UTILIZACIÓN DE LA

CITOMETRÍA DE FLUJO PARA

LA DETECCIÓN DE
LEVADURAS Brettanomyces
bruxellensis EN BARRICAS DE
DIFERENTES TONELERÍAS Y
AÑOS

USE OF FLOW CYTOMETRY

FOR THE DETECTION OF
Brettanomyces bruxellensis
YEASTS IN BARRELS OF
DIFFERENT COOPERAGES
AND YEARS

REBECA GARCÍA SAN JUAN

GRADO EN ENOLOGÍA
DEPARTAMENTO DE AGRICULTURA Y
ALIMENTACIÓN
2020-2021

TRABAJO FIN DE GRADO

ÍNDICE
Levaduras Brettanomyces/Dekkera Objetivo
Características Materiales y métodos
Factores que favorecen su desarrollo Resultados y discusión
Efectos producidos por Brettanomyces Conclusiones
Control preventivo de Brettanomyces
Bibliografía
Control curativo frente a Brettanomyces
Medios de diagnóstico y de control
LEVADURAS Brettanomyces/Dekkera. CARACTERÍSTICAS.

Familia:
Saccharomycetaceae
Brettanomyces Género Dekkera

Forma anamorfa que presenta Forma teleomorfa que presenta

reproducción asexual por gemación. reproducción sexual y esporulación.

Morfología ojival Aisladas, parejas, cadenas Productoras de filamentos

Dimensiones: 2-7 x 3-28 μm Formadoras de velo

Uva del viñedo

 FACTORES QUE FAVORECEN EL DESARROLLO DE Brettanomyces.

Maceración Factores Oxígeno disuelto

Azúcares Metabolismo
prefermentativa ambientales FOH y FML Nitrógeno
residuales lento
Vitaminas

Etanol pH Temperatura 0,35 g/l Pequeña

concentración
Hasta 15,5% vol >3,5 8ºC – 32ºC

EFECTOS PRODUCIDOS
POR Brettanomyces
 Refermentaciones
 Interferencias con
Saccharomyces cerevisiae
 Ácido acético y acetato de
etilo
 Tetrahidropiridinas
 Defectos en el color
 Fenoles volátiles
UMBRALES DE
DETECCIÓN
440 µg/l  4-EF
620 µg/l  4-EF + 4-EG
SÍNTESIS DE FENOLES VOLÁTILES
Ésteres ácido tartárico-ácidos fenólicos (ácidos cutárico, caftárico, fertárico)
Aspergillus niger
Cinamil esterasa
Ácidos fenólicos  ácidos cinámicos (ácidos cafeico, cumárico, ferúlico)
Levaduras Brettanomyces
Cinamato descarboxilasa Cinamato descarboxilasa
Vinilfenoles (4-vinilfenol y 4-vinilguayacol)
Notas Brettanomyces Notas
farmacéuticas Vinilfenol reductasa especiadas
Etilfenoles (4-etilfenol y 4-etilguayacol)
Notas
animales
CONTROL PREVENTIVO CONTRA Brettanomyces Vía térmica

Microondas
Control preventivo Viñedo
Ultrasonidos
Sulfitado Enjuague Vías físicas
CONTROL Hielo seco
Higiene y
PREVENTIVO
desinfección
Limpieza
Oxígeno
negativo
CONTRACoinoculación Desinfección
Arenado de
Brettanomyces barricas
Dióxido de
azufre
Vías químicas
Ozono
 Control curativo

Tratamientos Tratamientos Aductos de

físicos químicos antocianina

CONTROL Térmicos Quitosano

CURATIVO
FRENTE A
Separativos DMDC
Brettanomyces

Otros Antibiótico

Dióxido de
azufre
 Medios de cultivo Técnicas de biología
sólidos y líquidos molecular (RT-PCR)
MEDIOS DE
DIAGNÓSTICO Y
CONTROL
Técnicas
Citometría de flujo
inmunológicas
 Componentes fluídicos
CITOMETRÍA
DE FLUJO
Dispersión de la luz (Inf.
Sistema electrónico/informático

Directa)
• Forward Scatter Channel (FSC)
Tamaño celular
• Side Scatter Channel (SSC)

Complejidad/granularidad

Emisión de fluorescencia (Inf. Indirecta)

Componentes lumínicos
Fluorescencia emitida por el
fluorocromo tras ser excitado
por la fuente de luz laser

Fuente: (Juan i Otero & González-Navarro, 2013-2014).

OBJETIVO

Estudiar el crecimiento de las levaduras Brettanomyces bruxellensis

en barricas de roble francés de tonelerías y edades diferentes
haciendo uso de la citometría de flujo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Filtrado  Preparación de muestra  Elección del método  Análisis
Tabla 1. Resumen de los resultados de las pruebas de citometría de flujo expresados en media ± desviación estándar. Los datos fueron
tomados previamente a la introducción del vino en barrica en los apartados “Pretratamientos”, en barrica con 42 días de envejecimiento, en
barrica con 90 días de envejecimiento y en barrica con 152 días de envejecimiento. Se atiende al logaritmo de levaduras totales/ml, al
logaritmo de levaduras activas/ml y a logaritmo de Brettanomyces bruxellensis activas/ml.

