Replikacija DNK

Replikacija genomske DNK je kljuna za ivot svih stanica i organizama. ZATO? Osnovni bioloki proces razmnoavanja zahtijeva vjerni prijenos genetike informacije sa roditelja na potomstvo. Svaki put kada se stanica dijeli, njezin cjelokupni genom mora biti udvostruen, pri emu je za kopiranje velikih molekula iz DNK ( koje grade prokariotske i eukariotske hromosome ) potrebna prisutnost cijelog niza ENZIMA. Replikacija je SEMIKONZERVATIVAN proces, u kojem svaki roditeljski lanac slui kao kalup za sintezu novih, komplementarnih lanaca keri.

Semikonzervativna replikacija DNK

Dva se lanca roditeljske DNK razdvajaju i svaki od njih slui kao kalup za sintezu po jednoga novoga lanca. Na taj nain nastaju dvije nove, potpuno identine molekule DNK. Slijed nukleotida u novonastalim lancima DNK odreen je komplementarnim sparivanjem baza.

Glavni enzim ukljuen u ovaj proces je DNK-POLIMERAZA, koja katalizira spajanje deoksiribonukleozid 5' trifosfata ( dNTP ) rastueg lanca DNK. Ipak, replikacija DNK je znatno kompleksnija i zahtijeva vie od jedne enzimatske reakcije.
Udvajanje ( duplikacija, replikacija, matina sinteza ) molekuke DNK je proces nastajanja ( u prisustvu odgovarajuih enzima ) dva molekula DNK koji su identini izvornom molekulu DNK. Dokaz da se replikacija odvija na semikonzervativan nain potvrdili su 1958 godine Mezelson i Stal ( M. Messelson i F. W. Stahl ). Koristili su metodu centrifugiranja DNK u gradijentu gustine cezijumhlorida ( CsCl ).

Eksperimentalni dokaz semikonzervativne replikacije DNK

Gajili su bakteriju E. coli u podlozi kojoj su dodali radioaktivni obiljeeni azot ( duik ), teki izotop azota 15N NH4Cl, koji se ugraivao u lance DNK u toku replikacije, tako da je ova DNK imala veu gustinu od normalne. Zatim su prenijeli bakterije u laku podlogu koja je kao izvor azota sadravala 14N - NH4Cl i gajili ih u toku nekoliko generacija. Rezultat ovog eksperimenta je: DVOLANANA DNK KERKI ELIJA JE HIBRIDNA, SADRI JEDAN RODITELJSKI ( TEKI ) I JEDAN NOVI ( LAKI ) LANAC.

Opi pregled replikacije Molekuli DNK su, ak i kod vrlo jednostavnih organizama veoma dugaki, naprimjer genom virusa SV 40 se sastoji od jedne molekule DNK koja sadri 5,1 kb ( 1 kb = 1 kilobaza = 1 000 nukleotida ) i ima duinu od 1,7 m, genom faga T2 sadri 166 kb i ima duinu 56 m. Bakterijski genom ( E. coli ) sadri ( takoer se sastoji od jednog molekula DNK ) 4 000 kb i ima duinu 1360 m.

Humani genom ( HAPLOIDNI ), a zna se da svaki hromosom sadri po jedan molekul DNK, se sastoji od oko 3 milijarde bp ( baznih parova ) i ima duinu od oko 1 m. DNK mnogih elija ( npr. E. coli ) su krunog oblika ( termin kruni koristi se da bi se istaklo da je molekul ZATVOREN, a ne da bi se opisao stvarni oblik molekule ). DNK bakterije E. coli u toku replikacije izgleda kao zatvorena kruna linija s unutranjom petljom i podsjea na grko slovo ( teta ), tako da roditeljski lanci nisu u potpunosti razdvojeni.

Mjesta na hromosomu na kojima se replikacija odvija imaju oblik slova Y i nazvana su replikaciona viljuka. Danas se zna da je replikativna viljuka asimetrina. Oba lanca se sintetiu u smjeru 5' 3' i istovremeno, s tim da se jedan sintetie kontinuirano ( vodei lanac ), a drugi diskontinuirano, u vidu fragmenata koji se naknadno povezuju usljed ega se zavrava sa zakanjenjem ( lanac koji zaostaje ).

