Praktični rad. Vidim (svoju) DNA!

Promjer dva polinukleotidna lanca, koja su međusobno povezana vodikovim

vezama i grade molekulu DNA, iznosi 2 nm. Možemo li golim okom vidjeti
strukturu DNA? Strukturu ne, ali nakupine molekula da! Kad bi spojili sve molekule
DNA jedne stanice u neprekinuti lanac, duljina DNA bi iznosila oko 2 m.
Jednostavnim priborom i postupkom izolirajte svoju DNA iz stanica epitela usne
šupljine te iz banane i crvenog luka!

Materijal i pribor:

∙ otopina NaCl (8 %)

∙ tekući deterdžent za posuđe

∙ otopina pepsina (1 %)

∙ rashlađeni etanol (95,6%)

∙ vodovodna voda

∙ staklene čaše
(100 mL, 250 mL, 1000 mL)

∙ plastična čaša (plastična epruveta)

∙ 2 epruvete

∙ stakleni štapići

∙ automatska pipeta s nastavcima

∙ menzura (50 mL, 100 mL)

∙ 1 termometar (°C, ± 1°C)

∙ stalak za epruvete

∙ skalpel

∙ cjedilo

∙ kuhalo za vodu

∙ mikser

Metoda ekstrakcije DNA iz stanica banane i crvenog luka

1. Narežite na komadiće i stavite tkivo banane ili luka u mikser.
2. Dodajte 200 mL vode.
3. Uključite mikser i miksajte 15 sekundi.
4. Procijedite 100 mL suspenzije u staklenu čašu od 250 mL. Operite posudu miksera.

5. U 100 mL suspenzije dodajte 20 mL tekućeg deterđenta. Lagano i kratko promiješajte staklenim

štapićem.
6. Dodajte 15 mL 1% otopine pepsina. Ponovno i veoma pažljivo promiješajte suspenziju staklenim
štapićem kako ne biste oštetili DNA. Uronite čašu u vodenu kupelj (čaša od 1000 mL) s vodom
zagrijanom na 50⁰ C.
7. Nakon 10 minuta suspenziju izvadite iz vode i dodajte 30 mL otopine natrijevog klorida.

8. Raspodijelite suspenziju u manje čaše namijenjene grupnom radu.

9. Suspenziju ulijte u epruvetu. Ispunite 1/3 volumena epruvete.
10. Kao na priloženoj slici, nagnite epruvetu i polako, po stijenci epruvete, ulijte ohlađeni etanol
približno jednak volumen etanola.
11. Epruvetu odložite na stalak, promatrajte 10 minuta, fotografirajte i zabilježite promjene.

Praktični rad. Vidim (svoju) DNA!

I. Uvod (2 boda)

Deoksiribonukleinska kiselina (DNA), predstavlja nasljedni materijal kod većine

organizama. Svaka stanica u tijelu, osim crvenih krvnih stanica, sadrži istu DNA, no jedinka ne
dijeli istu DNA s drugom jedinkom. Potpuno istu DNA imaju samo identični blizanci.
Dok je veći dio DNA smješten u jezgri stanice, manja količina može se pronaći i u
mitohondrijima. Banana, luk i čovjek dijele sličnu molekularnu strukturu DNA, ali različite
informacije kodirane u njihovoj DNA određuju njihove specifične karakteristike i funkcije 1.

organizam banana luk čovjek

broj molekula ● 33 kromosoma2 ● 16 kromosoma 3
● 46 kromosoma4
DNA
struktura DNA Sličnosti:
● DNA - struktura dvostruke uzvojnice
● dva polinukleotidna lanca koji su omotani jedan oko drugog
● sastoji se od nukleotida (povezani vodikovim vezama)
● dva lanca jedne molekule DNA antiparalelno orijentirana (moraju biti suprotno
orijentirana)
● svaki nukleotid sastoji se od šećera (deoksiriboza), fosfatne skupine i jedne od četiri
dušične baze (adenin, timin, citozin, gvanin)
● DNA se nalazi u jezgri stanica istraživanih organizama

