PCR Sequencing

81
PCR v gii trnh t#

Gii trnh t# l g?
DNA l c s! ha h#c c&a gen. Phn t( DNA l m*t chu,i xo.n kp c&a hai m2ch 3n
3)4c c5u t2o t6 4 lo2i nucleotide khc nhau nh8 cc base c&a chng, 3 l: A (adenine),
C (cytosine), G (guanine) v T (thymine). Cc nucleotide ny n9i k:t lin ti:p v t? xc 3@nh. GiBi trnh t? c&a gen t>c l pht hiCn 3)4c th> t? s.p x:p c&a 4
lo2i nucleotide ny trn phn t( DNA.
Cc ph$&ng php gii trnh t# gene
1. Ph!ng php ha h"c gi%i trnh t( DNA
Vo nDm 1977, Maxam v Gilbert 3 pht minh 3)4c m*t ph)ng php ha h#c
3E c thE giBi trnh t? m*t 3o2n DNA. Nguyn t.c c&a ph)ng php ny l: (1) Tr)<c
h:t l phBi 3nh d5u m*t 3Gu c&a 3o2n DNA cGn phBi giBi trnh t? bHng m*t g9c
phospho 3Ing v@ phng x2 (
32
P); (2) X( l cc 3o2n DNA 3 3nh d5u ny v 7 (N7), hydrazine lm bi:n 3Ji Thymine v Cytosine, hydrazine v
NaCl 3E lm bi:n 3Ji Cytosine, acid 3E lm bi:n 3Ji Guanine v Adenine, NaOH 3E
lm bi:n 3Ji Adenine v Cytosine v<i Adenine )u tin hn Cytosine. Nh) vMy trong
giai 3o2n ny, phBi dng t nh5t 4 9ng nghiCm v trong m,i 9ng nghiCm, DNA 3)4c x(
l va cc 3o2n DNA m trn m,i 3o2n DNA ny chN c m*t v@ tr
nucleotide 3Kc hiCu v<i ch5t ha h#c l b@ bi:n 3Ji; (3) Cc nucleotide b@ bi:n 3Ji ny
sP b@ l5y ra khRi m2ch khung 3)8ng-phosphate (sugar-phosphate backbone) c&a 3o2n
DNA v nh8 3 tch ra 3)4c cc 3o2n m2ch 3n c m*t 3Gu 3nh d5u
32
P v m*t 3Gu
b@ m5t phn t( base v phn t( ny 3 b@ l5y ra khRi m2ch khung (hnh 37). (4) Th?c
hiCn 3iCn di mSu DNA 3 x( l trong 4 9ng nghiCm ny trn 4 hng c&a m*t gel
polyacrylamide bi:n tnh 3E cc m2ch 3n trong mSu di chuyEn trong gel khng b@ bi:n
3Ji trong qu trnh 3iCn di. Nh8 3, sau khi hon t5t 3iCn di, cc m2ch 3n sP b@ d6ng
t2i cc v@ tr khc nhau, ty thu*c vo m2ch 3n ny di ng.n khc nhau, theo hng d#c
su9t chiTu di c&a gel. p gel 3 3iCn di ny trn m*t phim nh2y tia X, cc v@ tr d6ng

82
l2i c&a cc m2ch 3n trn gel 3iCn di sP t2o thnh cc v2ch trn phim v cc v@ tr ny
3Tu b@ 3nh d5u phng x2 do cc m2ch 3n 3Tu c m*t 3Gu 3)4c 3nh d5u bHng
32
P.
T6 cc v2ch trn phim x2 k t? ghi ny (autoradiography), c thE 3#c 3)4c trnh t? c&a
cc nucleotide c&a 3o2n DNA (hnh 38).
Ph)ng php ha h#c xc 3@nh trnh t? DNA c&a Maxam v Gilbert trn th?c t:
khng phBi dU th?c hiCn v cGn phBi xc 3@nh kh nhiTu thng s9 t9i )u cho th nghiCm,
trong 3 kh nh5t l phBi xc 3@nh 3)4c nIng 3* ging vc t2p ny, ph)ng php Maxam Gilbert hiCn nay t 3)4c s( dLng, m
thay vo 3 cc nh khoa h#c dng ph)ng php enzyme v<i nhiTu )u 3iEm v)4t tr*i
hn.

Mch #$n DNA

32
P A p G p C p T p T p T p G p A p G p G p A p C p G p A..
32
P
32
P
32
P
32
P
32
P

Cc mch DNA
#$n c #%u b(
#nh d*u
32
P

Hnh 37: Cc mch #$n c m%t #(u #nh d*u v,i
32
P v m%t #(u base Guanine b. l*y kh0i mch khung do b.
bi2n #4i. Cc mch #$n ny c chi6u di ng7n khc nhau ty thu%c vo v. tr c9a Guanidine trn
#on DNA.
Hnh 38: Hnh x k t; ghi trn phim nhy tia X m%t gel polyacrylamide sau khi # #i=n di. Cc vch l v. tr cc
mch #$n b. d>ng li sau #i=n di. Cc v. tr ny g(n hay xa kh@i #iAm l tuB kch th<,c c9a mch #$n
di hay ng7n khc nhau. T> cc vch ny, #Dc trnh t; c9a #on DNA trong mEu.
C
T+G
G
A>C
3 5
G C C C A C T T C A G A A G A A A A A G G

83
2. Ph!ng php enzyme gi%i trnh t( DNA
Ph)ng php enzyme 3)4c Sanger v cc c*ng s? pht minh cVng vo nDm 1977,
v ngy hm nay ph)ng php ny cng ngy cng 3)4c hon thiCn v th?c hiCn dU
dng t2i cc phng th nghiCm. Nguyn t.c chung c&a ph)ng php ny c thE tm t.t
nh) sau:

thm
d*NTP, DNA
polymerase,
ddATP

GGAATGC
CCTTACG CATACGTGG
mGi GGAATGC
CCTTACG CATACGTGG
CGTAAGG*C*CdA
CGTAAGG*C*C*A*C*G*TdA
CGTAAGGdC
CGTAAGG*CdC
CGTAAGG*C*C*AdC
CGTAAGG*C*C*A*CdG
CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*A *TdG
CGTAAGG*C*C*A*C*GdT
CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*AdT
CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*A *TdG
CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*AdT
CGTAAGG*C*C*A*C*G*TdA
CGTAAGG*C*C*A*C*GdT
CGTAAGG*C*C*A*CdG
CGTAAGG*C*C*AdC
CGTAAGG*C*CdA
CGTAAGG*CdC
CGTAAGGdC

#i,n di trn gel
Chi.u #i,n di
thm
d*NTP, DNA
polymerase,
ddCTP

thm
d*NTP, DNA
polymerase,
ddGTP

thm
d*NTP, DNA
polymerase,
ddTTP

Hnh 39: Ph<$ng php Enzyme giHi trnh t; DNA. Ion DNA #<Jc chn vo m%t vector ti m%t v. tr bi2t r
trnh t;, nhK # c thA t4ng hJp #<Jc cc mch #$n c m%t #(u l mGi, m%t #(u l cc nucleotide
tLn. Trong hnh cc nucleotide #nh d*u * l cc nucleotide #<Jc dnh d*u
35
S, nhK vLy cc mch
#$n #<Jc #nh d*u.

84
Tr)<c h:t chn cc 3o2n DNA cGn phBi xc 3@nh trnh t? vo m*t vector l phage
hay plasmid t2i m*t v@ tr m trnh t? chu,i c&a v@ tr ny 3 3)4c xc 3@nh r. ChuyEn
thE t>c l 3)a cc vector mang 3o2n chn DNA ny vo t: bo vi khuWn 3E nhn bBn
cc vector ny thnh nhiTu bBn sao, sau 3 tch chi:t v tinh khi:t cc vector t6 vi
khuWn 3E thnh cc vector t? do.
Dng cc 3o2n mIi bJ sung m*t cch 3Kc hiCu vng men DNA polymerase v 4 lo2i nucleotide
t? do (g#i l dNTP: deoxynucleotide triphosphate) v m*t l)4ng r5t ging vng 3)4c th?c hiCn trong 4
9ng, v m,i 9ng cho m*t lo2i ddNTP khc nhau. B.t 3Gu t6 3o2n mIi, men DNA
polymerase sP ko cc dNTP vo 3E tJng h4p m2ch 3n bJ sung v 3 c&a 3)8ng deoxyribose, m
g9c OH t2i v@ tr ny chnh l ni 3E dNTP k:
ti:p 3)4c g.n vo. Nh8 vMy trong 9ng phBn >ng
c cc m2ch 3n DNA c cc chiTu di khc
nhau t)ng >ng v<i cc v@ tr trnh t? cc
nucleotide trn 3o2n DNA g9c (hnh 39).
XE giBi trnh t?, ng)8i ta dng ph)ng php
3iCn di trn gel polyacrylamide bi:n tnh. V<i
ph)ng php 3nh d5u mIi hay cc dNTP bHng
3Ing v@ phng x2
32
P hay
35
S th sau khi 3iCn di,
cVng gi9ng nh) ph)ng php c&a Maxam v Gilbert, ng)8i ta pht hiCn cc v2ch 3iCn
di bHng kY thuMt x2 k t? ghi, v t6 cc v2ch ny giBi 3)4c trnh t? c&a 3o2n DNA
(hnh 40).
T 3
C
G
C
A
G
T
C
C
T
A
G
C
T
T
A
G
C
G
G 5
A C G T

Hnh 40: Hnh x k t; ghi m%t k2t quH giHi
trnh t; DNA trn gel
polyacrylamide. T> k2t quH ny,
#Dc #<Jc trnh t; DNA

85
3. Gi%i trnh t( b)ng my t( +,ng (automated sequencer)
Cc phng th nghiCm hiCn nay 3Tu dng phBn >ng giBi trnh t? bHng ph)ng php
enzyme, nh)ng khi lm giBi trnh t? th th)8ng dng cc my t? 3*ng ch> khng dng
kY thuMt x2 k t? ghi nh) tr)<c 3y. XE th?c hiCn 3)4c giBi trnh t? bHng my t? 3*ng
th cc m2ch DNA 3n sBn sinh trong 9ng phBn >ng giBi trnh t? phBi 3)4c 3nh d5u
hu[nh quang 3E cc v2ch 3iCn di c&a cc m2ch 3n ny pht sng khi 3i qua m*t chm
tia sng laser. C5u t2o c&a m*t my t? 3*ng giBi trnh t? gIm hai phGn chnh y:u, 3
l: phGn 3iCn di v<i gel polyacrylamide v phGn pht hiCn cc v2ch 3iCn di. PhGn 3iCn
Hnh 41: S$ #G khMi m%t my t; #%ng giHi trnh t< dng bHn gel polyacrylamide. My gGm hai ph(n: ph(n
#i=n di gel polyacrylamide, ph(n pht hi=n cc vch #i=n di. Cc vch #i=n di #<Jc cc con m7t cHm
quang pht hi=n khi #i qua chm tia laser v pht sng ln. Tn hi=u #<Jc m7t cHm quang truy6n v6
my tnh #A hiAn th. thnh cc #Nnh c<Kng #% sng
A G C T T A C G G A C T A A T G C
Mu 1
Mu 2
Mu 3
Mu 4
Tia
LASER
My tnh
Th i gian
M7t cHm quang
A G C T T A C G G A C T A A T G C
Mu 1
Mu 2
Mu 3
Mu 4
Tia
LASER
My tnh
Th i gian
M7t cHm quang

