1989, 53(2):242. Microbiol. Rev.

H Hfte and H R Whiteley

thuringiensis.
Insecticidal crystal proteins of Bacillus
http://mmbr.asm.org/content/53/2/242
Updated information and services can be found at:
These include:
CONTENT ALERTS
more cite this article),
Receive: RSS Feeds, eTOCs, free email alerts (when new articles
http://journals.asm.org/site/misc/reprints.xhtml Information about commercial reprint orders:
http://journals.asm.org/site/subscriptions/ To subscribe to to another ASM Journal go to:

o
n

J
u
n
e

2
9
,

2
0
1
2

b
y

g
u
e
s
t
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

M I C R O B I O L O G I C A L R E V I E W S , J l u n e 1 9 8 9 . p . 2 4 2 - 2 5 5
0 1 4 6 - 0 7 4 9 / 8 9 / 0 2 0 2 4 ' - 1 4 $ 0 ' 2 . 0 0 / 0 )
C o p y r i g h t 1 1 9 8 9 . A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y
I n s e c t i c i d a l C r y s t a l P r o t e i n s o f B a c i l l l u s
t h u r i n g i e n s i s
HE R M A N HO FTE ' A ND H. R . W HI TE L E y
P l i t i t G e n e t i c S y s t e m n s N. V . , B - 9 0 0 0 G e u n t , B e l g i u m , l ( 1 / 1 t 1 De p a r t m i e n t ) f
I M i c r l o b i o l o g y , S C - 4 2 , U n i e v e s i t y o f W a s h i n g t o n .
S e a t t l e , W a s h i n g t o n 9 8 1 9 5 2
I NTR O DU C TI O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 2
DI V E R S I TYA ND C L A S S I FI C A TI O N O F C R YS TA L P R O TE I N G E NE S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 2
c r y l G e n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 3
Di s t r i b u t i o n o f C r y l p r o t e i n s a m o n g d i f f e r e n t B . t h u r i n g i e n s i s s t r a i n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 4
c r y I I G e n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 6
c r y i l l G e n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 6
Di p t e r a - A c t i v e C r y s t a l P r o t e i n G e n e s ( c r y l V a n d c y t A ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 7
E XP R E S S I O N O F c r y G E NE S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 8
M O DE O F A C TI O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 9
Fa c t o r s Th a t De t e r m i n e S p e c i f i c i t
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2 4 9
C o n s e r v e d Fe a t u r e s o f c r y G e n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 0
U S E O F B . THU R I NG I E NS I S C R YS T1A L P R O TE I NS I N P L A N P R O TE C TI O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 0
Tr a n s g e n i c P l a n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 0
R e s i s t a n c e De v e l o p m e n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 1
C O NC L U S I O NS A ND P E R S P E C TI V E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 1
A C KNO W L E DG M E NTS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 2
L I TE R A TU R E C I TE D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 2
I NTR O DU C TI O N
B a c i l l u s
t h m r i n ! g i e n s i s
a g r a m - p o s i t i v e s o i l b a c t e r i u m
c h a r a c t e r i z e d b y i t s a b i l i t y t o p r o d u c e c r y s t a l l i n e i n c l u s i o n s
d u r i n g s p o r - u l a t i o n . TI h e s e i n c l u s i o n s c o n s i s t o f p r o t e i n s
e x h i b i t i n g a h i g h l y s p e c i f i c i n s e c t i c i d a l a c t i v i t y ( r e v i e w e d i n
r e f e r e n c e s 4 a n d 9 7 ) . M a n y B . t h u r i u i g i e n s i s s t r a i n s w i t h
d i f f e r e n t i n s e c t h o s t s p e c t r a h a v e b e e n i d e n t i f i e d ( 9 ) . TI h e y
a r - e c l a s s i f i e d i n t o d i f f e r e n t s e r o t y p e s o r s u b s p e c i e s b a s e d o n
t h e i r f l a g e l l a r a n t i g e n s . M o s t s t r a i n s a r e a c t i v e a g a i n s t l a r v a e
o f c e r t a i n m e m b e r s o f t h e L e p i d o p t e r a , b u t s o m e s h o w
t o x i c i t y a g a i n s t d i p t e r i a n ( r e v i e w e d i n r e f e r - e n c e 2 2 ) o r c o -
l e o p t e r a n ( 5 3) s p e c i e s . Fo r s e v e r a l c r y s t . a l - p r o d u c i n g s t r a i n s .
n o t o x i c a c t i v i t y h a s y e t b e e n d e m o n s t r a t e d .
B . t l h i r i n g i e n s i s c r y s t a l l i n e i n c l u s i o n s d i s s o l v e i n t h e l a r v a l
m i d g u t , r e l c a s i n g o n e o r m o r e i n s e c t i c i d a l c r y s t a l p r o t e i n s
( a l s o c a l l e d 6 - e n d o t o x i n s ) o f 2 7 t o 1 4 0 k i l o d a l t o n s ( k Da ) . A s
d e s c r i b e d i n t h e f o l l o w i n g s e c t i o n , m o s t c r y s t a l p r o t e i n s a L r e
p r o t o x i n s t h a t a r e p r o t e o l y t i c a l l y c o n v e r - t e d i n t o s m a l l e r
t o x i c p o l y p e p t i d e s i n t h e i n s e c t m i d g u t . TFh e a c t i v c l t e d t o x i n
i n t e r a c t s w i t h t h e m i d g u t e p i t h e l i L u m c e l l s o t f s u s c e p t i b l e
i n s e c t s . E l e c t r o p h y s i o l o g i c a l ( 32 ) a n d b i o c h e m i c a l ( 4 9 ) e v i -
d e n c e s u g g e s t s t h a t t h e t o x i n s g e n e r c a t e p o r - e s i n t h e c e l l
m e m b r a n e , t h u s d i s t u r b i n g t h e o s m o t i c b a l a n c e . C o n s e -
q u e n t l y , t h e c e l l s s w e l l a n d l y s e . Th e l a r v a s t o p s f e e d i n g C a n d
e v e n t u a l l y d i e s . Fo r s e v e r a l B . t l h u r i n g i e n s i s t o x i n s , s p e c i f i c
h i g h - a f f i n i t y b i n d i n g s i t e s h a v e b e e n d e m o n s t r a t e d t o e x i s t
o n t h e m i d g u t e p i t h e l i u m o f s u s c e p t i b l e i n s e c t s ( 37 . 38 ) . Th i s
c o u l d , a t l e a s t i n p a r t . e x p l a i n t h e e x t r - e m e s p e c i f i c i t y o f
t h e s e p r o t e i n s .
Fo r m u l a t i o n s o f B . t h u r i n g i e n s i s h a v e b e e n u l s e d f o r m o r e
t h a n t w o d e c a d e s a s b i o l o g i c a l i n s e c t i c i d e s t o c o n t r o l a g r i -
c u l t u r a l p e s t s a n d , m o r e r e c e n t l y , i n s e c t v e c t o r - s o f a v a r i e t y
o f h u m a n a n d a n i m a l d i s e a s e s . R e c e n t l y , t h e c l o n i n g o f
i n s e c t i c i d a l c r y s t a l p r o t e i n g e n e s ( 9 7 ) a l n d t h e i r e x p r e s s i o n i n
p l a n t - a s s o c i c a t e d m i c r o o r g a l n i s m s ( 7 2 ) o r t r a n s g e n i c p l a n t s ( 5 .
C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .
2 3. 9 0 ) h C a s p r o v i d e d p o t e n t i a l l y p o w e r f u l a l t e r n a t i v e s t r a t e -
g i e s f o r - t h e p r o t e c t i o n o f c r o p s a g a i n s t i n s e c t d a m a g e .
Th e s e a p p l i e d c a s p e c t s a r e t o a l a r g e e x t e n t r e s p o n s i b l e f o r
a n i n c r e a s e d i n t e r e s t i n t h i s b a c t e r i u m a n d i t s c r y s t a l p r o -
t e i n s i n r e c e n t y e a r s . E x t e n s i v e s c r e e n i n g p r o g r a n m s a r e
b e i n g c a r r i e d o u t b y v a r i o u s g r o u p s t o s e a r c h f o r B . t u l i j -
, 0 i e n s i s s t r a i n s w i t h n e w i n s e c t i c i d a l s p e c t r a . Nu m e r o u s
p u b l i c a t i o n s r e p o r - t t h e i d e n t i f i c a t i o n o f c r y s t a l p r o t e i n s a n d
t h e c l o n i n g a n d s e q u e n c i n g o f c r - y s t a l p r o t e i n g e n e s . O n e
p r o b l e m r e l a t e d t o t h i s i s t h e l a c k o f a u n i t o r m n o m e n c l a t u r e
f o r t h e s e g e n e s a n d t h e i r p r o d u c t s . w h i c h m a k e s t h e l i t e r c a -
t u r e r a t h e r c o n f u s i n g .
I n t h i s r e v i e w , w e w i l l p r e s e n t a n u p d a t e o f t h e c u r r e n t
k n o w l e d g e o f B . t h u r i n g i e n Ns i s c r y s t a l p r o t e i n s C a n d t h e i l r
g e n e s . W e w i l l a l s o p r o p o s e a n o m e n c l a i t u r e a n d c l a s s i f i c a -
t i o n s c h e m e f o r c r - y s t a l p r o t e i n s b a s e d o n t h e i r s t r u c t u r e
( d e d u c e d f r o m t h e d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d
I DNA ] s e q u e n c e )
a s w e l l a s t h e i r h o s t r a l n g e .
DI V E R S I TYA ND C L A S S I FI C A TI O N O F C R YS TA L
P R O TE I N ( G E NE S
To d a t e , n u c l e o t i d e s e q u e n c e s h a v e b e e n r e p o r t e d f o r 4 2
B . t l h u r i a g i e n s i s c r y s t a l p r o t e i n g e n e s . S e v e r c a l s e q u e n c e s a r c e
i d e n t i c a l o r n e a r l y i d e n t i c a l c a n d t h u s r e p r e s e n t t h e s a m e g e n e
o r s l i g h t v a r i a n t s o f t h e s a m e g e n e . Ta k i n g t h i s i n t o a c c o u n t ,
1 4 d i s t i n c t c r y s t a l p r o t e i n g e n e s r e m a i n . S e v e r a l l i n e s o f
e v i d e n c e , s u m m a r i z e d b e l o w , s u g g e s t t h f a t 1 3 o f t h e s e
g e n e s - t h e s o - c a l l e d c r Y ( c r y s t c a l p r o t e i n ) g e n e s - s p e c i f y a
f a m i l y o f r e l a t e d i n s e c t i c i d a l p r o t e i n s ( C r y p r o t e i n s ) . Th e s e
1 3 g e n e s h C a v e b e e n d i v i d e d i n t o a m i n i m u m n u m b e r o f m a j o r
c l a s s e s ( f o u r ) a i n d s e v e r a l S u b c l a s s e s c h a r a i c t e r i z e d b y b o t h
t h e s t r u c t u r a l s i m i l a l r i t i e s a n d t h e i n s e c t i c i d a l s p e c t r a o f t h e
e n c o d e d p r o t e i n s . Th e f o u r m a j o r c l a s s e s a t r e L e p i d o p t e r a -
s p e c i f i c ( I ) . L e p i d o p t e r a - a n d Di p t e r a - s p e c i f i c ( I I ) , C o -
l e o p t e r a - s p e c i f i c ( I I I ) , a i n d Di p t e r a l - s p e c i f i c ( I V ) g e n e s . A d -
d i t i o n ( a l c l a s s e s c O u l d b e p r o p o s e d a n d m a y b e a d d e d l a t e r ,
f o r e x a m p l e . t o i n c l u d e g e n e s c o d i n g f o r n o n t o x i c c r y s t a l
2 4 2
V o l . 5 3. No . 2

o
n

J
u
n
e

2
9
,

2
0
1
2

b
y

g
u
e
s
t
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

I NS E C TI C I DA L C R YS TA L P R O TE I NS O F B . THU R I NG I E NS I S 2 4 3
TA B L E 1 . I n s e c t i c i d a l c r y s t a l p r o t e i n g e n e s o f B . t h i u r i n g i e n s i s "
No . o f P r e d i c t e d R e r n c
G e n e t y p e Ho s t r a n g e "
i o o d s
m o l m a s s O t h e r g e n e d e s i g n a t i o n s h o t y r
a m i n o a c i d
( k Da ) h l t p )
c r y I A ( a ) L 1 , 1 7 6 1 33. 2 4 . 5 - k b g e n e ( 5 6 ) . c ' / ' - I ( 8 5 ) 7 9
c r x ' I A ( b ) L 1 , 1 5 5 1 31 . 0 5 . 3- k b g e n e ( 5 6 ) . k u i r l t l d l ( 2 7 ) , b t 2 ( 39 ) , ( - c l - 2 ( 8 5 ) 9 2
c o I A ( c )
L
1 , 1 7 8 1 33. 3 6 . 6 - k b
g e n e ( 5 6 ) 3
c r y I B L
1 , 2 0 7 1 38 . 0 ( r y A 4 ( 7 ) , t y p e B ( 4 1 ) 7
( r v I C L 1 , 1 8 9 1 34 . 8 Ty p e C ( 4 1 ) , B TV I ( 4 2 ) . B t ( 7 7 ) 4 2
c r y l D L 1 , 1 6 5 1 32 . 5 Ho f t e , u n p u b -
l i s h e d
u r v l l A L / D 6 33 7 0 . 9 P 2 g e n e ( 1 7 ) , ( 7 - s B ! ( 9 8 ) 1 7
c r v I I B L 6 33 7 0 . 8 c - r v B 2 ( 9 8 ) 9 8
c l - NI I I A C 6 4 4 7 3. 1 ( Tv C ( 1 8 ) 35
C t - I V A D 1 , 1 8 0 1 34 . 4 1 30 - k Da e n d o t o x i n g e n e ( 9 6 ) , 1 2 5 - k Da p r o t e i n g e n e ( 6 ) , 9 6
I S R H3 ( 8 1 )
c r W I V B D 1 , 1 36 1 2 7 . 8 1 30 - k Da e n d o t o x i n g e n e ( 1 0 ) 6 ) , I S R H4 ( 8 2 ) , B t 8 ( 1 3) , 1 3
1 35 - k Da p r o t e i n g e n e ( 6 )
c r v I V C D 6 7 5 7 7 . 8 O R FI ( 8 8 ) 8 8
c r v I V D D 6 4 3 7 2 . 4 ( r v l D ( 1 6 ) 1 6
C t A D/ c y t o l . 2 4 8 2 7 . 4 2 7 - k Da t o x i n g e n e ( 9 1 ) 9 1
S e e t e x t f o r d e s c r i p t i o n a n d g e n e d e s i g n a t i o n s ; d e s i g n a t i o n s a p p r o v e d b y t h e No m e n c l a t i u r e C o m m i t t e e ( D. J . Ni e r l i c h , C h a i r m a n ) o f t h e P u b l i c a t i o n s B o a r d
o f t h e A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y .
" S p e c i f i e d h o s t r a n g e s : L , L e p i d o p t e r a ; D. Di p t e r a ; C . C o l e o p t e r a : c y t o l . , c y t o l y t i c a n d h e m o l y t i c .
R e f e r e n c e o f t h e f i r s t s u b m i t t e d p u b l i c a t i o n d e s c r i b i n g t h e g e n e t y p e . Th e n u m b e r o f a m i n o a c i d s a n d p r e d i c t e d m o l e c u l a r m a s s e s a r e d e r i v e d f r o m t h e
h o l o t y p e s e q u e n c e s .
p r o t e i n s . Ho w e v e r , t h e r e l a t i o n s h i p o f s u c h g e n e s t o t h o s e
d e s c r i b e d b e l o w i s n o t k n o w n , s i n c e t h e DNA s e q u e n c e s o f
g e n e s c o d i n g f o r n o n t o x i c p r o t e i n s h a v e n o t y e t b e e n d e t e r -
m i n e d . O n e c r y s t a l p r o t e i n g e n e o f B . t h i i r i i n g i e n s i s s u b s p .
i s r a e l e n s i s c o d e s f o r a 2 7 - k Da p r o t e i n t h a t e x h i b i t s c y t o l y t i c
a c t i v i t y a g a i n s t a v a r i e t y o f i n v e r t e b r a t e a n d v e r t e b r a t e c e l l s ,
a n d t h i s g e n e i s t o t a l l y u n r e l a t e d s t r u c t u r a l l y t o t h e c r y v
g e n e s . O n t h i s b a s i s , w e p r o p o s e a s e p a r a t e d e s i g n a t i o n f o r
t h e g e n e c o d i n g f o r t h e 2 7 - k Da p r o t e i n : c y t A f o r c y t o l y t i c
c r y s t a l p r o t e i n . Ta b l e 1 l i s t s t h e g e n e s a s s i g n e d t o t h e f o u r
m a j o r c r y c l a s s e s a n d t o t h e c y t c l a s s .
c r y I G e n e s
Th e L e p i d o p t e r a - s p e c i f i c c r y s t a l p r o t e i n s a r e u n d o u b t e d l y
t h e b e s t - s t u d i e d c r y s t a l p r o t e i n s . Th e 2 0 c r y I s e q u e n c e s t h a t
h a v e b e e n r e p o r t e d a r e l i s t e d i n Ta b l e 2 . S i x d i f f e r e n t g e n e s
( Ta b l e 1 ) c a n b e r e c o g n i z e d a m o n g t h e 2 0 s e q u e n c e s . A l l 2 0
g e n e s e n c o d e 1 30 - t o 1 4 0 - k Da p r o t e i n s , w h i c h a c c u m u l a t e i n
b i p y r a m i d a l c r y s t a l l i n e i n c l u s i o n s d u r i n g t h e s p o r u l a t i o n o f
B . t h u r i n g i e n s i s . A s s t a t e d a b o v e , t h e s e p r o t e i n s a r e p r o t o x -
i n s w h i c h s o l u b i l i z e i n t h e a l k a l i n e e n v i r o n m e n t o f t h e i n s e c t
m i d g u t a n d a r e p r o t e o l y t i c a l l y c o n v e r t e d b y c r y s t a l - a s s o c i -
a t e d o r l a r v a l - m i d g u t p r o t e a s e s i n t o a t o x i c c o r e f r a g m e n t o f
6 0 t o 7 0 k Da . Th i s a c t i v a t i o n c a n a l s o b e c a r r i e d o u t i n v i t r o
w i t h a v a r i e t y o f p r o t e a s e s ( r e v i e w e d i n r e f e r e n c e 9 7 ) .
Th e t o x i c d o m a i n i s l o c a l i z e d i n t h e N- t e r m i n a l h a l f o f t h e
p r o t o x i n . Th i s w a s d e m o n s t r a t e d f o r t h e C r y I A ( b ) ( 39 ) a n d
C r y I C ( H. Ho f t e , u n p u b l i s h e d d a t a ) p r o t e i n s t h r o u g h N-
t e r m i n a l a m i n o a c i d s e q u e n c i n g o f t h e t r y p s i n - a c t i v a t e d
t o x i n . B o t h p r o t e i n s a r e c l e a v e d a t a h o m o l o g o u s p o s i t i o n i n
t h e s e q u e n c e ( r e s i d u e s 2 9 a n d 2 8 , r e s p e c t i v e l y ) . Na g a m a t s u
e t a l . ( 7 1 ) d e t e r m i n e d t h e N- t e r m i n a l a m i n o a c i d s e q u e n c e o f
t h e t r y p t i c c o r e f r a g m e n t o f a B . t h i t i i n g i e n s i s s u b s p . d e n i -
d r o l i m i u s c r y s t a l p r o t e i n . Th i s s e q u e n c e c o r r e s p o n d s t o t h e
C r y l A s e q u e n c e s t a r t i n g f r o m r e s i d u e 2 9 . Th e p r o t e o l y t i c
c l e a v a g e s i t e i s h i g h l y c o n s e r v e d f o r t h e o t h e r C r y l A a n d t h e
C r y I D p r o t e i n s a s w e l l , s u g g e s t i n g t h a t f o r t h e s e p r o t e i n s ,
t h e N t e r m i n u s o f t h e t o x i c f r a g m e n t i s l o c a l i z e d a t t h e s a m e
p o s i t i o n . C r y I B , h o w e v e r , i s v e r y d i f f e r e n t f r o m t h e o t h e r
C r y l p r o t e i n s i n t h i s r e g i o n . I t i s n o t k n o w n w h e t h e r t h i s
p r o t e i n i s a l s o p r o c e s s e d a t t h e N t e r m i n u s . De l e t i o n a n a l y -
s i s o f s e v e r a l c r y I g e n e s [ c r y I A ( a ) ( 7 8 ) ,
c r y l A ( b ) ( 39 , 9 2 ) ,
c r v I A ( c ) ( 3) , a n d c r v l C ( 7 7 ) ] f u r t h e r c o n f i r m e d t h a t t h e 3' h a l f
o f t h e p r o t o x i n i s n o t a b s o l u t e l y r e q u i r e d f o r t o x i c a c t i v i t y .
Th e s h o r t e s t r e p o r t e d t o x i c f r a g m e n t w a s l o c a l i z e d b e t w e e n
c o d o n s 2 9 a n d 6 0 7 f o r C r y I A ( b ) ( 39 ) . Fu r t h e r r e m o v a l o f 4
c o d o n s f r o m t h e 3' e n d ( 9 2 ) o r 8 c o d o n s f r o m t h e 5 ' e n d
c o m p l e t e l y a b o l i s h e d t h e t o x i c a c t i v i t y o f t h e g e n e p r o d u c t .
S i m i l a r o b s e r v a t i o n s w e r e m a d e f o r t h e c r v I A ( W ) ( 7 8 ) a n d
c r v ' I A ( c ) ( 3) g e n e s .
Th e c r y I g e n e s c a n b e d i s t i n g u i s h e d f r o m t h e o t h e r
c r y
g e n e s s i m p l y b y s e q u e n c e h o m o l o g y ( >5 0 % a m i n o a c i d
i d e n t i t y [ Ta b l e 3] ) . Th r e e o f t h e s e g e n e s , ( c r y I A ( a ) , c r y l A ( b ) ,
a n d c r / V A ( c ) , s h o w m o r e t h a n 8 0 % a m i n o a c i d i d e n t i t y a n d
h a v e t h e r e f o r e b e e n c o n s i d e r e d a s a s e p a r a t e s u b g r o u p .
Th e s e t h r e e g e n e s w e r e p r e v i o u s l y d e s i g n a t e d a s t h e 4 . 5 - ,
5 . 3- , a n d 6 . 6 - k i l o b a s e ( k b ) g e n e s , r e s p e c t i v e l y ,
o n t h e b a s i s
o f t h e s i z e o f t h e Hi i d I I l r e s t r i c t i o n f r a g m e n t c o n t a i n i n g t h e
5 ' e n d o f t h e g e n e s ( 5 6 ) . Th e n u c l e o t i d e d i f f e r e n c e s b e t w e e n
t h e s e t h r e e g e n e s a r e l o c a l i z e d m a i n l y i n a l i m i t e d s e c t i o n o f
t h e r e g i o n e n c o d i n g t h e t o x i c f r a g m e n t ( 9 7 ) . Th e r e c e n t l y
i d e n t i f i e d c r v i B , c r i v I C , a n d c r v I D g e n e s d i f f e r m u c h m o r e
f r o m e a c h o t h e r a n d f r o m t h e c r y l A g e n e s ( Fi g . I A ) .
A c r y s t a l p r o t e i n g e n e f r o m B . t h l a l t - i n g i e n Ks i s s u b s p . a i z a -
w a i I C - 1 i s l i s t e d i n Ta b l e 2 a s a c r y l A ( b ) g e n e , d e s p i t e t h e
f a c t t h a t t h e p r o t e i n h a s d u a l h o s t s p e c i f i c i t y . A s d e s c r i b e d i n
a l a t e r s e c t i o n o n s p e c i f i c i t y , t h e t o x i c i t y o f t h e I C - 1 p r o t e i n
t o l e p i d o p t e r a n o r t o d i p t e r a n i n s e c t s d e p e n d s o n t h e s o u r c e
o f t h e p r o t e o l y t i c e n z y m e t h a t g e n e r a t e s t h e t o x i n ( 2 9 , 31 ) .
Th e d e c i s i o n t o i n c l u d e t h e I C - 1 g e n e i n t h e c r y l A ( b )
s u b c l a s s ( r a t h e r t h a n c r e a t i n g a n e w c l a s s ) w a s b a s e d o n t h e
s t r u c t u r e o f t h e g e n e p r o d u c t : t h e a m i n o a c i d s e q u e n c e
d i f f e r s f r o m t h e h o l o t y p e b y o n l y f o u r a m i n o a c i d s .
I n t e r e s t i n g l y , c o m p a r i s o n o f t h e p r e d i c t e d a m i n o a c i d
s e q u e n c e s s h o w s t h a t t h e C - t e r m i n a l h a l f i s h i g h l y c o n s e r v e d
f o r a l l c r i ! l g e n e s ( Fi g . 1 A ) . I t i s u n c l e a r w h e t h e r t h e
s e q u e n c e c o n s e r v a t i o n i n t h i s r e g i o n r e f l e c t s a n y f u n c t i o n a l
s i g n i f i c a n c e . A s s h o w n a b o v e , t h i s d o m a i n d o e s n o t s e e m t o
V O L . 5 3, 1 9 8 9