1 https://shorturl.at/alz57
2 https://shorturl.at/hAFQ8 (luk)
3 https://rb.gy/2u4x3r (banana)
4 https://rb.gy/2944hk (čovjek)
 Razlike:
●
svojstva DNA ● genetski materijal ● nosi informacije koje ● sadrži genetske
nalazi se u jezgri su odgovorne za rast, informacije koje utječu
svake svoje stanice razvoj, boju, okus… na sve aspekte ljudskog
● nosi informacije koje ● regulira procese razvoja (fizičke
su odgovorne za poput fotosinteze i karakteristika pa sve do
boju, oblik i okus diobe stanica predispozicija za
određene bolesti)
● odgovorna za
nasljeđivanje genetskih
osobitosti s roditelja na
potomstvo
Tablica 1 -svojstva i građa DNA kod banane, luka i čovjeka5

Proces u kojem se DNA kondenzira u vidljive kromosome, što slijedi razdvajanjem

kromosoma u dva identična skupa zove se mitoza (ili
mejoza, u slučaju stvaranja spolnih stanica).
Kondenzacija DNA ključan je korak u pripremi za
podjelu stanice, a proces uključuje značajne promjene
u organizaciji i pakiranju DNA. Prije same diobe,
stanica prolazi kroz razdoblje pripreme poznato kao
interfaza. U ovom razdoblju, DNA se replicira kako bi
se stvorile identične kopije kromosoma, čime se
osigurava da svaka kćerka stanica naslijedi potpuni
genetski materijal. Kada stanica započne proces Slika1.-Duplikacija i kondenzacija DNA
mitoze, ulazi u fazu profaze. U ovoj fazi, DNA počinje
kondenzirati. To znači da se dugačke niti DNA (koje su
tijekom interfaze rasvijetljene) skraćuju i zgušnjavaju.
Kromosomi postaju vidljiviji pod mikroskopom, a svaki
od njih sastoji se od dvije sestrinske kromatide,
identičnih kopija originalnog kromosoma.
Slika 2.-Kondenzacija DNA u kromosome
Kondenzacija DNA doseže vrhunac tijekom metafaze.
Kromosomi se poravnavaju duž središnje ravnoteže
stanice poznate kao metafazna ploča. Ovdje se
pripremaju za ravnomjernu podjelu između dviju
kćerkih stanica. U anafazi, sestrinske kromatide se
razdvajaju i kreću prema suprotnim polovima stanice.
Ovaj proces omogućuje ravnomjernu raspodjelu
genetskog materijala u dvije kćerke stanice. Na kraju,
u telofazi, DNA ponovno poprima svoju rastegnutu,
Slika 3.-Prikaz mitoze
manje kondenziranu strukturu. Ova faza označava
završetak diobe stanice. Citokineza se može smatrati posljednjom fazom mitoze kada se dvije

5 https://sciencing.com/genetics/
stanice kćeri razdvajaju, svaka s jezgrom i citoplazmatskim organelama. Cijeli proces
kondenzacije DNA tijekom stanične diobe ključan je za očuvanje i preciznu podjelu genetskog
materijala, osiguravajući da svaka kćerka stanica naslijedi kompletnu i identičnu genetsku
informaciju od majčinske stanice.6

PRIMJENA

DNA se često koristi u forenzičkim znanostima za identifikaciju pojedinaca i rješavanje

kriminalističkih slučajeva. Analiza DNA omogućuje usporedbu bioloških tragova (npr. krvi) s
uzorcima DNA prikupljenim od osumnjičenih ili s mjesta zločina. Točnost i jedinstvenost
genetskog materijala čine DNA forenziku iznimno učinkovitom u identifikaciji ili isključivanju
pojedinaca iz istrage.7