86
di polyacrylamide c thE l m*t bBn gel hay l m*t 9ng mao quBn ch>a gel. PhGn pht
hiCn v2ch 3iCn di l nh\ng con m.t cBm quang v m*t chm tia laser 3i qua tr)<c n.
Nguyn t.c ho2t 3*ng c&a my l trong su9t qu trnh 3iCn di, m,i khi c m*t v2ch
3iCn di 3i qua chm tia laser th v2ch 3iCn di sP pht sng ln v s? pht sng ny sP
3)4c con m.t cBm quang
ghi nhMn v l)u l2i thnh
m*t 3Nnh c)8ng 3* sng
trong biEu 3I. T6 biEu 3I
c&a cc 3Nnh c)8ng 3*
sng ny, my sP so dng
c&a cc 3Nnh t)ng >ng
vng giBi trnh t? c
thE th?c hiCn 3)4c chN
trong m*t 9ng nghiCm v
khi giBi trnh t? chN cGn 3iCn di trn m*t hng m khng cGn phBi trn 4 hng khc nhau
nh) tr)<c 3y (hnh 42). N:u dng diCn di mao quBn th ty thu*c vo s9 mao quBn c
thE ch2y m*t lGn m ng)8i lm th nghiCm c thE c s9 mSu cho m,i lGn ch2y nhiTu
hay t. Hnh 43 l s 3I kh9i minh h#a cho m*t giBi trnh t? 8 mao quBn (CEQ8000,
hay CEQ8800). Ty thu*c vo qui m c&a phng th nghiCm cng v<i s9 mSu giBi
trnh t? m phng th nghiCm c thE trang b@ giBi trnh t? t hay nhiTu mao quBn. V dL
v<i ABI th c nhiTu lo2i: chN 1 mao quBn, 4 mao quBn, 16 mao quBn, 48 mao quBn, rIi
96 mao quBn. Phng th nghiCm R&D c&a cng ty Nam Khoa tr)<c 3y nhu cGu giBi
trnh t? khng nhiTu nn chN trang b@ CEQ8000 c 8 mao quBn (hnh 44). Nh)ng nay
GGAATGC
CCTTACG CATACGTGG
CGTAAGGCCdA
CGTAAGGCdC
CGTAAGGCCACdG
CGTAAGGCCACGTdA
CGTAAGGdC
CGTAAGGCCACGTA TdG
CGTAAGGCCAdC
CGTAAGGCCACGdT
CGTAAGGCCACGTAdT
*CGTAAGGCCACGTA TdG
*CGTAAGGCCACGTAdT
*CGTAAGGCCACGTdA
*CGTAAGGCCACGdT
*CGTAAGGCCACdG
*CGTAAGGCCAdC
*CGTAAGGCCdA
*CGTAAGGCdC
*CGTAAGGdC
thm
dNTP, DNA
polymerase,
ddATP, ddTTP,
ddGTP, ddCTP
Chi.u #i,n di
GGAATGC
CCTTACG CATACGTGG
CGTAAGGCCdA
CGTAAGGCdC
CGTAAGGCCACdG
CGTAAGGCCACGTdA
CGTAAGGdC
CGTAAGGCCACGTA TdG
CGTAAGGCCAdC
CGTAAGGCCACGdT
CGTAAGGCCACGTAdT
*CGTAAGGCCACGTA TdG
*CGTAAGGCCACGTAdT
*CGTAAGGCCACGTdA
*CGTAAGGCCACGdT
*CGTAAGGCCACdG
*CGTAAGGCCAdC
*CGTAAGGCCdA
*CGTAAGGCdC
*CGTAAGGdC
thm
dNTP, DNA
polymerase,
ddATP, ddTTP,
ddGTP, ddCTP
thm
dNTP, DNA
polymerase,
ddATP, ddTTP,
ddGTP, ddCTP
Chi.u #i,n di

Hnh 42: V,i cc ddNTP #nh d*u hynh quang khc nhau, cc #Dan
trnh t; tLn cng @ #(u 5 sP #<Jc #nh d*u bRng 4 mu
hynh quang khc nhau t<$ng Sng v,i nuleotide tLn l A,
hay T, hay C hay G. Chnh nhK vLy khng c(n phHi th;c
hi=n phHn Sng giHi trnh t; trong 4 Mng phHn Sng.

87
do nhu cGu nghin c>u v d@ch vL ngy cng nhiTu nn 3 trang b@ thm ABI 3130XL
c 3:n 16 mao quBn (hnh 44).
Cc th: hC my vT sau ngy cng c nh\ng ch)ng trnh 3i km 3E ch]ng nh\ng
c thE hiEn th@ t? 3*ng cc k t? ho h#c c&a trnh t? DNA m cn gip cc nh nghin
c>u c thE: (1) Pht hiCn cc chi ti:t cGn thi:t trn trnh t? nh) m kh!i 3Gu, m k:t
thc, vng 3#c m! (ORF: Open Reading Frame), trnh t? 3Kc hiCu cho cc enzyme c.t
gic l vng trnh t? c
nghâ) thnh trnh t? acid amin c&a m*t protein, nh8 3 c thE xc 3@nh, phRng 3on,
hay lm c s! ban 3Gu 3E hiEu 3)4c ch>c nDng c&a gen...(3) T? 3*ng so snh trnh t?
DNA trong th nghiCm hay
m*t trnh t? DNA n2p vo
my, hay c thE trnh t? acid
amin c&a protein, vc nDng
gen...

Hnh 44: My giHi trnh t; CEQ8000 c 8 mao quHn c9a Beckman Coulter v ABI 3130XL c 16 mao quHn
c9a Applied Biosystem #<Jc trang b. ti phng th nghi=m R&D c9a cng ty Nam Khoa
C/c [-]
C
/
c
[
+
]
Laser
C1m
quang
Ii=n th2 cao
Mao
quHn
C/c [-]
C
/
c
[
+
]
Laser
C1m
quang
Ii=n th2 cao
C/c [-]
C
/
c
[
+
]
Laser
C1m
quang
Ii=n th2 cao
Mao
quHn

Hnh 43: S$ #G khMi m%t my di=n di mao quHn dng giHi trnh t; DNA

88
PCR l cng c' gip hon thi)n v m, r-ng ph/ p d'ng k1 thu4t gii trnh t#
PCR 3 3ng gp r5t nhiTu vo cng nghC giBi trnh t? lm cho cng nghC giBi trnh t?
ngy cng dU dng hn v thuMn tiCn hn. Khng chN vMy PCR cn lm cho giBi trnh t?
c nhiTu >ng dLng hn khng chN trong nghin c>u m cB trong chWn 3on n\a.
Tr)<c khi c PCR th ng)8i ta chN c thE giBi trnh t? cc 3o2n gene 3)4c c lMp v
chn vo plasmid v chN c nh) vMy th mng giBi trnh t?. Ngoi
ra, enzyme polymerase cVng l lo2i enzyme khng ch@u nhiCt nn phBn >ng giBi trnh t?
chN th?c hiCn ! 37
o
C, do vMy m v5n 3T t9i )u cc thnh phGn c&a phBn >ng r5t l kh
3Ing th8i hiCu quB c&a phBn >ng giBi trnh t? cVng khng cao.
T6 khi c s? ra 38i c&a kY thuMt PCR th kY thuMt giBi trnh t? cVng c nh\ng ti:n b*
r5t v)4t b?c. ChN cGn dng PCR l c thE nhn bBn 3o2n gene mu9n giBi trnh t? thnh
hng t_ bBn sao hon ton gi9ng hCt nhau v sBn phWm khu:ch 32i ny c thE 3)a vo
giBi trnh t? tr?c ti:p m khng cGn phBi chn vo m*t plasmid giBi trnh t? n\a. S? pht
minh ra kY thuMt nhn bBn DNA trong 9ng nghiCm bHng PCR cVng gip cho viCc cBi ti:n
phBn >ng giBi trnh t? km hiCu quB tr)<c 3y tr! nn hiCu quB hn nh8 p dLng enzyme
polymerase giBi trnh t? bTn vng giBi trnh t? 3)4c th?c hiCn qua cc
chu k[ nhiCt gi9ng hCt PCR, m ngy nay chng ta g#i l phBn >ng chu k[ nhiCt giBi trnh
t?. Vng chu k[ nhiCt giBi trnh t? th hiCu quB phBn >ng t9t hn r5t nhiTu, 3Ing
th8i t9i )u ha cc thnh phGn c&a phBn >ng cVng dU dng hn r5t nhiTu. C thE ni
chnh s? ra 38i v hon thiCn kY thuMt PCR 3 gip tDng t9c kY thuMt giBi trnh t? khng
nh\ng trong v5n 3T hon thiCn n, m cB trong v5n 3T ph2m vi p dLng.
Gii trnh t# b- gene ng$5i
1. Lm th. no gi%i trnh t( b, gene ng1i
GiBi trnh t? b* gen ng)8i t>c l giBi trnh t? ton b* th> t? s.p x:p cc nucleotide
A, T, C, v G c&a DNA trong 23 cKp nhiUm s.c thE t: bo ng)8i. D? n giBi trnh t? b*
gen ng)8i 3)4c Ti:n S^ James Watson, cha 3` c&a pht hiCn c5u trc DNA, 3T ra t6
gi\a thMp nin 1980. X:n thng 10 nDm 1990, d? n 3)4c ra 38i vu b* gen ng)8i c&a nhiTu qu9c gia

89
trn th: gi<i. Do tin 3on gi tr@ kinh t: mang l2i t6 viCc giBi m thnh cng b* gen
ng)8i sP r5t l<n, nn 3 c m*t s9 cng ty sinh h#c chuyn vT b* gen ng)8i 3 3)4c
hnh thnh. S? nhMp cu*c c&a cc cng ty t) nhn ny 3 t2o nn m*t bGu khng kh thi
3ua cho viCc khai ph b mMt vT b* gen c&a loi ng)8i chng ta, cng gGn 3:n nh\ng
ngy 3:n 3ch cng c?c k[ ngo2n mLc. Trong cu*c ch2y 3ua ny, nh8 3 p dLng m*t
ph)ng php c?c k[ 3*c 3o k:t h4p gi\a cng nghC PCR, cng nghC giBi trnh t?
DNA v<i cng nghC tin h#c, nn chN v<i kinh ph khoBng 200 triCu mY kim, Ti:n S^
Crag Venter c&a Celera Genomics tr! thnh ng)8i dSn 3Gu thnh cng nh5t trong viCc
giBi trnh t? 3)4c gGn nh) hon ton b* gen ng)8i.
Ci kh khDn c&a viCc giBi trnh t? b* gene ng)8i l khng thE no tch t6ng 32i
phn t( DNA c&a t6ng nhiUm s.c thE rIi 3em giBi trnh t? 32i phn t( DNA nguyn
van ny. Cc nh khoa h#c c&a HGP cVng nh) cc trung tm khc trn th: giu vT b* gen ng)8i th)8ng c.t cc 32i phn t( DNA c&a nhiUm s.c thE m*t cch 3@nh
h)<ng theo bBn 3I di truyTn, rIi 3em giBi trnh t? cc 3o2n c.t DNA ny, v cu9i cng
tm cch ghp n9i chng l2i vc v c nhiTu khi cc 3o2n
c.t DNA qu l<n, r5t kh giBi trnh t? cVng nh) kh cho k:t quB giBi trnh t? chnh xc.
Do 3, v<i m,i m*t 3o2n DNA cc nh khoa h#c phBi th?c hiCn giBi trnh t? t nh5t l
7 lGn 3E 3Bm bBo 3* lKp l2i. Chnh v vMy, v<i cch ti:p cMn ny, nhiTu v@ tr trn cc
32i phn t( DNA vSn khng thE giBi trnh t? 3)4c m t6 3 cc nh khoa h#c c&a HGP
c thE hon t5t viCc x:p 3ng v@ tr cc 3o2n DNA 3 giBi trnh t? trn 32i phn t(
DNA c&a nhiUm s.c thE.
Ti:n s^ Crag Venter 3 th?c hiCn m*t ph)ng php giBi trnh t? b* gen ng)8i m*t
cch hon ton khc h]n (hnh 45). Tr)<c h:t ng cho tch chi:t ton b* DNA nhiUm
s.c thE t: bo ng)8i rIi ph bung m*t cch khng 3@nh h)<ng cc 32i phn t( DNA
thnh cc mBnh DNA nhR hn. Xem giBi trnh t? t5t cB cc mBnh DNA nhR ny. Cu9i
cng dng nh\ng my 3iCn ton c?c m2nh m ng 3 h4p tc v<i cng ty ABI ch: t2o
ra, d tm cc 3Gu trng lKp c&a cc mBnh DNA nhR ny 3E l.p n9i vo 3ng cc v@ tr
c&a chng trn 32i phn t( DNA c&a nhiUm s.c thE. Chnh nh8 p dLng chi:n l)4c giBi
trnh t? ny m Celera Genomics 3 giBi trnh t? r5t nhanh cc mBnh DNA, chN cGn lKp
l2i cho m,i mBnh DNA c 5 lGn, v 3 x:p 3ng gGn nh) hGu h:t v@ tr c&a cc mBnh