o
n

J
u
n
e

2
9
,

2
0
1
2

b
y

g
u
e
s
t
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

2 4 4 HO FTE A ND) W HI TE L E Y
TA B L E 2 . O v e r v i e w o f r e p o r t e d c r y s t a l p r o t e i n g e n e s e q u e n c e s
No . o f a m n i n o a c i d
C r y s t a l
d . f m l ~e s s
c i f f e r i e n c e s t f r o m
p r o t e i n
I h o l o t p e s c q L n c n e '
R e f e i - c n c e
g e n e
S L I b S p . a n d / o r
s t r a i n
P r - o t o x i n To x i n "
c r v I A ( a ) k u i s t a k i HD- 1
k u r s t a k i HD- 1
s o t t o
e n t t o m l o ( c i d i t s
c r v I A ( b ) b e r l i n e r 1 7 1 5
b e ' - l i t e ' l 1 7 1 5
k i l ' i s t ( l k i HD- 1
k i i - Nt t i k i HD- 1
a i . ( l i a w a i I P L - 7
k u r s t a k i HD- 1
k u r s t a k i NR D- 1 2
( l i 1 a 0 0 a i I C - 1
( C i V I C e n t i o / l n o ( i d i i s 6 0 1
a i l o a w a i HD- 1 37
e n l t o m o ( i d I i s HD- l l t )
c r ! I D a i ( o l a w i
HD- 6 8
c r v I I A k i u s t a k i HD- 2 6 3
k i , ' . s v t o k i
HD- 1
c r v I I B
k u r s A k t i
H 1 ) - l
( c r Y! I I I A s i ( I / t d i ( , g o
t C t C E / ) 1 ' i O /
i . 5
E G 2 1 5 8
c r v I V A i s ' r c ( ' l ( ' / e l s i s
i s r a ( c l ( e n t s i s
c r v I V B i S r a e i e l O s i s
i s r ' a e i l ( ' l n s i s X
i S r a E l e s l i tXI s
i s r a e l e n , s i . s
H
3
1
2 4l
H
2
0
3
0 )
7 9
8 5
5 2
8 3. 8 4
6 4 a
H H 2 . 9 2
2 39
4 2 7 . 8 8 X
4 2 7 3
6 2 2 3
1 0 ( 6 33
4 4 3t )
H H 3
H H 7
1 1 H6 f t e . u n -
p u b l i s h e d
H H 4 2 )
7 " 7 7 7
2 H6 f t e , u n -
p u b l i s h e d
H H Ht ' f t e . u n -
p u b l i s h e d
H 1 7
( ) 0 ) 9 8
H 9 8
H 35
0 4 0 . 6 9 . 8 1
t ) t ) 1 8
H H 9 6
4 1 8 2
H H 1 3
1 1 8 9
3 3 8 2
9 7 7 8 1 0 ) 6
H H 8 8
H 1 6
H 9 1
1 1 1 9
0 ) 0 ) 9 3
1 1 2 4
Th e f i r - s t
r - e p o r t e d s e q u e l n c e o f l a g e n e t y p e i s c o n s i d c r e d t h e h o l o t v p c ( H)
s e q u e n c e . S u i b s e q u i e n t l y r e p o r t e d a m i n o a i c i d s e q u e n c e s a r e d e f i n e d b y t h e
n u m b e r o f a m i n o a c i d
c h a n g e s w i t h r - e s p e c t t o t h e h o l o t y p e s e q u l e n c c .
To x i n . Th e N- t e r m i n a l h a l f o t t h e c r y s t a l
p r - o t e i n , d e l i n e c a t e d
b y t h e
C - t e r m i n a l a m i n o a c i d o f t h e c o n s e r v e d a m i n o a c i d
s e q u j e n c e
b l o c k 5
( Fi g .
2 ) .
`
C o r - r e c t i o n s t o t h e
s e q u l c n c e i n r e f e r e n c e 8 8
( T. J . P o l l o c k , p e r s o n a l
c o m m u n i c a t i o n ) s h o w t h a t i t i s i d e n t i c a l t o t h a t i n r e f t c r e n c c 2 7 .
' Th e
r c p o r t e d s e q u l e n c e r - e p r e s e n t s t h e f i r - s t 8 2 3 r e s i d u e s ( 4 8 ) .
p l a y a r o l e i n t o x i c i t y . Ho w e v e r , i t i s i n t e r e s t i n g t h a t a l m o s t
a l l c y s t e i n e r e s i d u e s a r e l o c a l i z e d i n t h e C - t e r m i n a l h a l f a n d
t h a t d i s u l f i d e b o n d s h a v e b e e n i m p l i c a t e d i n t h e m a i n t e n a n c e
a n d t h e u n u s u a l s o l u b i l i t y p r o p e r t i e s o f t h e c r y s t a l s ( 6 3) .
He n c e , t h e C - t e r m i n a l h a l f m a y b e i n t i m a t e l y i n v o l v e d i n
c r y s t a l f o r m a t i o n , a n d t h e c o n s e r v a t i o n o f s e q u e n c e s i n t h i s
p a r t o f ' t h e m o l e c u l e i s a p p a r e n t l y s u f f i c i e n t t o a l l o w t h e
c o a s s e m b l y o f d i f f ' e r e n t c r y s t a l p r o t e i n s i n t h e s a m e c r y s t a l s .
Di s t r i b u t i o n o f C r y l p r o t e i n s a m o n g d i f f e r e n t B . t h u r i n g i e n -
s i s s t r a i n s . Tr a d i t i o n a l l y , t h e p r o t e i n c o m p o s i t i o n o f B .
t h i i r i n g i e n i s i s c r y s t a l s h a s b e e n s t u d i e d t h r o u g h p o l y a c r y l -
a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( 1 0 , 4 6 ) o r i m m u n o l o g i c a l l y b y
u s i n g p o l y c l o n a l a n t i s e r a a g a i n s t p u r i f i e d c r y s t a l s ( 5 7 ) . Th e s e
m e t h o d s s h o w e d t h a t s o m e c r y s t a l s c o n t a i n e d m o r e t h a n o n e
p r o t e i n . A g e n e t i c a p p r o r a c h b e c a m e p o s s i b l e w i t h t h e c l o n -
i n g o t c r y s t a l p r o t e i n g e n e s . Th e u s e o f g e n e - s p e c i f i c p r o b e s
l e d t o t h e d i s c o v e r y t h i a t v a r i o u s s u b s p e c i e s o f B . t l i i h i t r i g -
i e i s i s c o n t a i n e d o n e , t w o , o r t h r e e c l o s e l y r e l a t e d g e n e s ( 5 4 ,
5 6 ) . Th e s e t h r e e g e n e s w e r e f o u n d i n a n u m b e r o f d i f f ' e r e n t
s t r a i n s o r s u b s p e c i e s ( e . g . , B . t i h u r i n g i e n s i s s u b s p . k u r s t a k i
HD- 1 c o n t a i n s a l l t h r e e g e n e s , s t r a i n HD- 1 Di p e l h a s t h e
c r v I A ( a ) a n d ( c r I A ( c ) g e n e s , B . t h u r i n g i e n s i s s u b s p . t l h u i l -
g i e n s i s HD- 2 c o n t a i n s ( c r v I A ( b ) a n d ( c r v I A ( c ) , e t c . ) .
R e c e n t l y , a n a l t e r n a t i v e a p p r o a c h w a s d e s c r i b e d i n w h i c h
m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s w e r e u s e d t o i d e n t i f y s i n g l e p r o t e i n s
i n c r y s t a l p r e p a r a t i o n s . Hu b e r - L u k a c e t a l . ( 4 3) d e s c r i b e d 1 0
m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s g e n e r a t e d a g a i n s t p u r i f i e d c r y s t a l s
f r o m B . t l t l u i i i g i c t i s i s s u b s p . k u r s t a k i . I n v e s t i g a t i o n o f t h e
c r y s t a l s o f 1 4 B . t h u r i n g i e n s i s s t r a i n s w i t h t h e s e a n t i b o d i e s
r e v e a l e d c l e a r - c u t d i f f e r e n c e s i n i m m u n o r e a c t i v i t y . Ho w -
e v e r , i n t h i s s t u d y , n o d i r e c t c o r r e l a t i o n w a s m a d e b e t w e e n
t h e r e a c t i v i t y w i t h c e r t a i n m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s a n d t h e
p r e s e n c e o f c e r t a i n c r y s t a l p r o t e i n t y p e s .
I n a n o t h e r s t u d y , m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s w e r e u s e d t o
d i s t i n g u i s h t h e C r y I A , C r y I B , a n d C r y I C p r o t e i n s i n c r y s t a l
p r e p a r a t i o n s ( 4 1 ) . T' a b l e 4 s h o w s t h e r e s u l t s o f a s u r v e y o f 2 9
s t r a i n s o f 1 1 s e r o t y p e s b y u s i n g 35 m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s .
C r y l A i s t h e m o s t c o m m o n c r y s t a l p r o t e i n t y p e a n d w a s
p r e s e n t i n a l l b u t o n e s t r a i n t e s t e d ; C r y I B a n d C r y I C w e r e
l e s s c o m m o n . Th e f o r m e r o c c u r r e d i n f i v e s u b s p e c i e s .
w h e r e a s C r y I C w a s p r e s e n t o n l y i n B . t h l u r i n g i e n s i s s u b s p p .
( i Z U m t t l i a n d c e t t o o t o ( c i d t s . C e r t a i n s t r a i n s o f B . t h i t r i n g ! i e n s i s
s u b s p p . g a l l e r i a e a n d m o r r i s o n i c o n t a i n e d p r o t e i n s t h a t
r e a c t e d o n l y w i t h a L l i m i t e d s u b s e t o f t h e a n t i b o d i e s s p e c i f y -
i n g a c r y s t a l p r o t e i n t y p e . I t w i l l b e i n t e r e s t i n g t o s e e t o w h a t
e x t e n t t h e s e c r y s t a L l p r o t e i n s d i f f e r f r o m t h e a l r e a d y - k n o w n
c r y s t a l p r o t e i n t y p e s w i t h r e g a r d t o s t r u c t u r e a n d i n s e c t
s p e c i f i c i t y . I t s h o u l d b e n o t e d t h a t t h e m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s
u s e d i n t h e a b o v e s t u d i e s m a y n o t h a v e d e t e c t e d a l l o f t h e
t o x i n s i n t h e c r y s t a l s . S i m i l a r l y , s u b t l e v a r i a t i o n s i n a m i n o
a c i d s e q u e n c e w h i c h m i g h t b e r e s p o n s i b l e f o r d i f f e r e n c e s i n
h o s t s p e c t r u m m i g h t h a v e e s c a p e d d e t e c t i o n . I t i s c l e a r ,
h o w e v e r , t h a t m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s c a n s i g n i f i c a n t l y s p e e d
u p t h e i d e n t i f i c a t i o n o f c r y s t a l p r o t e i n s p r o d u c e d b y n e w l y
i s o l a t e d B . t h i t r i n g i e n s i s s t r a i n s a n d a r e t h e r e f o r e a p o w e r f u l
t o o l i n s c r e e n i n g f o r s t r a i n s w i t h n e w i n s e c t i c i d a l p r o p e r t i e s .
Th e y a l l o w t h e r a p i d i d e n t i f i c a t i o n n o t o n l y o f k n o w n c r y s t a l
p r o t e i n s b u t , m o r e i m p o r t a n t l y , a l s o o f c r y s t a l p r o t e i n s w i t h
a s y e t u n k n o w n s t r u c t u r a l c h a r a c t e r i s t i c s ( e . g . . a s w a s
s h o w n f o r s t r a i n s o f B . t h u t r i n g i e n s i s s u b s p p . g a l l e r i a e a n d
m o l ' r r i s o n i ) . I n t h i s w a y , s t r a i n s p r o d u c i n g c r y s t a l p r o t e i n s
w i t h u n i q u e s t r u c t u r a l p r o p e r t i e s - a n d p o s s i b l y a l s o u n i q u e
i n s e c t i c i d a l s p e c t r a - c a n b e p r e s e l e c t e d p r i o r t o t h e m o r e
t i m e - c o n s u m i n g b i o a s s a y s .
I n t o t o , t h e s e d a t a c l e a r l y d e m o n s t r a t e d t h a t m a n y s t r a i n s
p r o d u c e s e v e r f a l c r y s t a l p r o t e i n s s i m u l t a n e o u s l y a n d t h a t t h e
c r ' , I A ( ( )
c r v I B
k i r s t o k i HD- 7 3
t l i u r i n t g i e n s i s HD- 2
C e n t o n o c ( ' i d l S s HD- 1 1 0 )
( i n V I V C
u
' v I V I )
I NS ' ( I l ( ' ( ' 1 l S i S
i Nl s l ( ' I ' l N . i . S
( v t A i s r a e l e n s i s
1 m 1 r 1 r i . XO 1 1 i P C J - 1 4
i s l r a i l l i ' P G i s
m ? o r r 1 i s o n t i P G - 1 4
M I C R KO B I o ( ) I . . R F V .

o
n

J
u
n
e

2
9
,

2
0
1
2

b
y

g
u
e
s
t
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

I NS E C TI C I DA L C R YS TA L P R O TE I NS O F B . THU R I NG I E NS I S
2 4 5
TA B L E 3. P e r c e n t a m i n o a c i d i d e n t i t y b e t w e e n ( 1 r - e n c o d e d p r o t e i n s
%/ 4 A m i n o a i c i d i d e n t i t v " f o r :
C r y s t a l p r o t e i n
C r I - y A ( b ) C r v I A ( c ) C r y l B C r - y l C C r y l D C r v I I I A " C r y I V A C r y l V B C r y l V C "
C r y I A ( a ) 9 0 8 2 5 5 6 7 7 1 2 5 2 7 2 7
2 2
C r y I A ( b )
8 6 5 6 6 6 7 1 2 8 2 7 2 7 2 3
C r y I A ( c )
5 5 6 7 7 0 2 3 2 8 2 4 2 4
C r y I B
5 8 5 6 34 2 6 2 8
2 2
C r y l C
7 0 31 2 6 30 2 1
C r y 1 D
2 3 2 8 2 8 2 2
C r y 1 l l A
2 3 1 9 2 6
C r y I V A
5 4 2 9
C r y l V B
2 9
Fo r t h e c a l c u l a t i o n o f t h i s p e r c c n t a g e , p a i r s o f a m i n o a c i d s e q u L e n c e s w e r e a l i g n e d b y u s i n g t h e G E NA L I G N p r o g r a n i ( I n t e l l i G e n e t i c s ) .
w i t h a g a p p e n a l t y
o f z e r o . Th e n u m b e r o f m a t c h e d a m i n o a c i d s w a s d i v i d e d b y t h e n u m b e r o f r e s i d u e s o f t h e l o n g e s t s e q u e n c e o f t h e t w o , u s i n g t h e e n t i r e d e d u c e d s e q u e n c e .
C r y l l
a n d C r y l V D a r e n o t i n c l u d e d , b e c a u s e t h e r e i s l i t t l e o r n o s i g n i f i c a n t a m i n o a c i d i d e n t i t y b e t w e e n t h e s e t w o p r o t e i n s a n d t h e o t h e r - s s h o w n i n t h e t a b l e . B e c a u s e
1 0 0 % m a t c h e s a r e n o t i n d i c a t e d , C r y I A ( a ) h a s b e e n o m i t t e d f r o m t h e c o l u m n s a n d C r y l V C h a s b e e n o m i t t e d f r o m t h e r o w s .
"
Th e c o m p a r i s o n w a s m a d e b y u I s i n g o n l y t h e p u t a t i v e t o x i n f r a g m e n t s ( r e s i d L i e 1 t o t h e C - t e r - m i n a l r - e s i d u L e o f c o n s e r v e d s e q u e n c e
b l o c k 5 o f Fi g . 2 ) .
s a m e ( o r v e r y s i m i l a r ) c r y s t a l p r o t e i n s o c c u r i n B . t l i i i n i i g i -
e t n s i s s t r a i n s o f d i f f e r e n t s u b s p e c i e s . Th i s m o b i l i t y o f c r y s t a l
p r o t e i n g e n e s a m o n g s t r a i n s o f B . t h i n l i i n g i e n i s i s s u b s p e c i e s i s
n o t u n e x p e c t e d , s i n c e m o s t g e n e s a r e l o c a l i z e d o n l a r g e
c o n j u g a t i v e p l a s m i d s ( r e v i e w e d i n r e f e r e n c e 1 1 ) . I n a d d i t i o n ,
t h e o b s e r v e d a s s o c i a t i o n o f s e v e r a l c r v l A g e n e s ( 5 5 , 6 1 ) a n d
c r v I V B ( 6 ) ( s e e b e l o w ) w i t h I S e l e m e n t s ( 6 4 ) a n d / o r t r a n s -
p o s o n l i k e s t r u c t u r e s c o u l d c o n t r i b u t e t o t h e i r m o b i l i t y .
Th e i n s e c t i c i d a l a c t i v i t y o f B . t l i l r i n i g i e n s i s c r y s t a l p r o -
t e i n s h a s t r a d i t i o n a l l y b e e n i n v e s t i g a t e d b y u s i n g c r u d e
p r e p a r a t i o n s o f s p o r e - c r y s t a l m i x t u r e s ( 9 ) . Th e r e s u l t s o f
t h e s e s t u d i e s , h o w e v e r , a r e d i f f i c u l t t o i n t e r p r e t . S p o r e -
c r y s t a l p r e p a r a t i o n s g e n e r a l l y a l s o c o n t a i n o t h e r t o x i c
a g e n t s , s u c h a s t h e b e t a - e x o t o x i n ( 5 8 ) a n d t o x i c s p o r e
c o m p o n e n t s . I n a d d i t i o n , i n s o m e c a s e s i t i s n o t k n o w n
w h e t h e r t h e g e r m i n a t i o n o f s p o r e s i n s i d e t h e l a r v a e c o n t r i b -
u t e s t o t h e o b s e r v e d t o x i c e f f e c t s . He n c e , t h e s e e a r l i e r
s t u d i e s d i d n o t y i e l d c o n c l u s i v e d a t a t h a t t o x i c i t y w a s d u e
s o l e l y t o t h e a c t i v i t y o f t h e c r y s t a l p r o t e i n s . I n s o m e r e c e n t
i n v e s t i g a t i o n s , g r a d i e n t - p u r i f i e d c r y s t a l s w e r e u s e d i n t o x i c -
i t y a s s a y s ( 4 5 , 6 0 ) . Ho w e v e r , s i n c e m a n y B . t l i n i r i n g i e n L s i s
s t r a i n s s i m u l t a n e o u s l y p r o d u c e m o r e t h a n o n e c r y s t a l p r o -
t e i n , i t i s s t i l l d i f f i c u l t t o a c c u r a t e l y d e t e r m i n e t h e t o x i c i t y
s p e c t r u m o f i n d i v i d u a l p r o t e i n s f r o m t h e s e s t u d i e s .
P r e p a r a t i o n s c o n t a i n i n g s i n g l e c r y s t a l p r o t e i n s h a v e b e e n
o b t a i n e d i n t h e f o l l o w i n g w a y s : t h r o u g h p r o t e i n p u r i f i c a t i o n
( 1 0 5 ) , t h r o u g h t h e i n t r o d u c t i o n ( b y c l o n i n g o r c o n j u g a t i o n )
a n d e x p r e s s i o n o f t h e c o r r e s p o n d i n g g e n e s i n h e t e r o l o g o u s
h o s t s ( s e e t h e r e f e r e n c e s c i t e d i n Ta b l e 2 ) , o r b y u s i n g B .
t h i i r i - i g i e n i s i s s t r a i n s t h a t p r o d u c e o n l y o n e c r y s t a l p r o t e i n
( 4 1 ) . Th e t o x i c i t y d a t a f o r i n d i v i d u a l ( c r l - s p e c i f i e d p r o t e i n s
o b t a i n e d s o f a r a r e s u m m a r i z e d i n Ta b l e 5 . Th e p r o t e i n s ,
p u r i f i e d
f r o m B . t I l i i n i g i e n i s i s c r y s t a l s c o n s i s t i n g o f a s i n g l e p r o t e i n
[ C r y I A ( c ) a n d C r y I B ] o r f r o m r e c o m b i n a n t E s c h e r i c l h i a c o l i
c l o n e s , w e r e s o l u b i l i z e d i n a n a l k a l i n e b u f f e r ( p H 1 0 ) w i t h
r e d u c i n g a g e n t s p r i o r t o t h e b i o a s s a y . Th e s e d a t a c l e a r l y
d e m o n s t r a t e t h a t s i n g l e c r y s t a l p r o t e i n s a r e h i g h l y s p e c i f i c
f o r c e r t a i n l e p i d o p t e r a n s p e c i e s . Fo r i n s t a n c e , C r y I B a n d
C r y I D w e r e a c t i v e a g a i n s t o n l y o n e o f t h e l e p i d o p t e r a n
FI G . 1 . A m i n o a c i d s e q u e n c e c o m p a r i s o n o f B . t h l u r i n g i e n t s i s c r y s t a l p r o t e i n s . S e q u e n c e s w e r e a l i g n e d b y u s i n g t h e G E NA L I G N p r o g r a m
( I n t e l l i G e n e t i c s ) . G a p s t h a t w e r e a d d e d f o r o p t i m a l a l i g n m e n t s a r e n o t i n d i c a t e d . V e r t i c a l l i n e s r e p r e s e n t a m i n o a c i d s t h a t a r e c o n s e r v e d
f o r
a l l l e p i d o p t e r a n c r y s t a l p r o t e i n s ( C r y l ) ( A ) ; a l l d i p t e r a n c r y s t a l p r o t e i n s ( C r y l V ) ( B ) ; a n d a l l C r y l C r y l I l , a n d C r y l V c r y s t a l p r o t e i n s ( e x c e p t
C r y l V D) ( C ) . Th e p o s i t i o n s o f t h e f i v e c o n s e r v e d s e q u e n c e b l o c k s ( s e e t e x t a n d Fi g . 2 ) a r e u n d e r l i n e d . Th e C r y l l p r o t e i n s s h o w s i g n i f i c a n t
h o m o l o g y o n l y t o t h e s e q u e n c e o f b l o c k 1 . V e r t i c a l l i n e s i n t h e C - t e r m i n a l h a l f ( o u t s i d e t h e t o x i n - e n c o d i n g r e g i o n ) r e p r e s e n t a m i n o
a c i d s
c o n s e r v e d f o r t h e C r y l V A a n d C r y l V B p r o t e i n s i n p a n e l B a n d f o r a l l c r y s t a l p r o t e i n s s p e c i f i e d b y c r y g e n e s ( e x c e p t C r y l l . C r y l l l .
a n d
C r y l V C a n d C r y l V D) i n p a n e l C . A b b r e v i a t i o n : H. h y d r o p h o b i c t r a n s m e m b r a n e s e q u e n c e ( 2 0 ) p r e s e n t i n a l l c r y s t a l p r o t e i n s e x c e p t C r y l l
a n d
C r y l V D. Nu m b e r s r e f e r t o p o s i t i o n s i n t h e s e q u e n c e a f t e r a l i g n m e n t ( a m i n o a c i d s p l u s g a p s ) .
V O L . 5 3, 1 9 8 9

