmente semejante a la toxina colérica.

Se localiza la bacteria en el intestino delgado elaborando toxinas que alteran las

células del epitelio del intestino delgado, destruyéndolas, lo que ocasiona salida de
agua y electrolitos que se vierten a la luz intestinal originando una diarrea acuosa.

Originan diarrea infantil y la denominada diarrea del turista. Los síntomas se

inician entre las 8 y 48 horas de la ingestión del alimento y son diarrea acuosa, a
veces con mucosidad, dolor abdominal, nauseas, vómitos y si se origina fiebre, no
muy alta. A veces puede ser grave, semejante al colera. Son excepcionales en
nuestro país, pero causan con gran frecuencia enteritis en paises subdesarrollados
del Próximo y Extremo Oriente, Africa y Centro y SurAmerica.
 Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiología y Parasitología Tema 7

Investigación y recuento de Escherichia coli

Cepas enteroinvasivas (ECEI).

Tienen características atípicas que las hacen semejantes a Shigella, ya que son
inmóviles y no producen gas de la glucosa y fermenta la lactosa muy lentamente.
Tienen un potencial enteroinvasor semejante al de Shigella.

Las bacterias penetran en el intestino e invaden las células epiteliales del colon donde
se multiplican y destruyen ocasionando ulceraciones, lo que ocasiona diarrea
sanguinolenta. Es mas grave que la anterior. Los síntomas aparecen entre las 8 y 24
horas de la ingestión y son escalofríos, malestar, dolor de cabeza, dolor abdominal,
diarrea sanguinolenta y fiebre. Dura varios días y semanas. No es demasiado grave y
es muy rara en nuestro país.
Cepas enteropatógenas (ECEP).

Se les denomina cepas enteropatógenas clásicas por ser las que mas comunmente
ocasionan enteritis en nuestro país. Ocasionan una patología parecida a las cepas
enterotoxigénicas. Son causantes de numerosos brotes en guarderías y otras
comunidades infantiles. Es mas frecuente en países subdesarrollados con condiciones
higiénicas deficientes. Se localizan en el epitelio intestinal pero no destruyen los
tejidos. Los síntomas aparecen entre las 17 y 72 horas y son dolor abdominal,
vómitos, fiebre , diarrea acuosa con abundante moco pero sin sangre. Dura entre 7 y
72 horas.
 Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiología y Parasitología Tema 7

Investigación y recuento de Escherichia coli

Cepas enterohemorrágicas (ECEH).

E.coli serovar O157:H7 pueden causar la
muerte. Producen verotoxina. Lesiona la
mucosa intestinal produciendo sangrado, sin
reacción inflamatoria local.
Colitis hemorrágica: dolor abdominal, con vómitos, diarrea acuosa y sanguinolenta y
poca o ninguna fiebre.
Síndrome hemolítico urémico: diarrea sanguinolenta y sobre todo en niños fallo renal
agudo que puede terminar en muerte. No hay fiebre.
Púrpura trombótica trombocitopénica: No hay fiebre y hay diarrea hemorrágica, pero
se afecta el sistema nervioso central. Se producen coágulos en el cerebro y puede
ocasionar la muerte.
 Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiología y Parasitología Tema 7

Investigación y recuento de Escherichia coli Caldo lactosado biliado verde brillante

(Brilliant Green Bile Lactose: B.G.B.L)
Tubos positivos en B.G.B.L. Agar Levine EMB Peptona 10 g
Lactosa 10 g
Peptona 10 g Bilis de buey 20 g
Lactosa 10 g Verde brillante 0,0133 g
Fosfato dipotásico 2g Agua destilada 1.000 ml
Eosina 0,40 g Disolver. Ajustar el pH a 7,4. Distribuir en
Azul de metileno 0,065 g tubos de ensayo con campana Durham a razón
Agar 15 g de 10 ml. Esterilizar en autoclave a 121 ºC 20
1 ml Agua destilada 1.000 ml minutos.

10 ml caldo B.G.B.L.
con campana Durham

Incubación 44,5ºC, 24-28 h.

Las colonias de E. coli sobre agar Levine miden 2-3 mm de diámetro, son planas o
ligeramente cóncavas, con centros oscuros, casi negros, que ocupan las 3/4 partes de la
Tubos + (gas) colonia. Con luz reflejada, se observa un brillo metálico verdoso; a veces, este brillo
metálico no se manifiesta.
I M Vi C
Pruebas confirmativas
Agar Levine Indol + Rojo metilo + VP - Citrato -

Incubación 37ºC, 24 h.

