Vjeba br.

18.10.2013

Izolacija DNA

1. DEOKSIRIBONUKLEINSKA KISELINA (DNA) Deoksiribonukleinska kiselina (krae DNA, od engl. DeoxyriboNucleic Acid) je sloena molekula koja sadri nasljednu informaciju potrebnu za razvoj i funkcioniranje svih ivuih organizama, ukljuujui i neke viruse. Glavna uloga DNA molekule je dugotrajna pohrana informacije. Moemo je usporediti s vanim programskim sustavom jer sadri instrukcije i upute za izgradnju drugih komponenata elije, kao to su proteini i ribonukleinske kiseline (RNA molekule). Dijelovi DNA molekule koji nose nasljednu uputu (informaciju) nazivaju se geni, dok drugi segmenti DNA molekule imaju strukturnu ulogu ili su ukljueni u regulaciju genske informacije. 1.1. Otkrie DNA Ljudi su odavno uoili kako neke fizike osobine organizama bivaju ouvane iz generacije u generaciju (npr. djeca nasljeuju mnoga svojstva od svojih roditelja). Meutim, dugo se nije znala bioloka osnova procesa nasljeivanja, odnosno koje su elijske strukture i koje molekule nositelji nasljednih svojstava. Poetkom 20. stoljea se smatralo da su proteini, a ne DNA, najvjerojatnije nositelji nasljednih svojstava. Kao glavni argument za to navodilo se da su proteini graeni od 20 razliitih aminokiselina, a DNA od samo 4 razliita nukleotida (to se inilo premalo da sadrava informaciju za svu raznolikost ivog svijeta). Osim toga, tada jo nisu bila poznata fizikalna i kemijska svojstva DNA. Pionir znanstveno utemeljenih istraivanja procesa nasljeivanja bio je Gregor Johann Mendel koji je djelovao u drugoj polovici 19. stoljea. Prouavajui razliite osobine kod graka, uoio je kako se te osobine prenose iz generacije u generaciju prema odreenim zakonitostima, te je zakljuio kako moraju postojati tzv. osnovne jedinice nasljeivanja koje je T. H. Morgan kasnije nazvao genima. Morgan je utvrdio da se geni nalaze na posebnim strukturama u eliji nazvanim hromosomi. Naime, promatramo li diobu elije pod mikroskopom, vidjet emo kako

jezgra nestaje, a pojavljuju se hromosomi. Oni se tijekom diobe pravilno raspodijele u dvije novonastale elije keri i onda nestanu tj. na njihovom mjestu se ponovo pojave elijske jezgre. Promatrajui pojavljivanje i nestajanje hromosoma tijekom trajanja elijskog ciklusa, znanstvenici su doli do zakljuka kako se nasljedni materijal nalazi upravo u njima. Meutim, hromosomi se sastoje i od DNA i proteina, pa je jo uvijek ostalo pitanje koja je od tih dviju makromolekula nositelj nasljednih svojstava.

Slika 1. James D. Watson i Fransis Crick pokraj svog modela strukture DNA (http://blogs.blouinnews.com/blouinbeatsciencehealth) Tijekom prve polovice 20. stoljea polako su prikupljani dokazi da je upravo molekula DNA nosilac nasljednih svojstava. Meu glavne istraivae na tom polju svrstavaju se F. Griffith i O. Avery (dokazali su da DNA iz jednog soja bakterija moe prijei u drugi soj i promijeniti njegova svojstva koja se dalje nasljeuju, tj. da upravo DNA odreuje nasljedna svojstva), A. Hershey i M. Chase (koristei viruse dokazali su da je DNA, a ne proteini, genski materijal), te naravno Rosalind Franklin, James D. Watson i Francis Crick. Godine 1953. prema rendgenskim slikama koje je napravila Rosalind Franklin, James D. Watson i Francis Crick predloili su prvi pravilni model strukture DNA molekule - "model dvostruke uzvojnice", ime su objanjena mnoga njena fizikalnokemijska svojstva.

1.2. Graa molekule DNA Osnovna gradivna jedinica molekule DNA je nukleotid. Nukleotid se sastoji od eera pentoze, fosfatne skupine i odgovarajue duine (azotne baze).