o
n

J
u
n
e

2
9
,

2
0
1
2

b
y

g
u
e
s
t
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

2 4 6 HO FTE A ND W HI TE L E Y
TA B L E 4 . Di s t r i b u t i o n o f t h r e e c r y s t a l p r o t e i n t y p e s a m o n g
d i f f e r e n t B . t l h i r i n g i e n s i s s t r a i n s a s d e t e r m i n e d b y
r e a c t i o n w i t h m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s '
P r e s e n c e o f f o l l o w i n g
Fl a g e l l a r f B . t h l r i l l t t t i e t - S t r a i n p r o t e i n ' :
s e r o t v p e x i . s s t U b s p .
C r y l A ' C r y l B C r y I C
1 t l i / t u r i n g i e n i s i s HD- 2 . B e r l i n e r 1 7 1 5 + +
HD- 1 4 + ( a ) - -
4 4 1 2 - + -
3a n t i e s t i HD- 4 + - -
3a 3b k i u r s t u i k i HD- 1 + - -
HD- 7 3 + ( c ) - -
4 a 4 b ( l e t i d r o l i u t i x s HD- 7 + - -
HD- 37 + ( a ) - -
4 a 4 c k e n w i e HD- 5 , HD- 6 4 . + ( c ) - -
HD- 1 36
HD- 5 5 1 + + -
S a 5 b g / i l l c r i i c t e HD- 8 . HD- 1 2 9 + ? ?
6 e n t o t n o ( i d t ( s HD- 1 1 0 . 4 4 4 8 + ( a ) + +
6 s i i h t o Xi ( t i t s HD- 1 0 + + -
7 a i z , a w a i HD- 1 1 , HD- 6 8 + - -
HD- 1 2 7 , HD- 8 5 4 . + - +
HD- 2 2 9 , HD- 1 33,
HD- 1 37
HD- 2 7 2 + + -
HD- 8 4 7 + - +
8 a 8 b m 7 o r r i s o n t i HD- 1 2 + -
9 t o l w t o r t h l i i HD- 1 2 1 + - -
S e e r e f e r - c n c e 4 1 .
P r o t e i n s t h a t r e a c t w i t h o n l y s o m e o f t h e m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s t h a t
s p e c i f y a c r y s t a l p r - o t e i n t y p e a r e d e s i g n a t e d b y ' . A l l C r v I A - s p e c i f i c a n t i b o d -
i e s r e c o g n i z e d C r y l A ( b ) ; t w o d i d n o t b i n d t o C r y l A ( a ) : t w o o t h e r m o n o c l o n a l
a n t i b o d i e s d i d n o t r e a c t w i t h C r y l A ( c ) . He n c e , t h e l a s t t w o c r y s t a l p r o t e i n s
c o u l d b e d i s t i n g u i s h e d . p r o v i d e d t h a t n o o t h e r C r y l A p r o t e i n s w e r e p r e s e n t i n
t h e c r - y s t a l s .
Th e C r y l A s u b t y p e ( a o r c ) i s i n d i c a t e d w h e n k n o w n .
s p e c i e s t e s t e d . A n i n t e r e s t i n g o b s e r v a t i o n i s t h a t t h e t h r e e
C r y l A p r o t e i n s , w h i c h a r e s t r u c t u r a l l y v e r y c l o s e l y r e l a t e d .
a l s o s h o w l a r g e l y o v e r l a p p i n g a c t i v i t y s p e c t r a .
c r y I l G e n e s
Th e ( c r y l l g e n e s e n c o d e 6 5 - k Da p r o t e i n s w h i c h f o r m
c u b o i d a l i n c l u s i o n s i n s t r a i n s o f s e v e r a l s u b s p e c i e s : B .
t h i i r i i n g i e n i s i s s u b s p . k u r s t a k i HD- 1 a n d 1 4 o t h e r s t r a i n s , B .
t h i t i i n g i e n 1 s i s s u b s p . t h u i r i n t g i e n s i s B e r l i n e r . a n d B . t / l i i r i n l < g i -
e n . s i s s u b s p p . t o l w to r d t l i i a n d k e n t v a e ( 1 0 3, 1 0 4 ; W . R . W i d n e r ,
u n p u b l i s h e d r e s u l t s ) . Th e s e c r y s t a l p r o t e i n s w e r e p r e v i o u s l y
d e s i g n a t e d a s P 2 p r o t e i n s , a s o p p o s e d t o t h e 1 30 - k Da P 1
c r y s t a l p r o t e i n s p r e s e n t i n t h e s a m e s t r a i n s ( 1 0 5 ) .
Th e f i r s t c r V I I A g e n e w a s c l o n e d f r o m B . t l i l u r i n g i e n s i s
s u b s p . k i u r - s t a i k i HD- 2 6 3 a n d e x p r e s s e d i n B a c i l l u s i n e g a t e -
r i u m t ( 1 7 ) . C e l l s p r o d u c i n g t h e C r y l l A p r o t e i n w e r e t o x i c f o r
t h e l e p i d o p t e r a n s p e c i e s He l i o t t i i s v i r e s c e n s a n d
L y m u n n t r i a
d i s p a r a s w e l l a s f o r l a r v a e o f t h e d i p t e r a n A e d e s a e g v p t i .
W i d n e r a n d W h i t e l e y ( 9 8 ) c l o n e d t w o r e l a t e d g e n e s ( c r y I I A
a n d ( - r v I I B ) f r o m B . t h u r i n g i e n t . s i s s u b s p . k i i r - s t a k i HD- 1 .
B o t h g e n e s e n c o d e p r o t e i n s o f 6 33 a m i n o a c i d s w i t h a
p r e d i c t e d m o l e c u l a r m a s s o f 7 1 k Da , s l i g h t l y l a r g e r t h a n t h e
a p p a r e n t m o l e c u l a r m a s s d e t e r m i n e d f o r t h e P 2 p r o t e i n s
p r o d u c e d i n B . t h l i r i n g i e n t . s i s . B o t h g e n e s w e r e e x p r e s s e d i n
E . c o l i . a n d t h e r e c o m b i n a n t p r o t e i n s w e r e p u r i f i e d . A l -
t h o u g h t h e t w o p r o t e i n s a r e h i g h l y h o m o l o g o u s ( 8 7 % a m i n o
a c i d i d e n t i t y ) , t h e y d i f f e r i n t h e i r i n s e c t i c i d a l s p e c t r a . C r y l l A
i s a c t i v e a g a i n s t b o t h a l e p i d o p t e r a n ( M a n c l u c a s e x t a ) a n d a
d i p t e r a n ( A . ( l a e g p t i ) s p e c i e s , w h e r e a s c v I l I B i s t o x i c o n l y t o
t h e l e p i d o p t e r a n i n s e c t . Th e d e c i s i o n t o c l a s s i f y t h e p r o t e i n
e n c o d e d b y t h e l a t t e r g e n e a s C r y l l ( r a t h e r t h a n C r y l ) i s
b a s e d o n t h e s t r u c t u r a l s i m i l a r i t y o f C r y l l A a n d C r y l I B a n d
o n t h e f a c t t h a t t h e C r y l I p r o t e i n s s h o w a r a t h e r l i m i t e d
h o m o l o g y t o t h e o t h e r C r y p r o t e i n s ( s e e t h e s e c t i o n o n
c o n s e r v e d s e q u e n c e s ) . Th e DNA s e q u e n c e f u r t h e r i n d i c a t e d
t h a t c r v I I A i s t h e d i s t a l g e n e o f a n o p e r o n , c o n s i s t i n g o f t h r e e
o p e n r e a d i n g f r a m e s ( o : f l , o , i : 2 , a n d c r v I I A ) . Th e g e n e
p r o d u c t s o f
o , J f 2
a n d c r y I I A c o u l d b e d e t e c t e d i n c u b o i d a l
c r y s t a l s i n s e v e r a l B . t h i n i i s g i e t i s i s s u b s p e c i e s . I t i s u n c l e a r
w h e t h e r t h e o r f l a n d c r v NI I I B p r o d u c t s a r e a l s o p r e s e n t i n t h e
c r y s t a l s . Th e o i J 2 g e n e p r o d u c t , w h i c h i s h i g h l y i m m u n o -
g e n i c , h a s a n u n u s u a l r e p e a t e d s t r u c t u r e ; t h e f u n c t i o n s o f t h e
p r o t e i n s e n c o d e d b y o i f l a n d o i ; f 2 a r e n o t k n o w n .
Th e r e p o r t e d s e q u e n c e s o f t h e t w o p r e v i o u s l y d e s c r i b e d
c r v I I A g e n e s ( 1 7 , 9 8 ) a r e i d e n t i c a l , e x c e p t t h a t Do n o v a n e t
a l . ( 1 7 ) i d e n t i f i e d a n o p e n r e a d i n g f r a m e o f 5 9 0 r a t h e r t h a n
6 33 a m i n o a c i d s . Th i s d i f f e r e n c e i s t h e r e s u l t o f a s e q u e n c i n g
e r r o r ( t h e i n s e r t i o n o f o n e a d d i t i o n a l t h y m i d i n e r e s i d u e
[ W .
P . Do n o v a n , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ] ) .
A s s h o w n
b e l o w , t h e c r y l l g e n e s s h o w a r a t h e r l i m i t e d h o m o l o g y t o t h e
o t h e r c r y g e n e s .
c r y I l I G e n e s
Th r e e C o l e o p t e r a - s p e c i f i c B .
t l t i i t g i - i g i e i t s i s
s t r a i n s h a v e
b e e n d e s c r i b e d s o f a r : B . t l h l r i i t g i e i t s i s s u b s p . t e n e b r i o n i s
( 5 3) , B . t l t l u r i , t g i e n i s i s s u b s p . s a u n i d i e g o ( 36 ) , a n d B . t l i i r i n g -
i e i t s i s E G 2 1 5 8 ( 1 8 ) . E a c h o f t h e s t r a i n s p r o d u c e s r h o m b o i d a l
c r y s t a l s c o n t a i n i n g o n e m a j o r p r o t e i n . C l o n i n g a n d s e q u e n c -
i n g d e m o n s t r a t e d t h e p r e s e n c e o f t h e s a m e c r y s t a l p r o t e i n
g e n e i n a l l t h r e e s t r a i n s . Th e g e n e , e x p r e s s e d i n E . c o l i ,
d i r e c t s t h e s y n t h e s i s o f a 7 2 - k Da p r o t e i n t o x i c f o r t h e
C o l o r a d o p o t a t o b e e t l e ( L e p t i i o s a r c - s a d e c e m n l i n e a t a ) . Th i s
p r o t e i n i s c o n v e r t e d i n t o a 6 6 - k Da t o x i n b y s p o r e - a s s o c i a t e d
TA B L E 5 . To x i c i t y o f c r y s t a l p r o t e i n s a g a i n s t f i v e L e p i d o p t e r a s p e c i e s "
L C , , , o f p r o t e i n " f o r :
C r y B . t t I 1 i t t i i f i e i Ni S s L a b s p .
p r - o t e i n a n d s t r a i n P i ' r i , i sh r o . s . s i i c o e M i t t l o s x . v t a He l i o t h i . s l i r } s C ( t I N M o a n e s t r b r o a s . s i c o , . S p o l o p t e r a o l i t t o r o l i . s
( r L g / m ( n g / c m 2 ) ( n g / c m 2 ) ( n g / c m 2 ) ( n g / c m 2 )
C r y l A ( a ) a i z t , a w a i HD- 6 8 0 . 8 5 . 2 9 ( ) 1 6 5 >1 , 35 0 )
C r y l A ( b ) b e r l l i n e r 1 7 1 5 0 ) . 7 8 . 6 1 0 1 6 2 >1 , 35 0
C r y l A ( c ) k i i l - s t t i k i HD- 7 3 0 . 3 5 . 3 1 . 6 2 . t ) 0 0 >1 , 35 0
C r y l B t l t t / r i t t g i e i t s i s 4 4 1 2 2 . 8 >6 2 5 >6 2 5 >1 , 35 0 >1 , 35 0 )
C r y l C e t t o t n o c i d i u s HD- 1 1 0 6 . 0 ) >1 2 8 >2 5 6 2 2 1 0 4
C r y l l ) a i z o t i w t i HD- 6 8 >7 5 5 >2 5 6 >1 . 35 0 >1 , 35 0
P r o t e i n s w e r e p u r i f i e d f r o m r e c o m b i n a n t E . c o / i c l o n e s o r f r o m B . t h u t i n g i e n t s i . s c r y s t a l c o n t a i n i n g a s i n g l e c r y s t a l p r o t e i n [ C r y l A ( c ) f r o m B . t l l l l t t i g i 1 i t s i . s
s u b s p . k u r s i a k i HD- 7 3 a n d C r y l B f r o m B . t l h t t r i n g i e n . s i . s s L a b s p . t t t r i n g i e t . s i . s 4 4 1 2 ) a n d s o l u b i l i z e d p r i o r t o t h e b i o a s s a y .
"
Da t a a r c f r o m r - e f e r e n c e 4 1 ( f o r - C r y l A a n d C r y I 1 B ) o r H. H6 f t e . u i n p u b l i s h e d o b s e r v a t i o n s ( f o r C r y l C a i n d C r y I D) . L C , , , S t 0 ( l l e t h a l c o n c e n t r a t i o n .
M I C R O B I O I . . R E V .

o
n

J
u
n
e

2
9
,

2
0
1
2

b
y

g
u
e
s
t
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

I NS E C TI C I DA L C R YS TA L P R O TE I NS O F B . THU R I NG I E NS I S 2 4 7
FI G . 2 . C o n s e r v e d a m i n o a c i d s e q u e n c e b l o c k s . A m i n o a c i d s e q u e n c e b l o c k s c o n s e r v e d f o r a l l c r y s t a l p r o t e i n s e n c o d e d b y c r y g e n e s .
e x c e p t C r y l I a n d C r y l V D, a r e s h o w n . Th e p o s i t i o n o f t h e s e b l o c k s i n t h e s e q u e n c e i s s h o w n i n Fi g . 1 . A m i n o a c i d s m a r k e d b y t h e s h a d e d
a r e a a r e i d e n t i c a l o r c o n s e r v a t i v e l y c h a n g e d f o r a t l e a s t 8 o f t h e 1 0 c r y s e q u e n c e s . Th e r e g i o n i n t h e C r y l I A . C r y I I B , a n d C r y l V D a m i n o a c i d
s e q u e n c e h o m o l o g o u s t o t h e b l o c k 1 s e q u e n c e i s a l s o s h o w n .
p r o t e a s e s w h i c h r e m o v e 5 7 N- t e r m i n a l a m i n o a c i d s ( 6 9 ) . A s
d i s c u s s e d b e l o w , c r l I I I A i s h o m o l o g o u s t o t h e t o x i n - e n -
c o d i n g d o m a i n o f t h e c r 1 a n d c ( r y I V g e n e s a n d l a c k s a r e g i o n
c o r r e s p o n d i n g t o t h e 3' h a l f o f t h e s e m o l e c u l e s . De l e t i o n
a n a l y s i s d e m o n s t r a t e d t h a t t h e g e n e c a n n o t b e t r u n c a t e d a t
t h e 3' e n d w i t h o u t t h e l o s s o f t o x i c a c t i v i t y ( D. A . Fi s c h h o f f ,
S o c . I n v e r t e b r . P a t h o l . A b s t r . Tw e n t y - Fi r s t M e e t i n g . a b s t r .
6 0 , p . 6 0 , 1 9 8 8 ) . I n t e r e s t i n g l y , t h e 1 2 C - t e r m i n a l a m i n o a c i d s
o f t h i s p r o t e i n a r e h i g h l y s i m i l a r t o t h e s e q u e n c e a t t h e C
t e r m i n u s o f t h e s m a l l e s t t o x i c f r a g m e n t o f C r y I A ( b ) , a s
d e t e r m i n e d b y d e l e t i o n a n a l y s i s ( d e s c r i b e d a b o v e ) . I n a d d i -
t i o n , a l l b u t t h r e e o t h e r c r y s t a l p r o t e i n s c o n t a i n a b l o c k o f 1 2
c o n s e r v e d a m i n o a c i d s a t a c o m p a r a b l e p o s i t i o n ( Fi g . 2 ,
b l o c k 5 ) . Th i s m a k e s i t r e a s o n a b l e t o a s s u m e t h a t t h e C
t e r m i n u s o f t h e t o x i c f r a g m e n t o f t h e s e c r y s t a l p r o t e i n s w i l l
a l s o b e d e f i n e d b y t h i s s e q u e n c e . De l e t i o n s t u d i e s o n c r v -
I A ( a ) , c r v I A ( c ) ( c i t e d a b o v e ) , a n d c r v I V B ( 7 4 ) a t l e a s t d o n o t
c o n t r a d i c t t h i s a s s u m p t i o n .
Di p t e r a - A c t i v e C r y s t a l P r o t e i n G e n e s ( c r y l V a n d c y t A )
Th e c r v l V c l a s s o f c r y s t a l p r o t e i n g e n e s i s c o m p o s e d o f a
r a t h e r h e t e r o g e n e o u s g r o u p o f Di p t e r a - s p e c i f i c c r y s t a l p r o -
V O L . 5 3, 1 9 8 9
Yv :
- e e '