Analiza DNA koristi se u genetskom testiranju kako bi se identificirale genetske

varijacije povezane s različitim bolestima i stanjima. Ove informacije mogu pomoći u
predviđanju rizika od određenih bolesti i prilagodbi medicinskih postupaka prema genetskim
predispozicijama pojedinca. Personalizirana medicina koristi te informacije kako bi prilagodila
terapeutske pristupe i poboljšala učinkovitost liječenja.8

Također DNA možemo koristiti i u području genetskog inženjeringa kako bi se

modificirali geni organizama, uključujući i ljudske. Tehnologije poput CRISPR-Cas9 omogućuju
precizno editiranje genoma. U medicini, ova tehnologija otvara vrata razvoju novih terapija i
liječenju genetski uvjetovanih bolesti. Genetsko inženjerstvo također ima potencijal za
liječenje bolesti stvaranjem genetski modificiranih stanica koje se mogu koristiti u terapiji
regenerativne medicine.9

II. Kratki opis metode (2 boda)

1. Odabrali smo uzorke luka, banane i tkiva čovjeka.

6 https://www.sciencedirect.com/topics/neuroscience/cell-cycle-m-phase
7 https://shorturl.at/itvy1
8 https://shorturl.at/cgwGM
9 https://shorturl.at/akmPZ
 2. Luk i banana smo izrezali na male komade, a kao DNA čovjeka se pripremili smo
pljuvačku kako bi bili u skladu s etičkim smjernicama.
3. Dodali smo komade uzorka u čašu s otopinom NaCl (8%).
4. Dodali smo odgovarajuću količinu tekućeg deterdženta za posuđe kako bismo razbili
stanične membrane i pažljivo promiješali da ne oštetimo DNA..
5. Zatim smo dodali pepsin (1%) u smjesu kako bi razgradili proteine i histone.
6. Čašu s uzorkom stavili smo u vodenu kupelj na temperaturi od 50°C.
7. Održavali smo ovu temperaturu tijekom određenog vremena kako bismo potaknuli
aktivnost pepsina.
8. Stavili smo čašu s uzorkom u ohlađeni etanol kako bi izazvali precipitaciju DNA.
9. Pomiješali smo nježno i promatrali taloženje DNA.
10. Koristili smo stakleni štapić za pažljivo izdvajanje vidljive DNA iz otopine.

III. Rezultati (4 boda)

Slika 4.-Kondenzirana DNA banane Slika 5.- Kondenzirana DNA iz sline

(lijevo) i luka (desno), Florijan Lalić, 4.G čovjeka, Florijan Lalić, 4.G

Opažanja

● epruveta A (banana): Na temelju fotografija primjećujemo da je izolirana DNA iz

banane niske kvalitete, ali to je zato što je trebalo više vremena da se u epruveti A
dogodi reakcija. Nakon vizualne inspekcije zaključili smo da je izolirana DNA iz banane
visoke kvalitete. Niti DNA su iznimno duge i jasno vidljive, sugerirajući da je ekstrakcija
genetskog materijala iz biljnog tkiva bila učinkovita. DNA se čini čistom i dobro
 definiranom, bez znakova kontaminacije drugim tvarima. Kvaliteta izolacije DNA iz
banane čini ovu metodu pogodnom za daljnja istraživanja i analize.
● epruveta B (luk): Izolirana DNA iz luka također pokazuje solidnu kvalitetu. Niti DNA su
nešto kraće u usporedbi s onima iz banane, ali i dalje su vidljive i dobro definirane.
Opažamo da su niti malo manje izražene, što može ukazivati na manju koncentraciju
DNA u uzorku. Unatoč tome, rezultati su zadovoljavajući, a DNA iz luka pruža dobar
materijal za daljnje analize.
● epruveta C (uzorak čovjeka): Izolirana DNA iz uzorka čovjeka može pokazivati manju
kvalitetu u usporedbi s biljnim uzorcima. Niti DNA su kraće i manje izražene, što može
sugerirati teže izdvajanje genetskog materijala iz ljudskih stanica u ovom postupku.
Moguće je da su prisutni neki inhibitori ili da je potrebno prilagoditi uvjete ekstrakcije
kako bi se poboljšala kvaliteta DNA iz uzorka čovjeka.