Slika 2. Graa nukleotida (http://www.znanje.org/i/i21/01iv11/01iv1129/gradja.htm) Ovisno o tome radi li se o DNA ili o RNA, eer u nukleotidu se razlikuje. Ugljikovi atomi u molekuli eera oznaavaju se brojevima 1' 5' (ita se npr. jedan crtano), s tim da je duina baza vezana na 1' ugljikov atom, a fosfatna skupina na 5'. Na 2' ugljikovu atomu eer moe imati hidroksilnu (-OH) skupinu. Taj eer je riboza, a nukleinska kiselina koja ga sadri naziva se ribonukleinska kiselina ili RNA. U molekuli DNA na tom atomu nema -OH skupine pa se taj eer naziva deoksiriboza, a nukleinska kiselina koja ga sadri deoksiribonukleinska kiselina ili DNA. Fosfatna skupina, koja se, kao to je ve spomenuto, nalazi na 5' ugljikovu atomu eera, nosi negativan naboj. Stoga je ukupan naboj molekule DNA negativan. Na 1' ugljikov atom vezana je duina baza tzv. N-glikozidnom vezom (veza sa eerom preko atoma duika). Duine baze dijele se na purinske (dva prstena u strukturi, adenin i gvanin) i pirimidinske (jedan prsten u strukturi, timin, citozin i uracil). Upravo duina baza odreuje o kojem se nukleotidu radi. Primjerice, duina baza adenin u sastavu je nukleotida adenozin trifosfata (ATP), gvanin gvanozin trifosfata (GTP), citozin citidin trifosfata (CTP), uracil uridin trifosfata (UTP) i timin timidin trifosfata (TTP). Osim prema molekuli eera, DNA i RNA se razlikuju i u bazama. Umjesto timina, u molekuli RNA nalazi se uracil.

Kristalografskom analizom je utvreno da molekula DNA ima strukturu dvostruke uzvojnice (engl. double helix), odnosno da se sastoji od dva polinukleotidna lanca koji su omotani jedni oko drugog. Nukleotidi unutar jednog polinukleotidnog lanca povezani su kovalentnim fosfodiesterskim vezama koje ine vanjski dio uzvojnice fosfodiestersku okosnicu polinukleotidnog lanca (sastoji se od naizmjeninih eera i fosfata. Duikove baze oba lanca nalaze se u sreditu dvostruke uzvojnice i povezane su vodikovim vezama po principu komplementarnosti. Drugim rijeima, dva lanca su meusobno povezana vodikovim vezama. Dva lanca koja tvore jednu molekulu DNA moraju biti suprotno orijentirana, to znai da jedan lanac dvostruke uzvojnice mora zavravati s 5' krajem, a drugi lanac s 3' krajem. Zato se kae da su dva lanca jedne molekule DNA antiparalelno orijentirani.

Slika 3. Graa DNA- dvostruki helix (http://www.meritnation.com/askanswer/question/explain-the-packaging-of-dna-dna-replication-hormon/molecular-basis-ofinheritance/5040160) Veina molekula DNA koje se nalaze u eliji sastoje se od lanaca dugih po nekoliko milijuna nukleotida, odnosno duinih baza. Kada se navodi duina odreene molekule DNA, uobiajeno je da se ona izraava u broju duinih baza. Primjerice, ukupna duina ljudske DNA je oko 6 x 109 parova baza (engl. base pairs, ili skraeno bp). Naravno, pri tome se podrazumijeva da se radi o cijelim nukleotidima. Informacija o nasljednim svojstvima svakog

organizma odreena je redoslijedom duinih baza u dvolananoj molekuli DNA. Slijed duinih baza koji u molekuli DNA nosi informaciju za jedno nasljedno svojstvo nazivamo gen. Kod eukariota, najvei dio informacije o nasljednim svojstvima stanice smjeten je u vie linearnih DNA molekula. One pak tijekom veeg dijela ivotnog ciklusa elije bivaju dvostrukom membranom (jezgrina ovojnica) odvojene od ostatka elije, u organelu zvanom elijska jezgra. Tijekom elijske diobe te se linearne molekule DNA organiziraju u zasebne strukture zvane kromosomi. Prokarioti nemaju organela, pa tako ni jezgru. Stoga se njihova DNA nalazi slobodno u citoplazmi, najee u obliku jedne krune molekule DNA po eliji.