o
n

J
u
n
e

2
9
,

2
0
1
2

b
y

g
u
e
s
t
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

2 4 8 HO FTE A NI ) W HI TE L E Y
t e i n g e n e s . Fo u r d e s c r i b e d g e n e s , a s w e l l a s t h e ( c t A g e n e .
w e r e a l l i s o l a t e d f r o m t h e s a m e 7 2 - M Da p l a s m i d p r e s e n t i n
s t r a i n s o f B . t h u r i n i g i e n s i s s u b s p . i s r a c l e n s i s . Th e ( l I V A .
c r NI V B , c r v I V C , a n d c r v I V D g e n e s e n c o d e p r o t e i n s w i t h
p r e d i c t e d m o l e c u l a r m a s s e s o f 1 35 . 1 2 8 . 7 8 . a n d 7 2 k Da ,
r e s p e c t i v e l y . Th e s e p r o t e i n s a s s e m b l e , t o g e t h e r w i t h t h e
2 7 - k Da c v t A g e n e p r o d u c t , i n o v o i d c r y s t a l c o m p l e x e s . A
c r y s t a l c o m p l e x w i t h t h e s a m e o r a v e r y s i m i l a r p r o t e i n
c o m p o s i t i o n h a s a l s o b e e n o b s e r v e d i n o n e o t h e r s t r a i n , B .
t h l i i r i n i g i e n s i s s u b s p . m n o r r i s o n i P G - 1 4 . Th e b i o c h e m i c a l
p r o p e r t i e s a n d t h e t o x i c i t y o f t h e d i f f e r e n t c r y s t a l c o m p o -
n e n t s h a v e b e e n e x t e n s i v e l y r e v i e w e d b y Fe d e r i c i e t a l . ( 2 2 ) .
He r e w e w i l l s u m m a r i z e o n l y t h e m o s t r e c e n t d a t a .
To x i c i t y t e s t s w i t h c r y s t a l p r o t e i n p r e p a r a t i o n s . d e r i v e d
e i t h e r f r o m B . t l u r i n g i c e n s i s s u b s p . i s r a e l e n s i s c r y s t a l s ( 1 2 )
o r f r o m r e c o m b i n a n t E . c o l i ( 6 . 1 3, 1 5 ) o r B a c i l l u s ( 1 6 , 2 5 .
1 0 6 ) s t r a i n s , p r o v i d e t h e f o l l o w i n g p i c t u r e . A l l c r y s t a l c o m -
p o n e n t s a r e , t o v a r i o u s e x t e n t s , t o x i c a g a i n s t l a r v a e o f
c e r t a i n m o s q u i t o s p e c i e s . S o l u b i l i z a t i o n o f t h e p r o t e i n s
r e d u c e s t h e t o x i c i t y d r a m a t i c a l l y ( 5 0 - t o 1 0 0 - f o l d ) . Th i s i s
a t t r i b u t e d n o t t o a r e a l l o s s o f t o x i c i t y b u t r a t h e r t o r e d u c e d
l e v e l s o f t o x i n i n g e s t i o n b y l a r v a e o w i n g t o t h e i r f i l t e r -
f e e d i n g b e h a v i o r . No s i n g l e c r y s t a l c o m p o n e n t i s a s t o x i c a s
t h e i n t a c t c r y s t a l c o m p l e x . O n e p o s s i b l e e x p l a n a t i o n f o r t h i s
i s t h a t t w o o r m o r e p r o t e i n s a c t s y n e r g i s t i c a l l y , y i e l d i n g a
h i g h e r a c t i v i t y t h a n w o u l d b e e x p e c t e d o n t h e b a s i s o f t h e
s p e c i f i c t o x i c i t y o f t h e i n d i v i d u a l p r o t e i n s . Th e f o l l o w i n g
l i n e s o f e v i d e n c e s u g g e s t t h a t t h i s i s i n d e e d t h e c a s e . Th e
2 7 - k Da c v t A - s p e c i f i e d p r o t e i n e x h i b i t s n o o r a r a t h e r l o w
d i p t e r a n a c t i v i t y ( s e e b e l o w ) . Ho w e v e r , s u b t o x i c d o s e s o f
t h i s p r o t e i n w e r e r e p o r t e d t o s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e t h e t o x -
i c i t y o f t h e c a . 1 30 - k Da ( C r y I V A a n d C r y I V B ) a n d t h e c a .
7 0 - k Da ( C r y I V D) p r o t e i n f r a c t i o n s o f B . t l i i i n i g i e i i s i s s u b s p .
i s r ( l e l e n s i s c r y s t a l s a g a i n s t A .
a l e g y p t i
l a r v a e ( 1 0 2 ) . S i m i l a r
o b s e r v a t i o n s w e r e d e s c r i b e d f o r c o m b i n a t i o n s o f C r y l V B
a n d C r y I V C a g a i n s t l a r v a e o f C l d . v x p i ) i P e n s ( 1 5 ) .
Th e a r c h i t e c t u l e o f c r v NI V A a n d c r Nl I V B i s s i m i l a r t o t h a t o f
t h e c r l I g e n e s . Th e y a l s o e n c o d e c a . 1 30 - k Da p r o t e i n s ,
w h i c h a r e p r o t e o l y t i c a l l y c o n v e r t e d i n t o s m a l l e r t o x i c f r a g -
m e n t s . Th e r e i s s o m e c o n t r o v e r s y a b o u t t h e e x a c t m o l e c u l a r
m a s s e s o f t h e t o x i c c o r e f r a g m e n t s , w h i c h v a r y f r o m 5 3 ( 1 2 )
t o 7 8 ( 1 3) k Da i n d i f f e r e n t s t u d i e s . Th e 3' h a l v e s o f t h e s e
g e n e s a r e a l m o s t i d e n t i c a l t o e a c h o t h e r a n d a r - e h i g h l y
s i m i l a r t o t h e 3' h a l v e s o f t h e c r l g e n e s ( Fi g . 1 ) . Th i s
s u g g e s t s t h a t t h e t o x i c f r a g m e n t o l t C r y l V A a n d C r y I V B i s
a l s o l o c a l i z e d i n t h e N- t e r m i n a l h a l f . Th i s w a s c o n f i r m e d f o r
t h e c r y I V B g e n e p r o d u c t t h r o u g h d e l e t i o n a n a l y s i s ( 1 3, 1 5 ,
7 4 ) .
Th e c r y ' I V C g e n e e n c o d e s a p r o t e i n w i t h a p r e d i c t e d
m o l e c u l a r m a s s o f 7 8 k Da . A s e c o n d o p e n r e a d i n g f r a m e
( O R F2 ) i s l o c a l i z e d 4 5 b a s e p a i r s d o w n s t r e a m f r o m t h e s t o p
c o d o n o f t h i s g e n e ( O R FI ) . O R FI s h o w s h o m o l o g y t o t h e 5 '
h a l f o f t h e o t h e r c r v g e n e s , w h e r e a s O R F2 c o r r e s p o n d s t o
t h e
r e m a i n i n g 3' p a r t ( 8 8 ) . ' I Th i s g e n e c o n f i g u r a t i o n h a s
p r o b a b l y e v o l v e d t h r o u g h t h e i n s e r t i o n o f a DNA f r a g m e n t
i n t o a
g e n e t h a t o t h e r w i s e w o u l d e n c o d e a c a . 1 30 - k Da
p o l y p e p t i d e . W h e n i n t r o d u c e d i n t o B . s u b t i l i s o r i n t o a c u r e d
B . t h u r i n g i c e n s i s s u b s p . i s r a c l c e n s i s s t r - a i n , c r v NI V C d i r e c t s t h e
e x p r e s s i o n o f a t o x i c p r o t e i n o f c a . 5 8 k Da , p r e s u m a b l y a
p r o t e o l y t i c f r a g m e n t o f t h e O R FI g e n e p r o d u c t . M i n o r
a m o u n t s o f t h i s 5 8 - k Da p r o t e i n h a v e a l s o b e e n f o u n d i n B .
t l h u r i n g i c n s i s s u b s p . i s r a l e n i s i s c r y s t a l s ( 2 5 ) . Th e r e g i o n
s p e c i f y i n g t h e a c t i v e t o x i n i n c r lI V A . ( r y I V B . a n d ( c r I V C i s
h i g h l y d i v e r g e n t . C o n s e r v e d a m i n o a c i d s a r - e r e s t r i c t e d
m a i n l y t o f i v e s e q u e n c e b l o c k s , w h i c h a r e a l s o c o n s e r - v e d f o r
t h e
C r y l a n d C r y l l I A p r o t e i n s ( s e c b e l o w ) .
I ' h e
c r YI V D g e n e e n c o d e s a 7 2 - k Da p r o t e i n ( 1 6 ) , w h i c h i s
a m a j o r c o m p o n e n t o f t h e B . t h l u r i n i g i e n s i s s u b s p . i s r a c l k e s i s
c r y s t a l s ( 2 2 ) . Th i s c r y s t a l p r o t e i n , u n l i k e a l l o t h e r k n o w n
c r . y - e n c o d e d p r o t e i n s , i s p r o t e o l y t i c a l l y c o n v e r t e d i n t o a n
a c t i v e f r a g m e n t o f c a . 30 k Da ( 1 2 , 4 4 , 7 5 ) . Th e e x a c t
l o c a l i z a t i o n o f t h i s f r a g m e n t i n t h e i n t a c t p r o t e i n i s n o t
k n o w n . S e q u e n c e c o m p a r i s o n s r e v e a l a r a t h e r l i m i t e d h o -
m o l o g y t o t h e o t h e r c r y s t a l p r o t e i n s i n a s h o r t r e g i o n o f t h e
m o l e c u l e ( b e t w e e n c o d o n s 4 5 a n d 1 7 4 ) .
Th e 2 7 - k Da p r o t e i n e n c o d e d
b y c t A s h o w s n o
s e q u e n c e
h o m o l o g y t o t h e o t h e r c r y s t a l p r o t e i n g e n e s . I n a d d i t i o n , t h i s
p r o t e i n , p u r i f i e d f r o m B .
t h u r i n g i e n s i s s u b s p . i s r a e l e n i s i s
c r y s t a l s o r f r o m a r e c o m b i n a n t B . s u b t i l i s c l o n e , s h o w s
u n i q u e f u n c t i o n a l f e a t u r e s . I t i s c y t o l y t i c f o r a v a r i e t y o f
i n v e r t e b r a t e a n d v e r t e b r a t e c e l l s , i n c l u d i n g m a m m a l i a n
e r y t h r o c y t e s ( 8 7 . 9 5 ) ; h o w e v e r , i t s i n v i v o i n s e c t i c i d a l a c t i v -
i t y i s u n c e r t a i n . S o m e a u t h o r s ( 6 8 , 9 5 ) h a v e s h o w n t h a t t h i s
p r o t e i n h a s a w e a k t o x i c i t y t o A .
a c g y p t i
l a r v a e ( 5 0 % l e t h a l
c o n c e n t r a t i o n , 1 1 0 t o 1 2 5 p . g / m l , c o m p a r e d w i t h c a . 1 n g / m l
f o r i n t a c t c r y s t a l s ) , w h e r e a s o t h e r s h a v e f a i l e d t o d e m o n -
s t r a t e a n y i n s e c t t o x i c i t y ( 2 2 ) .
E XP R E S S I O N O F c r y G E NE S
Th e s t r u c t u r e o f t h e ( c v I A ( a ) p r o m o t e r r e g i o n h a s b e e n
r e v i e w e d p r e v i o u s l y ( 9 7 ) . I n b r i e f , i n B .
t h l i n i i i i g i e n s i s ,
( c v I A ( a ) i s t r a n s c r i b e d f r o m t w o s t a r t s i t e s , l o c a t e d c a . 1 6
b a s e p a i r s a p a r t : B t 1 , w h i c h i s a c t i v a t e d e a r l y i n s p o r u l a t i o n
( t ,
t o t , [ w h e r e t , i n d i c a t e s t h e n u m b e r o f h o u r s a f t e r t h e
o n s e t o f s p o r u l a t i o n ] ) , a n d B t I I , w h i c h i s a c t i v a t e d a t
m i d s p o r u l a t i o n ( t 4 t o t 5 ( 1 0 1 ) . I n v i t r o t r a n s c r i p t i o n f r o m B t
I i s c a t a l y z e d b y a s p e c i f i c B . t h l u i i n , - i g i e c i s i s r i b o n u c l e i c a c i d
( R NA ) p o l y m e r a s e c o n t a i n i n g a n e w s i g m a s u b u n i t o f C c a . 35
k Da ( 8 ) ; v e g e t a t i v e g e n e s a r e t r a n s c r i b e d b y t h e p r e d o m i n a n t
R NA p o l y m e r a s e , w h i c h c o n t a i n s a s i g m a s u b u n i t o f 6 1 k Da .
T' r a n s c r i p t i o n f r o m B t I I r e q u i r e s a s e c o n d R NA p o l y m e r a s e
c o n t a i n i n g a n o t h e r n e w s i g m a s u b u n i t o f c a . 2 8 k Da ( K. L .
B r o w n a n d H. R . W h i t e l e y , u n p u b l i s h e d o b s e r v a t i o n s ) . Th e
c r v l A ( b ) a n d
c r YI A ( c ) g e n e s a r e r e p o r t e d t o h a v e t h e s a m e
p r o m o t e r s t r u c t u r e c i s ( c r I A ( a ) ( 2 , 8 8 ) , a n d t r a n s c r i p t i o n o f
s e v e r a l o t h e r g e n e s ( c r , x I B , c r v I I A , a n d
c Yt A )
r e q u i r e s t h e
s i g m a - 35 - c o n t a i n i n g R NA p o l y m e r a s e ( B r o w n a n d W h i t e l e y ,
u n p u b l i s h e d ) . L a s t l y . m a n y c r y s t a l p r o t e i n g e n e s h a v e a
s t r o n g t e r m i n a t o r . W o n g a n d C h a n g ( 1 0 0 ) s h o w e d t h a t t h e
p r e s e n c e o f t h e t e r m i n a t o r s i g n i f i c a n t l y e n h a n c e s t h e s t a b i l -
i t y o f c r y s t a l p r o t e i n m e s s e n g e r R NA ( m R NA ) .
I n S p o ' B a c i l l u s s u b t i l i s , t r a n s c r i p t i o n o f c i v l A ( a ) i s
p r e d o m i n a n t l y f r o m t h e B t I s t a r t s i t e ( H. E . S c h n e p t , W . R .
W i d n e r . K. L . B r o w n , a n d H. R . W h i t e l e y , u n p u b l i s h e d
o b s e r v a t i o n s ) , a n d p r e l i m i n a r y e v i d e n c e ( B r o w n a n d W h i t e -
l e y , u n p u b l i s h e d ) i n d i c a t e s t h a t i n v i t r o t r a n s c r i p t i o n r e -
q u i r e s a B . s i i h t i l i s R NA p o l y m e r a s e c o n t a i n i n g a s i g m a
s u b u n i t o f c a . 35 k Da . Th e i d e n t i t y o f t h e R NA p o l y m e r a s e
r e s p o n s i b l e f o r t h e m u c h w e a k e r t r a n s c r i p t i o n f r o m B t I I i n
S p o ' c e l l s h a s n o t b e e n i n v e s t i g a t e d . Tr a n s c r i p t i o n m a p p i n g
s h o w e d t h a t B t I i s u t i l i z e d i n t h e s p o l i C , s p o l I A C , a n d
s p o l I l E s p o r u l a t i o n m u t a n t s o f B . s u b t i l i s , b u t n o t i n t h e
. s p o I I 4 1 m u t a n t . A s s a y s o f c h l o r a m p h e n i c o l a c e t y l t r a n s f e r -
a s e f u s e d t o t h e c r v
' l A ( a )
p r o m o t e r s h o w e d l i t t l e o r n o
u t i l i z a t i o n o f t h e p r o m o t e r ( < 5 % a c t i v i t y ) i n s p o O A , s p o O B ,
s p o ( F. s p o O H, s p o I E , a n d s p o I l A A m u t a n t s a n d p a c r t i a l
a c t i v i t y ( 4 0 %) i n s p o O J m u t a n t s . Ho w e v e r , t h e d e p e n d e n c e
o n s p o r u l a l t i o n m a y b e r e l a t e d t o t h e v e c t o r u s e d i n c l o n i n g ,
s i n c e S h i v a k u m a r e t a l . ( 8 6 ) r e p o r t e d t h a t a c r y s t a l p r o t e i n
g e n e c l o n e d i n t o a d i f f e r e n t p l a s m i d w a s n o t r e g u l a t e d b y
s p o r u l a t i o n .
M I C R O B I ( ) I - . R E V .

o
n

J
u
n
e

2
9
,

2
0
1
2

b
y

g
u
e
s
t
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

I NS E C TI C I DA L C R YS Tl A L P R O TE I NS O F B . THU R I NG I E NS I S 2 4 9
I n E . ( o l i , ( r v I A ( a ) i s t r a n s c r i b e d f r o m a s i t e a t o r v e r y
n e a r B t I I ; t h e i d e n t i t y o f t h e p o l y m e r a s e r e s p o n s i b l e f o r t h i s
t r a n s c r i p t i o n h a s n o t b e e n e s t a b l i s h e d . U n e x p e c t e d l y .
e x p r e s s i o n o f t h e c r v I A ( a ) g e n e i n E . c o l i , b u t n o t i n B .
s i l b t i l i s , i s r e g u l a t e d n e g a t i v e l y b y a r e g i o n o f DNA l o c a t e d
a t a b o u t p o s i t i o n - 8 7 t o - 2 5 8 r e l a t i v e t o B t I . De l e t i o n o r
i n t e r r u p t i o n o f t h i s r e g i o n e n h a n c e s g e n e e x p r e s s i o n a p p r o x -
i m a t e l y 1 0 - f o l d ( 8 0 ) . De l e t i o n o f t h i s r e g i o n a l s o y i e l d s
i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f c r y I A ( b ) ( 8 8 ) . Th e b i o c h e m i c a l b a s i s
f o r t h i s r e g u l a t o r y m e c h a n i s m h a s n o t b e e n i n v e s t i g a t e d .
Th e r e i s o n e a d d i t i o n a l r e g u l a t o r y m e c h a n i s m t h a t s h o u l d
b e m e n t i o n e d . Fu l l e x p r e s s i o n o f t h e c y t A g e n e i n E . c o l i
( i . e . , a b u n d a n t s y n t h e s i s o f C y t A , t o x i c i t y t o m o s q u i t o
l a r v a e , a n d h a e m o l y t i c a c t i v i t y ) r e q u i r e s t h e p r e s e n c e o f a
s e g m e n t o f B . t / l O l i i l l g i e c n s i s s u b s p . i s r a e l e n / s i s DNA l o c a t e d
a b o u t 4 k i l o b a s e s u p s t r e a m f r o m t h e c ( t A g e n e ( 6 8 ) . Th i s
r e g i o n i s n o t r e q u i r e d f o r e x p r e s s i o n o f t h e ( c t A g e n e i n B .
s i , b t i l i s ( 9 5 ) . Th e u p s t r e a m DNA t h a t i s i n v o l v e d i n f u l l
e x p r e s s i o n e n c o d e s a 2 0 - k Da p e p t i d e ( 1 ) , w h i c h a c t s i n t r a n s
a t t h e p o s t t r a n s c r i p t i o n a l l e v e l t o i n c r e a s e t h e a m o u n t o f
C y t A p r o d u c e d . Th i s e f f e c t o c c u r s a f t e r t h e i n i t i a t i o n o f
t r a n s l a t i o n ; p o s s i b l y t h e 2 0 - k Da p e p t i d e i s i n v o l v e d i n p r o -
t e c t i n g C y t A f r o m d e g r a d a t i o n . Th e g e n e e n c o d i n g t h e
2 0 - k Da p e p t i d e i s a p p a r e n t l y t r a n s c r i b e d a s p a r t o f a n o p e r o n
w h i c h c o n t a i n s
c r YI V D,
a n d i t s p r o d u c t i s s y n t h e s i z e d c o n -
c u r r e n t l y w i t h C y t A , b e g i n n i n g a t a b o u t t . I n t e r e s t i n g l y , t h e
2 0 - k Da p r o t e i n i s p r e s e n t i n B .
t / h u r i n g i e l S i s
s u b s p . i s r a / e l n -
s i s c r y s t a l s ; t h u s , c r y s t a l s m a y c o n t a i n n o t o n l y m i x t u r e s o f
s e v e r a l i n s e c t i c i d a l p r o t e i n s , b u t a l s o r e g u l a l t o r y p r o t e i n s o r
p r o t e i n s s u c h a s t h e o i f 2 p r o d u c t ( p a r t o f t h e ( c r I I A o p e r o n )
w h i c h m a y h a v e s o m e s t r u c t u r a l f u n c t i o n .
M O DE O F A C TI O N
M o s t s t u d i e s o f t h e h i s t o p a t h o l o g y a n d m o d e o f a c t i o n
h a v e b e e n c a r r i e d o u t o n l e p i d o p t e r a n l a r v a e w i t h o f t e n
r a t h e r i l l - d e f i n e d t o x i n p r e p a r a t i o n s d e r i v e d f r o m w h o l e B .
t / m u r i n g i e n s i s
c r y s t a l s . I n s u m m a r y , t h e s e i n v e s t i g a t i o n s ( r e -
v i e w e d i n d e t a i l i n r e f e r e n c e 6 3) s h o w e d t h a t t h e c r y s t a l
p r o t e i n s d i s s o l v e i n t h e l a r v a l i n s e c t m i d g u t a n d a r e p r o t e -
o l y t i c a l l y c o n v e r t e d i n t o a t o x i c c o r e f r c a g m e n t . Th e e p i t h e -
l i a l c e l l s o f t h e m i d g u t , o r c u l t u r e d i n s e c t c e l l s , r a p i d l y s w e l l
a n d b u r s t a f t e r t o x i n t r e a t m e n t . Th e a b s e n c e o f a l a g p e r i o d
b e f o r e t h e a p p e a r a n c e o f t h e f i r s t s y m p t o m s s u g g e s t s t h a t t h e
t o x i n d o e s n o t n e e d t o b e i n t e r n a l i z e d t o m e d i a t e c y t o t o x i c -
i t y . R e c e n t i n v e s t i g a t i o n s s h e d m o r e l i g h t o n t h e m e c h a n i s m
o f a c t i o n . Kn o w l e s a n d E l l a r ( 4 9 ) s t u d i e d t h e e f f e c t o f B .
t l / l i u r l i g i e s l i i s t o x i n s o n t h e p e r m e a b i l i t y o f c u l t u r e d i n s e c t
c e l l s b y u s i n g r a d i o a c t i v e l y l a b e l e d s m a l l m o l e c u l e s . A f t e r
t o x i n t r e a t m e n t , t h e y o b s e r v e d a r a p i d r e l e a s e o f t h e s m a l l
m o l e c u l e s , w h i c h l e a k e d o u t o f t h e c e l l b e f o r e t h e l a r g e r
o n e s . I n a d d i t i o n , c y t o l y s i s w a s i n h i b i t e d o r d e l a y e d b y
o s m o t i c p r o t e c t a n t s . O n t h e b a s i s o f t h e s e a n d o t h e r o b s e r -
v a t i o n s , t h e a u t h o r s p r o p o s e d t h a t a l l f o u r o f t h e B . t / l i l -
g i e n s i s
t o x i n p r e p a r a t i o n s t h e y t e s t e d ( d e r i v e d f r o m B .
t / 1 1 1 i n i e n s i e l . $ i s s u b s p p . k u r s t a k i HD- 1 , a i z ( l a w a i HD- 2 4 9 , t h / i r -
i n g i e n i s i s HD- 5 0 , a n d i s r a e l e n s i s I FS - 7 3) p r o v o k e a c o l l o i d -
o s m o t i c l y s i s a s d e s c r i b e d f o r - m e l l i t i n . A c c o r d i n g t o t h i s
m o d e l , t h e s e t o x i n s i n d u c e t h e f o r m a t i o n o f s m a l l , n o n s p e -
c i f i c p o r e s ( 0 . 5 t o 1 n m ) i n t h e m e m b r a n e o t s u s c e p t i b l e c e l l s ,
r e s u l t i n g i n a n e t i n f l u x o f i o n s a n d a n a c c o m p a n y i n g i n f l o w
o f w a t e r . A s a r e s u l t , t h e c e l l s s w e l l a n d l y s e .
O n e h a s t o r e m a r k h e r e t h a t r e s u l t s f r o m i n v e s t i g a t i o n s o n
c u l t u r e d i n s e c t c e l l s s h o u l d
a l w a y s
b e c o n f i r m e d b y s t u d i e s
o n l a r v a l g u t t i s s u e f o r t h e f o l l o w i n g r e a s o n s : ( i ) t h e a v a i l a b l e
c e l l l i n e s a r e d e r i v e d f r o m t i s s u e s o t h e r t h a n t h e m i d g u t a n d
a r e t h e r e f o r e n o t a p r i m a r y t a r g e t o f B . t h u r i n g i e n i s i s t o x i n s
i n v i v o ; ( i i ) t o x i c e f f e c t s o n i n s e c t c e l l l i n e s a r e o b s e r v e d
o n l y
a t m u c h h i g h e r t o x i n c o n c e n t r a t i o n s ( 1 0 0 - f o l d ) t h a n t h o s e
r e q u i r e d f o r i n v i v o t o x i c i t y ; a n d ( i i i ) t h e s p e c i f i c i t y
f o r c e l l
l i n e s d e r i v e d f r o m d i f f e r e n t i n s e c t s p e c i e s d o e s n o t
s t r i c t l y
c o r r e l a t e w i t h t h e i n v i v o h o s t r a n g e o f c r y s t a l p r o t e i n s ( 4 8 ,
9 9 ) .
B i o c h e m i c a l s t u d i e s o n i s o l a t e d m i d g u t m e m b r a n e s l e a d t o
s l i g h t l y d i f f e r e n t c o n c l u s i o n s . S a c c h i e t a l . ( 7 6 ) s t u d i e d t h e
K- a m i n o a c i d c o t r a n s p o r t i n t o b r u s h b o r d e r m e m b r a n e
v e s i c l e s ( B B M V s ) p r e p a r e d f r o m m i d g u t s o f P i e r i s b r a s s i c i e
l a r v a e . Tr e a t m e n t w i t h t h e t o x i n ( i . e . , p u r i f i e d , s o l u b i l i z e d ,
a n d a c t i v a t e d c r y s t a l s f r o m B . t h i u r i n g i e n s i s s u b s p .
k i , r - s t i k i
HD- 1 a n d B . t h i u r i n g i e n s i s s u b s p . t h / u l r i n g i e n s i s 4 4 1 2 ) i m m e -
d i a t e l y i n h i b i t e d t h e t r - a n s p o r t o f l a b e l e d h i s t i d i n e d r i v e n
b y
a K' g r a d i e n t . A s t h e y o b s e r v e d n o i n f l u e n c e o f t h e t o x i n o n
t h e K' - a m i n o a c i d c o t r a n s p o r t e r i t s e l f , t h e y r e a s o n e d t h a t
t h e K' g r a d i e n t m u s t b e d i s s i p a t e d t h r o u g h f o r m a t i o n o f
c h a n n e l s i n t h e b r u s h b o r d e r m e m b r a n e
u p o n
t o x i n t r e a t -
m e n t . ' I ' h e a m i n o a c i d t r a n s p o r t i n t h i s t i s s u e c a n a l s o b e
d r i v e n b y a Na ' g r a d i e n t , a l t h o u g h l e s s
e f f i c i e n t l y .
Ho w -
e v e r , t h e a u t h o r s f a i l e d t o d e m o n s t r a t e a n y
i n f l u e n c e o f t h e
t o x i n o n t h e Na ' - d r i v e n a m i n o a c i d c o t r a n s p o r t .
Fr o m t h i s ,
t h e y c o n c l u d e d t h a t t h e c h a n n e l s m i g h t b e K'
s p e c i f i c .
I n c o n c l u s i o n , t h e s e s t u d i e s s u g g e s t t h a t B .
t h u i r i n g i e n s i s
t o x i n s i n d u c e t h e f o r m a t i o n o f p o r e s i n t h e m e m b r a n e o f
b o t h m i d g u t e p i t h e l i a l c e l l s a n d c u l t u r e d i n s e c t c e l l s . Di r e c t
p e r m e a b i l i t y m e a s u r e m e n t s o n B B M V s w i t h
r a d i o a c t i v e l y
l a b e l e d i o n s a r e n e e d e d t o s o r t o u t w h e t h e r t h e
i n i t i a l l y
f o r m e d p o r e s a r e K' s p e c i f i c . I n r e l a t i o n t o t h i s , i t w i l l b e
i n t e r e s t i n g t o s e e w h e t h e r t h e t o x i n i n d u c e s p o r e
f o r m a t i o n
i n d i r e c t l y t h r o u g h i n t e r a c t i o n w i t h r e s i d e n t m e m b r a n e
p r o -
t e i n s o r d i r e c t l y t h r o u g h i n s e r t i o n i n t o t h e m e m b r a n e .
Th e m e c h a n i s m o f t h e c y t o t o x i c a c t i v i t y
h a s b e e n a d -
d r e s s e d i n s e v e r a l o t h e r s t u d i e s s u m m a r i z e d i n t h e d i s c u s -
s i o n s e c t i o n o f r e f e r e n c e 4 9 . A r a t h e r u n u s u L a l o b s e r v a t i o n
w a s m a d e b y E n g l i s h a n d C a n t l e y ( 2 1 ) , w h o d e m o n s t r a t e d
t h a t t o x i n p r e p a r a t i o n s f r o m B . t l l l i l l t i i e l n S i s S u b s p .
A k u r s t a k i
c r y s t a l s n o n s p e c i f i c a l l y i n h i b i t e d a K' - a d e n o s i n e
t r i p h o s -
p h a t a s e f r o m v a r i ' O u S S o u r c e s ( i n s e c t c e l l s , h u m a n
e r y t h r o -
c y t e s , a n d d o g k i d n e y s ) . Ho w e v e r , t h e i n h i b i t i o n o c c u r r e d
o n l y a t v e r y h i g h t o x i n c o n c e n t r a t i o n s ( 1 0 0 Fg / m l ) .
a n d i t
s e e m s u n l i k e l y t h a t i t p l a y s a s i g n i f i c a n t r o l e i n i n s e c t
t o x i c i t y .
Fa c t o r s Th a t De t e r m i n e
S p e c i f i c i t y
I n t h e p r e v i o u s s e c t i o n s , w e p r e s e n t e d a n o v e r v i e w o f t h e
v a r i a t i o n i n i n s e c t h o s t r a n g e a m o n g
i n d i v i d u a l
c r y s t a l
p r o t e i n s . O n e o f t h e m o s t i n t r i g u i n g q u e s t i o n s
r e l a t e s t o t h e
m o l e c u l a r b a s i s f o r t h i s e x t r e m e i n s e c t
s p e c i f i c i t y .
Th e m o s t
o b v i o u s f a c t o r s t h a t m a y i n f l u e n c e t h e h o s t
r a n g e
o f a
c r y s t a l
p r o t e i n a r e ( i ) d i f f e r e n c e s i n t h e l a r v a l
g u t a f f e c t i n g
t h e
s o l u b i l i z i a t i o n a n d / o r p r o c e s s i n g e f f i c i e n c y
o f t h e
p r o t o x i n
a n d ( i i ) t h e p r e s e n c e o t s p e c i f i c t o x i n - b i n d i n g
s i t e s
( r e c e p -
t o r s ) i n t h e g u t o f d i f f e r e n t i n s e c t s . I t h a s b e e n s h o w n t h a t
c e r t a i n i n s e c t s h a v e a l o w
s u s c e p t i b i l i t y t o i - B .
t / h u r i n i g i e n s i s
c r y s t a l p r o t e i n s o w i n g t o t h e i n e f f i c i e n t S o l u b i l i z a t i o n o f t h e
c r y s t a l s . I n v i t r o , S o l u b i l i z a t i o n o f
c r y s t a l s s i g n i f i c a n t l y
e n h a n c e s t h e t o x i c a c t i v i t y ( 4 5 , 5 9 ) . Ho w e v e r , d r a m a t i c
d i f f e r e n c e s i n s p e c i f i c i t y a r e m a i n t a i n e d a f t e r S o l u b i l i z a t i o n
o f t h e c r y s t a l p r o t e i n s ( Ta b l e 3) .
M o s t e x p e r i m e n t s i n w h i c h t h e t o x i c a c t i v i t i e s o f
p r o t o x i n
a n d a c t i v a t e d t o x i n w e r e c o m p a r e d s u g g e s t
t h a t
s u s c e p t i b i l -
i t y f o r c e r t a i n c r y s t a l p r o t e i n s i s
i n d e p e n d e n t
o f t h e a c t i v a -
t i o n ( 4 5 , 6 3) . Ho w e v e r , f o r o n e c r y s t a l p r o t e i n , e v i d e n c e w a s
V o l . 5 3, 1 9 8 9