90
DNA 3 giBi trnh t? trn 32i phn t( DNA c&a nhiUm s.c thE. Hn th: n\a, TS. Crag
Venter cVng tuyn b9 cng ty 3 triEn khai m*t kY thuMt m<i c thE lm cho ph)ng
php giBi trnh t? b* gen c&a cng ty, v9n d^ 3 l ph)ng php nhanh nh5t rIi, tr!
thnh nhanh hn n\a. Cu9i nDm 2000, Celera Genomics 3 hon thnh viCc giBi trnh
t? b* gen c&a chu*t vc
nDng c&a cc gen.
2. K.t qu% gi%i trnh t( b, gene ng1i
Sau gGn 10 nDm nghin c>u
th?c hiCn v<i nh\ng nDm cng vT
sau cng si 3*ng khng kh thi
3ua do s? nhMp cu*c c&a cc cng
ty t) nhn, ngy 26 thng 6 nDm
2000, t2i Ta B2ch bc v<i s?
hiCn diCn c&a TJng Th9ng Hoa
K[ Bill Clinton, hai khoa h#c gia
MY l Ti:n S^ Crag Venter 32i
diCn cho Celera Genomic v Ti:n
S^ Francis Collins 32i diCn cho
HGP (HGP: Human Genome
Project) c&a NIH (NIH: National
Institute of Health) cng b9 m*t
cch long tr#ng l ch)ng trnh
giBi trnh t? b* gen ng)8i 3
hon t5t. Xy chnh l m*t th8i
kh.c l@ch s( c?c k[ quan tr#ng v
3ng nh< c&a nhn lo2i, 3nh d5u
ngy nhn lo2i 3 c trong tay
m*t bBn 3I sinh h#c cGn thi:t 3E
b)<c vo k_ nguyn ma han cc thnh t?u v^

c
a
g
g
c
a
t
t t c c
a g
c
g g c g
g c
g g a g c a g
c g a g c g g c g g
c c a g c a g t
g a g
g a g a c a g
c
c c a g c a g t
g a g
g a g a c a g c
c g a g c g g c
g g
g
g c g g c
g g a
g c a g
c a g g c a t t
t
c c a g c
c g a g c
g g c
g g c
g g a g c a
g g c a t t t
c c a
g c a
g t
g a g g a
g a c a g c
t g t a c
ccgtcaaccggagtta
acgttct
DNA t3 mhi5m s7c th9
#0;c ph bung thnh
nhi.u mnh nh<
Cc mnh DNA nh<
#0;c gi1i trnh t/
Cc mnh DNA nh< #0;c ch0$ng trnh phn tch
t/ #>ng tm cc #%u trng l?p, nh@ # ti hi,n
#0;c trnh t/ cAa #i phn tC DNA

Hnh 45:
Ph<$ng php giHi trnh t; b% gen ng<Ki c9a cng ty Celera
Genomics: tr<,c h2t tch chi2t ton b% DNA c9a nhiTm s7c
thA t2 bo ng<Ki, sau # ph tung DNA thnh cc mHnh nh0,
giHi trnh t; t*t cH cc mHnh nh0 ny, cuMi cng nhK ch<$ng
trnh vi tnh c;c mnh #A nMi k2t cc #on DAN nh0 ny li
v,i nhau bRng cch d tm cc #(u trng lUp nhK vLy ti hi=n
#<Jc mch DNA nguyn th9y

91
32i vT sinh y h#c trong t)ng lai. D thnh cng c&a cc nh khoa h#c giBi trnh t?
3)4c 3.1 t_ cc k t? ha h#c lm nn b* gen ng)8i 3 3)4c v nh) s? kiCn l@ch s(
con ng)8i b)<c ln mKt trDng (ngy 26 thng 7 nDm 1969, t6 khoang 3J b* phi thuyTn
Apollo, Neil Armstrong b)<c xu9ng 3i d2o trn mKt trDng v 3nh d5u th8i 3iEm con
ng)8i th?c hiCn 3)4c hon ton )<c m 3 t6ng ao )<c b5y lu: kh.c d5u chn mnh
trn bT mKt ch@ HHng), nh)ng 3y ch)a phBi l th8i 3iEm m con ng)8i 3 to2i nguyCn
3)4c )<c m hiEu bi:t t)8ng tMn 3)4c b* gen c&a mnh.
ThMt s? cho 3:n th8i 3iEm 3 cc nh khoa h#c ! Cng ty Celera Genomic hy
cn ch)a giBi trnh t? 3)4c 3% b* gen ng)8i, t>c khoBng 150 triCu, v cng viCc ny
3i hRi phBi t6 1 3:n 2 nDm n\a m<i c thE hon t5t v 3% cn l2i ny nHm trn phGn
kh giBi trnh t? nh5t. Cn HGP th thnh cng t hn, hy cn nhiTu 3o2n trnh t? c&a
b* gen m cc nh khoa h#c c&a HGP ch)a giBi 3)4c v cVng c nhiTu 3o2n trnh t? 3
giBi 3)4c nh)ng h# vSn ch)a s.p x:p vo 3ng v@ tr. Ngoi ra, cho d cc nh khoa
h#c c giBi trnh t? 3)4c m*t cch tr#n van b* gen con ng)8i, th cu9n sch c&a 38i
s9ng (the book of life) ny hy cn ch)a 3#c 3)4c, nh) Gerald Rubin, Ph Gim 39c
Nghin C>u Y Sinh H#c c&a ViCn Y H#c Howard Hughes giBi thch: Cu9n sch 3)4c
vi:t bHng m*t ngo2i ng\ r5t ph>c t2p, cGn phBi c m*t th8i gian di chng ta m<i hiEu
3)4c. ThMt vMy, c thE t)!ng t)4ng l n:u cc trnh t? c&a b* gen ng)8i 3)4c in ra
thnh sch th sP cGn phBi khoBng 200 cu9n v m,i cu9n dy phBi 500 trang. C 3000
trang nHm rBi rc trong 200 cu9n sch trn l c nghâ t>c l c gen, m cho 3:n hiCn
nay chN mc l
xc 3@nh 3)4c gen. Hy cn vi trang (khoBng 3%) ch)a vi:t xong v nh\ng trang ny
l nh\ng trang kh vi:t nh5t v thu*c nh\ng vng kh giBi trnh t? nh5t trong b* gen
ng)8i.
Cho 3:n thng 4 nDm 2003, cc trang khuy:t ny 3 3)4c cc nh khoa h#c vi:t
hon t5t. Tuy vMy, m*t viCc r5t l<n hiCn 3ang 3Kt ra tr)<c m.t cc nh khoa h#c 3 l
phBi xc 3@nh 3)4c cc trnh t? no l gen v ch>c nDng c&a cc gen ny. ChN c 3%
c&a b* gen ng)8i l mang gen t>c l mang trnh t? c nghâ v hiCn nay cc nh khoa
h#c cVng ch)a bi:t chnh xc l thMt s? c bao nhiu gen trong b* gen ng)8i. Cu trB
l8i phRng ch6ng nh5t l t6 28.000 3:n 140.000 gen, v gGn 3y nh5t c lP l 3ang gGn
3:n con s9 chnh xc hn, 3 l 30.000 gen. Trong khoBng 30.000 gen ny, cc nh

92
khoa h#c hiCn chN bi:t 3)4c ch>c nDng c&a khoBng 10.000 gen, hy cn 20.000 ch)a
bi:t ch>c nDng c&a chng. Xy chnh l m*t cu*c 3ua ma han 3Gy si 3*ng
v k:t quB t6ng chKng m*t c&a cu*c 3ua, t>c k:t quB c&a viCc xc 3@nh 3)4c chc nDng
c&a t6ng gen, 3Tu h>a han nh\ng p dLng c?c k[ ngo2n mLc v 3Gy triEn v#ng trong
sinh h#c cVng nh) y h#c.
3. Gi%i trnh t( b, gene ng1i cu,c +ua cha k.t thc
Gen chnh l trnh t? cc nucleotide trong chu,i DNA chN huy 3)4c s? tJng h4p
m*t protein. Chnh v vMy xc 3@nh 3)4c ch>c nDng c&a m*t gen t>c l xc 3@nh 3)4c
protein m gen tJng h4p c c5u trc nh) th: no v c nhiCm vL g trong c thE s9ng.
Sau k:t quB giBi trnh t? b* gen ng)8i, hiCn nay cc nh khoa h#c 3ang c nhiTu chi:n
l)4c 3E c thE nhanh chng pht
hiCn ch>c nDng c&a cc gen trong
b* gen ng)8i. Chng ti xin trnh
by ra 3y ba trong s9 nh\ng chi:n
l)4c 3.
(1) Nh8 k:t quB giBi trnh t?
b* gen ng)8i, cc nh khoa h#c sP
nhanh chng xc 3@nh cc trnh t?
mang gen. V<i cc kY thuMt sinh
h#c phn t( hiCn 32i nh) kY thuMt
PCR, cc nh khoa h#c sP dU dng
nhn bBn cc gen ny trong 9ng
nghiCm rIi dng ha chng vo cc
vect 3E sau 3 nh8 cc hC t: bo
biEu hiCn 3E biEu hiCn cc protein.
Vc nDng g? XE bi:t 3)4c ch>c nDng c&a
protein trong th) viCn, cc nh khoa h#c sP th( nghiCm cc protein ny hC th9ng cc
lo2i nui c5y t: bo 3E tm hiEu m9i giao ti:p gi\a protein th( nghiCm v<i t: bo 3ch,

Dng PCR #A t4ng
hJp cc gen

Clone vo cc
vector
I<a vo cc
h= thMng t2
bo biAu hi=n

LLp th< vi=n
protein

ThV nghi=m trn cc
loi t2 bo #ch

Hnh 46: Chi2n l<Jc to th< vi=n protein #A # tm chSc nWng
c9a gen, tm t7t l t> gen t4ng hJp cc protein, trX
trong th< vi=n protein, rGi thV trn cc h= thMng t2 bo
#ch #A pht hi=n chSc nWng c9a protein, t> # bi2t
#<Jc chSng nWng c9a gen.