Dakle, REPLIKACIJA je i semikonzervativni proces

Replikativna viljuka

Replikacija vodeeg ( direktnog ) lanca DNK ( engl. leading strand ) tee NEPREKIDNO ( kontinuirano ), dok se replikacija zaostajueg lanca DNK ( eng: lagging strand ) odvija sa prekidima ( diskontinuirano ) i sporije. Replikacija zaostajueg lanca odvija se POSREDNO ( indirektno ) nastaje povezivanjem OKAZAKIJEVIH fragmenata ( R.T. Okkazaki i saradnici, 1968 ). OKAZAKIJEV fragment je dio DNK, tj. kratki lanci novosintetizirane DNK ( duine 1 000 2 000 nukleotida kod bakterija, odnosno 100 200 nukleotida kod eukariota ). Kao poetna matrica za sintezu Okazakijevih fragmenata slui molekula RNK sa prajmerom.

ENZIMI REPLIKACIJE Uestvuje oko 20-ak enzima i drugih proteina. Enzim koji katalizira fosfodiestersko povezivanje nukleotida u smjeru 5' 3' je DNK polimeraza I ili Konbergov enzim. Ovaj enzim zahtijeva postojanje zaetnika ili PRAJMERA ( eng. primer ) u vidu kratkih polinukleotidnih lanaca komplementarno sparenih sa lancem matricom. Enzim dobija instrukcije za sintezu novog lanca DNK od matrice. Pored polimerazne, posjeduje i egzonukleaznu aktivnost u oba smjera, 3' 5' i 5' 3'. Kod bakterija DNK polimeraza I - kao egzonukleaza uklanja prajmere ( kada vie nisu potrebni ), a kao polimeraza popunjava praznine nastale njihovim uklanjanjem.

Enzimi DNK polimeraza II i III su slini DNK polimerazi I katalizuju sintezu DNK u smjeru 5' 3' i to samo u prisustvu lanca matrice i prajmera. Egzonukleazna aktivnost im je samo u smjeru 3' 5'. DNK polimeraza III moe da ugradi vie hiljada nukleotida u novi lanac ( prije nego se odvoji od matrice ugrauje 1 000 nukleotida / sec. ), a DNK polimeraza I ugrauje 10 nukleotida / sec. DNK polimeraza III obavlja sintezu najveeg dijela DNK molekule, pa se naziva DNK replikaza.

Ulogu prajmera u toku replikacije DNK imaju kratki lanci RNK duine od 10 do 60 nukleotida ( komplementarno spareni sa dijelovima DNK lanca matrice ). Kako nastaju prajmeri? Enzim primaza katalizuje nastajanje prajmera. Primaza meusobno povezuje ribonukleozidfosfate i moe da zapone sintezu polinukleotidnog lanca.

Mehanizmi neophodni za razdvajanje lanaca DNK i formiranje replikativne viljuke su 3 tipa proteina: DNK HELIKAZA omoguava raskidanje H veza i otvaranje dvolanane zavojnice. PROTEINI koji destabiliziraju dvolananu zavojnicu ( SSB proteini, eng. single strand DNA binding, ili HDP proteini, eng. Helix destabilizing proteins ). DNK TOPOIZOMERAZE ( vie tipova ovih enzima ) DNK topoizomeraza I ( umanjuje tenziju uvrtanja u molekuli DNK ) DNK topoizomeraza II , bakterijska se naziva DNK-iraza ( stalno se umeu negativni supernavoji djelovanjem ovog enzima). Specifini enzimi koji odmotavaju dvostruku uzvojnicu na mjestu SINTEZE.

Neki enzimi replikacije

MEHANIZMI REPLIKACIJE DNK KOD PROKARIOTA Uslovno cio proces replikacije se moe podijeliti u tri faze: INICIJACIJA replikacije. ELONGACIJA novonastalih lanaca DNK. TERMINACIJA replikacije. Inicijacija: replikacija kod bakterijske DNK poinje na mjestima koja obuhvataju 245 bp i odlikuje se specifinim redoslijedom nukleotida oznaenog kao LOKUS oriC, gdje se nalaze 4x ponovljeni segmenti od po 9 bp, kao i 3 ponovka nukleotidnog niza duine 13 bp.

Ishodite replikacije E. coli

DNK se u prisustvu proteina HU ( slinog eukariotskim histonima ) savija obuhvatajui proteinski kompleks DnaA ( oko 30 subjedinica ) i nastaje DnaA DNA POETNI ili INICIJALNI KOMPLEKS. Za otvoreni kompleks uz pomo proteina DnaC vezuju se HELIKSAZE gradei PREINICIJALNI kompleks.