o
n

J
u
n
e

2
9
,

2
0
1
2

b
y

g
u
e
s
t
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

2 5 0 HO FTI E A ND W HI TE L E Y
p r o v i d e d t h a t a p r o t o x i n c a n b e a c t i v a t e d i n t o e i t h e r a
d i p t e r a n o r a l e p i d o p t e r a n t o x i n , d e p e n d i n g o n t h e s o u r c e o f
t h e p r o t e o l y t i c e n z y m e s ( 31 ) . I n b r i e f , Ha i d e r e t a l . ( 2 9 , 31 )
c l o n e d a g e n e c o d i n g f o r a 1 30 - k Da p r o t e i n f r o m B . t l i i r i n -
g i e n s i s s u b s p . a i z a i i w a i i n t o E . c o l i . Tr e a t m e n t o f t h e 1 30 - k Da
p r o t e i n w i t h t r y p s i n y i e l d e d a 5 5 - k Da p e p t i d e t h a t w a s t o x i c
t o c u l t u r e d l e p i d o p t e r a n c e l l s ( C h o r i s t o n e u r a( l i m i l e c r a n a )
b u t n o t t o c u l t u r e d d i p t e r a n c e l l s . W h e n t h e t r y p s i n - a c t i -
v a t e d t o x i n w a s e x p o s e d t o m o s q u i t o g u t p r o t e a s e s , a
5 3- k Da p e p t i d e w a s d e t e c t e d , a n d t h e p r e p a r a t i o n w a s t o x i c
o n l y t o c u l t u r e d m o s q u i t o c e l l s . B i n d i n g s t u d i e s s h o w e d t h a t
t h e t r y p s i n - a c t i v a t e d 5 5 - k Da p e p t i d e b o u n d t o a 6 8 - k Da
p r o t e i n p r e s e n t i n t h e m e m b r a n e s o f c u l t u r e d l e p i d o p t e r a n
c e l l s . A r e c e p t o r f o r t h e Di p t e r a - s p e c i f i c 5 3- k Da p e p t i d e h a s
n o t b e e n i d e n t i f i e d .
R e c e n t e x p e r i m e n t s ( 37 . 38 ) s u g g e s t t h a t t h e i n t e r a c t i o n
w i t h h i g h - a f f i n i t y b i n d i n g s i t e s o n t h e i n s e c t m i d g u t e p i t h e -
l i u m m a y , t o a l a r g e e x t e n t , d e t e r m i n e t h e h o s t s p e c t r u m o f
B . t l h i i r i n g i e n s i s c r y s t a l p r o t e i n s . I n a f i r s t s e t o f e x p e r i -
m e n t s , b i n d i n g s t u d i e s w e r e c a r r i e d o u t w i t h t w o
1 2 5
I - l a b e l e d
t o x i n s [ C r y I A ( b ) a n d C r y I B ] o n B B M V s p r e p a r e d f r o m t h e
l a r v a l m i d g u t o f M . s e x a t a n d P . b r a s s i c a e . r e s p e c t i v e l y . Th e
C r y I A ( b ) t o x i n i s a c t i v e a g c a i n s t b o t h i n s e c t s , w h e r e a s t h e
C r y I B t o x i n a c t s o n l y a g a i n s t P . b r a s s i c a e ( Ta b l e 5 ) . I n t e r -
e s t i n g l y , t h e a c t i v a t e d C r y I A ( b ) t o x i n b i n d s w i t h h i g h a f f i n i t y
t o B B M V s d e r i v e d f r o m b o t h i n s e c t s , w h e r e a s t h e C r y l B
t o x i n s h o w s s a t u r a b l e b i n d i n g o n l y t o P . b r a s s i c a e v e s i c l e s .
He t e r o l o g o u s c o m p e t i t i o n e x p e r i m e n t s w i t h o t h e r t o x i n s
p r o v i d e f u r t h e r e v i d e n c e f o r a c o r r e l a t i o n b e t w e e n t o x i c i t y
a n d s p e c i f i c b i n d i n g . C r y I A ( a ) a n d C r y l A ( c ) . w h i c h a r e
e q u a l l y t o x i c f o r M . s e x t a ( Ta b l e 5 ) . c o m p e t e d w i t h t h e
l a b e l e d C r y l A ( b ) t o x i n f o r t h e s a r m e b i n d i n g s i t e , w h e r e a s t h e
d i p t e r a n - s p e c i f i c C r y I V B a n d t h e c o l e o p t e r a n - s p e c i f i c C r y -
I I I A d i d n o t c o m p e t e . U n e x p e c t e d l y , c o m p e t i t i o n e x p e r i -
m e n t s w i t h l a b e l e d a n d u n l a b e l e d C r y l A ( b ) a n d C r y I B t o x i n s
s h o w e d t h a t t h e y r e c o g n i z e d i s t i n c t b i n d i n g s i t e s o n t h e s a m e
B B M V s f r o m P . b r a s s i c a e .
V e r y l i t t l e i s k n o w n s o f a r a b O u t t h e b i o c h e m i c a l n 1 a t u r e o f
t h e s e s p e c i f i c t o x i n - b i n d i n g s i t e s . B i n d i n g s t u d i e s o n
B B M V s a f t e r t r e a t m e n t w i t h v a r i o u s p r o t e a s e s s u g g e s t t h a t
t h e b i n d i n g s i t e s c o n s i s t a t l e a s t o f a p r o t e i n a c e o u s c o m p o -
n e n t ( 37 ; H. v a n M e l l a e r t , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) .
Kn o w l e s a n d E l l a r ( 4 8 ) i d e n t i f i e d a 1 4 6 - k Da m e m b i r a n e
g l y c o p r o t e i n f r o m C h o r i s t o n e u r a f a i m i f e r a n i a c c l l s a s a p o s -
s i b l e t o x i n r e c e p t o r . Kn o w l e s e t a l . a l s o r e p o r - t e d t h a t
N- a c e t y l g a l a c t o s a r n i n e p r o t e c t e d t h e s e c e l l s a g a i n s t B . t l i i i -
i i e , , i n s i s s u b s p . k a i r i s t a i k i HD- 1 p r e p a r a t i o n s . s u g g e s t i n g
t h a t t h i s s u g a r i s a p a r t o f t h e b i n d i n g s i t e ( 5 1 ) . Ho w e v e r .
N- a c e t y l g a l a c t o s a l n m i n e d i d n o t i n t e r f e r - e w i t h t h e s p e c i f i c
b i n d i n g o f
2 5
1 - l a b e l e d C r y I B t o x i n t o P . b r a s s i c a c B B M V s
o r w i t h t h e b i n d i n g o f ' 2 5 I - l a b e l e d C r y l A ( b ) t o x i n t o A l . s ( . v t a
v e s i c l e s ( v a n M e l l a e r t , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) . Th e s e
r e s u l t s a l s o s u g g e s t t h a t t h e e f f e c t o f B . t i l h u r i n g i e n s i s t o x i n s
o n c u l t u r e d c e l l l i n e s i s n o t d i r e c t l y c o m p a r a b l e t o t h e i n v i v o
a c t i v i t y .
C o n s e r v e d Fe a t u r e s o f c r y G e n e s
Tl h e c r x g e n e s d e s c r i b e d s o f a L r s h a r e t h e f o l l o w i n g c h a r -
a c t e r i s t i c s . Th e y e n c o d e i n s e c t i c i d a l p r o t e i n s , e i t h e r o f 1 30
t o 1 4 0 k Da o r o f c a . 7 0 k Da , c o n t a i n i n g a t o x i c f r a g m e n t o f
6 0 + 1 0 k Da . O n e e x c e p t i o n i s t h e
c r YI V D
p r o t e i n , w h i c h
c o n t a i n s a c a . 30 - k Da a c t i v e c o r e c o m p o n e n t ( 1 2 ) . Fo r t h e
1 30 - t o 1 4 0 - k Da p r o t e i n s , t h e t o x i c s e g m e n t i s l o c a l i z e d i n
t h e N- t e r m i n a l h a l f o f t h e p r o t o x i n . Th e C - t e r m i n a l p . a r t o f
t h e c . a . 1 30 - k Da p r o t e i n s ( C r y l , C r y I V A , a n d C r y l V B ) i s n o t
e s s e n t i a l f o r
t o x i c i t y ,
b u t i s t h e m o s t
h i g h l y
c o n s e r v e d
d o m a i n o f t h e s e
c r y s t a l p r o t e i n s ( Fi g . 1 ) .
I n t h e a m i n o a c i d
s e q u e n c e c o r r e s p o n d i n g t o t h e t o x i c
d o m a i n , f i v e
h i g h l y c o n s e r v e d
s e q u e n c e b l o c k s c a n b e
d i s t i n g u i s h e d
i n a l l b u t t h r e e
( c v - s p e c i f i e d p r o t e i n s ( Fi g . 1
a n d 2 ) . W i t h i n t h e s e c o n s e r v e d
s e q u e n c e b l o c k s , n o ( o r
r e l c a t i v e l y f e w ) g a p s
w e r e n e e d e d f o r t h e
a l i g n m e n t o f t h e
i d e n t i c a l o r r e l a t e d a r m i n o a c i d s . Th e s e b l o c k s a r e
s e p a r a t e d
b y h i g h l y v a r i a b l e s e q u e n c e s
o f v a r i o u s l e n g t h s f o r t h e
d i f l e r e n t c r y s t a l p r o t e i n s . E x c e p t i o n s a r e t h e C r y l l p r o t e i n s
a n d
C r y I V D,
w h i c h s h o w
s i g n i f i c a n t h o m o l o g y o n l y t o t h e
o t h e r c u I p r o t e i n s
i n a r e g i o n c o r r e s p o n d i n g t o b l o c k 1 .
A n o t h e r
r e c u r r i n g f e a t u r e f o r a l l c r y s t a l p r o t e i n s e x c e p t
C r y l l a n d C r y I V D
i s t h e
p r e s e n c e o f a s t r e t c h o f
h y d r o p h o -
b i c a m i n o a c i d s a t a c o m p a r a b l e p o s i t i o n w i t h i n t h e 1 2 0
N- t e r m i n a l a m i n o a c i d s . Th i s a m i n o a c i d s t r e t c h s h o w s t h e
p r o p e r t i e s o f a p r e d i c t e d t r a n s m e m b r a n e s e q u e n c e a c c o r d -
i n g
t o
E i s e n b e r g
e t
a l l . ( 2 0 ) ( Fi g . 1 ) . R e m a r k a b l y , w i t h i n t h i s
r e g i o n o n l y t h e h y d r o p h o b i c c h a r a c t e r a n d n o t t h e i d e n t i t y o f
t h e a m i n o a c i d s i s c o n s e r v e d , s t r o n g l y s u p p o r t i n g a f u n c -
t i o n a l s i g n i f i c a n c e . I t h 1 a s b e e n
p r o p o s e d t h a t t h e c o n s e r v e d
h y d r o p h o b i c r e g i o n p l f a y s a r o l e i n a n i n t e r a c t i o n o f t h e t o x i n
w i t h t h e m e m b r a n e o f m i d g u t e p i t h e l i a l c e l l s ( 7 9 ) , b u t d i r e c t
e x p e r i m e n t a l e v i d e n c e
f o r
s u c h i n t e r a c t i o n s i s
l a c k i n g .
U S E O F B . THU R I NG I E NS I S C R YS TA L P R O TE I NS I N
P L A NT P R O TE C TI O N
B .
t h u r i n g i e n s i . s h a s p r o v e n t o b e a v a l u a b l e a l t e r n a t i v e t o
c o n v e n t i o n a l i n s e c t i c i d e s . I t i s h i g h l y a c t i v e a n d h a r m l e s s t o
t h e e n v i r o n m e n t o w i n g t o i t s s p e c i f i c i t y . Fo r m u l a t i o n s o f B .
t h i j t , i g i e n i s i s s p o r e - c r y s t c a l m i x t u r e s a r e c o m m e r c i a l l y a v a l i l -
a b l e
f o r u s e a s b i o l o g i c a l i n s e c t i c i d e s i n a g r i c u l t u r e a n d
f o r e s t r y .
B .
t h I i i r i n , u , , i e n s i s s u b s p . i s r a e l e n s i s , a c t i v e
a g a i n s t
l a r v C a e o f
m o s q u i t o e s a n d b l a c k f l i e s , i s b e i n g u s e d t o c o n t r o l
v e c t o r s o f a v a r i e t y o f h u m a n a n d a n i m a l d i s e a s e s . A n
i m p o r t a n t d i s a d v a n t a g e i s t h e r a t h e r r e s t r i c t e d h o s t r a n g e o f
t h e
e x i s t i n g B . t h l a r i n g i e n s i s s p r i a y s . S c r - e e n i n g s a m p l e s f r o m
d i f f e r e n t e n v i r o n m e n t s m a y y i e l d B . t h u i i n g i e n s i s s t r a i n s
w i t h b r o a d e r h o s t r a n g e s o r n e w ' s p e c i f i c i t i e s . Th e h o s t r a n g e
o f s t r a i n s u s e d
c o m m e r c i a l l y c a n b e e x p a n d e d t h r o u g h t h e
i n t r o d u c t i o n o f n e w c r y s t a l p r o t e i n g e n e s . Th i s c a n b e
a c h i e v e d t h r o u g h c o n j u g a t i o n ( r e v i e w e d i n r e f e r e n c e 1 1 ) o f
p l a s m i d s f r o m o t h e r B .
t h u t r i u i g i e n s i s s t r - a i n s o r
t h r o u g h
d i r e c t t r a n s f o r m a t i o n o f c r y s t a l p r o t e i n g e n e s c l o n e d i n a B .
t i u r a i n g i e n s i s r e p l i c o n ( 34 ) . I n t h i s r e s p e c t , t h e r e c e n t d e v e l -
o p m e n t o f a n e f f i c i e n t t r a n s f o r m a t i o n s y s t e m i n v o l v i n g t h e
u s e o f e l e c t r o p o r a t i o n ( J . M a h i l l o n , p e r s o n a l c o m m u n i c a -
t i o n ) w i l l g r e a t l y f a c i l i t a t e f u t u i - e m a n i p u l a k t i o n o f B .
t l i i i r i n l -
g , i e n s i s s t r a i n s .
A n o t h e r p r o b l e m r e l a t e d t o c o m m e r c i a l B .
t h u r i n g i e n s i s
p r e p c a r a l t i o n s i s t h e l i m i t e d f i e l d s t a b i l i t y . He r e , t h e i n t r o d u c -
t i o n o f c r y s t a l p r o t e i n g e n e s i n t o p l a n t - a s s o c i a t e d m i c r o o r -
g a n i s m s m i g h t p r o v i d e a v a l u a b l e a l t e r n a t i v e . O n e p r o -
p o s a l i s t o i n t r o d u c e t h e s e g e n e s i n t o e n d o p h y t i c b a c t e r i a
( 1 4 ) . A n o t h e r a p p r o a c h i s t h e Tn 5 - m e d l i a t e d i n s e r t i o n o f a
( c r I A ( b ) g e n e i n t o t h e c h r o m o s o m e s o f P s e u l o n i o n a s f l u o -
r e s c e n s a n d A g r o b a c t e r i a t n r a t l i o b a c t e r s t r a i n s t h a t c o l o n i z e
c o r - n r o o t s ( 7 2 ) . Tr a l n s f o r - m a n t s o f t h e P . f l u o r e s ( e n s a n d A .
r a ( l i o b a ( t e r s t r a i n s e x p r e s s e d t h e c r y s t a l p r o t e i n a n d w e r e
t o x i c a g a i n s t M . s e x t a .
Tr a n s g e n i c P l a n t s
R e c e n t l y , t h e f e a s i b i l i t y o f g e n e r a t i n g i n s e c t - r e s i s t a n t
t r a n s g e n i c c r o p s b y u s i n g B . t h i t r i n g i e n s i s c r y s t a l p r o t e i n s
M I C R O B I O L . . R FV .