Slika 4. Elektronska mikrografija krunih molekula DNA prokariota (http://evolutionaryroutes.wordpress.com/2011/08/08/evolutions-usual-suspects-1-plagiarizing) 1.3. Pakiranje DNA u jezgri elije Genetiki materijal prokariota i eukariota se jako razlikuje; prokariotske stanice sadre najee jednu krunu molekulu DNA, a eukariotske vie linearnih molekula. U oba sluaja DNA je puno dua od same stanice (oko 1000 puta za bakterijsku stanicu) i kako bi stala u jezgru (odnosno u stanicu prokariota) DNA se savija te precizno i kompaktno pakira. Proces smatanja DNA u jezgri naziva se kondenzacija. Kondenzacija se u veine prokariota dogaa smatanjem DNA molekule, dok se u eukariota odvija uz pomo specifinih proteina - histona. Negativno nabijena molekula DNA vee se za pozitivno nabijene histonske proteine tako da se po 146 nukleotida dvostruke uzvojnice omotava oko kompleksa histonskih proteina. Pojedini histonski kompleks je oktamer, tj. sastoji se od 8 pojedinanih proteina (svaki od 4 razliite vrste histona: H2A, H2B, H3 i H4, zastupljen je po 2 puta, odnosno 2H2A, 2H2B, 2H3 i 2H4). Time

nastaje struktura nukleosom (146 nukleotida duga nit DNA namotana oko histonskog oktamera). Promjer pojedinog nukleosoma iznosi 11 nm. Histon H1 se naknadno vee na nukleosom i stabilizira ga te omoguuje pakiranje vie nukleosoma u deblja vlakna (30 nm). Ona daljnjom kondenzacijom tvore velike namotane ome koje se dre zajedno pomou nehistonskih proteina. Takav oblik pakiranja genskog materijala naziva se hromatin. hromatinske niti su iroke 300 nm. Kao to je gore opisano, hromatin se sastoji od molekula DNA i proteina. To naravno ne vidimo kada eliju promatramo pod mikroskopom vidimo samo jezgru ispunjenu kromatinom koji je na nekim mjestima tamniji (jae kondenziran), a na drugim svjetliji (slabije kondenziran). Zato jezgra ne izgleda homogeno obojena ve zrnata.

Slika 5. Organizacija DNA u eliji (http://www.biologyexams4u.com/2012/03/dnapackaging.html) Kondenzirani dijelovi hromatina u jezgri nazivaju se zajednikim imenom

heterohromatin. On se nakon zavretka elijske diobe ne dekondenzira, odnosno ostaje kondenziran i u jezgri, pa se stoga jae boji bojama specifinim za DNA. Do heterohromatinske DNA teko dolaze enzimi upravo zbog toga to je jako kondenzirana. To ima za posljedicu da se

ona kasno replicira i rijetko ili nikada ne transkribira. Dakle, heterokromatin je uglavnom inaktivan dio hromatina i obuhvaa inaktivne gene te podruja DNA koja ne sadre gene. Jedno od najvanijih podruja heterohromatina je i centromera. Prilikom diobe elije, od neizmjerne je vanosti da se genski materijal precizno podijeli u dvije novonastale elije. Stoga se relativno disperzan hromatin jo vie kondenzira kako bi se to lake i preciznije podijelio u elije keri. Tako nastaju pod mikroskopom vidljivi hromosomi. Pri tome jedan hromosom sadri dvije molekule DNA nastale replikacijom, vidljive kao krakovi hromosoma ili hromatide. Pojedini hromosom moe sadravati hiljade gena, ali ima i hromosoma s tek stotinjak gena. Budui je heterohromatin gue kondenziran, podruje na kojem se dvije hromatide u hromosomu dre zajedno izgleda tanje od ostalih dijelova hromatida. Stoga se podruje centromere na hromosomu jo naziva i primarno suenje hromosoma. Za razliku od centromere koja predstavlja primarno suenje gusto kondenziranog hromosoma, na nekim hromosomima postoji sekundarno suenje, a ukazuje na mjesto gdje e se formirati jezgrica (nukleolus), pa se sekundarno suenje jo naziva nukleolarni organizator. 2. IZOLACIJA DNA Ekstrakcija DNA predstavlja jedan od primarnih postupaka u genetikom inenjerstvu i molekularnoj biologiji uope. To je prvi korak u karakterizaciji genetikog materijala. Budui da je DNA (tj. nukleinske kiseline) osnovni nosilac nasljednih informacija, za bilo kakvu direktnu genetiku karakterizaciju neophodno je poznavati metode i tehnike izolacije DNA. Kao izvor DNA moe nam posluiti bilo kakav organski dio ili ostatak koji sadri elije sa jedrom. DNA podlijee izvjesnim organsko-degradacijskim procesima, to u velikoj mjeri oteeva izolaciju iz zastarjelih uzoraka (ali je mogue!). Postupak izolacije i karakterizacije nasljednog materijala se iroko primjenjuje u fundamentalnoj, istraivakoj biologiji i njenim primijenjenim granama: medicini, farmaciji, hortikulturi, umarstvu, forenzici, veterinarstvu, itd. za dijagnostike analize i transformaciju svojstava odabranih resursa npr. dobijanje biljaka otpornih na suu, dijagnostika sklonosti za tumor, dijagnostika AIDS-a tj. zaraenosti HIV-om i drugih infekcija, provjera rodoslova i istokrvnih linija npr. pasa ili konja, itd.