Vino inicial
log (Levaduras totales/ml)
Xത± s
log (Levaduras activas/ml)
Xത± s
log (B. bruxellensis activas/ml)
Xത± s RESULTADOS
Y DISCUSIÓN
Pretratamientos 5.55 4.24 4.00
(Lanciego)
Vino
Pretratamientos 5.16 ± 0.06 2.65 ± 0.047 1.87 ± 0.38
preclarificación
Pretratamientos Vino tras filtrado 4.92 2.38 1.96
Vino preparado
Pretratamientos 4.51 ± 0.14 1.70 ± 0.14 1.63 ± 0.17
para barrica

1.5 meses (42 días de Barrica tipo 1

4.36 ± 0.00 2.28 ± 0.19 1.95 ± 0.14
Mayor población en vino inicial
envejecimiento) Radoux reusada
1.5 meses (42 días de Barrica tipo 2
envejecimiento) Radoux nueva
5.12 ± 1.34 3.18 ± 1.33 2.88 ± 1.38 Disminución con pretratamientos
1.5 meses (42 días de Barrica tipo 3
envejecimiento) (Taransaud nueva)
4.66 ± 0.13 2.06 ± 0.16 1.77 ± 0.16
Tendencia > nº microorganismos
3 meses (90 días de Barrica tipo 1
en Radoux nueva que en Radoux
2.77 ± 1.04 2.38 1.54
envejecimiento) Radoux reusada vieja
3 meses (90 días de Barrica tipo 2
3.50 ± 0.14 3.21 2.48
envejecimiento) Radoux nueva
3 meses (90 días de Barrica tipo 3 Grano fino Radoux. 42 y 90 días.
3.28 ± 1.18 2.36 1.77
envejecimiento) (Taransaud nueva)

5 meses (152 días) Barrica tipo 1

3.76 ± 0.35 2.67 ± 0.01 2.40 ± 0.14
envejecimiento Radoux reusada
5 meses (152 días) Barrica tipo 2
3.56 ± 0.15 2.83 ± 0.09 2.50 ± 0.31
envejecimiento Radoux nueva
5 meses (152 días) Barrica tipo 3
4.69 ± 0.35 2.98 ± 0.12 2.66 ± 0.40
envejecimiento (Taransaud nueva)
CONCLUSIONES
Citometría de flujo con marcaje
inmunológico  alternativa menos
costosa
Desarrollo en profundidad  mayor
rigurosidad
Mayor nivel poblacional de
microorganismos  barricas nuevas
Brettanomyces  no concluyente
 desviaciones estándar presentes.
Estudios complementarios
Procedencia: UVA, NO BARRICA
La temperatura  no se observa
claramente en el presente estudio
Mayor número de barricas para
comprobarlo correctamente
Pretratamientos: clarificación,
filtración y otras adiciones  efecto
considerable en el vino
Barricas de grano fino  mayor
porosidad que las de grano grueso
 mayor desarrollo microbiano al
presentar mayor intercambio
gaseoso
MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCIÓN
¿ALGUNA PREGUNTA?
  Juan i Otero, M., & González-Navarro, E. (2013-2014). Aplicaciones
clínicas de la citometría de flujo. SEQC. Ed Cont Lab Clín; 17, 62-70.
 Hidalgo Togores, J. (2003). Tratado de Enología. Ediciones Mundi-
Prensa .
 Suárez-Lepe, J., Benito, S., Palomero, F., Morata, A., Calderón , F., &
Estrella, I. (2008). Detección de Dekkera/Brettanomyces en vinos tintos.
XXXIth World Congress of Vine and Wine. OIV. Verona, Italia.
 Chatonnet, P., Miranda, A., & Palacios, A. (2013). Brettanomyces: Mitos
y Realidades. En C. R. Duero, INNOVACIÓN VITIVINÍCOLA EN LA
BIBLIOGRAFÍA RIBERA DEL DUERO: SOSTENIBILIDAD III (págs. 57-70).
 Navascués López-Cordón, E. (2009). Brettanomyces/Dekkera: control y
detección en bodegas. Revista Enología Nº1, 12-16.
 Vegas, A. (2018). ENOLOGÍA PARA TODOS: El grano de la madera.
Vinetur.
 Romano, A., Perello, M., Lonvaud-Funel, A., & De Revel, G. (27-29 de
marzo de 2008). Aspectos sensoriales del carácter Brett. Nueva
evaluación del umbral de percepción olfatoria de fenoles volátiles en un
vino tinto. Wine Active Compounds Congress. Beaune, Francia.