93
nh8 3 xc 3@nh t: bo 3ch no c phBn >ng vc nDng protein 3E bi:t 3)4c ch>c nDng c&a gen. (hnh 46).
(2) GiBi trnh t? b* gen c&a 3*ng vMt h\u nhV
nh) d nhn (r5t gi9ng b* gen ng)8i) hay chu*t,
3y l nh\ng b* gen c&a cc 3*ng vMt c nhiTu
t)ng 3Ing vc nDng
c&a gen thng qua s? thay 3Ji hoKc biEu hiCn c&a
m*t tnh tr2ng no 3 c&a 3*ng vMt th nghiCm m*t
khi cc nh nghin c>u dng cc kY thuMt sinh h#c
phn t( gy 3*t bi:n hay lm knock-out ngay trn nh\ng vng mang gen c&a b* gen.
M*t khi 3 xc 3@nh 3)4c gen v ch>c nDng c&a m*t gen trn 3*ng vMt th nghiCm, cc
nh nghin c>u sP dU dng truy tGm v pht hiCn gen v ch>c nDng c&a gen ny trn b*
gen ng)8i nh8 pht hiCn s? t)ng 3Ing vT trnh t? trong gen ng)8i vc nDng l nh8 hnh dng c&a n vc nDng c&a protein ny n:u ch)a bi:t 3)4c cc
hnh dng c&a n. Chnh v vMy m ViCn Qu9c Gia Khoa H#c Y Khoa TJng Qut t2i
Hoa K[ 3ang chi m*t khoBng 20 triCu 3 la 3E thnh lMp cc trung tm Proteomics, l
cc trung tm chuyn nghin c>u v l)u tr\ cc c5u trc v hnh dng 3)4c vi tnh ha
(hnh 47) c&a cc protein c trong thin nhin. Cc viCn Proteomics nh) vMy cVng
3ang v sP thnh lMp t2i cc n)<c khc. Cc nh khoa h#c hy v#ng rHng trong vng 10
nDm t<i 3y, cc viCn proteomics sP l)u tr\ 3)4c hnh dng c&a gGn 10.000 protein c
trong thin nhin. Con s9 ny d hy cn r5t nhR so vc bao gIm t5t cB hnh d2ng c&a t5t cB cc protein c lin quan 3:n sinh
h#c v y h#c, v cc protein khc khng c trong danh sch cVng chN l cc bi:n thE hay

Hnh 47: Hnh dng c9a phn tV khng thA
#<Jc vi tnh ha

94
cc 3Ing d2ng vu ch.c ch.n sP dU dng
hn trong xc 3@nh cc ch>c nDng c&a gen.
4. Vi3t Nam c th4 tham gia vo cu,c +ua ny khng?
HiCn nay cc nh khoa h#c 3ang c9 g.ng nghin c>u khai ph cc b mMt trong
cu9n sch 38i s9ng ghi chp 3Gy 3& trnh t? b* gen ng)8i vng dLng cch m2ng trong sinh h#c, y h#c, cVng nh) cc l^nh v?c khoa h#c khc
v sP 3)a 3:n nhiTu ti:n b* m<i cho loi ng)8i trong k_ nguyn m<i ny. Cc nh y-
sinh h#c c&a chng ta hon ton c thE tham gia trong cu*c 3ua ny, v theo chng ti
th sinh h#c phn t( 39i v<i cc qu9c gia thu nhMp th5p c thE coi nh) l m*t ngnh
khoa h#c ti7u th8 cng nghi)p hi)n 9:i. Ti7u th8 cng nghi)p v khng nh5t thi:t
phBi c cc my mc c?c k[ hiCn 32i v t9n km m vSn c thE th?c hiCn 3)4c cc kY
thuMt bHng cc thi:t b@ khng qu 3.t tiTn. Hi)n 9:i v nh nghin c>u th?c hiCn kY
thuMt d?a trn cc ki:n th>c hiCn 32i vc hiCn 32i c&a nhn lo2i. V5n 3T chnh l chng ta phBi c chuWn
b@ nh) th: no v phBi c chi:n l)4c tham gia vo cu*c 3ua nh) th: no.
XE chuWn b@, quan tr#ng nh5t l chng ta phBi c9 g.ng xy d?ng v 3o t2o trong
cVng nh) ngoi n)<c 3*i ngV cc nh nghin c>u y sinh h#c c trnh 3* v bBn l^nh
ngang tGm vu c&a chng ta khng chN phBi c ki:n th>c
v kY nDng vT chuyn mn sinh-y h#c m cn phBi c khB nDng ti:p cMn 3E khai thc
3)4c kho tng ki:n th>c cVng nh) cc d\ liCu ngy cng cMp nhMt trn m2ng internet.
Ngoi ra, chng ta phBi trnh tnh tr2ng 3o t2o cc nh nghin c>u nh)ng l2i khng
chuWn b@ cho h# cc 3iTu kiCn cVng nh) ph)ng tiCn lm viCc. Chnh v s? thi:u th9n
3iTu kiCn cVng nh) ph)ng tiCn lm viCc m cc nh nghin c>u c&a chng ta d c
trnh 3* v bBn l^nh 3:n 3u cVng sP thui ch*t dGn nhiCt huy:t cVng nh) khB nDng theo
th8i gian, v dGn dGn tnh tr2ng chBy mu ch5t xm trong cVng nh) ngoi n)<c sP
khng thE trnh khRi.
VT chi:n l)4c, th c lP chng ta cVng c9 g.ng tham gia cu*c 3ua vu c ch: ! m>c 3* sinh h#c phn t( tc 3*ng c&a cc d)4c liCu trong n)<c bHng cch
xy d?ng cc m hnh th nghiCm ex-vivo trn cc c5y t: bo 3E pht hiCn s? cBm >ng

95
biEu hiCn gen khi cho cc hC th9ng nui c5y t: bo ny ti:p cMn vc 3* sinh h#c phn t(, ch.c
ch.n chng ta sP khai thc 3)4c cc nguIn d)4c liCu qu m chng ta v9n c sen trong
n)<c. Ngoi ra, dn t*c ViCt c&a chng ta l m*t dn t*c kh thuGn nh5t, bn c2nh 3
chng ta cVng c nh\ng dn t*c t ng)8i s9ng r5t tMp trung v ch)a hT b@ lai tr*n, 3y
chnh l c s! cho cc nghin c>u vT s? phn b9 cc gen cVng nh) cc m di truyTn
cho cc nghin c>u >ng dLng sau ny 3E pht hiCn, ch\a tr@ hoKc phng ng6a cc bCnh
l di truyTn.
Nhn lo2i 3ang b)<c vo thin nin k_ 21 v<i hnh trang mang theo l cc ti:n b*
v)4t bMc ! nhiTu l^nh v?c khoa h#c khc nhau, trong 3 c khoa h#c Y h#c v Sinh
h#c. M*t hnh trang cGn y:u nh5t cho m*t cu*c s9ng dU dng hn v t9t 3ap hn l
cu9n sch c&a 38i s9ng v<i hGu nh) ton b* trnh t? c&a b* gen ng)8i m cc nh khoa
h#c m<i v6a k@p hon t5t. ViCc khai thc cu9n cWm nang sinh h#c cGn y:u nh5t ny c&a
nhn lo2i 3i hRi m*t s? h4p tc 3a ngnh cVng nh) chuyn ngnh. Chnh v vMy nn
chng ti cho rHng chng ta cVng khng thE bR qua y:u t9 h4p tc v h#c hRi: chng ta
phBi h4p tc v h#c hRi t6 b2n b qu9c t:, v quan tr#ng nh5t l phBi bi:t h#c hRi v
bi:t h4p tc gi\a chng ta vng dLng kh
thnh cng kY thuMt giBi trnh t? vo cc d@ch vL chWn 3on v nghin c>u. D)t PCR v gi%i trnh t( +4 +?nh danh vi khuAn
Nh8 pht hiCn 3)4c m*t cKp mIi m sau 3 3)4c 3Kt tn l
NK
16s-F v
NK
16s-R
khu:ch 32i 3)4c 3o2n DNA di 527 bps ch>a cc trnh t? gip phn biCt gi9ng v loi
cc vi khuWn, phng th nghiCm NK-Biotek v 3n v@ R&D c&a cng ty Nam Khoa 3
xy d?ng thnh cng qui trnh PCR cho gene 16s rDNA v qui trnh giBi trnh t? tr?c
ti:p sBn phWm PCR ny 3E 3@nh danh vi khuWn. Thnh cng ny 3 gip phng th
nghiCm NK-Biotek v 3n v@ R&D c&a Nam Khoa th?c hiCn 3)4c kh nhiTu >ng dLng
trong cc xt nghiCm d@ch vL v nghin c>u.

96
a. fng dLng trong xt nghiCm vi sinh lm sng 3@nh danh vi khuWn k@ kh
Vi khuWn k@ kh l cc vi khuWn chN c thE tDng tr)!ng trong 3iTu kiCn kh tr)8ng
khng c oxygene phn t( (O
2
). Vi khuWn k@ kh c thE l cc vi khuWn c l4i 3)4c s(
dLng trong cng nghC vi sinh, tuy nhin vT mKt y h#c r5t c nhiTu loi vi khuWn k@ kh
l cc tc nhn nhiUm khuWn n*i sinh hay ngo2i sinh. BCnh l nhiUm khuWn k@ kh r5t 3a
d2ng, t6 cc nhiUm khuWn t2i ch, k:t h4p v<i cc vi khuWn khng k@ kh, hay cc nhiUm
khuWn hC th9ng, hay cc nhiUm khuWn 3Kc hiCu. Do 3a d2ng nh) vMy nn viCc xc 3@nh
m*t nhiUm khuWn k@ kh vT mKt lm sng khng phBi dU dng. Trong khi 3 xt nghiCm
vi sinh lm sng t2i cc phng th nghiCm th)8ng bR h]n xt nghiCm vi khuWn k@ kh v
gKp phBi nhiTu tr! ng2i vT kY thuMt nh) l: (1) C 3)4c ph)ng tiCn chuyn ch! bCnh
phWm sao cho gi\ 3)4c bCnh phWm lun ! 3iTu kiCn k@ kh cho 3:n khi 3:n 3)4c phng
th nghiCm. (2) T2o kh tr)8ng k@ kh 3E nui c5y phn lMp 3)4c vi khuWn k@ kh t6 cc
bCnh phWm. (3) X@nh danh cho 3)4c vi khuWn k@ kh. (4) Lm 3)4c khng sinh 3I vi
khuWn k@ kh.
Trong cc tr! ng2i trn, tr! ng2i kh giBi quy:t nh5t l v5n 3T 3@nh danh vi khuWn
k@ kh phn lMp 3)4c t6 cc bCnh phWm. C nhiTu b* th( nghiCm nh) API 20A c&a Bio-
Merieux, RapID
TM
ANA II c&a Oxoid, PRAS II (Scott), AN Ident (Analytab), ANA
card (Vitek)...c sen trn th@ tr)8ng 3E cho cc phng th nghiCm chuyn dng cho 3@nh
danh vi khuWn k@ kh. Tuy nhin cc b* th( nghiCm ny kh c sen t2i ViCt Nam v nhu
cGu khng nhiTu. Hn n\a cc b* th( nghiCm ny cVng c nhiEu h2n ch: nh) t_ lC 3@nh
danh sai kh cao (19% 39i v<i API 20A, 10% 39i v<i RapID
TM
ANA II), t_ lC khng
thE 3@nh danh 3:n loi cVng nhiTu (38% 39i v<i RapID
TM
ANA II, 29% 39i v<i API
20A).
Chnh v vMy nn 3E c thE th?c hiCn 3)4c xt nghiCm vi sinh lm sng vi khuWn
k@ kh, phng th nghiCm NK-Biotek v 3n v@ R&D c&a cng ty Nam Khoa 3 triEn
khai m*t giBi php ton diCn, bao gIm ch: t2o 3)4c mi tr)8ng chuyn ch! CaryBac
c thE gi\ bCnh phWm ! 3iEu kiCn k@ kh trong th8i gian 24 gi8 hn cB th8i gian cGn
thi:t 3E chuyEn mSu t6 lm sng 3:n phng th nghiCm, s( dLng Jn 3@nh ph)ng tiCn
t2o kh tr)8ng k@ kh bHng cc ti Anaerocult A c&a Merck, th?c hiCn 3)4c khng sinh
3I vi khuWn k@ kh bHng b* th( nghiCm khng sinh 3I k@ kh do 3n v@ R&D nghin
c>u v thi:t k: ra. Trong 3@nh danh vi khuWn k@ kh, phng th nghiCm NK-Biotek v