o
n

J
u
n
e

2
9
,

2
0
1
2

b
y

g
u
e
s
t
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

I NS E C TI C I DA L C R YS TA L P R O TE I NS O F B . THU R I NG I E NS I S 2 5 1
w a s d e m o n s t r a t e d . I n a l l p r e v i o u s l y d e s c r i b e d e x p e r i m e n t s
( 5 , 2 3, 9 0 ) , a n A g r o b a c t e r i i m n t i n m e f a c i e n s - b a s e d t r a n s f o r -
m a t i o n s y s t e m ( 2 8 ) w a s u s e d . M o d i f i e d c r y s t a l p r o t e i n g e n e s
w e r e p l a c e d u n d e r t h e c o n t r o l o f a p r o m o t e r a n d a 3' e n d o f
a p l a n t g e n e . V a e c k e t a l . ( 9 0 ) u s e d d e r i v a t i v e s o f a ( r y I A ( b )
g e n e u n d e r c o n t r o l o f t h e m a n n o p i n e s y n t h a s e TR 2 ' p r o -
m o t e r f r o m t h e o c t o p i n e Ti p l a s m i d o f A . t u i i n e c i e n s . Th r e e
g r o u p s o f t o x i n g e n e c a s s e t t e s w e r e u s e d : t h e i n t a c t g e n e ; 3'
d e l e t i o n d e r i v a t i v e s c o n t a i n i n g t h e t o x i n - e n c o d i n g h a l f o f t h e
g e n e ; a n d f u s i o n s b e t w e e n t h e t o x i n - e n c o d i n g p a r t o f t h e
g e n e a n d i e o , a s e l e c t a b l e m a r k e r g e n e d e r i v e d f r o m Tn 5
w h i c h c o n f e r s k a n a m y c i n r e s i s t a n c e ( n e o m y c i n p h o s p h o -
t r a n s f e r a s e a c t i v i t y ) t o t r a n s f o r m e d p l a n t c e l l s . Th e s e f u s i o n
g e n e s e x p r e s s e d c h i m e r i c p r o t e i n s w i t h b o t h i n s e c t i c i d a l a n d
n e o m y c i n p h o s p h o t r a n s f e r a s e a c t i v i t i e s . Th i s a l l o w e d t h e
s e l e c t i o n o f p l a n t t r a n s f o r m a n t s w i t h h i g h i n s e c t i c i d a l a c t i v -
i t y t h r o u g h s e l e c t i o n o n h i g h d o s e s o f k a n a m y c i n . Tr a n s -
f o r m e d t o b a c c o p l a n t s t o x i c a g a i n s t M . s e x t a l a r v a e w e r e
o b t a i n e d , a n d t h e a m o u n t o f c r y s t a l p r o t e i n d e t e c t e d i m m u -
n o l o g i c a l l y i n t h e p l a n t t i s s u e c o r r e l a t e d w e l l w i t h t h e l e v e l
o f i n s e c t r e s i s t a n c e . I t i s r e m a r k a b l e t h a t l e v e l s o f c r y s t a l
p r o t e i n t h a t k i l l e d i n s e c t s w e r e o b t a i n e d o n l y w h e n t h e
t r u n c a t e d o r f u s i o n g e n e s w e r e u s e d . I t i s n o t k n o w n w h y t h e
i n t a c t g e n e i s n o t e x p r e s s e d i n t h e p l a n t c e l l s . Tr a n s g e n i c
t o b a c c o p l a n t s t e s t e d i n f i e l d t r i a l s w e r e f u l l y p r o t e c t e d
a g a i n s t M . s e x t c i a n d H. v i r e s c e n s d a m a g e ( G . W a r r e n ,
p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) . Fi s c h h o f f e t a l . ( 2 3) u s e d a s i m i l a r
a p p r o a c h w i t h 3' - d e l e t e d d e r i v a t i v e s o f a c r y I A ( b ) g e n e
u n d e r t h e c o n t r o l o f t h e 35 S p r o m o t e r o f c a u l i f l o w e r m o s a i c
v i r u s . Th e y t r a n s f o r m e d t o m a t o p l a n t s a n d o b t a i n e d p l a n t s
t h a t w e r e t o x i c f o r M . s e x t a i . B a r t o n e t a l . ( 5 ) u s e d a
3' - d e l e t e d c r y A ( a ) g e n e u n d e r t h e c o n t r o l o f t h e 35 S p r o -
m o t e r . Th e y a l s o i n s e r t e d t h e 5 ' u n t r a n s l a t e d l e a d e r o f t h e
c o a t p r o t e i n g e n e ( g e n e 4 ) o f a l f a l f a m o s a i c v i r u s u p s t r e a m o f
t h e t o x i n g e n e . Th i s l e a d e r m i g h t e n h a n c e t h e e f f i c i e n c y o f
t r a n s l a t i o n i n i t i a t i o n . To b a c c o p l a n t s r e s i s t a n t a g a i n s t M .
s e x t a l a r v a e w e r e o b t a i n e d .
S i m i l a r a p p r o a c h e s a r e n o w b e i n g u s e d f o r o t h e r c o m m e r -
c i a l c r o p s w i t h i m p o r t a n t l e p i d o p t e r a n o r c o l e o p t e r a n p e s t s
a n d f o r w h i c h a t r a n s f o r m a t i o n s y s t e m i s a v a i l a b l e ( p o t a t o ,
c o t t o n , e t c . ) . A r e c e n t i m p o r t a n t d e v e l o p m e n t i s t h e u s e o f
h i g h - v e l o c i t y m i c r o p r o j e c t i l e s ( 4 7 , 6 5 ) , m a k i n g i t p o s s i b l e t o
t r a n s f o r m o t h e r c r o p s , e s p e c i a l l y m o n o c o t s ( e . g . , c o r n ) ,
w h i c h c a n n o t b e t r a n s f o r m e d b y t h e A g r o b a c t e r i u , n s y s t e m .
R e s i s t a n c e De v e l o p m e n t
De s p i t e t h e w i d e u s e o f B . t l i l i r i t n g i e n I s i s f o r m u l a t i o n s o v e r
t h e l a s t 2 0 y e a r s , n o c a s e s o f r e s i s t a n c e d e v e l o p m e n t i n t h e
f i e l d h a v e b e e n r e p o r t e d . A n i m p o r t a n t f a c t o r t h a t m a y h a v e
c o n t r i b u t e d t o t h i s i s t h e l o w p e r s i s t e n c e o f B . t h l i i i n g i e n i s i s
i n t h e e n v i r o n m e n t . Th e s i t u a t i o n m i g h t c h a n g e d r a m a t i c a l l y
w h e n t h e u s e o f i n s e c t - r e s i s t a n t t r a n s g e n i c p l a n t s b e c o m e s
w i d e s p r e a d , s i n c e s e v e r a l g e n e r a t i o n s o f i n s e c t s p e r y e a r w i l l
b e c o n t i n u o u s l y e x p o s e d t o c r y s t a l p r o t e i n s , p r o v i d i n g a n
i d e a l e n v i r o n m e n t f a r t h e d e v e l o p m e n t o f r e s i s t a n c e . I n t h i s
r e s p e c t , i t i s i n t e r e s t i n g t o m e n t i o n t h e o n l y r e p o r t e d c a s e o f
r e s i s t a n c e d e v e l o p m e n t i n t h e l a b o r a t o r y .
M c G a u g h e y ( 6 6 ) d e m o n s t r a t e d t h a t t h e I n d i a n m e a l m o t h
( P l o d i a i n t e r p u i n c t e l l a ) , a l e p i d o p t e r a n p e s t o f s t o r e d g r a i n
a n d g r a i n p r o d u c t s , c a n d e v e l o p r e s i s t a n c e a g a i n s t Di p e l
( A b b o t L a b o r a t o r i e s ) , a c o m m e r c i a l s p o r e - c r y s t a l f o r m u l a -
t i o n o f B . t l i i l i i g i e n i s i s s u b s p . k u , r s t a k i HD- 1 . A c o l o n y o f
P l o d i a i n t e r p l u n c t e l l a w a s r e a r e d o n a d i e t c o n t a i n i n g Di p e l
a t a d o s e e x p e c t e d t o p r o d u c e 7 0 t o 9 0 % l a r v a l m o r t a l i t y . I n
t w o g e n e r a t i o n s , r e s i s t a n c e i n c r e a s e d c a . 30 - f o l d , a n d a f t e r
1 5 g e n e r a t i o n s , a p l a t e a u 1 0 0 t i m e s h i g h e r t h a n t h e c o n t r o l
l e v e l w a s r e a c h e d . Th e r e s i s t a n c e r e m a i n e d s t a b l e i n t h e
a b s e n c e o f s e l e c t i v e p r e s s u r e a n d w a s i n h e r i t e d a s a r e c e s -
s i v e t r a i t . A n i n t e r e s t i n g o b s e r v a t i o n w a s t h a t o t h e r B .
t h u t r - i n l g i e n t s i s s t r a i n s w e r e s t i l l h i g h l y a c t i v e a g a i n s t t h e
r e s i s t a n t i n s e c t s ( 6 7 ) . A n a t t r a c t i v e h y p o t h e s i s i s t h a t t h e
s e l e c t e d P l o d i a i n t e r p u i n c t e l l a s t r a i n i s r e s i s t a n t o n l y t o
C r y l A t o x i n s p r e s e n t i n t h e Di p e l p r e p a r a t i o n , b u t n o t t o
o t h e r t y p e s o f t o x i n s . I f t h i s i s s o , t h e n t h e s i m u l t a n e o u s
e x p r e s s i o n i n t r a n s g e n i c p l a n t s o f t w o o r m o r e t o x i n s t h a t a c t
i n d e p e n d e n t l y a g a i n s t t h e s a m e i n s e c t ( p e r h a p s t h r o u g h t h e
r e c o g n i t i o n o f d i s t i n c t b i n d i n g s i t e s ) s h o u l d r e d u c e t h e
p r o b a b i l i t y t h a t r e s i s t a n t i n s e c t p o p u l a t i o n s w i l l d e v e l o p .
O v e r a l l , t h e s t u d y o f t h e m o l e c u l a r b a s i s o f r e s i s t a n c e
a g a i n s t s e l e c t e d t o x i n s d e s e r v e s i n t e n s i v e s t u d y a n d m a y
p r o v i d e i m p o r t a n t c l u e s f o r t h e u n d e r s t a n d i n g o f t h e b a s i s o f
t h e i n s e c t s p e c i f i c i t y .
C O NC L U S I O NS A ND P E R S P E C TI V E S
I t h a s b e c o m e c l e a r i n r e c e n t y e a r s t h a t B . t h u r i n i g i e n s i s i s
p r o v i d e d w i t h a s u r p r i s i n g l y l a r g e a n d v a r i a b l e f a m i l y o f
i n s e c t i c i d a l p r o t e i n s . I n t h i s r e v i e w , w e h a v e p r e s e n t e d a
c l a s s i f i c a t i o n o f c r y s t a l p r o t e i n g e n e s b a s e d o n i n s e c t s p e c -
i f i c i t y a n d t h e p r i m a r y s t r u c t u r e o f t h e p r o t e i n s . Kn o w l e s
a n d E l l a r ( 5 0 ) h a v e a l s o p o i n t e d o u t t h a t c r y s t a l p r o t e i n s c a n
b e g r o u p e d a c c o r d i n g t o h o s t r a n g e . Th e y p r o p o s e d f i v e
p a t h o t y p e s : f o u r o f t h e s e c o r r e s p o n d t o t h e f o u r c l a s s e s
s h o w n i n Ta b l e 1 , a n d t h e f i f t h c o n t a i n s n o n t o x i c p r o t e i n s .
W e h a v e n o t i n c l u d e d t h e f i f t h c l a s s , b e c a u s e t h e s t r u c t u r e s
o f n o n t o x i c c r y s t a l p r o t e i n s h a v e n o t b e e n d e t e r m i n e d . To
d a t e , 1 4 g e n e t y p e s c a n b e d i s t i n g u i s h e d i n o u r c l a s s i f i c a t i o n .
W e h a v e a s s i g n e d t h e s e g e n e s t o t h e m i n i m u m n u m b e r o f
c a t e g o r i e s : t h e 1 3 r e l a t e d c r y ' g e n e s h a v e b e e n p l a c e d i n f o u r
c l a s s e s a c c o r d i n g t o s t r u c t u r e a n d h o s t r a n g e . A t o t a l l y
u n r e l a t e d g e n e ( c y t A ) h a s b e e n p l a c e d i n a s e p a r a t e , f i f t h
c a t e g o r y . A d d i t i o n a l g e n e t y p e s w i l l u n d o u b t e d l y b e d i s c o v -
e r e d i n t h e c u r r e n t i n t e n s i v e s c r e e n i n g e f f o r t s t o i s o l a t e
c r y s t a l p r o t e i n s w i t h d i f f e r e n t h o s t r a n g e s . W e h o p e t h a t
Ta b l e 1 w i l l p r o v i d e a u s e f u l f r a m e w o r k f o r t h e c l a s s i f i c a t i o n
o f t h e s e a d d i t i o n a l g e n e s .
P r o g r e s s h a s b e e n m a d e i n t h e u n d e r s t a n d i n g o f t h e
b i o c h e m i c a l m e c h a n i s m o f t o x i c i t y a n d t h e f a c t o r s t h a t
d e t e r m i n e t h e e x t r e m e s p e c i f i c i t y . Da t a f r o m i n v i t r o e x p e r -
i m e n t s s t r o n g l y s u g g e s t t h a t a c t i v a t e d t o x i n s i n d u c e t h e
f o r m a t i o n o f p o r e s i n t h e m e m b r a n e o f s u s c e p t i b l e c e l l s a n d
t h a t t h e y r e c o g n i z e h i g h - a f f i n i t y b i n d i n g s i t e s ( p u t a t i v e r e -
c e p t o r s ) o n t h e m i d g u t e p i t h e l i u m o f s u s c e p t i b l e i n s e c t s
o n l y . S e v e r a l i n t e r e s t i n g q u e s t i o n s r e l a t i n g t o t h e s t r u c t u r e -
a c t i v i t y r e l a t i o n s h i p o f B . t h l i i r i n i g i e n s i s t o x i n s h a v e n o t y e t
b e e n a n s w e r e d . I t i s n o t k n o w n w h e t h e r t h e a c t i v e t o x i n , l i k e
s e v e r a l o t h e r p r o t e i n t o x i n s ( 7 0 ) , c o n s i s t s o f t w o o r m o r e
d o m a i n s t h a t m e d i a t e d i f f e r e n t s t e p s i n t h e t o x i c a c t i o n ( e . g . ,
r e c e p t o r b i n d i n g , p o r e f o r m a t i o n ) . Th e c o m p a r i s o n o f t h e
d e d u c e d a m i n o a c i d s e q u e n c e s r e v e a l e d a n u m b e r o f s e -
q u e n c e e l e m e n t s c o n s e r v e d f o r m o s t c r y s t a l p r o t e i n s ; h o w -
e v e r , i t i s n o t k n o w n w h e t h e r t h e s e c o n s e r v e d e l e m e n t s a l s o
h a v e a n y f u n c t i o n a l r o l e i n t h e t o x i c a c t i v i t y . I n v i t r o
m u t a g e n e s i s t e c h n i q u e s ( 9 4 ) a n d / o r t h e f u n c t i o n a l i n v i t r o
a s s a y s f o r r e c e p t o r b i n d i n g ( 37 , 38 ) a n d m e m b r a n e p e r m e -
a b i l i t y ( 7 6 ) w i l l s h e d m o r e l i g h t o n t h e s e m a t t e r s . A l s o ,
m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s c a n b e u s e d t o m a p f u n c t i o n a l d o -
m a i n s o n t h e t o x i n m o l e c u l e . Fi n a l l y , t w o r e c e n t r e p o r t s
d e s c r i b e t h e i n v i t r o c r y s t a l l i z a t i o n o f C r y l l I A a n d s o m e
p r e l i m i n a r y X- r a y d i f f r a c t i o n d a t a ( 2 6 , 6 2 ) . Th i s a p p r o a c h
w i l l p r o v i d e t h e n e c e s s a r y s t r u c t u r a l d a t a f o r a r a t i o n a l s t u d y
o f t h e m o l e c u l a r b a s i s o f t h e i n s e c t i c i d a l a c t i v i t y .
V O L . 5 3, 1 9 8 9

o
n

J
u
n
e

2
9
,

2
0
1
2

b
y

g
u
e
s
t
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

2 5 2 HO FTE A ND W HI TE L E Y
Th e d i s c o v e r y o f p u t a t i v e r e c e p t o r s i t e s f o r B . t l h u r i n a i c n -
s i s t o x i n s p r o v i d e s p r o m i s i n g a v e n u e s f o r f u t u l - e r e s e a r c h .
B i n d i n g s t u d i e s i n v o l v i n g t h e u s e o f d i f f e r e n t t o x i n s a n d a
v a r i e t y o f i n s e c t s p e c i e s w i l l s h o w w h e t h e r t o x i c i t y i s a l w a y s
a s s o c i a t e d w i t h h i g h - a f f i n i t y b i n d i n g t o m i d g u t m e m b r a n e s .
I n t e r e s t i n g r e s u l t s c a n a l s o b e e x p e c t e d f r o m t h e i s o l a t i o n
a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e p u t a t i v e r e c e p t o r m o l e c u l e s . Do
t h e s e r e c e p t o r s h a v e a n y p h y s i o l o g i c a l r o l e i n h e a l t h y i n -
s e c t s , a n d c a n o n e i d e n t i f y r e l a t e d m o l e c u l e s i n t h e m i d g u t
e p i t h e l i u m o f n o n s u s c e p t i b l e i n s e c t s ' ? A n s w e r s t o t h e s e
q u e s t i o n s m i g h t p r o v i d e s t r a t e g i e s f o r t h e d e v e l o p m e n t o f
n e w g e n e r a t i o n s o f i n s e c t i c i d e s .
Ne w i n s i g h t s o n t h e r e g u l a t i o n o f c r y s t a l p r o t e i n g e n e
e x p r e s s i o n w e r e p r o v i d e d b y t h e i d e n t i f i c a t i o n o f t w o s p o r u -
l a t i o n - s p e c i f i c s i g m a f a c t o r s , t h e f i n d i n g o f n e g a t i v e r e g u l a -
t i o n o f c r y s t a l p r o t e i n g e n e e x p r e s s i o n i n E . ( o l i , a n d t h e
d e s c r i p t i o n o f a p r o t e i n a f f e c t i n g t h e e x p r e s s i o n o f t h e C y t A
g e n e a t a p o s t t a n s l a t i o n a l l e v e l i n E . ( c o l i . Th e r e c e n t
d e v e l o p m e n t o f t r a n s f o r m a t i o n s y s t e m s f o r B . t l l h u r i n i i s l i s
w i l l f a c i l i t a t e t h e s t u d y o f c r y s t a l p r o t e i n g e n e r e g u l a t i o n i n
i t s o r i g i n a l h o s t . Th e r e s u l t s f r o m t h e s e s t u d i e s a r e e s s e n t i a l
f o r t h e d e v e l o p m e n t o f n e w B . t h u i r i n g i e n s i s s t r a i n s e x p r e s s -
i n g c o m b i n a t i o n s o f c r y s t a l p r o t e i n s w i t h i n t e r e s t i n g i n s e c t i -
c i d a l s p e c t r a .
Th e e x p r e s s i o n o f d i p t e r a n - a c t i v e c r y s t a l p r o t e i n s i n o t h e r
m i c r o o r g a n i s m s , s u c h a s B . s p h l a c r i ( c u s o r c y a n o b a c t e r i a ( W .
C h u n g J a t u p o r n c h a i , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) . m a y a l l o w
m o r e e f f e c t i v e c o n t r o l o f m e d i c a l l y i m p o r t a n t d i p t e r a n i n s e c t
v e c t o r s . Fi n a l l y , i t m a y b e p o s s i b l e t o p r o d u c e a n u m b e r o f
a g r i c u l t u r a l l y i m p o r t a l n t c r o p s f r o m t r a n s g e n i c p l a n t s t h a t
e x p r e s s B . t l u r i i i g i c a i s i s c r y s t a l p r o t e i n s . Th i s w i l l p r o v i d e a
p o t e n t i a l l l y p o w e r f u l a l t e r n a t i v e t o c h e m i c a l i n s e c t i c i d e s i n
a g r i c u l t u r e .
A C KNO W L E DG NI E NTS
W e t h i a n k D. B u r g e s . B . Fe d e r i c i . A . A r o n s o n . P . B 3t a u i m a n n . D.
Fi s c h h o f f . a n d o t h e r s f o r t h e i r c o m m e n t s a n d h e l p f u l d i s c u s s i o n o f
t h e g e n e c l a s s i f i c c a t i o n s c h e m e a t t h e 1 9 8 8 m e e t i n g o f t h e S o c i e t y f o r
I n v e r t e b r a t e P a t h o l o g y . U n i v e r s i t y o f C a l i f o r - n i a a t S a I n D) i e g o .
H. R . W . t h a n k s J o n a t h a n V i s i c k a n d H. E r n e s t S c h n e p f f o r a s s i s -
t a n c e i n p r e p a i - a t i o n o f t h e m a n u s c r i p t : H. H. t h a n k s V e r a V e r -
m a e r c k e , S t e f a i a n v a n G y s e g h e m , a n d Kc a r e l S p r u y t f o r t h e f i g u r e s .
Th e w o r - k b y H. R . W . r e p o r t e d i n t h i s r e v i e w , w a s s u p p o r t e d b y
P u b l i c He a l t h S e r v i c e g r a n t G M 2 0 7 8 4 f r - o m t h e Na t i o n a l I n s t i t u t e s
o f He a l t h .
L I TE R A TU R E C I TE D
1 . A d a m s , L . F. , J . E . V i s i c k , a n d H. R . W h i t e l e y . 1 9 8 9 . A
2 0 ) - k i l o d a l t o n p r o t e i n i s r e q u i - e d f o r - e f f i c i e n t p r o d u I c t i o n o f t h e
B a c i l l u s t h t u r i n g L , i c n s i s s u b s p . i s r a e l e a s i s 2 7 - k i l o d i a l t o n c r v s t a l
p r - o t e i n i n E s c h e r i c h i a ( c l i . J B a t e r i o l . 1 7 1 : 5 2 1 - 5 3t ) .
2 . A d a n g , M . J . , K. F. I d l e r , a n d T. A . R o c h e l e a u . 1 9 8 7 . S t r u c -
t u r a l a n d a n t i g e n i c r e l a t i o n s h i p s i m o n g t h r e e i n s e c t i c i d a l c r v s -
t a l p r o t e i n s o f B a c i l l u s t h i u r i n a g i e s i . s s u b s p . k u r s t a k i . p . 8 5 - 9 9 .
I l K. M a r a m o r o s c h ( e d . ) . B i o t e c h n o l o g y i n i n v e r t e b r a t e p a -
t h o l o g y a n d c e l l c u l t u r e . A c a d e m i c P r e s s , I n c . . S a n Di e g o .
C a l i f .
3. A d a n g , M . J . , M . J . S t a v e r , T. A . R o c h e l e a u , J . L e i g h t o n , R . F.
B a r k e r , a n d D. V . T' h o m p s o n . 1 9 8 5 . C h a r a c t e r i z e d f u l l - l e n g t h
a n d t r u n c a t e d p l a s m i d c l o n e s o f t h e c r y s t a l p r o t e i n o f B a c i l l u s
t h u r i n i g i c a s i s s u b s p . k u r s t a k i HD- 7 3 a n d t h e i r t o x i c i t y t o
M u a d u c a s e t ( a . G e n e 36 : 2 8 9 - 30 t ) .
4 . A r o n s o n , A . I . , W . B e c k m a n , a n d P . Du n n . 1 9 8 6 . B a c i l l u s
i h u i a g i c a n s i s a n d r e l a t e d i n s e c t p a t h o g e n s . M i c r o b i o l . R e v . 5 0 :
1 - 2 4 .
5 . B a r t o n , K. A . , H. R . W h i t e l e y , a n d N. - S . Ya n g . 1 9 8 7 . B a c i l l u s
t h u r i n g i a i e s i s h - e n d o t o x i n e x p r e s s e d i n t r a n s g e n i c Ni c O t i a n a
t a b a c u i t n p r o v i d e s r e s i s t a n c e t o l e p i d o p t e r a n i n s e c t s . P l a n t
P h y s i o l . 8 5 : 1 1 0 3- 1 1 0 9 .
6 . B o u r g o u i n , C . , A . De l e c l u s e , J . R i b i e r , A . Kl i e r , a n d G .
R a p o p o r t . 1 9 8 8 . A B a c i l l u s t i l h u r i i i g i c n s i s s u b s p . i s r a l c / e s i s
g e n e e n c o d i n g a 1 2 5 - k i l o d a l t o n l a r v i c i d a l p o l y p e p t i d e i s a s s o -
c i a t e d w i t h i n v e r t e d r e p e a t s e q u e n c e s . J . B a c t e r i o l . 1 7 0 : 35 7 5 -
3X5 8 3.
7 . B r i z z a r d , B . L . , a n d H. R . W h i t e l e v . 1 9 8 8 . Nu c l e o t i d e s e -
q u e n c e o f a n a d d i t i o n a l c r y s t a l p r o t e i n g e n e c l o n e d f r o m
B a c i l l u s t h i u r i t g i c n s i s s u b s p . t l u l a - i a g i c g i e a s i s .
Nu c l e i c A c i d s R e s .
1 6 : 4 1 6 8 - 4 1 6 9 .
8 . B r o w n , K. L . , a n d H. R . W h i t e l e y . 1 9 8 8 . I s o l a t i o n o f a B a c i l l u s
t h u r i n g i e n s i s R NA p o l y m e r a s e c a p a b l e o f t r a n s c r i b i n g c r y s t a l
p r o t e i n g e n e s . P r o c . Na t I . A c a d . S c i . U S A 8 5 : 4 1 6 6 - 4 1 7 0 .
9 . B u r g e s , H. D. ( e d . ) . 1 9 8 1 . M i c r o b i o l c o n t r o l o f p e s t s a n d p l a n t
d i s e a s e s 1 9 7 ( 0 - 1 9 8 0 . A c a d e m i c P r e s s . I n c . ( L o n d o n ) . L t d . ,
I o n d o n .
1 0 . C a l a b r e s e , D. M . , K. W . Ni c k e r s o n , a n d L . C . L a n e . 1 9 8 0 . A
c o m p a r i s o n o f p r o t e i n c r y s t a l s u b u n i t s i z e s i n B a c i l l u s t l i i u r i u -
g i e a s i s . C c a n . J . M i c r o b i o l . 2 6 : 1 0 0 6 - 1 0 1 0 .
1 1 . C a r l t o n , B . C . , a n d J . NI . G o n z a l e z , J r . 1 9 8 5 . P l a s m i d s a n d
d e l t a - e n d o t o x i n p r o d u c t i o n i n d i f f e r e n t s u b s p e c i e s o f B a c i l l u s
t h i r i n g i e n a s i s , p . 2 4 6 - 2 5 2 . I a J . A . Ho c h a n d P . S e t l o w ( e d . ) ,
M o l e c u l a r b i o l o g y o f m i c r o b i a l d i f f e r e n t i a t i o n . A m e r i c a n S o c i -
e t y f o r M i c r o b i o l o g y , W a s h i n g t o n , D. C .
1 2 . C h i l c o t t , C . N. , a n d D. J . E l l a r . 1 9 8 8 . C o m p a r a t i v e s t u d y o f
B a c i l l u t s t l h u r i a g i c n s i s v a r . i s r a c l c a i s i s c r y s t a l p r o t e i n s i / l v i v O
a n d i / l v i t r o . J . G e n . M i c r o b i o l . 1 34 : 2 5 5 1 - 2 5 5 8 .
1 3. C h u n j a t u p o r n c h a i , W . , H. Ho f t e , J . S e u r i n c k , C . A n g s u t h a n a -
s o m b a t , a n d NI . V a e c k . 1 9 8 8 . C o m m o n f e a t u r e s o f B a c i l l u s
t h u r i a g i c a s i s t o x i n s s p e c i f i c f o r Di p t e r c a a n d L e p i d o p t e r a . E u r .
J . B i o c h e m . 1 7 3: 9 - 1 6 .
1 4 . C r a w f o r d , M . 1 9 8 8 . A R S p r o d d e d i n t o t h e o p e n . S c i e n c e 2 39 :
7 1 9 .
1 5 . De l c l u s e , A . , C . B o u r g o u i n , A . Kl i e r , a n d G . R a p o p o r t . 1 9 8 8 .
S p e c i f i c i t y o f a c t i o n o n m o s q u i t o l a r v a e o f B a c i l l u s t h u r i a g i e a -
s i s i s r a c l e l a s i s t o x i n s e n c o d e d b y t w o d i f f e r e n t g e n e s . M o l .
G e n . G e n e t . 2 1 4 : 4 2 - 4 7 .
1 6 . Do n o v a n , W . P . , C . C . Da n k o c s i k , a n d M . P . G i l b e r t . 1 9 8 8 .
M o l e c u l a k r c h a r a c t e r i z a t i o n o f a g e n e e n c o d i n g a 7 2 - k i l o d a l t o n
m o s q u i t o - t o x i c c r y s t a l p r o t e i n t r o m B a c i l l u s t h u r i a g i e a s i s
s u b s p . i s r a ( l c a . s i s . J . B a c t e r i o l . 1 7 0 : 4 7 32 - 4 7 38 .
1 7 . D) o n o v a n , W . P . , C . C . Da n k o c s i k , NI . P . G i l b e r t , M . C .
G a w r o n - B u r k e , R . G . G r o a t , a n d B . C . C a r l t o n . 1 9 8 8 . A m i n o
a c i d s e q u e n c e a n d e n t o m o c i d a l a c t i v i t y o f t h e P 2 c r y s t a l
p r o t e i n . J . B i o l . C h e m . 2 6 3: 5 6 1 - 5 6 7 . ( E r r a t u m J . B i o l . C h e m .
2 6 4 : 4 7 4 0 . 1 9 8 8 . )
1 8 . I ) o n o v a n , W . P . , , J . NI . G o n z a l e z , M . P . G i l b e r t , a n d C .
I ) a n k o s i k . 1 9 8 8 . I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f E G 2 1 5 8 , a
n e w s t r a i n o f B a c i l l u s t h u r i a < g i c n s i . s t o x i c t o c o l e o p t e r a n l a r v a e .
a n d n u c l e o t i d e s e q u e n c e o f t h e t o x i n g e n e . M o l . G e n . G e n e t .
2 1 4 : 36 5 - 37 2 .
1 9 . E a r p , D. J . , a n d D. J . E l l a r . 1 9 8 7 . B a c i l l u s t h u r i a g i a e n s i s v a r .
i u 0 E Ti s o n a i s t r a i n P G 1 4 : n u c l e o t i d e s e q u e n c e o f a g e n e e n c o d i n g
a 2 7 k Da c r y s t a l p r o t e i n . Nu c l e i c A c i d s R e s . 1 5 : 36 1 9 .
2 1 0 . E i s e n b e r g , D. , E . S c h w a r t z , M . Ko m a r o m y , a n d R . W a l l . 1 9 8 4 .
A n a l y s i s o f m e m b r a n e a n d s u r f a c e p r o t e i n s e q u e n c e s w i t h t h e
h y d r o p h o b i c m o m e n t p l o t . J . M o l . B i o l . 1 7 9 : 1 2 5 - 1 4 2 .
2 1 . E n g l i s h , L . H. , a n d L . C . C a n t l e y . 1 9 8 6 . De l t a e n d o t o x i n i s a
p o t e n t i n h i b i t o r o f t h e ( Na . K) - A TP a s e . J . B i o l . C h e m . 2 6 1 :
1 1 7 0 - 1 1 7 3.
2 . Fe d e r i c i , B . A . , P . L u t h y , a n d J . E . l b a r r a . 1 9 9 0 . Th e p a r a s p o -
r a l b a d v o f B a c i l l u s t h i n i a g i C n s i s s u b s p . i s r a e l c n s i s : s t r u c t u r e .
p r - o t e i n c o m i l p o s i t i o n a n d t o x i c i t y . I n H. d e B a r j a c a n d S .
S u t h e r l a n d ( e d . ) . B a c t e r i a l c o n t r o l o f m o s q u i t o e s a n d b l a c k -
f l i e s : b i o c h e m i s t r y . g e n e t i c s a n d a p p l i c a t i o n s o f B a c i l l u s t h i u -
i a g i c a s i s a n d B a c i l l u i s p h a c r i c u s . i n p r e s s . R u t g e r s U n i v e r s i t y
P ' r e s s . Ne w B r u n s w i c k . N. J .
2 3. Fi s c h h o f f , D. A . , K. S . B o w d i s c h , F. J . P e r l a k , P . G . M a r r o n e ,
S . H. M c C o r m i c k , J . G . Ni e d e r m e y e r ,
D. A . De a n , K. Ku s a n o -
Kr e t z m e r , E . . j . M a y e r , D. E . R o c h e s t e r , S . G . R o g e r s ,
a n d
R . T. Fr a l e y . 1 9 8 7 . I n s e c t t o l e r a n t t r a n s g e n i c t o m a t o
p l a n t s .
B 3i o / Te c h n o l o g y 5 : 8 0 7 - 8 1 3.
M I C
R O B i o 0 1 -
R E V