Inicijacija elongacije

Elongacija: Napredovanje REPLIKACIJE u oba pravca se odvija uz djelovanje DNK heliksaze i proteina SSB ( destabilizira dvolananu zavojnicu ). Zatim sinteza prajmera RNK polimeraze i primaze. DNK polimeraza III se vezuje za replikativnu viljuku i poinje kontinuiranu sintezu vodeih lanaca DNK. Sinteza lanca koji zaostaje je mnogo kompleksnija. Obezbjeuje je putujui kompleks, PRIMOZOM, koji pored PRIMAZE I HELIKAZE sadri 5 razliitih proteina. Terminacija: replikacija se zavrava u regionu od 350 bp nazvanih REPLIKATIVNI TERMINUS nasuprot REPLIKATIVNOM poetku oriC. Replikativni terminus ili TERMINACIONI region obuhvata 6 identinih segmenata duine 23 bp ( TerE, TerD, TerA, TerF, TerB i TerC) po 3 sa svake strane. Replikativna viljuka koja dolazi u ovaj region preko segmenata biva zaustavljena u terminacionom regionu.

Terminacija replikacije DNK kod bakterija

MEHANIZMI REPLIKACIJE DNK KOD EUKARIOTA Molekuli DNK u eukariotskim elijama su znatno vei nego u prokariotskim elijama i vrsto su vezani za PROTEINE i REPLIKUJU se u okviru hromatinske strukture. Mehanizmi procesa replikacije su zajedniki odvijaju se semikonzervativnim i semidiskontinuiranim mehanizmom i istovremeno u oba smjera bidirekciono. Molekula DNK se replikuje 10 20 puta sporije nego u prokariotskim. Mjesta poetka replikacije nazvana su ARS elementima ( eng. autonomously replicating sequences, autonomni replicirajui slijedovi ) obuhvataju regione od 300 bp. Replikon je region hromosoma ija replikacija zapoinje u odreenom ARS elementu i predstavlja jednu replikativnu jedinicu. ENZIMI najmanje 5 vrsta DNK polimeraza , , , i itd.

DNK polimeraza se sastoji od vie subjedinica ( 4 u elijama Drosophile, 5 u elijama jetre pacova ) katalizuje sintezu lanca DNK u smjeru 5' 3', poevi od prajmera moe da ugradi samo 100 200 nukleotida. Ne posjeduje EGZONUKLEAZE. AKTIVNOST ne moe da provjerava sopstveni uinak i ispravlja nastale greke. Polimeraze i uestvuju u reparaciji oteenja molekule DNK. Polimerazi se pripisuje replikacija mitohondrijalne DNK.

DNK polimeraza se sastoji od 2 subjedinice moe da ugradi neogranien broj nukleotida u rastui lanac DNK, posjeduje egzonukleaznu aktivnost smjera 3' 5' ( koriguje greke u toku replikacije ). Njena katalitika aktivnost zavisi od interakcije sa proteinom PCNA ( eng. proliferating cell nuclear antigen ) prisutan u nukleusu stanica koje imaju sposobnost da se dijele. Kompleks polimeraze i proteina PCNA ima ulogu REPLIKAZE vodeeg lanca DNK.

Kompleks RFA se vezuje za jednolanane regione molekula DNK ( uloga slina ulozi bakterijskog proteina SSB ), dok RFC uestvuje u formiranju aktivnih replikativnih kompleksa. Enzim telomeraza ( ribonukleoproteinski kompleks, ija komponenta RNK sadri segment komplementaran nizu koji se ponavlja u okviru telomere ). Uloga mu je u replikaciji krajeva linearnih molekula DNK u telomerama. Telomerni dijelovi DNK sadre ponovljene jednostrane slijedove DNK sa nakupinama G ostataka u jednom lancu. Djelovanjem telomeraze nastaju jednolanani 3' krajevi u kojima se esto pojavljuje GVANIN ( G ), tzv. G - KVARTET G G.

POPRAVAK OTEENIH MOLEKULA DNK

( REPARACIJA )

REPARACIJA NESPARENIH NUKLEOTIDA

REPARACIJA ISJECANJEM BAZA ( EKSCIZIONA REPARACIJA ) REPARACIJA ISJECANJEM NUKLEOTIDA DIREKTNA REPARACIJA POSTREPLIKATIVNA ( REKOMBINACIJSKA ) REPARACIJA

SOS ODGOVOR

VRSTE REKOMBINACIJA

HOMOLOGNA GENETIKA REKOMBINACIJA )

SPECIJALNA REKOMBINACIJA ( kljuna uloga enzima REKOMBINAZE ) TRANSPOZICIONA REKOMBINACIJA