97
3n v@ R&D c&a cng ty Nam Khoa 3 3)a ra m*t ti:p cMn hon ton ma trnh t? 3Kc hiCu
gi9ng v loi nHm trong gene 16S c&a vi khuWn.
C thE tm t.t qui trnh nh) sau: Vi khuWn m#c trn h*p th2ch phn lMp 3)4c gKt
vo n)<c mu9i sinh l v khuWn 3E 32t 3* 3Lc 0.5 1 McF. Sau 3 3un cch th&y si
trong 10 pht. XE ngu*i rIi ly tm 13.000RPM trong 5. L5y 5ml d@ch nJi cho vo PCR
mix 45ml ch>a sen cc thnh phGn kE cB cKp mIi
NK
16s-F v
NK
16s-R khu:ch 32i 3o2n
DNA di 527 bps ch>a trnh t? 3Kc hiCu loi trn gene 16S c&a vi khuWn. Ch2y ch)ng
trnh nhiCt PCR gIm 1 chu k[ 95
o
C/5 3E kch ho2t enzyme hot start Taq polymerase,
rIi 40 chu k[ 94
o
C/15-60
o
C/30-72
o
C/1. SBn phWm PCR sau 3 3)4c tinh s2ch bHng
b* Wizard SV Gel and PCR clean-up Sytem c&a Promega. SBn phWm tinh s2ch 3)4c
3iCn di trn th2ch v sau 3 3@nh l)4ng bHng quang phJ GenQuant c&a Pharmacia, sau
3 3)4c 3)a vo phBn >ng giBi trnh t? 2 chiTu s( dLng mIi xui v mIi ng)4c c&a
PCR th?c hiCn trn b* thu9c th( DTCS cycle sequencing kit c&a Beckman Coulter.
Ch)ng trnh lun nhiCt c&a phBn >ng giBi trnh t? vng giBi trnh t? 3)4c t&a bHng
ethanol, rIi sau 3 3)4c ch2y 3iCn di giBi trnh t? trn my giBi trnh t? CEQ8000. K:t
quB giBi trnh t? 3)4c so chu,i bHng ch)ng trnh blast search trn ngn hng d\ liCu
gene c&a NCBI. T6 k:t quB so chu,i, chng ta sP c 3)4c k:t quB 3@nh danh vi khuWn.
Sau ny, vng giBi trnh t? v 3iCn di
giBi trnh t? cVng 3 3)4c nghin c>u 3E t)ng thch vng giBi trnh t? th dng BigDye Terminator V. 3.1 Cycle Sequencing kit
c&a ABI vng giBi trnh t? l tr)<c h:t 1 chu k[
96
o
C/1, theo sau 25 chu k[ 96
o
C/10-50
o
C/5-60
o
C/4. SBn phWm c&a phBn >ng giBi
trnh t? sau khi t&a bHng ethanol, 3)4c ch2y 3iCn di giBi trnh t? trn my giBi trnh t?
ABI 3130XL v<i gel POP 7 v mao quBn 50cm. Hnh 48 l m*t k:t quB 3@nh danh
bHng giBi trnh t? 16s rDNA vi khuWn k@ kh phn lMp t6 mSu m& xoang c&a bCnh nhn.
Phng th nghiCm NK biotek 3 p dLng ti:p cMn ny trong nDm 2008 cho xt nghiCm

98
Hnh 48: K2t quH giHi trnh t; 16s rDNA tr;c khuYn Gram [+] phn lLp k. kh t> b=nh phYm mZ xoang l*y t> b=nh
nhn cho php k2t luLn #y l Propionibacterium acnes
vi sinh lm sng vi khuWn k@ kh v<i cc mSu bCnh phWm l 39 mSu m& xoang l5y t6
bCnh nhn b@ vim xoang m2n tnh. K:t quB xt nghiCm cho th5y c 31% (18/59) c5y ra
tc nhn vi khuWn k@ kh v k:t quB 3@nh danh bHng ph)ng php giBi trnh t? 16s
rDNA cho th5y c 11% (2/18) Veillonella (cGu khuWn Gram -), 17% (3/18) Prevotella
buccae (tr?c khuWn Gram -), 22% (4/18) l Propionibacterium acnes, 6% (1/18) l
Streptococcus aginosus, 17% (3/18) l Streptococcus constellatus, 17% (3/18) l
Streptococcus gordonii, 6% (1/18) l Peptostreptococcus micros, v 6% (1/18) l
Peptostreptococcus stomatis. K:t quB ny cho th5y PCR v giBi trnh t? 16s rDNA l
m*t giBi php kY thuMt hon ton c thE s( dLng 3E 3@nh danh vi khuWn k@ kh, giBi
quy:t 3)4c khu kY thuMt ph>c t2p v kh khDn nh5t trong qui trnh xt nghiCm vi sinh
lm sng vi khuWn k@ kh.

b. Pht hiCn ch5t l)4ng cc sBn phWm probiotic cho ng)8i v cho th&y sBn
Probiotic chnh l cc vi sinh vMt khng gy bCnh, 3)4c dng lm sBn phWm tr4
sinh qua 3)8ng Dn hay u9ng s( dLng trn ng)8i, gia sc, hay th&y sBn 3E pht huy hiCu
quB ch9ng l2i cc nhiUm trng nh8 cc c ch: nh) c2nh tranh ch5t dinh d)hng v chJ

99
bm c&a vi sinh vMt gy bCnh, phLc hIi vi khuWn ch bnh th)8ng cho ru*t hay cho mi
tr)8ng, kch thch hC th9ng miUn d@ch khng 3Kc hiCu c&a c thE vMt ch& ch9ng l2i vi
sinh vMt gy bCnh, hay ti:t ra cc ch5t c tnh khng sinh khng 3)4c cc vi sinh vMt
gy bCnh.
Cc vi khuWn th)8ng 3)4c dng lm probiotic l Bacillus subtilis, Lactobacillus
acidophilus, Bifidobacterium...v th)8ng 3)4c cung c5p d)<i d2ng b*t ghi hm l)4ng
v cc lo2i vi khuWn c trong sBn phWm. Do cc vi khuWn ny th)8ng l cc vi khuWn dU
m#c nn chN v<i cc ph)ng tiCn phng th nghiCm v cc mi tr)8ng nui c5y thng
th)8ng l c thE sBn xu5t 3)4c cc sBn phWm probiotic nn hiCn nay trn th@ tr)8ng c&a
chng ta xu5t hiCn kh nhiTu sBn phWm probiotic 3)4c sBn xu5t t6 r5t nhiTu c s! trong
v ngoi n)<c 3E s( dLng khng chN cho gia sc, th&y sBn m cB cho ng)8i. Chnh v
tnh tr2ng ny nn c m*t v5n 3T m nhiTu ng)8i r5t quan tm, 3 l liCu ch5t l)4ng
c&a cc sBn phWm probiotic hiCn 3ang c mKt trong th@ tr)8ng c thMt s? 3ng nh) nh
sBn xu5t cng b9 hay khng, 3Kc biCt l liCu cc vi khuWn 3)4c ghi trong nhn hiCu sBn
phWm c 3ng l vi khuWn c trong sBn phWm hay khng, v hm l)4ng c 3Bm bBo
3ng nh) vMy hay khng.
XE trB l8i cu hRi trn, trong nDm 2008 phng th nghiCm NK-Biotek v b* phMn
R&D c&a Nam Khoa 3 h)<ng dSn m*t s9 3T ti t9t nghiCp luMn vDn Th2c S^ c n*i
dung tm hiEu ch5t l)4ng cc sBn phWm probiotic dng cho ng)8i v th&y sBn hiCn
3ang l)u thng trn th@ tr)8ng. XE kiEm tra hm l)4ng th giBi php kY thuMt khng
kh, chN cGn th?c hiCn c5y 3@nh l)4ng bHng ph)ng php th2ch 3J hay ph)ng php
lng trn bT mKt mi tr)8ng dinh d)hng v & ! 3iTu kiCn thch h4p l c thE cho 3)4c
k:t quB 3@nh l)4ng chnh xc hm l)4ng vi khuWn 3ch c trong mSu sBn phWm cGn
phBi kiEm tra. Tuy nhin 3E xc 3@nh chnh xc tn vi khuWn c trong sBn phWm c
3ng nh) tn 3)4c nu trong nhn sBn phWm hay khng l2i l m*t v5n 3T khng 3n
giBn v cc vi khuWn probiotic nh) B. subtilis, L. acidophilus...khng phBi l cc vi
khuWn dU dng 3)4c 3@nh danh 3:n loi n:u chN d?a vo cc tnh ch5t sinh vMt ha h#c.
Chnh v vMy, chng ti 3 giBi php PCR v giBi trnh t? gene 16s rDNA c&a vi khuWn
phn lMp 3)4c t6 cc sBn phWm probiotic 3E xc 3@nh danh tnh c&a vi khuWn. K:t quB
cho th5y c kh nhiTu lo2i sBn phWm probiotic s( dLng cho ng)8i v cho th&y sBn c
v5n 3T vT mKt ch5t l)4ng cB vT hm l)4ng lSn vT vi khuWn thMt s? c trong sBn phWm.

100
B%ng 13 v 14 trnh by k:t quB cho th5y s? khc biCt gi\a vi khuWn thMt s? c trong
sBn phWm probiotic so v<i k:t quB 3)4c nh sBn xu5t cng b9 trn nhn.

STT Tn s1n phDm Tn vi khuDn trn nhn s1n phDm KEt qu1 PCR v gi1i trnh t/ 16sDNA
1 Biosubtyl DL Bacillus subtilis 10
7
/gr Bacillus subtilis 10
6
/gr
2 Bidisubtilis (gi gi*y) Bacillus subtilis 10
8
/gr Bacillus cereus 10
7
/gr
3 Bidisubtilis (gi nhm) Bacillus subtilis 10
8
6
/gr
4 Bio Acimin Bacillus subtilis 10
8
7
/gr
5 Biosubtyl II (gi) Bacillus subtilis 10
7
/gr Bacillus pumilus 10
7
/gr
6 Biosubtyl II (vin) Bacillus subtilis 10
8
8
/gr
7 Subtyl Bacillus subtilis 10
7
7
/gr
8 Medilac Vita Bacillus subtilis 10
6
6
/gr
9 Bio Baby Bacillus subtilis 10
6
6
/gr
10 Bio Vita Bacillus subtilis 10
6
6
/gr

Bng 13: K2t quH #.nh danh bRng k[ thuLt PCR v giHi trnh t; 16s rDNA v k2t quH #.nh l<Jng cc vi khuYn
thLt s; c trong cc probiotic sV d\ng trn ng<Ki
STT Tn s1n phDm Tn v l0;ng* vi khuDn
trn nhn s1n phDm
KEt qu1 #(nh danh
v #(nh l0;ng* th/c tE
1 DT-LACTO Bacillus subtilis
Lactobacillus acidophilus
Bacillus pumilus
Khng tm th*yL. acidophilus
2 Bio-DW Bacillus subtilis 10
9
/gr
Bacillus subtilis 10
6
/gr
3 Probiotex-one Bacillus subtilis B. megaterium
4 Vime-Subtyl Bacillus subtilis 10
11
4
/gr
5 Biozyme for fish Bacillus subtilis 10
9
6
/gr
6 Novazyme F Bacillus subtilis 10
9
5
/gr
7 Subtyl-LA Bacillus subtilis Bacillus pumilus
8 NPV-Prozyme 90 Bacillus subtilis 10
6
/gr
Bacillus subtilis
Khng tm th*yL. acidophilus 10
6
/gr
9 ProKura Bacillus subtilis 10
9
7
/gr
10 Men g*u vng Bacillus subtilis
Bacillus cereus
11 Biobac Bacillus subtilis Bacillus pumilus
12 Pond clear Bacillus subtilis 10
11
/gr
5
/gr
13 Bio Pond Bacillus subtilis 10
8
/gr
5
/gr
14 Men Bac Bacillus subtilis
Bacillus cereus
15 Microzyme Bacillus subtilis ?
5
/gr
16 Zymmix Lactobacillus acidophilus Acidovorax sp.
17 Lactovet Lactobacillus acidophilus Clostridium phylofermentant
18 Zeofarm Lactobacillus acidophilus 10
9
/gr L. acidophilus 10
6
/gr
*ChN nu ln l<Jng cc vi khuYn m #.nh danh bRng PCR v giHi trnh t; cho th*y k2t quH khng sai l=ch