Agar PCA
Incubación 37ºC, 18-24 h.
 Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiología y Parasitología Tema 7

Prueba rápida para Investigación de E. coli (MUG)

Suspension madre 1:10 TSB E. coli posee, junto con algunas especies de
Salmonella y Shigella, la enzima -D-
1 ml 1 ml 1 ml
Caldo lauril sulfato (MUG) glucuronidasa, que actúa sobre el 4-metil-
Triptosa 20 g umbeliferil--D-glucurónico (MUG) y libera
Lactosa 5g 4-metil-umberiferona que emite fluorescencia
Cloruro sódico 5g azul/verde cuando se ilumina con luz
Lauril-sulfato sódico 0,10 g ultravioleta.
Fosfato dipotásico 2,75 g
Fosfato potásico 0,75 g MUG +
10-1 10-2 10-3 L-Triptófano 1g
β-D-glucurónico 0,10 g
Agua destilada 1000ml
Caldo lauril sulfato (MUG)

Identificación de cepas ECEH

E. coli O157:H7
Pruebas confirmativas
MUG - Sorbitol -

Se considera E. coli
- Si se ha producido gas por fermentación de la lactosa.
- Si se produce fluorescencia azul/verde por presencia
de la enzima -D-glucuronidasa.
- Si la reacción de indol es positiva.
Las cepas de E. coli enterohemorragicas, no dan
fluorescencia cuando se investigan por la técnica
MUG. No fermentan el sorbitol y dan positiva la
prueba de aglutinación en latex
 Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiología y Parasitología Tema7

CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS DE Escherichia coli

Prueba Reacción Movilidad + Indol + RM + VP -

-galactosidasa + Glucosa + Citrato - LDC + Urea -

Lactosa +
SH2 -
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Investigación de Enterobacterias totales

Los miembros de la familia Enterobacteriaceae son microorganismos de forma bacilar,

Gram-, anaerobios facultativos, no esporulados, móviles o inmóviles, que fermentan la
glucosa, reducen los nitratos a nitritos, son oxidasa- y crecen en medios que contienen
sales biliares. De los integrantes de esta familia, unos fermentan la lactosa y otros no.
Incluye los siguientes géneros:

No fermentadores de la lactosa Fermentadores de la lactosa

Salmonella Escherichia
Shigella Enterobacter
Edwarsiella Citrobacter
Hafnia Serratia (a veces)
Proteus Kelbsiella
Providencia
Yersinia
Morganella
Erwinia (fermenta excepcionalmente)
 Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiología y Parasitología Tema 8

Investigación de Enterobacterias totales Agar biliado rojo violeta glucosa

Caldo EE de Mossel simple (Violet Red Bile Glucose: VRBG)
Peptona 10 g Extracto de levadura 3g
Técnica en medio líquido. NMP Fosfato sódico 6,50 g Peptona 7g
Dextrosa 5g Cloruro sódico 5g
Suspension madre 1:10 TSB Fosfato potásico 2g Sales biliares 1,50 g
Bilis de buey 20 g Glucosa 10 g
1 ml 1 ml 1 ml Verde brillante 0,125 g Rojo neutro 0,03 g
Agua destilada 1.000 ml Cristal violeta 0,002 g
Agar 12 g
Agua destilada 1.000 ml

Medio Kliger Iron Agar: KIA

Extracto de carne 3g
Extracto de levadura 3g
10-1 10-2 10-3 Peptona 20g
Cloruro sódico 5g
1ml Sulfato ferroso 0,30g
1ml 1ml
Tiosulfato sódico 0,30g
EE Mossel Lactosa 10g
Colonias rojo violeta rodeadas de un Glucosa 1g
halo rojo Rojo fenol 0,05g
Agar 15g
Pruebas confirmativas Agua destilada 1.000 ml
Incubación 37ºC, 24 h.
Oxidasa - Kliger
Lectura en tablas NMP

Agar VRBG
Incubación 37ºC, 24 h.
Colonias típicas

Agar PCA
 Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiología y Parasitología Tema 8

Agar biliado rojo violeta glucosa

Investigación de Enterobacterias totales (Violet Red Bile Glucose: VRBG)
Extracto de levadura 3g
Peptona 7g
Técnica en medio sólido
Cloruro sódico 5g
Suspension madre 1:10 TW Sales biliares 1,50 g
Glucosa 10 g
Rojo neutro 0,03 g
Cristal violeta 0,002 g
Agar 12 g
10 ml Agua destilada 1.000 ml

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

1 ml

Agar VRBG
Pruebas confirmativas
Incubar a 37ºC 24h. Contar colonias típicas Kliger
Oxidasa -

Agar PCA

Pruebas confirmativas

Oxidasa - Kliger