IV. Zaključak (12 bodova)

● Zašto ste koristili mikser?
○ Upotreba miksera ima ključnu ulogu u procesu razbijanja staničnih stijenki
biljnog tkiva. Miješanje pomaže u homogenizaciji uzorka, čime se oslobađa
DNA iz stanica. Ovaj korak olakšava daljnju ekstrakciju genetskog materijala.
● Zašto ste dodali deterdžent i NaCl (aq)? 10
○ Deterdžent razgrađuje i otapa masti sa suđa i posuđa, pa isto tako razgrađuje
masti od kojih su izgrađene stanične membrane (fosfolipidi) što ubrzava
oslobađanje sadržaja stanice u otopinu pa tako i molekula DNA. Kuhinjska sol
ima ulogu neutralizacije naboja, tj. natrijevi ioni iz soli neutraliziraju negativne
naboje fosfata na molekulama DNA zbog kojih se one odbijaju pa će se uz
dodatak NaCl lakše taložiti.
● Što je pepsin i koja je njegova uloga u ovom praktičnom radu?
○ Pepsin, kao proteolitički enzim, koristi se za razgradnju proteina histona u
jezgri stanica, tj. pomoću pepsina odvajamo molekule DNA od histona što
rezultira jasnijim rezultatima. Njegova prisutnost omogućava oslobađanje DNA
iz proteinskih kompleksa, što je ključno za uspješnu ekstrakciju genetskog
materijala.
● Zašto ste suspenziju izložili temperaturi od 50°C? 11
○ Temperatura od 50oC odabrana je zato što je odabrani enzim (pepsin)
najaktivniji pri temp. od 3oC do 50oC iako ovi podatci variraju ovisno o izvoru.
Enzimi su najaktivniji pri povišenim temperaturama, no kada bismo suspenziju
izložili temperaturama višima od 50oC aktivnost pepsina bi se zaustavila te bi
se sam enzim imobilizirao
● Zašto ste koristili ohlađeni etanol?
○ Ohlađeni etanol koristi se za precipitaciju DNA iz otopine. Etanol je odabran
zato što je etanol manje polarna molekula od molekule DNA, zbog čega se
DNA bolje taloži u etanolu nego npr. u vodi u kojoj bi se DNA otopila.
Nataložene molekule DNA sakupljaju se na granici između vode i etanola, ovo
 se događa zato što su nastale molekule lakše, tj. manje gustoće od vode pa se
dižu u sloj etanola koji je također manje gustoće od vode.

10
-https://shorturl.at/cijnY
11
-https://rb.gy/mwgmr1

V. Popis literature (2 boda)

● Genetika, evolucija, ekologija : udžbenik iz biologije za IV. razred

gimnazije / Boris Vrtar, Josip Balabanić, Milan Meštrov.
● Priručnik za vježbe iz biologije 1. Šver, Lidija; Bielen, Ana; Babić,
Ivana; Vladušić, Tomislav; Hrašćan, Reno; Durgo, Ksenija;
Franekić, Jasna
https://repozitorij.pbf.unizg.hr/islandora/object/pbf%3A4148/d
atastream/FILE0/view , pristupljeno 2.12.2023.
● DO ONIONS, STRAWBERRIES AND BANANAS HAVE DNA?
https://www.edvotek.com/site/pdf/S-75.pdf , pristupljeno 2.12.2023.
● 3.9.1. Izolacija DNA iz voća.
https://edutorij-admin-api.carnet.hr/storage/extracted/fd4e4aca-de35-49a7-
9436-638df9b1c154/izolacija-dna-iz-voca.html , pristupljeno 2.12.2023.
● Sciencing. https://sciencing.com/five-types-gene-splicing-mechanism-
23880.html , pristupljeno 2.12.2023.
● Science direct, Cell cycle
https://www.sciencedirect.com/topics/neuroscience/cell-cycle , pristupljeno
2.12.2023.