Bng 14: K2t quH #.nh danh bRng k[ thuLt PCR v giHi trnh t; 16s rDNA v k2t quH #.nh l<Jng* cc vi khuYn
thLt s; c trong cc probiotic sV d\ng cho th9y sHn

101
Phn tch cc d\ kiCn trnh by trong hai bBng trn, chng ta th5y 39i v<i cc sBn
phWm probiotic dng cho ng)8i, s? sai biCt vT hm l)4ng gi\a k:t quB kiEm tra so v<i
cng b9 trn nhn khng nhiTu (khng qu 10 lGn), nh)ng c 3:n 50% tn vi khuWn
cng b9 khng 3ng va cc toxin, lm vi khuWn tr4 sinh. X9i va L. acidophilus cn hGu h:t l khng tm th5y vi khuWn ny nh) cng
b9 trn nhn. Hnh 49 minh h#a m*t k:t quB giBi trnh t? gene 16s rDNA xc 3@nh vi
khuWn l B. cereus trong khi nhn sBn phWm l2i l B. subtilis. Cn vT mKt hm l)4ng th
thMt thBm h2i, trong cc cc sBn phWm 3)4c kiEm tra thMt s? c vi khuWn nh) cng b9
th 3a s9 hm l)4ng tLt giBm t6 10
4
3:n 10
5
so vu l
m*t ti:ng chung bo 3*ng 3E cc nh sBn xu5t cVng nh) cc c quan kiEm tra ch5t
Hnh 49: M%t ch9ng vi khuYn phn lLp t> m%t sHn phYm probiotic n2u chi d;a vo tnh ch*t khuYn lc v nhu%m
Gram th khng thA bi2t #y khng phHi l B. subtilis, nh<ng khi giHi trnh t; 16s rDNA th xc #.nh #<Jc
#y l B. cereus.

102
l)4ng nn quan tm 3:n v5n 3T ch5t l)4ng c&a cc sBn phWm probiotic s( dLng cho
ng)8i v th&y sBn hiCn 3ang l)u hnh t2i ViCt Nam; v 3E kiEm tra 3)4c ch5t l)4ng
cc sBn phWm probiotic th phBi s( dLng PCR v giBi trnh t? gene 16s rDNA v chN c
giBi php ny m<i c thE 3@nh danh chnh xc vi khuWn 3)4c s( dLng lm probiotic,
trnh nhGm lSn v<i cc vi khuWn khng c tc dLng probiotic hay thMm ch c thE 3*c
h2i.

Hnh 50: M%t phi2u l l.ch 16s rDNA c9a m%t ch9ng vi khuYn dng trong kiAm chuYn v,i cc thng tin v6 tnh ch*t
khuYn lc, hnh Hnh Gram, cc tnh ch*t sinh ha c$ bHn, v quan trDng nh*t l trnh t; gene 16s rDNA

103
c. Xy d?ng l l@ch 16s rDNA c&a cc ch&ng vi khuWn dng trong kiEm chuWn
Trong n*i kiEm hay ngo2i kiEm vi sinh, r5t cGn thi:t phBi dng cc ch&ng vi sinh
c l l@ch 3@nh danh ch&ng chnh xc. Cc phng th nghiCm vi sinh th)8ng yu cGu
cung c5p cc ch&ng qu9c t: v<i l l@ch xu5t pht t6 nh cung c5p ch&ng. HiCn nay r5t
kh 3E c thE 32t mua cc ch&ng g9c qu9c t: v v5n 3T nguy c kh&ng b9 sinh h#c.
Chnh v vMy giBi php hay nh5t hiCn nay l s( dLng cc ch&ng g9c qu9c t: hiCn 3ang
l)u gi\ t2i cc phng th nghiCm, thMm ch s( dLng cc ch&ng g9c phn lMp 3)4c
nh)ng phBi c l l@ch d@nh danh chnh xc 3:n loi. X>ng tr)<c yu cGu ny, phng th
nghiCm NK-Biotek v 3n v@ R&D c&a Nam Khoa 3 xy d?ng l l@ch 16s rDNA c&a
t5t cB cc ch&ng qu9c t: ATCC, cVng nh) m*t s9 ch&ng phn lMp 3)4c v tiu biEu cho
cc gi9ng v lo2i vi khuWn cGn cho kiEm chuWn. Hnh 50 minh h#a m*t l l@ch 16s
rDNA c&a 1 ch&ng vi khuWn 3)4c phng th nghiCm NK-Biotek v 3n vi R&D c&a
Nam Khoa 3E cung c5p dng trong kiEm chuWn.

Hnh 51: M%t k2t quH #.nh danh bRng PCR v giHi trnh t; 16s rDNA c9a m%t ch9ng vi sinh cng nghi=p cho
th*y #y l Acrobacterium tumefaciens, l vi khuYn r*t kh #.nh danh bRng vi sinh kinh #iAn

104
d. Lm xt nghiCm d@ch vL 3@nh danh vi khuWn
CVng v<i cng nghC PCR v giBi trnh t? 16s rDNA c&a vi khuWn, phng th
nghiCm NK-Biotek v 3n v@ R&D c&a Nam Khoa 3 v 3ang th?c hiCn d@ch vL 3@nh
danh cc vi khuWn 3)4c dng trong vi sinh cng nghiCm cVng nh) vi sinh nng nghiCm
3)4c g(i 3:n t6 cc cng ty, nh my, hay t6 cc yu cGu c&a cc 3T ti nghin c>u.
MSu 3)4c g(i 3:n 3E 3@nh danh c thE l cc ch&ng vi khuWn c5y trn mi tr)8ng nui
c5y, hay l cc d@ch tch chi:t DNA, hay huyTn d@ch vi khuWn. C thE ni v<i giBi php
kY thuMt PCR v giBi trnh t? gene 16s rDNA, cc vi khuWn d l2 3:n 3u, d kh 3@nh
danh 3:n 3u cVng 3Tu 3)4c 3@nh danh 3:n loi. Hnh 51 l k:t quB m*t ch&ng vi
khuWn dng trong vi sinh cng nghiCm 3)4c yu cGu 3@nh danh, v k:t quB 3@nh danh
cho th5y 3y l vi khuWn Agrobacterium tumefaciens.
2. 6ng d9ng k; thu>t PCR v gi%i trnh t( +4 +?nh danh vi nBm
Trong cc xt nghiCm vi sinh th 3@nh danh vi n5m c lP l m*t tr! ng2i l<n nh5t v
n:u s( dLng cc ph)ng php kinh 3iEn th khng chN phn tch hnh thi 32i thE v vi
thE, v9n d^ ph>c t2p v cng phu, m cn phBi lm cho 3)4c cc khBo st sinh vMt ha
h#c khc nh) 3Ing ha 3)8ng, phn tch cc ch5t bi:n d)hng...Chnh v vMy thng
th)8ng t c phng th nghiCm vi sinh lm 3)4c xt nghiCm vi n5m.
NhMn diCn 3)4c tr! ng2i kY thuMt chnh y:u ny, phng th nghiCm NK-Biotek v
3n v@ R&D cng ty Nam Khoa 3 c9 g.ng tm giBi php v)4t qua, v sau m*t th8i
gian nghin c>u - th( nghiCm, 3 xy d?ng 3)4c m*t giBi php kY thuMt 3 l s( dLng
PCR v giBi trnh t? gene 28s rDNA. Nguyn t.c c&a giBi php ny l s( dLng b*
NK
FUNGI-DNAPREP do 3n v@ R&D c&a cng ty Nam Khoa ch: t2o 3E tch chi:t
DNA ton phGn t6 mSu vi n5m hay mSu th( ch>a vi n5m cGn 3@nh danh, sau 3 s(
dLng PCR va cc trnh t? 3Kc hiCu gi9ng v loi c&a vi n5m trn
gene 26s rDNA, v sau cng l giBi trnh t? tr?c ti:p v 2 chiTu sBn phWm PCR 3E 3@nh
danh vi n5m qua blast search trn ngn hng d\ liCu gene c&a NCBI.
fng dLng giBi php kY thuMt ny, phng th nghiCm NK-Biotek v 3n v@ R&D
c&a cng ty Nam khoa 3ang th?c hiCn r5t thnh cng hai d@ch vL, 3 l:

105
Candida ort hopsilosis
1(2%)
Malassezia rest rict a
2 (3%)
Rhinocladiella at rovirens
3 (5%)
Penicit rium cit rinum
3 (5%)
Xylaria curt a
1(2%)
Schizophyllum cominune
1(2%)
Pichia guilliermondii
1(2%)
Pseudallescheria boydi
4 (7%)
Aspergillus f lavus
2 (3%)
Aspergillus oryzae
11(19%)
Aspergillus f umigat us
23 (40%)
Aspergillus niger
4 (7%)
Neosart orya f ischeri
2 (3%)

Bi#u '( 12: T4ng k2t cc k2t quH pht hi=n v #.nh danh n*m bRng k[ thuLt PCR v giHi trnh t; 28s rDNA trong
cc mEu bi n*m l*y t> m4 vim xoang trn b=nh nhn
a. Pht hiCn v 3@nh danh vi n5m trong cc bi n5m l5y ra t6 phSu thuMt bCnh nhn
vim xoang
Tr)<c 3y, cc bCnh phWm bi n5m (fungus ball) th)8ng 3)4c cc bc s^ tai mVi
h#ng g(i 3:n phng th nghiCm giBi phWu bCnh v k:t quB th)8ng 3)4c nhMn vT sau 1
tuGn l nhn th5y vi thE cc s4i t n5m nghi Aspergillus. HiCn nay v<i xt nghiCm PCR
v giBi trnh t? 3)4c th?c hiCn t2i phng th nghiCm NK-biotek th cc nh lm sng sP
c k:t quB sau 2 ngy v<i 3@nh danh vi n5m 3:n loi. Bi4u +C 12 tJng k:t cc k:t quB
pht hiCn v 3@nh danh vi n5m trong cc bi n5m 3)4c bCnh viCn Tai MVi H#ng TP.HI
Ch Minh g(i 3:n trong th8i gian gGn 3y. C tJng c*ng 58 mSu 3)4c g(i 3:n lm xt
nghiCm, v cB 58 3Tu pht hiCn v 3@nh danh 3)4c vi n5m l tc nhn gy bCnh.
b. D@ch vL 3@nh danh vi n5m
Trn c s! c&a kY thuMt PCR v giBi trnh t? gene 28s rDNA, phng th nghiCm
NK-Biotek v 3n v@ R&D c&a cng ty Nam Khoa triEn khai 3)4c xt nghiCm d@ch vL
3@nh danh vi n5m vu. C thE ni l cho 3:n nay, hGu nh) khng c mSu vi n5m no g(i 3:n
phng th nghiCm NK-Biotek l khng c k:t quB 3@nh danh. Hnh 52 v hnh 53 minh
h#a hai k:t quB 3@nh danh n5m trong xt nghiCm d@ch vL 3@nh danh vi n5m c&a NK-
Biotek.