o
n

J
u
n
e

2
9
,

2
0
1
2

b
y

g
u
e
s
t
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

I NS E C TI C I DA L C R YS TA L P R O TE I NS O F B . THU R I NG I E NS I S 2 5 3
2 4 . G a l j a r t , N. J . , N. S i v a s u b r a m a n i a n , a n d B . A . Fe d e r i c i . 1 9 8 7 .
P l a s m i d l o c a t i o n , c l o n i n g a n d s e q u e n c e a n a l y s i s o f t h e g e n e
e n c o d i n g a 2 7 . 3- k i l o d a l t o n c y t o l y t i c p r o t e i n f r o m B a c i l l u s
t h u r i n g i e n s i s s u b s p . u o u r n i s o t i ( P G - 1 4 ) . C u r r . M i c r o b i o l . 1 6 :
1 7 1 - 1 7 4 .
2 5 . G a r d u n o , F. , L . Th o r n e , A . M . W a l f i e l d , a n d T. J . P o l l o c k .
1 9 8 8 . S t r u c t u r a l r e l a t e d n e s s b e t w e e n m o s q u i t o c i d a l e n d o t o x -
i n s o f B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s s u b s p . i s r a c i l e t s i . s . A p p l . E n v i r o n .
M i c r o b i o l . 5 4 : 2 7 7 - 2 7 9 .
2 6 . G a r f i e l d , J . L . , a n d C . D. S t o u t . 1 9 8 8 . C r y s t a l l i z a t i o n a n d
p r e l i m i n a r y X- r a y d i f f r a c t i o n s t u d i e s o f a t o x i c c r y s t a l p r o t e i n
f r o m a s u b s p e c i e s o f B a c i l l u s t l u h u r i n t g i e t n s i s . J . B i o l . C h e m . 2 6 3:
1 1 8 0 0 - 1 1 8 0 1 .
2 7 . G e i s e r , M . , S . S c h w e i t z e r , a n d C . G r i m m . 1 9 8 6 . Th e h y p e r v a r i -
a b l e r e g i o n i n t h e g e n e s c o d i n g f o r e n t o m o p a t h o g e n i c c r y s t a l
p r o t e i n s o f B a c i l l u s t l h u i r i n t g i e n l s i s : n u c l e o t i d e s e q u e n c e o f t h e
k i u r l i d l g e n e o f s u b s p . k i u r s t a i k i HD1 . G e n e 4 8 : 1 0 9 - 1 1 8 .
2 8 . G h e y s e n , G . , P . Dh a e s e , M . V a n M o n t a g u , a n d J . S c h e l l . 1 9 8 5 .
DNA f l u x a c r o s s g e n e t i c b a r r i e r s : t h e c r o w n g a l l p h e n o m e n o n ,
p . 1 1 - 4 7 . I n B . Ho h n a n d E . S . De n n i s ( e d . ) , G e n e t i c f l u x i n
p l a n t s . S p r i n g e r - V e r l a g , V i e n n a . A u s t r i a .
2 9 . Ha i d e r , M . Z . , a n d D. J . E l l a r . 1 9 8 7 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e
t o x i c i t y a n d c y t o p a t h i c s p e c i f i c i t y o f a c l o n e d B a c i l l u s t l h u i n -
g i e n s i s c r y s t a l p r o t e i n u s i n g i n s e c t c e l l c u l t u r e . M o l . M i c r o -
b i o l . 1 : 5 9 - 6 6 .
30 . Ha i d e r , M . Z . , a n d D. J . E l l a r . 1 9 8 8 . Nu c l e o t i d e s e q u e n c e o f a
B a c i l l t s t h i n i g i e n . s i s a i z a i w a i I C 1 e n t o m o c i d a l c r y s t a l p r o t e i n
g e n e . Nu c l e i c A c i d s R e s . 1 6 : 1 0 9 2 7 .
31 . Ha i d e r , M . Z . , B . H. Kn o w l e s , a n d D. J . E l l a r . 1 9 8 6 . S p e c i f i c i t y
o f B a c i l l u s t l l r i n i g i e n s i s v a r . c o l h n c r i i n s e c t i c i d a l d e l t a - e n d o -
t o x i n b y d i f f e r e n t i a l p r o c e s s i n g o f t h e p r o t o x i n b y l a r v a l g u t
p r o t e a s e s . E u r . J . B i o c h e m . 1 5 6 : 5 31 - 5 4 0 .
32 . Ha r v e y , W . R . , M . C i o f f i , J . A . T. Do w , a n d M . G . W o l f e r s -
b e r g e r . 1 9 8 3. P o t a s s i u m i o n t r a n s p o r t A TP a s e i n i n s e c t e p i t h e -
l i u m . J . E x p . B i o l . 1 0 6 : 9 1 - 1 1 7 .
33. He f f o r d , M . A . , R . B r o u s s e a u , G . P r e f o n t a i n e , Z . Ha n n a , J . A .
C o n d i e , a n d P . C . K. L a u . 1 9 8 7 . S e q u e n c e o f a l e p i d o p t e r a n
t o x i n g e n e o f B a c i l l u s t l h l i n g i e n s i s s u b s p . k i u r . s t a i k i NR D- 1 2 . J .
B i o t e c h n o l . 6 : 30 7 - 32 2 .
34 . He i e r s o n , A . , R . L a n d e n , A . L o v g r e n , G . Da l h a m m a r , a n d
H. G . B o m a n . 1 9 8 7 . Tr a n s f o r m a t i o n o f v e g e t a t i v e c e l l s o f
B a c i l l u s t h l u r i i t g i e n s i s b y p l a s m i d DNA . J . B a c t e r i o l . 1 6 9 : 1 1 4 7 -
1 1 5 2 .
34 He i e r s o n , A . , R . L a n d e n , A . L o v g r e n , G . Da l h a m m a r , a n d H. G .
B o w m a n . 1 9 8 7 . Tr a n s f o r m a t i o n o f v e g e t a t i v e c e l l s o f B a c i l l u s
t h l u i i n g i e n i s i s b y p l a s m i d DNA . J . B a c t e r i o l . 1 6 9 : 1 1 4 7 - 1 1 5 2 .
35 . He r r n s t a d t , C . , T. E . G i l r o y , D. A . S o b i e s k i , B . D. B e n n e t , a n d
F. H. G a e r t n e r . 1 9 8 7 . Nu c l e o t i d e s e q u e n c e a n d d e d u c e d a m i n o
a c i d s e q u e n c e o f a c o l e o p t e r a n - a c t i v e d e l t a - e n d o t o x i n g e n e
f r o m B a c i l l i t s t h u r i n g i e n s i s s u b s p . s t I a d i e g o . G e n e 5 7 : 37 - 4 6 .
36 . He r r n s t a d t , C . , G . G . S o a r e s , E . R . W i l c o x , a n d D. L . E d w a r d s .
1 9 8 6 . A n e w s t r a i n o f B a c i l l u s
t l u r i i n g i i c g i e n s i s
w i t h a c t i v i t y
a g a i n s t c o l e o p t e r a n i n s e c t s . B i o / Te c h n o l o g y 4 : 30 5 - 30 8 .
37 . Ho f m a n n , C . , P . L u t h y , R . Hu t t e r , a n d V . P l i s k a . 1 9 8 8 . B i n d i n g
o f t h e d e l t a e n d o t o x i n f r o m B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s t o b r u s h -
b o r d e r m e m b r a n e v e s i c l e s o f t h e c a b b a g e b u t t e r f l y ( P i e r i . s
b r a s s i c a e ) . E u r . J . B i o c h e m . 1 7 3: 8 5 - 9 1 .
38 . Ho f m a n n , C . , H. V a n d e r b r u g g e n , H. Ho f t e , J . V a n R i e , S .
J a n s e n s , a n d H. V a n M e l l a e r t . 1 9 8 8 . S p e c i f i c i t y o f B a c i l l u s
t h l u i n l i i g i e n i s i s 8 - e n d o t o x i n s i s c o r r e l a t e d w i t h t h e p r e s e n c e o f
h i g h - a f f i n i t y b i n d i n g s i t e s i n t h e b r u s h b o r d e r m e m b r a n e o f
t a r g e t i n s e c t m i d g u t s . P r o c . Na t l . A c a d . S c i . U S A 8 5 : 7 8 4 4 -
7 8 4 8 .
39 . Ho f t e , H. , H. d e G r e v e , J . S e u r i n c k , S . J a n s e n s , j . M a h i l l o n , C .
A m p e , J . V a n d e k e r c k h o v e , H. V a n d e r b r u g g e n , M . V a n M o n -
t a g u , M . Z a b e a u , a n d M . V a e c k . 1 9 8 6 . S t r u c t u r a l a n d f u n c -
t i o n a l a n a l y s i s o f a c l o n e d d e l t a e n d o t o x i n o f B a c i l l u s t l i l / u i n l -
g i e n s i s B e r l i n e r 1 7 1 5 . E u r . J . B i o c h e m . 1 6 1 : 2 7 3- 2 8 0 ) .
4 0 . Ho f t e , H. , J . S e u r i n c k , A . V a n Ho u t v e n , a n d M . V a e c k . 1 9 8 7 .
Nu c l e o t i d e s e q u e n c e o f a g e n e e n c o d i n g a n i n s e c t i c i d a l p r o t e i n
o f B a c i l l u s t l i i h u r i t n g i e t i s i s v a r . t e n e b r i o n i s t o x i c a g a i n s t C o -
l e o p t e r a . Nu c l e i c A c i d s R e s . 1 5 : 7 1 8 3.
4 1 . Ho f t e , H. , J . V a n R i e , S . J a n s e n s , A . V a n Ho u t v e n , H. V a n d e r -
b r u g g e n , a n d M . V a e c k . 1 9 8 8 . M o n o c l o n a l a n t i b o d y a n a l y s i s
a n d i n s e c t i c i d a l s p e c t r u m o f t h r e e t y p e s o f l e p i d o p t e r a n - s p e -
c i f i c i n s e c t i c i d a l c r y s t a l p r o t e i n s o f B a c i l l u s t h u r i n g i c n s i s .
A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 4 : 2 0 1 0 - 2 0 1 7 .
4 2 . Ho n & e , G . , T. v a n d e r S a i m , a n d B . V i s s e r . 1 9 8 8 . Nu c l e o t i d e
s e q u e n c e o f c r y s t a l p r o t e i n g e n e i s o l a t e d f r o m B . t i t u i n i g i c t I s i s
s u b s p e c i e s e n t o m i o c i d i u s 6 0 . 5 c o d i n g f o r a t o x i n h i g h l y
a c t i v e
a g a i n s t S p o t l o p t e r a s p e c i e s . Nu c l e i c A c i d s R e s . 1 6 : 6 2 4 0 .
4 3. Hu b e r - L u k a c , M . , F. J a q u e t , P . L u t h y , R . Hu e t t e r ,
a n d D. G .
B r a u n . 1 9 8 6 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s t o a
c r y s t a l p r o t e i n o f B a c i l l u s t i u r i n g i e n s i s s u b s p . k u r - s t a i k i . I n f e c t .
I m m u n . 5 4 : 2 2 8 - 2 32 .
4 4 . I b a r r a , J . E . , a n d B . A . Fe d e r i c i . 1 9 8 6 . I s o l a t i o n o f a r e l a t i v e l y
n o n - t o x i c 6 5 - k i l o d a l t o n p r o t e i n i n c l u s i o n f r o m t h e p a r a s p o r a l
b o d y o f B a c i l l u s t l i u r i n g i e n s i s s u b s p . i s r t a i l e n i s i s . J . B a c t e r i o l .
1 6 5 : 5 2 7 - 5 33.
4 5 . J a q u e t , F. , R . Hu t t e r , a n d P . L u t h y . 1 9 8 7 . S p e c i f i c i t y
o f
B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s d e l t a - e n d o t o x i n . A p p l . E n v i r o n . M i c r o -
b i o l . 5 3: 5 0 0 - 5 0 4 .
4 6 . J a r r e t , P . 1 9 8 5 . P o t e n c y f a c t o r s i n t h e d e l t a - e n d o t o x i n o f
B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s v a r . a i l z a w a i , a n d t h e
s i g n i f i c a n c e
o f
p l a s m i d s i n t h e i r c o n t r o l . J . A p p l . B a c t e r i o l . 5 8 : 4 37 - 4 4 8 .
4 7 . Kl e i n , T. M . , T. G r a d z i e l , M . E . Fr o m m , a n d J . C . S a n f o r d .
1 9 8 8 . Fa c t o r s i n f l u e n c i n g g e n e d e l i v e r y
i n t o Z e c i I n a y s c e l l s
b y
h i g h - v e l o c i t y m i c r o p r o j e c t i l e s . B i o / Te c h n o l o g y
6 : 5 5 9 - 5 6 3.
4 8 . Kn o w l e s , B . H. , a n d D. J . E l l a r . 1 9 8 6 . C h a r a c t e r i z a t i o n a n d
p a r t i a l p u r i f i c a t i o n o f a
p l a s m a m e m b r a n e r e c e p t o r
f o r B a c i l l u s
t h u r i n g i e n s i s v a r . k u r i - s t a i k i l e p i d o p t e r a n - s p e c i f i c
8 - e n d o t o x i n .
J . C e l l S c i . 8 3: 8 9 - 1 0 1 .
4 9 . Kn o w l e s , B . H. , a n d D. J . E l l a r . 1 9 8 7 . C o l l o i d - o s m o t i c l y s i s
i s
a g e n e r a l f e a t u r e o f t h e m e c h a n i s m o f a c t i o n o f B a c i l l u s
t h u r i n g i c n s i s f - e n d o t o x i n s w i t h d i f f e r e n t i n s e c t s p e c i f i c i t i e s .
B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 9 2 4 : 5 0 9 - 5 1 8 .
5 0 . Kn o w l e s , B . H. , a n d D. J . E l l a r . 1 9 8 8 . Di f f e r e n t i a l s p e c i f i c i t y
o f
t w o i n s e c t i c i d a l t o x i n s f r o m B a c i l l u s t i u l r i n g i c n s i s v a r . a i i z -
w a t i . M o l . M i c r o b i o l . 2 : 1 5 3- 1 5 7 .
5 1 . Kn o w l e s , B . H. , W . E . Th o m a s , a n d D. J . E l l a r . 1 9 8 4 . L e c t i n -
l i k e b i n d i n g o f B a c i l l u s t h l i i n - i g i e n i s i s
v a r . k i u r - s t t a k i
l e p i -
d o p t e r a n - s p e c i f i c t o x i n i s a n i n i t i a l
s t e p
i n i n s e c t i c i d a l a c t i o n .
FE B S L e t t . 1 6 8 : 1 9 7 - 2 0 2 .
5 2 . Ko n d o , S . , N. Ta m u r a , A . Ku n i t a t e , M . Ha t t o r i , A . A k a s h i ,
a n d
I . O h m o r i . 1 9 8 7 . C l o n i n g a n d n u c l e o t i d e s e q u e n c i n g
o f t w o
i n s e c t i c i d a l d e l t a - e n d o t o x i n g e n e s f r o m B a c i l l u s t h u r i e n s i s .
A g r i c . B i o l . C h e m . 5 1 : 4 5 5 - 4 6 3.
5 3. Kr i e g , A . , A . Hu g e r , G . L a n g e n b r u c h ,
a n d W . S c h n e t t e r . 1 9 8 3.
B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s v a r . t e n 1 e b r - i o n I i s :
a n e w
p a t h o t y p e
e f f e c -
t i v e a g a i n s t l a r v a e o f C o l e o p t e r a . J . A p p l . E n t o m o l . 9 6 : 5 0 0 -
5 0 8 .
5 4 . Kr o n s t a d , J . W . , H. E . S c h n e p f , a n d H. R .
W h i t e l e y .
1 9 8 3.
Di v e r s i t y o f l o c a t i o n s f o r t h e B a c i l l u s
t l i i h u i n g i e n s i s c r y s t a l
p r o t e i n g e n e . J . B a c t e r i o l . 1 5 4 : 4 1 9 - 4 2 8 .
5 5 . Kr o n s t a d , J . W . , a n d H. R .
W h i t e l e y .
1 9 8 4 . I n v e r t e d
r e p e a t
s e q u e n c e s
f l a n k t h e B a c i l l u s
t h u r i n g i e n s i s c r y s t a l p r o t e i n g e n e .
J . B a c t e r i o l . 1 6 0 : 9 5 - 1 0 2 .
5 6 . Kr o n s t a d , J . W . , a n d H. R .
W h i t e l e y .
1 9 8 6 . Th r e e c l a s s e s o f
h o m o l o g o u s
B a c i l l u s
t h u r i n g i e n s i s c r y s t a l p r o t e i n g e n e s .
G e n e
4 3: 2 9 - 4 0 .
5 7 . Kr y w i e n z c y k , J . 1 9 7 7 .
A n t i g e n i c c o m p o s i t i o n
o f b - e n d o t o x i n a s
a n a i d i n i d e n t i f i c a t i o n o f B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s v a r i e t i e s .
P u b l i c a t i o n I P - X- 1 6 . I n s e c t
P a t h o l o g y
R e s e a r c h I n s t i t u t e , C a -
n a d i a n Fo r e s t S e r v i c e , S a u l t S a i n t e M a r i e , O n t a r i o , C a n a d a .
5 8 . L e c a d e t , M . - M . , a n d H. d e
B a r j a c .
1 9 8 1 . B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s
b e t a - e x o t o x i n , p .
2 9 3- 32 1 . I n E . W . Da v i d s o n ( e d . ) , P a t h o g e n -
e s i s o f i n v e r t e b r a t e m i c r o b i a l d i s e a s e s . A l l e n h e l d , O s m u n a n d
C o . , To t o w a , N. J .
5 9 . L e c a d e t , M . - M . , a n d R . De d o n d e r . 1 9 6 7 .
E n z y m a t i c h y d r o l y s i s
o f t h e
c r y s t a l s
o f B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s b y
t h e
p r o t e a s e s
o f
P i e r i s b r a s s i c a e . 1 . P r e p a r a t i o n
a n d f r a c t i o n a t i o n o f t h e
l y -
s a t e s . J . I n v e r t e b r . P a t h o l . 9 : 31 0 - 32 1 .
6 0 . L e c a d e t , M . - M . , a n d D. M a r t o u r e t . 1 9 8 7 . Ho s t
s p e c i f i c i t y
o f
t h e B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s 8 - e n d o t o x i n t o w a r - d
l e p i d o p t e r a n
s p e c i e s : S p o u d o p t c r a l i t t o r a l i s B d v . a n d P i c r i s b r a s s i c a e L . J .
l n v e r t e b r . P a t h o l . 4 9 : 37 - 4 8 .
V O L . 5 3, 1 9 8 9