2.1. Miller-ov protokol za ekstrakciju DNA (isoljavanje) iz brisa bukalne sluznice Princip Ova procedura sadri osnovne upute za izolaciju DNA iz oralnih briseva. Protokol se bazira na lizi nukleiranih elija pomou ekstrakcijskog pufera i digestiji proteina sa Qiagen proteinazom. Nakon digestije slijedi serija isoljavanja sa 6M NaCl-om. NaCl uklanja zaostale proteine. DNA se konano izdvaja precipitacijom dodavanjem hladnog etanola i

resolubilizacijom u tris-EDTA puferu ili destilovanoj vodi. Uzorak Bris bukalne sluznice, osuen na zraku ili uronjen u izopropanol. Kvalitet postupka a. Prije zapoinjanja procedure uvjerite se da su svi reagensi, instrumenti i aparati ispravni i da zadovoljavaju bar minimalne standarde za kontrolu kvaliteta procesa. b. Minimalno jedna negativna kontrola mora biti zastupljena i proi cijelu proceduru od poetka do kraja i analizirana zajedno sa ostalim uzorcima. Sigurnost a. Svi uzorci moraju biti tretirani kao infektivni. Radi line sigurnosti preporuuje se koritenje zatitne opreme u laboratoriji. b. Odbacivanje biohazardnog otpada se vri na za to predvienom mjestu. c. Dobro se upoznati sa protokolima o sigurnosti i pouzdanosti procedure, prije samog poetka rada. Procedura Potrebni materijal i reagensi (po uzorku): -tubice vol. 1,5 ml 3 kom -PVC rukavice par

-99% etanol oko 500 l -70% etanol 200 l -TE pufer ili ddH2O 50 l -pufer za ekstrakciju 550 l -Qiagen Pronase 100 l Potrebna oprema: -srednjeturana centrifuga -vorteks -pipetori 20, 200 i 1000 l -frizeri 20 a. Sakupljanje uzoraka Uzorci se uzimaju brisom, tj. vatiranim tapiem trljajui po unutranjosti usne duplje. b. Protokol za ekstrakciju: tapi sa bukalnom sluznicom potopiti u sljedei pufer:

Inkubirati 1 sat na temp. 60 C Dodati 200 ml 6M NaCl-a, snano protresti 1 minut, Centrifugirati na 2500 rpm 15 min., Nakon centrifugiranja supernatant prebaciti u novu tubicu,

Protresti 15 sekundi, Centrifugirati na 2500 rpm 15 min., Supernatant prebaciti u novu tubicu, Dodati 2 x vol. hladnog apsolutnog etanola, Okrenuti tubicu par puta, Centrifugirati 10 min na 10 000 rpm, Dekantirati etanol, Dodati 200 ml 70 % etanola, promukati 10 sekundi, Centrifugirati 5 min. na 13 000 rpm, Dekantirati etanol, Staviti u speedvac i osuiti. Dodati 50 ml dest. H2O. Ostaviti preko noi da se resolubizira, ili staviti 30 minuta u termoblok na 37 oC.

2.2. DNA ekstrakcija iz biolokih uzoraka metod organske ekstrakcije Protokol za ekstrakciju DNA iz brisa bukalne sluznice metodom organske ekstrakcije Princip Ova procedura sadri osnovne upute za izolaciju DNA iz oralnih briseva. Protokol se bazira na lizi nukleiranih elija pomou ekstrakcijskog pufera i digestiji proteina sa Qiagen proteinazom. Nakon digestije slijedi serija ispiranja sa smjesom fenol/hloroform/isoamilni alkohol. Fenol uklanja zaostale proteine, a hloroform zaostali fenol. DNA se konano izdvaja precipitacijom dodavanjem hladnog etanola i resolubilizacijom u tris-EDTA puferu ili destilovanoj vodi. 3. KVANTITATIVNA I KVALITATIVNA ANALIZA IZOLOVANE DNA Postoji nekoliko metoda za kvantitativnu i kvalitativnu analizu izolovane DNA:

-time PCR,

Od ovih nabrojanih metoda najee se koriste elektroforeza na agaroznom gelu te UV spektrofotometrija. 3.1. Elektroforeza DNA na agaroznom gelu Princip Elektroforeza oznaava gibanje estica u elektrinom polju, dok elektroforeza DNA predstavlja tehniku koje se primjenjuje za separaciju biolokih molekula, baziranu na fizikim osobinama molekule, kao to su veliina, oblik, izoelektrina taka molekule. Najee se primjenjuje u analitike svrhe, za separaciju i analizu DNA fragmenata razliite veliine. Snaga elektrinog polja podstie migraciju fragmenata DNA kroz gel. Molekule koje se separiraju elektroforetski najee u svojoj strukturi sadre anionske ili kationske grupe, pa su prema tome dipolarni joni. Fragmenti DNA putuju ka pozitivnoj elektrodi, anodi, zbog negativnog naboja koji nosi DNA molekula. Fragmenti vee molekulske mase migriraju sporije kroz gel, u odnosu na fragmente manje molekulske mase ija je migracija bra. Veliina fragmenata separiranih na gelu se determinira komparacijom uzorka sa DNA ladder-om, koji sadri fragmente DNA poznate veliine i slui kao referentni sistem. Izbor sistema pufera je bitan, jer o njemu ovisi koliina elektrine energije koja se moe primjeniti na sistemu. Ako je dovod struje previsok, dolazi do pretjeranog zagrijavanja, to moe uzrokovati denaturaciju uzorka, a ako je dovod struje prenizak, ne dolazi do pretjeranog zagrijavanja, ali elektroforeza traje dugo pa razdvojene zone nisu otre zbog difuzije.

3.2. UV spektrofotometrija Princip Spektrofotometrija je jedan od naina kvantifikacije biomolekula. To je, u principu, fotoelektrino mjerenje zraenja koje neka supstanca apsorbira na odreenoj valnoj duini. Prema podrujima valnih duina izvora svjetla, razlikuju se ultraljubiasta (200 - 400 nm), vidljiva (400 - 760 nm) i infracrvena (iznad 760 nm) spektrofotometrija. Ova metoda slui za kvantitativno odreivanje malih koliina otopljenih supstanci. Koliina apsorbiranog svjetla odreene valne duine odgovara koncentraciji ispitivane supstance. to se nukleinskih kiselina tie, spektrofotometrom se mjeri apsorbancija na 260 i 280 nm. Potpuno ista DNA ima OD (optical density ili optika gustoa) A260/A280 =1,8- 2,0. Kontaminacija CH2O, fenolom i proteinima se rauna preko odnosa OD230/OD260. Ako je ovaj odnos vei od 0,5 prisutna je kontaminacija. Za odreivanje koncentracije DNA dobivene izolacijom, uzorak DNA jedinine apsorancije na 260 nm ima koncentraciju 50 mg/ml DNA. Da bi smo kvantifikovali DNA spektrofotometrijskom analizom potrebno je uzorak DNA razrijediti destilovanom vodom (1:100), izmjeriti apsorbanciju na 260 i 280 nm, i koncentraciju raunati po formuli: cDNA = A260 x R x 50 (mg/ml) 3.3. Polimerase chain reaction (PCR) Lanana reakcija sa polimerazom, polimerazna lanana reakcija, lanana sinteza polimerazom samo su neki od naina da se prevede naziv tehnike koja je doslovno izazvala revoluciju na polju molekularne genetike i biologije uopte. Polazna koliina DNA, koja je decenijama predstavljala ograniavajuci faktor u istraivanjima, svela se na doslovno jednu, dobro ouvanu molekulu a mukotrpne procedure izolacije i preiavanja dijelova genoma postale su jednostavnije. Pred istraivacima su se naglo otvorile nove mogunosti. Pored toga, gotovo da ne postoji drutvena djelatnost koju ova tehnika nije direktno ili indirektno dotakla i zauvijek izmijenila. Glavni krivci za ovakvu pometnju su Kary Mullis i njegovi suradnici iz Odjela za humanu genetiku Korporacije Cetus. U asopisu Science 1985. godine objavljen je nauni rad autora R. Saiki, K. Mullis, H. Erlich u kojem prvi put opisuju tehniku specifinog umnoavanja fragmenta DNA in vitro koju katalizira enzim DNA polimeraza i izolovan iz