106

3. 6ng d9ng PCR v gi%i trnh t( +4 pht hi3n, +?nh lDng v xc +?nh genotype
HCV
Pht hiCn, 3@nh l)4ng v xc 3@nh genotype HCV l cc thng s9 m bc s^ cGn
phBi bi:t tr)<c khi cho chN 3@nh 3iTu tr@ 3Kc hiCu bHng interferon ph9i h4p v<i ribavirin
l pht 3I 3iTu tr@ chuWn cho bCnh nhn c antiHCV [+]. Pht hiCn HCV-RNA 3E xc
3@nh l bCnh nhn 3ang nhiUm HCV, 3@nh l)4ng HCV-RNA l 3E xc 3@nh l)4ng virus
tr)<c khi b.t 3Gu 3iTu tr@ v lm c s! 3E theo di hiCu quB 3iTu tr@, cn xc 3@nh
genotype HCV l 3E gip bc s^ 3iTu tr@ quy:t 3@nh 3)4c th8i gian 3iTu tr@ cho bCnh
nhn. Thng th)8ng cc phng th nghiCm lm sng sP phBi th?c hiCn cc yu cGu ny
ring lP, nghâ l h# phBi pht hiCn HCV-RNA tr)<c, rIi m trnh t; ny k2t quH blast search trn ngn hng gene NCBI cho k2t
quH #.nh danh Candida tropicalis v,i #% t<$ng #Gng 99%.
Hnh 53: Vi n*m c hnh dng vi thA hnh que di nh< gc trn tri cho k2t quH PCR v giHi trnh t; 28s
rDNA nh< bn d<,i, v t> trnh t; ny k2t quH blast search trn ngn hng gene NCBI cho k2t
quH #.nh danh Rhinocladiella atrovirens v,i #% t<$ng #Gng 99%.

107
m<i 3@nh genotype HCV v th)8ng th
do yu cGu kY thuMt nn cc xt
nghiCm ny 3Tu phBi b.t 3Gu t6 mSu
huy:t thanh c&a bCnh nhn. Cng ty
Nam Khoa l2i s( dLng m*t ti:p cMn
khc r5t m<i mP, tiCn l4i, v t t9n km
hn 3E pht triEn m*t giBi php ton
diCn th?c hiCn 3)4c cc yu cGu ny
c&a bc s^ cng m*t lc. X l giBi
php s( dLng RT real-time PCR 3E
pht hiCn v 3@nh l)4ng HCV-RNA
trong mSu huy:t thanh bCnh nhn v
sau 3 giBi trnh t? tr?c ti:p sBn phWm
real-time PCR 3E xc 3@nh genotype
HCV bHng cch so chu,i trnh t? giBi
3)4c v<i ngn hng d\ liCu genotype
HCV trn th) viCn NCBI v th) viCn
Los Alamos.
XE xc 3@nh genotype HCV, ngoi
l do l m*t m.t xch c&a giBi php
ton diCn nh) 3 nu ! trn, cng ty
Nam Khoa ch#n ti:p cMn giBi trnh t?
v cn c nhiTu l do: (1) N:u s( dLng
kit InoLIPA c&a Siemen (Bayer) l kit
3)4c cc nh y h#c th6a nhMn th sP l
m*t l?a ch#n kh tn km v gi thnh
c&a kit ny kh cao, k:t quB c 3i khi
khng phn bi$t '()c subtype, v v<i
version cV th c s+ nh,m l.n gi0a 6a v 1b; (2) N:u s( dLng kY thuMt giBi trnh t?
vng 5NC c&a HCV bHng hC th9ng giBi trnh t? kn Trugene c&a Siemen (Bayer) d
r5t 3)4c nhiTu nh y h#c th6a nhMn, nh)ng cVng sP l m2t l+a ch3n tn km v gi

Yu c%u xc #(nh
genotype HCV
F(nh l0;ng HCV-RNA
bHng xt nghi,m
RT-qPCR sC dIng kit
NK
RT-HCVqPCR
Xc #(nh genotype HCV: gi1i trnh t/ tr/c tiEp s1n
phDm HCVqPCR (#200bp trn vng 5NC)
ABI 3130XL
(16 capillaries)
CEQ8000
(8 capillaries)

KJT QUM
24 gi@ sau khi nhOn mPu
F(nh l0;ng 37.017 copies/ml
Ki9u gene 1c
Hnh 54: Qui trnh RT-realtime PCR v giHi trnh t; vng
5NC #A pht hi=n, #.nh l<Jng v #.nh genotype
HCV

108
Bi#u '( 13: Phn bM cc genotype HCV trong 2000 mEu
huy2t thanh b=nh nhn nhiTm HCV #<Jc gVi
#2n xt nghi=m ti phng th nghi=m NK-Biotek
trong nWm 2008
thnh c&a cc vMt liCu tiu hao 3i km theo hC th9ng ny r5t cao; (3) S( dLng ph)ng
php real-time PCR v<i cc probe 3Kc hiCu l m*t ti:p cMn 3n giBn v r` tiTn nh)ng
khng '4 nh7y c8m cho ch9n 'on v vng khu:ch 32i khng phBi l vng 5 NC (l
vng 3)4c cng nhMn l nh2y cBm nh5t cho chWn 3on), khng c kh8 n;ng phn bi$t
cao cc subtype th)8ng gKp v kh thi:t k: 3)4c cc probe 3Kc hiCu 3:n subtype, v
nguy c pht hiCn cho khng 3Kc hiCu m vSn 3)4c l,m t(=ng l c kh8 n;ng pht
hi$n '>ng nhi?m.
Chnh v cc l do trn, Phng th NghiCm Y Khoa NK-BIOTEK v cng ty Nam
Khoa 3 nghin c>u v xy d?ng 3)4c ph)ng php xt nghiCm xc 3@nh genotype
HCV bHng kY thuMt giBi trnh t? vng 5NC c&a HCV nh)ng thay v s( dLng hC th9ng
giBi trnh t? kn c&a Trugene, s( dLng hC th9ng giBi trnh t? m! c&a ABI (my ABI
3130XL c 16 mao qu8n) hay c&a Beckman Coulter (my CEQ8000 c 8 mao qu8n).
Ti:p cMn ny 3 mang 3:n cho bCnh nhn v cc nh lm sng nhiTu l4i 3iEm: (1) Nh8
giBi trnh t? tr?c ti:p 3)4c sBn phWm PCR t6 real-time PCR s( dLng mIi v taqman
probe 3Kc hiCu vng 5NC nn k:t quB xt nghiCm xc '@nh genotype lun 'i km vBi
kDt qu8 '@nh l()ng HCV-RNA. Do vMy cc nh lm sng tr)<c khi quy:t 3@nh 3iTu tr@
3Kc hiCu cho bCnh nhn chN cGn cho m*t chN 3@nh xt nghiCm xc 3@nh genotype HCV
l 3& m khng cGn cho thm xt nghiCm 3@nh l)4ng. (2) X2t 3)4c 3* nh2y cho chWn
3on nh8 sBn phWm 3ch 3E giBi
trnh t? xc 3@nh genotype HCV
chnh l sBn phWm PCR d?a trn
vng 'ch 5NC l vng duy nh5t
trn genome HCV 3)4c th6a
nhMn l 3& nh2y cBm 3E lm chWn
3on xc 3@nh v 3@nh l)4ng
HCV. (3) X2t 3)4c 3* chnh xc
trong xc 3@nh genotype HCV
khng khc biCt vu cn 3)4c cung c5p thng tin vT trnh

109
t? vng 5NC 3 giBi 3)4c v cc thng tin ny r5t qu gi trong cc nghin c>u vT
phylogenetic 3E gp phGn trong nghin c>u nguIn g9c nhiUm trng hay nghin c>u
3Ing nhiUm HIV/HCV.
Hnh 54 tm t.t qui trnh pht hiCn, 3@nh l)4ng v 3@nh genotype HCV bHng kY
thuMt RT real-time PCR trn 3ch l vng 5 NC c&a b* gene HCV rIi sau 3 giBi trnh
t? tr?c ti:p sBn phWm PCR 3E xc 3@nh genotype HCV. Trong nDm 2008, tJng k:t 2000
mSu xt nghiCm 3@nh genotype HCV th?c hiCn t2i phng th nghiCm NK-Biotek, chng
ti nhMn th5y 3a s9 genotype c&a HCV nhiUm trn bCnh nhn l 1b (58%), k: 3 l 6a
(17%). Bi4u +C 13 tJng k:t s? phn b9 cc genotype HCV trong 2000 mSu huy:t thanh
bCnh nhn nhiUm HCV 3)4c g(i 3:n xt nghiCm t2i phng th nghiCm NK-Biotek
trong nDm 2008.
4. p d9ng PCR v gi%i trnh t( +4 pht hi3n +,t bi.n khng thuEc cFa HBV
HiCn nay t2i ViCt Nam, nh8 cc ti:n b* vT kY thuMt sinh h#c phn t( 3@nh l)4ng
3)4c HBV 3E lm c s! 3nh gi hiCu quB 3iTu tr@; v pht 3I cVng nh) cc thu9c c
khB nDng 3iTu tr@ bCnh vim gan virus B m2n tnh lun c sen trn th@ tr)8ng 3E bc s^
dU dng l?a ch#n, nn viCc 3iTu tr@ 3Kc hiCu cho bCnh nhn vim gan virus B m2n tnh
3 phJ bi:n hn. Tuy nhin, 3iTu tr@ 3Kc hiCu bCnh l vim gan virus B m2n tnh bHng
cc thu9c khng virus l m*t 3iTu tr@ lu di. Chnh v vMy nn HBV (virus vim gan B,
hepatitis B virus) c c h*i ti:p xc lu di v<i cc thu9c khng virus v t2o 3)4c cc
3*t bi:n khng thu9c, v t6 35y nBy sinh ra yu cGu phBi c xt nghiCm pht hiCn cc
3*t bi:n khng thu9c c&a HBV, 3Kc biCt 39i v<i cc thu9c nh) lamivudine, adefovir v
entecavir l cc thu9c th)8ng 3)4c s( dLng hiCn nay.
XE pht hiCn 3Gy 3& cc 3*t bi:n khng cc thu9c nu trn, n:u ch#n ti:p cMn real-
time PCR hay PCR-RFLP th chN c thE pht hiCn 3)4c r5t t 3*t bi:n khng thu9c c&a
HBV v c qu nhiTu cc bi:n thE c&a HBV 3 lm cho viCc thi:t k: cc probe pht
hiCn 3*t bi:n hay thi:t k: cc v@ tr 3E enzyme c.t gi<i h2n nhMn diCn b@ kh khDn r5t
nhiTu. Hn n\a cho 3:n hiCn nay, y vDn chN m<i bo co c real-time PCR v PCR-
RFLP pht hiCn 3*t bi:n khng lamivudine ! hai v@ tr 180 v 204 trong khi 3 cn
nhiTu 3*t bi:n n\a khng chN t2o cho virus khng lamivudine, m cB adefovir v
entecavir n\a. Ch#n ti:p cMn nh) vMy ch.c ch.n sP khng 3p >ng 3)4c th?c t:.

110
Do vMy phng th nghiCm NK-
BIOTEK v cng ty Nam Khoa 3
ch#n m*t ti:p cMn khc d?a trn
ph)ng tiCn v trang thi:t b@ hiCn
32i 3ang c ! cng ty, 3 chnh l
ti:p cMn PCR v giBi trnh t? m*t
3o2n DNA di 550 bps trn vng
gene preS 3E lm xt nghiCm pht
hiCn cc 3*t bi:n khng
Lamivudine, Adefovir v
Entecavir. Xt nghiCm d?a trn ti:p
cMn ny hiCn nay 3ang 3)4c nhiTu
nh lm sng v nghin c>u y h#c
tin cMy nh8 cc )u 3iEm sau: (1)
Pht hiCn 3)4c hGu h:t cc v@ tr
3*t bi:n c thE xBy ra 3E gy ra
khng 3 lo2i thu9c trn; (2) V<i 3*
nh2y cBm c&a thi:t b@ giBi trnh t?
hiCn nay (sequencer ABI 3130XL,
giBi hai chiTu), khng chN t5t cB cc
3iEm 3*t bi:n kE trn 3Tu 3)4c giBi
3:n, m cB tnh tr2ng heterozygote
c&a 3*t bi:n/hoang d2i vSn 3)4c
pht hiCn; (3) V<i trnh t? giBi
3)4c, k:t quB xt nghiCm cn cung
c5p thng tin m*t cch chnh xc
vT genotype c&a HBV m khng
cGn phBi c chN 3@nh xt nghiCm
ny t6 lm sng. Hnh 55 m tB qui trnh xt nghiCm PCR v giBi trnh t? gene preS 3E
pht hiCn cc 3*t bi:n khng thu9c v xc 3@nh genotype HBV, trong 3 k:t quB pht
hiCn 3*t bi:n 3)4c trnh by trong m*t bBng liCt k cc v@ tr 3*t bi:n 3*t bi:n khng

Yu c%u tm #>t biEn
khng thuQc cAa HBV
PCR khuEch #i #Ran #?c
hi,u 550bps trn vng
gene preS cAa HBV
Tm #>t biEn khng thuQc: gi1i trnh t/ tr/c tiEp s1n
phDm PCR 550bps t3 vng gene preS
ABI 3130XL
(16 capillaries)
KE T QUA (24 gi sau khi nha n mau)
Genotype Genotype C
Pht hi,n #>t biEn
TAATTTGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCTTGTCCTCCAATTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATC
TTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTACCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAGGAACATC
AACTACCAGCACGGGACCATGCAAGACCTGCACGATTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTGTACAAAACCTTCGGACGG
AAATTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCTTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTA
GTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAAC
ATCTTGAATCCCTTTTTACCGCTGT
Khng
Lamivudine

KQ
Khng
Adefovir

KQ
Khng
Entecavir

KQ
I169T K L80V/I K T184G K
V173L K S85A K S202I K
L180M Co V84M K M250V K
A181T K A181V/T K
T184S K V214A K
M204I Co Q215S K
V207M/I K N236T K
Q215S K
Hnh 55: Qui trnh xt nghi=m pht hi=n #%t bi2n khng
thuMc v xc #.nh genotype c9a HBV bRng k[
thuLt PCR v giHi trnh t; m%t #Dan DNA 550 bps
trn gene PreS c9a HBV

111
lamivudine, adefovir v entecavir 3 3)4c cc nh nghin c>u ghi nhMn v t5t cB cc v@
tr 3*t bi:n ny 3Tu nHm trong trnh t? 3)4c
giBi.
Trong nDm 2008, phng th nghiCm
NK-Biotek c&a cng ty Nam Khoa 3 th?c
hiCn 3)4c 455 xt nghiCm PCR v giBi trnh
t? vng gene PreS c&a HBV, k:t quB cho
th5y c 3:n 69% cc tr)8ng h4p l thu*c
genotype B v 31% l genotype C, khng
c cc genotype khc. C 46% pht hiCn c
3*t bi:n khng lamivudine v<i 30% ! v@ tr
204, 9% ! hai v@ tr 204 v 207, 6.5% ! 204 v 180, v 0.5% 3*t bi:n cB 204, 180 v
207. K:t quB ny 3)4c trnh by trong bi4u +C 14.
5. p d9ng PCR v gi%i trnh t( pht hi3n +,t bi.n precore/ promoter v genotype
HBV
Trong qu trnh phBn >ng vng miUn d@ch t6 bCnh nhn, HBV c thE b@
3*t bi:n precore v 3*t bi:n core promoter. X*t bi:n precore l 3*t bi:n t2i v@ tr
nucleotide 1896 t6 G thnh A (G1896A) lm cho codon TGG tr! thnh TAG l m*t
stop codon. X*t bi:n ny 3 lm cho HBV khng thE tJng h4p 3)4c HBeAg. Do vMy,
khi th( mu bCnh nhn, khng pht hiCn 3)4c HBeAg m HBV-DNA vSn tIn l2i cng
v<i HBeAb [+]. Xy l m*t 3*t bi:n r5t quan tr#ng cGn phBi 3)4c pht hiCn v bCnh
nhn sP c nguy c cao vo x gan hay ung th) gan, 3Kc biCt khi pht hiCn 3)4c thm
3*t bi:n core promoter t2i hai v@ tr nucleotide 1762 v 1764 (A1762T, G1764A). Khi
bCnh nhn b@ pht hiCn mang HBV c cc 3*t bi:n ny th phBi 3)4c 3iTu tr@ bHng
thu9c khng virus su9t 38i. Chnh v tGm quan tr#ng 39i v<i lm sng nh) vMy nn
trong th8i gian qua phng th nghiCm NK-BIOTEK & cng ty Nam Khoa 3 xy d?ng
3)4c kY thuMt PCR v giBi trnh t? vng gene core 3E lm xt nghiCm pht hiCn 3*t
bi:n precore v 3*t bi:n core promoter v khng chN vMy, cn cho bi:t thm vT
genotype HBV. Hnh 56 minh h#a qui trnh ny.
Xt nghiCm ny hiCn nay 3ang 3)4c nhiTu nh lm sng v nghin c>u y h#c quan
tm v tin cMy. Trong nDm 2008, phng th nghiCm NK-Biotek v cng ty Nam Khoa
29.89
8.79
6.59
0.45
54.28
0
10
20
30
40
50
60
204 204+207 204+180 204+180+207 KhongB

Bi#u '( 14:
S; phn bM t] l= cc v. tr #%t bi2n khng
lamivudine pht hi=n #<Jc

112
3 th?c hiCn 134 mSu xt nghiCm 3*t
bi:n precore v core promoter c&a
HBV trn cc bCnh nhn b@ bc s^ 3iTu
tr@ nghi ng8 c 3*t bi:n precore/core
promoter. K:t quB cho th5y c 3:n 73%
pht hiCn 3*t bi:n vu su hn vT m9i lin hC v<i
lm sng, bCnh h#c v sinh bCnh h#c.
Bi4u +C 15 trnh by t_ lC phn b9 cc
kiEu 3*t bi:n pht hiCn 3)4c.
6. PCR v gi%i trnh t( pht hi3n +,t
bi.n khng rifampicine v INH
cFa M. tuberculosis
T6 nDm 1996, chng ti 3 b.t 3Gu
triEn khai kY thuMt PCR pht hiCn M.
tuberculosis v cho 3:n hiCn nay xt
nghiCm PCR pht hiCn M. tuberculosis
do chng ti pht triEn ny 3 3)4c cc
nh y h#c trong n)<c ch5p nhMn nh8 3*
nh2y cBm r5t cao so v<i khBo st tr?c
ti:p v nui c5y. Vt biEn
precore/promoter cAa HBV
PCR khuEch #i #Ran #?c
hi,u 250bps trn vng
gene core cAa HBV
Tm #>t biEn precore/promoter: gi1i trnh t/ tr/c
tiEp s1n phDm PCR 250bps t3 vng gene core
ABI 3130XL (16 capillaries) hay
CEQ8000 (6 capillaries)
KJT QUM
(24 gi@ sau khi nhOn mPu)
B=nh nhn c
HBeAg- HBeAb+,
HBVDNA+,
ALT - b*t th<Kng

Hnh 56: Qui trnh PCR v giHi trnh t; pht
hi=n #%t bi2n precore/promoter
36
26%
38
28%
28
20%
27
19%
2
1%
9
6%

G1896A
A1762T, G1764A
G1896A
A1762T, G1764A
Khng #>t biEn
A1762T
G1896A
A1762T
Bi#u '( 15: T] l= phn bM cc kiAu #%t bi2n
precore/core promoter pht hi=n
#<Jc trong 134 mEu xt nghi=m

113
ch9i ci trong l^nh v?c chWn 3on lao, v)4t qua cc cng cL vi sinh kinh 3iEn. M*t v5n
3T hiCn nay 3ang 3)4c cc nh y h#c quan tm l lm th: no c thE c 3)4c k:t quB
khng sinh 3I vi khuWn M. tuberculosis v<i th8i gian ng.n hn, v v<i ph)ng php vi
sinh kinh 3iEn th k:t quB khng
sinh 3I chN c thE c 3)4c sau
hn 2 thng v<i 1 thng 3E c
3)4c vi khuWn m#c 3)4c trn
mi tr)8ng nui c5y v 1 thng
3E c k:t quB khng sinh 3I.
Thng tin vT khng sinh 3I m
bc s^ cGn bi:t nh5t l liCu vi
khuWn phn lMp trn bCnh nhn
c 3T khng vc khng lao c
rifampicine.
Tr)<c th?c t: 3i hRi ny,
phng th nghiCm NK-Biotek
v 3n v@ R&D cng ty Nam
405 427
Leu Ser Gln Phe Met Asp Gln Asn Asn Pro Leu Ser Gly Leu Thr His Lys Arg Arg Leu Ser Ala Leu
CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC CCG CTG TCG GGG TTG ACC CAC AAG CGC CGA CTG TCG GCG CTG
Pro
CCG
Leu
CTA
Val
GTC
/..../
Dele
Leu
TTG
Tyr
TAC
Asp
GAC
Gln
CAG
Asn
AAC
Arg
CGC
Pro
CCC
Leu
TTG
Gln
CAG
Trp
TGG
Pro
CCG
(3%) (3%) (9%) (1%) (1%) (1%)
(28%)
(52%)
Hnh 57: Vng nng v,i cc #%t bi2n trn rpoB gene v t] l= th<Kng xy ra

Yu c>u
PCR pht hi)n MTB
Tm 9-t bi?n khng Rifampicine v INH
PCR pht hiCn MTB
d?a trn khu:ch 32i
trnh t? 249bp trn
IS6110
PCR khu:ch 32i trnh
t? 3Kc hiCu ch>a cc
3*t bi:n trn rpoB,
katG, v inhA
K?t qu pht hi)n
MTB trong vng 24gi5
Gii trnh t# pht hi)n 9-t bi?n
rpoB, katG v inhA
G2t biDn rpoB
L430P
S431G
Q432K/L
433 ins TTC(phe : F)
D435G/A/V
440 ins TCGGGGTTG
H445N/D/Q/S/R/L/Y/F
S450L
L452P
I480V
G2t biDn katG
S315T
G2t biDn inhA
C-15T
K?t qu khng sinh 9A MTB
72 gi5 sau khi lBy mCu 9m

Hnh 58: M tH qui trnh PCR v giHi trnh t; #A pht hi=n cc
#%t bi2n khng rifampicin v INH c9a vi khuYn M.
tuberculosis tr;c ti2p t> mEu #m m khng phHi qua
nui c*y. K2t quH #2n tay cc nh lm sng chN 72 giK
sau khi l*y mEu #m

114
Khoa 3 nghin c>u v th( nghiCm m*t qui trnh PCR v giBi trnh t? 3E khu:ch 32i
m*t vng nng c&a gene rpoB c&a M. tuberculosis 3E c thE pht hiCn 3)4c t5t cB cc
3*t bi:n th)8ng xBy ra t2o cho vi khuWn khng 3)4c rifampicine (hnh 57).
Ngoi vng nng ny, chng ti cVng 3 thnh cng trong xy d?ng m*t qui trnh
pht hiCn 3T khng INH bHng kY thuMt PCR v giBi trnh t? gene katG 3E pht hiCn v@
tr 3*t bi:n th)8ng gKp l S315T v gene inhA 3E xc 3@nh v@ tr 3*t bi:n C-15T. HiCn
nay qui trnh ny 3 3)4c chng ti p dLng 3E pht hiCn tr?c ti:p cc 3*t bi:n khng
thu9c ny t6 bCnh phWm m khng cGn thi:t phBi qua nui c5y. Hnh 58 minh h#a tm
t.t qui trnh 3)4c phng th nghiCm NK-Biotek th?c hiCn 3E pht hiCn MTB v cho
lun k:t quB khng sinh 3I chN 72 gi8 sau khi l5y mSu 3m t6 bCnh nhn. HiCn nay
chng ti 3ang ti:p tLc nghin c>u 3E c thE c thm cc k:t quB khng sinh 3I pht
hiCn cc 3*t bi:n khng cc thu9c khng lao khc nh) ethambutol, PAS, PZA,
Ofloxacin...3E c thE 3p >ng 3)4c m*t cch 3Gy 3& cc yu cGu 3:n t6 cc nh lm
sng trong cu*c chi:n 35u ch9ng l2i tnh hnh lao 3a khng ngy cng trGm tr#ng hiCn
nay.

PCR Sequencing

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

PCR Sequencing

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

81

PCR v gii trnh t#

You might also like