Escherichia coli. 1988. godine, opet u Science, isti tim naunika publicira rad u kome umjesto navedene polimeraze E. coli uvode termostabilnu DNA polimerazu i izolovanu iz bakterije Thermus aquaticus (Taq). Unato brojnim modifikacijama, raznovrsnim primjenama i automatizaciji procesa lanane sinteze polimerazom, osnovne odrednice ove tehnike utemeljene 1985. i 1988. nisu se znaajnije izmijenile. Osnovne premise na kojim se zasniva PCR su : u nativnom stanju DNA je dvostruki heliks, sastoji se od dva antiparalelna

polinukleotidna lanca meusobno povezana vodikovim vezama, nukleotidi jednog polinukleotidnog lanca su meusobno povezani kovalentnom vezom izmeu dezoksiriboze jednog nukleotida i fosfatne grupe susjednog nukleotida, vodikove veze koje odravaju dva polinukleotidna lanca zajedno uvijek se formiraju izmeu komplementarnih baza tj. A-adenin se uvijek vee za T-timin a C-citozin za G-guanin, vodikove veze su energetski slabe i lako se remete zagrijavanjem (denaturacija), dok su kovalentne veze stabilne i pri zagrijavanju se odravaju, hlaenje dovodi do ponovnog uspostavljanja vodikovih veza izmeu

komplementarnih baza (renaturacija), DNA replikaciju in vivo inicira RNK Pol I sintetizirajui kratke RNK sekvence, time kreirajui supstrat za DNA Pol I (slobodnu -OH- grupu dezoksiriboze na 3 kraju), na optimalnoj temperaturi, DNA Pol I katalizira ugradnju slobodnih dezoksiribonukleotid-3-fosfata na postojei oligonukleotidni lanac sa slobodnom -OH- grupom na 3 kraju kada je isti vodikovim vezama povezan za matricu. Poavi od ovih premisa, Mullis2 je pretpostavio da moe postii umnoavanje specifinog dijela DNA molekule koji lei izmeu dva regiona ija je sekvenca poznata. Selekcija specifinog dijela DNA molekule postie se primjenom oligonukleotidnih prajmera, kratkih DNA sekvenci (20-30 nukleotida) koje su komplementarne krajevima definirane sekvence. U tipinoj PCR reakciji uestvuju dva prajmera sintetizirana u 53 pravcu tako da se

na njihovom 3 kraju nalazi dezoksiriboza sa slobodnom -OH- grupom. Obino se obiljeavaju sa F (forward) i R (reverse). Na temperaturi od 95oC pucaju vodikove veze koje odravaju dvolananu strukturu molekule iji se dio umnoava (template DNA = matrica) te se ona denaturie. Sputanjem temperature stvaraju se uslovi za renaturaciju ali i za formiranje hibridnih molekula matrica-prajmer. DNA Pol I pronalazi takve hibride i, pod odgovarajuim uslovima, katalizira vezivanje fosfatne grupe dezoksinukleotid-3-fosfata za 3 -OH- grupu dezoksiriboze prajmera prema zakonu komplementarnosti. Rezultat je sintetiziran naspramni lanac komplementaran matrici koji moe posluiti kao matrica drugom prajmeru. Ovaj ciklus denaturacije zagrijavanjem, renaturacije hlaenjem i sinteze naspramnog lanca moe se ponavljati a svaki novosintetizirani lanac postaje matrica u narednom ciklusu. Takoer, sa porastom broja ciklusa eksponencijalno raste broj molekula specifino umnoavanog dijela DNA. Teoretski broj molekula ciljane sekvence koja se sastoji od sekvence prajmera i dijela DNA molekule izmeu prajmerskih sekvenci, iznosi 2n-2n (n - broj ciklusa) za svaku molekulu DNA matrice. Takoer teoretski, od jedne jedine molekule se, u 30 ciklusa, moe dobiti 2302*30 = 1073741764 ciljanih fragmenata. Ponavljanje ciklusa moe biti efikasno sve dok ne nastane deficit neke od komponenti (prajmera, nukleotid-3-fosfata ili enzima). Ovisno od svrhe reakcije, veliine umnoavanog dijela DNA i eljene koncentracije, tipina PCR reakcija se odvija u 30-40 ciklusa.