o
n

J
u
n
e

2
9
,

2
0
1
2

b
y

g
u
e
s
t
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

2 5 4 HO FTE A ND W HI TE L E Y
6 1 . L e r e c l u s , D. , J . R i b i e r , A . Kl i e r , G . M e n o u , a n d M . - M .
L e c a d e t . 1 9 8 4 . A t r a n s p o s o n - l i k e s t r u c t u r e r e l a t e d t o t h e 6 -
e n d o t o x i n g e n e o f B a c i l l u s t l h u r i n g i e n s i s . E M B O J . 3: 2 5 6 1 -
2 5 6 7 .
6 2 . L i , J . , R . He n d e r s o n , J . C a r r o l l , a n d D. E l l a r . 1 9 8 8 . X- r a y
a n a l y s i s o f t h e c r y s t a l l i n e p a r a s p o r a l i n c l u s i o n i n B a c i l l u s
t h u r i n g i e n s i s v a r . t e c e b r - i o n i i s . J . M o l . B i o l . 1 9 9 : 5 4 3- 5 4 4 .
6 3. L u i t h y , P . , a n d H. R . E b e r s o l d . 1 9 8 1 . B a c i l l u s t l i i r l g w i n i i e s i s
d e l t a - e n d o t o x i n : h i s t o p a t h o l o g y a n d m o l e c u l a r m o d e o f a c t i o n ,
p . 2 35 - 2 6 7 . I n E . W . Da v i d s o n ( e d . ) . P a t h o g e n e s i s o f i n v e r t e -
b r a t e m i c r o b i a l d i s e a s e s . A l l e n h e l d , O s m u n a n d C o . To t o w a ,
N. J .
6 4 . M a h i l l o n , J . , J . S e u r i n c k , L . V . R o m p u y , J . De l c o u r , a n d M .
Z a b e a u . 1 9 8 5 . Nu c l e o t i d e s e q u e n c e a n d s t r u c t u r a l o r g a n i z a t i o n
o f a n i n s e r t i o n s e q u e n c e e l e m e n t ( 1 S 2 31 ) f r o m B a c i l l u s t h u r -
i g i e l c i s i s s t r a i n B e r l i n e r 1 7 1 5 . E M B O J . 4 : 38 9 5 - 38 9 9 .
6 4 a . M a s s o n , L . , P . M a r c o t t e , G . P r e f o n t a i n e , a n d R . B r o u s s e a u .
1 9 8 9 . Nu c l e o t i d e s e q u e n c e o f a g e n e c l o n e d f r o m B a c i l l u s
t l h u r i n g i n s i s s u b s p e c i e s e n t o t n o c i d u s c o d i n g f o r a n i n s e c t i -
c i d a l p r o t e i n t o x i c f o r B o u u h b v m l o r i . Nu c l e i c A c i d s R e s . 1 7 :
4 4 6 .
6 5 . M c C a b e , D. E . , W . F. S w a i n , B . J . M a r t i n e l l , a n d P . C h r i s t o u .
1 9 8 8 . S t a b l e t r a n s f o r m a t i o n o f s o y b e a n ( G l y c i n e m a x . ) b y
p a r t i c l e a c c e l e r a t i o n . B i o / Te c h n o l o g y 6 : 9 2 3- 9 2 6 .
6 6 . M c G a u g h e y , W . H. 1 9 8 5 . I n s e c t r e s i s t a n c e t o t h e b i o l o g i c a l
i n s e c t i c i d e B a c i l l u s t h l r i n - i g i e t u s i s . S c i e n c e 2 9 9 : 1 9 3- 1 9 5 .
6 7 . M c G a u g h e y , W . H. , a n d D. E . J o h n s o n . 1 9 8 7 . To x i c i t y o f
d i f f e r e n t s e r o t y p e s a n d t o x i n s o f B a c i l l u s
t h u l i u g - i i c g i . s i s
t o
r e s i s t a n t a n d s u s c e p t i b l e I n d i a n m e a l m o t h s ( L e p i d o p t e r a :
P y r a l i d a e ) . J . E c o n . E n t o m o l . 8 0 : 1 1 2 2 - 1 1 2 6 .
6 8 . M c L e a n , K. M . , a n d H. R . W h i t e l e y . 1 9 8 7 . E x p r e s s i o n i n
E s c h c r i c h i a c o l i o f a c l o n e d c r y s t a l p r o t e i n g e n e o f B a c i l l u s
t h u r i n g i e n s i s s u b s p . i s r a e l e t i s i s . J . B a c t e r i o l . 1 6 9 : 1 0 1 7 - 1 0 2 3.
6 9 . M c P h e r s o n , S . A . , F. J . P e r l a c k , R . L . Fu c h s , P . G . M a r r o n e ,
P . B . L a v r i k , a n d D. A . Fi s c h h o f f . 1 9 8 8 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e
c o l e o p t e r a n - s p e c i f i c p r o t e i n g e n e o f B a c i l l u s t h i u r i n g i c n s i s v a r .
t c i c b n - i o u n i s . B i o / Te c h n o l o g y 6 : 6 1 - 6 6 .
7 0 . M i d d l e b r o o k , J . L . , a n d R . B . Do r l a n d . 1 9 8 4 . B a c t e r i a l t o x i n s :
c e l l u l a r m e c h a n i s m s o f a c t i o n . M i c r o b i o l . R e v . 4 8 : 1 9 9 - 2 2 1 .
7 1 . Na g a m a t s u , Y. , Y. I t a i , C . Ha t a n a k a , G . Fu n a t s u , a n d K.
Ha y a s h i . 1 9 8 4 . A t o x i c f r a g m e n t f r o m t h e e n t o m o c i d a l c r y s t a l
p r o t e i n o f B a c i l l u s t h u r i n g i c n s i s . A g r i c . B i o l . C h e m . 4 8 : 6 1 1 -
6 1 9 .
7 2 . O b u k o w i c z , M . G . , F. J . P e r l a c k , K. Ku s a n o - Kr e t z m e r , E . J .
M e y e r , a n d L . S . W a t r u d . 1 9 8 6 . I n t e g r a t i o n o f t h e d e l t a
e n d o t o x i n g e n e o f B a c i l l u s t h u r n i e n i g i s i s i n t o t h e c h r o m o s o m e
o f r o o t c o l o n i z i n g s t r a i n s o f p s e u d o m o n a d s u s i n g Tn 5 . G e n e
4 5 : 32 7 - 331 .
7 3. O e d a , K. , K. O s h i e , M . S h i m i z u , K. Na k a m u r a , H. Ya m a m o t o ,
1 . Na k a y a m a , a n d H. O h k a w a . 1 9 8 7 . Nu c l e o t i d e s e q u e n c e o f
t h e i n s e c t i c i d a l p r o t e i n g e n e o f B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s s t r a i n
a i z t a w a i I P L 7 a n d i t s h i g h l e v e l e x p r e s s i o n i n E s c h e r i c h i a c o l i .
G e n e 5 3: 1 1 3- 1 1 9 .
7 4 . P a o - i n t a r a , M . , C . A n g s u t h a n a s o m b a t , a n d S . P a n y i m . 1 9 8 8 .
Th e m o s q u i t o l a r v i c i d a l a c t i v i t y o f 1 30 k Da d e l t a - e n d o t o x i n o f
B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s v a r . i s r a e l e n s i s r e s i d e s i n t h e 7 2 k Da
a m i n o - t e r m i n a l f r a g m e n t . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n .
1 5 3: 2 9 4 - 30 0 .
7 5 . P f a n n e n s t i e l , M . A . , G . A . C o u c h e , E . J . R o s s , a n d K. W .
Ni c k e r s o n . 1 9 8 6 . I m m u n o l o g i c a l r e l a t i o n s h i p s a m o n g p r o t e i n s
m a k i n g u p t h e B a c i l l u s t l u r i n g i e n s i s s u b s p . i s r a e l e n s i s c r y s t a l -
l i n e t o x i n . A p p I . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 2 : 6 4 4 - 6 4 9 .
7 6 . S a c c h i , V . F. , P . P a r e n t i , G . M . Ha n o z e t , B . G i o r d a n a , P .
L u t h y , a n d M . G . W o l f e r s b e r g e r . 1 9 8 6 . B a c i l l u s t h l i u n i - i g i e n g i s i s
t o x i n i n h i b i t s K+ - g r a d i e n t - d e p e n d e n t a m i n o a c i d t r a n s p o r t
a c r o s s t h e b r u s h - b o r d e r m e m b r a n e o f P i e t i s b l r a . s s i c a c e m i d g u t
c e l l s . FE B S L e t t . 2 0 4 : 2 1 3- 2 1 8 .
7 7 . S a n c h i s , V . , D. L e r e c l u s , G . M e n o u , J . C h a u f a u x , a n d M . - M .
L e c a d e t . 1 9 8 8 . M u l t i p l i c i t y o f d e l t a - e n d o t o x i n g e n e s w i t h d i f -
f e r e n t i n s e c t i c i d a l s p e c i f i c i t i e s i n B a c i l l u s t l h u l - i i n g i e t i s i s a i z a v a , i
7 . 2 9 . M o l . M i c r o b i o l . 2 : 39 3- 4 0 4 .
7 8 . S c h n e p f , H. E . , a n d H. R . W h i t e l e y . 1 9 8 5 . De l i n e a t i o n o f a
t o x i n - e n c o d i n g s e g m e n t o f a B a c i l l l s t h l l u n i n g i e n s i s c r y s t a l
p r o t e i n g e n e . J . B i o l . C h e m . 2 6 0 : 6 2 7 3- 6 2 8 0 .
7 9 . S c h n e p f , H. E . , H. C . W o n g , a n d H. R . W h i t e l e y . 1 9 8 5 . Th e
a m i n o a c i d s e q u e n c e o f a c r y s t a l p r o t e i n f r o m B a c i l l u s t h u r -
i n i g i e c i s i s d e d u c e d f r o m t h e DNA b a s e s e q u e n c e . J . B i o l .
C h e m . 2 6 0 : 6 2 6 4 - 6 2 7 2 .
8 0 . S c h n e p f , H. E . , H. C . W o n g , a n d H. R . W h i t e l e y . 1 9 8 7 .
E x p r e s s i o n o f a c l o n e d B a c i l l u s t h i l r i n g i e n s i s c r y s t a l p r o t e i n
g e n e i n E . s c h e r i c h i a c o l i . J . B a c t e r i o l . 1 6 9 : 4 1 1 0 - 4 1 1 8 .
8 1 . S e k a r , V . , D. V . Th o m p s o n , M . J . M a r o n e y , R . G . B o o k l a n d ,
a n d M . J . A d a n g . 1 9 8 7 . M o l e c u l a r c l o n i n g a n d c h a r a c t e r i z a t i o n
o f t h e i n s e c t i c i d a l c r y s t a l p r o t e i n g e n e o f B a c i l l u s t l h u r i n g i c n s i s
v a r . t e n e b r i o u n i s . P r o c . Na t l . A c a d . S c i . U S A 8 4 : 7 0 36 - 7 0 4 0 .
8 2 . S e n , K. , G . Ho n d a , N. Ko y a m a , M . Ni s h i d a , A . Ne k i , H. S a k a i ,
M . Hi m e n o , a n d T. Ko m a n o . 1 9 8 8 . C l o n i n g a n d n u c l e o t i d e
s e q u e n c e s o f t h e t w o 1 30 k Da i n s e c t i c i d a l p r o t e i n g e n e s o f
B a c i l l u s t h u r i n g u i e n s i s v a r . i s r a l c e n s i s . A g r i c . B i o l . C h e m . 5 2 :
8 7 3- 8 7 8 .
8 3. S h i b a n o , Y. , A . Ya m a g a t a , T. A m a c h i , a n d M . Ta k a n a m i . 1 9 8 6 .
C o m p l e t e s t r u c t u r e o f a n i n s e c t i c i d a l c r y s t a l p r o t e i n g e n e f r o m
B a c i l l u s t h u r i n g i c n s i s , p . 30 7 - 32 t ) . I l l A . T. G a n e s a n a n d J . A .
Ho c h ( e d . ) , B a c i l l u s m o l e c u l a r g e n e t i c s a n d b i o t e c h n o l o g y
a p p l i c a t i o n s . A c a d e m i c P r e s s . I n c . , O r l a n d o . Fl a .
8 4 . S h i b a n o , Y. , A . Ya m a g a t a , N. Na k a m u r a , T. l i z u k a , H. S u g i -
s a k i , a n d M . Ta k a n a m i . 1 9 8 5 . Nu c l e o t i d e s e q u e n c e c o d i n g f o r
t h e i n s e c t i c i d a l f r a g m e n t o f t h e B a c i l l u s t l h i i n i g i e n s i s c r y s t a l
p r o t e i n g e n e . G e n e 34 : 2 4 3- 2 5 1 .
8 5 . S h i m i z u , M . , K. O s h i e , K. Na k a m u r a , Y. Ta k a d a , K. O e d a , a n d
H. O h k a w a . 1 9 8 8 . C l o n i n g a n d e x p r e s s i o n i n E s c h e r i c h i a c o l i
o f t h e 1 35 - k Da i n s e c t i c i d a l p r o t e i n g e n e f r o m B a c i l l u s t i l u i n -
g i c u i s i s s u b s p . a i z l a a ( l i I P L 7 . A g r i c . B i o l . C h e m . 5 2 : 1 5 6 5 - 1 5 7 3.
8 6 . S h i v a k u m a r , A . G . , G . . J . G u n d l i n g , T. A . B e n s o n , D. C a s u t o ,
M . F. M i l l e r , a n d B . B . S p e a r . 1 9 8 6 . V e g e t a t i v e e x p r e s s i o n o f
t h e 6 - e n d o t o x i n g e n e s o f B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s s u b s p . k u i r s t u i k i
i n B a c i l l u s s i u b t i l i s . J . B 3a c t e r i o l . 1 6 6 : 1 9 4 - 2 0 4 .
8 7 . Th o m a s , W . E . , a n d D. J . E l l a r . 1 9 8 3. B a c i l l u s t h u r i n g i c e s i s
v a r . i s r a c l u e l e s i s c r y s t a l 8 - e n d o t o x i n : e f f e c t s o n i n s e c t a n d
m a m m a l i a n c e l l s i n v i t r o a n d i n v i v o . J . C e l l S c i . 6 0 : 1 8 1 - 1 9 7 .
8 8 . Th o r n e , L . , F. G a r d u n o , T. Th o m p s o n , D. De c k e r , M . Z o u n e s ,
M . W i l d , A . M . W a l f i e l d , a n d T. P o l l o c k . 1 9 8 6 . S t r u c t u r a l
s i m i l a r i t y b e t w e e n t h e L e p i d o p t e r a - a n d Di p t e r a - s p e c i f i c i n s e c -
t i c i d a l e n d o t o x i n g e n e s o f B a c i l l u s t d u r i n i e n g s i s s u b s p . k u r -
s t t u k i a n d i s r - a e l e u s i s . J . B a c t e r i o l . 1 6 6 : 8 0 1 - 8 1 1 .
8 9 . Tu n g p r a d u b k u l , S . , C . S e t t a s a t i e n , a n d S . P a n y i m . 1 9 8 8 . Th e
c o m p l e t e n u c l e o t i d e s e q u e n c e o f a 1 30 k Da m o s q u i t o - l a r v i c i d a l
d e l t a - e n d o t o x i n g e n e o f B a c i l l u s t l h l u r i n g i e t i s i s v a r . i s r a i e l e i s i s .
Nu c l e i c A c i d s R e s . 1 6 : 1 6 37 - 1 6 38 .
9 0 . V a e c k , M . , A . R e y n a e r t s , H. Ho f t e , S . J a n s e n s , M . De B e u k e l -
e e r , C . De a n , M . Z a b e a u , M . V a n M o n t a g u , a n d J . L e e m a n s .
1 9 8 7 . Tr a n s g e n i c p l a n t s p r o t e c t e d f r o m i n s e c t a t t a c k . Na t u r e
( L o n d o n ) 32 8 : 33- 37 .
9 1 . W a a l w i j c k , C . , A . M . Du l l e m a n s , M . E . S . v a n W o r k u m , a n d B .
V i s s e r . 1 9 8 5 . M o l e c u l a r c l o n i n g a n d t h e n u c l e o t i d e s e q u e n c e o f
t h e M r 2 8 0 0 0 c r y s t a l p r o t e i n g e n e o f B a c i l l u s
t l d i u u i t , g i e n g s i i s
s u b s p . i s r a e l c t i s i s . Nu c l e i c A c i d s R e s . 1 3: 8 2 0 6 - 8 2 1 7 .
9 2 . W a b i k o , H. , K. C . R a y m o n d , a n d L . A . B u l l a , J r . 1 9 8 6 .
B a c i l l u s t d l i r i n - i , g i e n s i s e n t o m o c i d a l p r o t o x i n g e n e s e q u e n c e a n d
g e n e p r o d u c t a n a l y s i s . DNA 5 : 30 5 - 31 4 .
9 3. W a r d , E . S . , a n d D. J . E l l a r . 1 9 8 6 . B a c i l l u s t h u r l i n i * g i e i s i s v a r .
i s r a c l e l e t i s i s d e l t a - e n d o t o x i n : n u c l e o t i d e s e q u e n c e a n d c h a r a c -
t e r i z a t i o n o f t h e t r a n s c r i p t s i n B a c i l l u m s t h a u r i n g i e n s i s a n d E s c h -
e r i c l i a c o l . J . M o l . B i o l . 1 9 1 : 1 - 1 1 .
9 4 . W a r d , E . S . , D. J . E l l a r , a n d C . N. C h i l c o t t . 1 9 8 8 . S i n g l e a m i n o
a c i d c h a n g e s i n t h e B a c i l l h u s t h u r i n g i c n s i s v a r . i s r a e l e n s i s
6 - e n d o t o x i n a f f e c t t h e t o x i c i t y a n d e x p r e s s i o n o f t h e p r o t e i n . J .
M o l . B i o l . 2 0 2 : 5 2 7 - 5 35 .
9 5 . W a r d , E . S . , A . R . R i d l e y , D. J . E l l a r , a n d J . A . To d d . 1 9 8 6 .
B a c i l l u s t h l u u r i n g i e n s i s v a r . i s r a e l e n u s i s d e l t c l - e n d o t o x i n : c l o n i n g
a n d e x p r e s s i o n o f t h e t o x i n i n s p o r o g e n i c a n d a s p o r o g e n i c
s t r a i n s o f B a c i l l u u s s l i b t i l i . s . J . M o l . B i o l . 1 9 1 : 1 3- 2 2 .
9 6 . W a r d , S . , a n d D. E l l a r . 1 9 8 7 . Nu c l e o t i d e s e q u e n c e o f a
B a c i l l u s t h i u r i n u g i e n i s i s v a r . i s i - a c l e l u s i s g e n e e n c o d i n g a 1 30 k Da
d e l t a - e n d o t o x i n . Nu c l e i c A c i d s R e s . 1 5 : 7 1 9 5 .
M I C R O B I O L . R E V .

o
n

J
u
n
e

2
9
,

2
0
1
2

b
y

g
u
e
s
t
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

I NS E C TI C I DA L C R YS TA L P R O TE I NS O F B . THU R I NG I E NS I S 2 5 5
9 7 . W h i t e l e y , H. R . , a n d H. E . S c h n e p f . 1 9 8 6 . Th e m o l e c u l a r
b i o l o g y o f p a r a s p o r a l c r y s t a l b o d y f o r m a t i o n i n B a c i l l u s t l h u r -
i n t g i e n i s i s . A n n u . R e v . M i c r o b i o l . 4 0 : 5 4 9 - 5 7 6 .
9 8 . W i d n e r , W . R . , a n d H. R . W h i t e l e y . 1 9 8 9 . Tw o h i g h l y r e l a t e d
i n s e c t i c i d a l c r y s t a l p r o t e i n s o f B a c i l l u s t h l u i i j i g i e n i s i s s u b s p .
k i u r - s t ( u k i p o s s e s s d i f f e r e n t h o s t r a n g e s p e c i f i c i t i e s . J . B a c t e r i o l .
1 7 1 : 9 6 5 - 9 7 4 .
9 9 . W i t , D. P . , H. C a r l s o n , a n d J . C . Ho d g d o n . 1 9 8 6 . C y t o t o x i c i t y
o f B a c i l l u s t h l r i i n g i e t a s i s 6 - e n d o t o x i n t o c u l t u r e d C F- 1 c e l l s
d o e s n o t c o r r e l a t e w i t h i n i 1 i v o a c t i v i t y t o w a r d s s p r u c e b u d -
w o r m l a r v a e , p . 3- 6 . I n R . A . S a m s o n . J . M . V l a k , a n d P .
P e t e r s ( e d . ) , Fu n d a m e n t a l a n d a p p l i e d a s p e c t s o f i n v e r t e b r a t e
p a t h o l o g y . S o c i e t y f o r I n v e r t e b r a t e P a t h o l o g y . S a n Di e g o ,
C a l i f .
1 0 0 . W o n g , H. C . , a n d S . C h a n g . 1 9 8 5 . I d e n t i f i c a t i o n o f a p o s i t i v e
r e t r o r e g u l a t o r t h a t f u n c t i o n s i n E s c h e r i c h i a c o l i a n d B a c i l l u s
s l u b t i l i s , p . 1 0 4 - 1 0 9 . I n J . A . Ho c h a n d P . S e t l o w ( e d . ) ,
M o l e c u l a r b i o l o g y o f m i c r o b i a l d i f f e r e n t i a t i o n . A m e r i c a n S o c i -
e t y f o r M i c r o b i o l o g y , W a s h i n g t o n , D. C .
1 0 1 . W o n g , H. C . , H. E . S c h n e p f , a n d H. R . W h i t e l e y . 1 9 8 3.
Tr a n s c r i p t i o n a l a n d t r a n s l a t i o n a l s t a r t s i t e s f o r t h e B a c i l l u s
t h i u r i n g i e n s i s c r y s t a l p r o t e i n g e n e . J . B i o l . C h e m . 2 5 8 : 1 9 6 0 -
1 9 6 7 .
1 0 2 . W u , D. , a n d F. N. C h a n g . 1 9 8 5 . S y n e r g i s m i n m o s q u i t o c i d a l
a c t i v i t y o f 2 6 a n d 6 5 k Da p r o t e i n s f r o m B a c i l l i t s t h l u i r i t u g i e u s i s
s u b s p . i s r a l e i n s i s c r y s t a l . FE B S L e t t . 1 9 0 : 2 32 - 2 36 .
1 0 3. Ya m a m o t o , T. 1 9 8 3. I d e n t i f i c a t i o n o f e n t o m o c i d a l t o x i n s o f
B a c i l l u s t i l i i i i g i e n s i s b y h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g -
r a p h y . J . G e n . M i c r o b i o l . 1 2 9 : 2 5 9 5 - 2 6 0 3.
1 0 4 . Ya m a m o t o , T. , J . A . G a r c i a , a n d H. T. Du l m a g e . 1 9 8 3.
I m m u n o l o g i c a l p r o p e r t i e s o f t h e e n t o m o c i d a l p r o t e i n s o f B a i -
c i l h l s t h U u r i n g i e n s i s a n d i t s i n s e c t i c i d a l a c t i v i t y . J . l n v e r t e b r .
P a t h o l . 4 1 : 1 2 2 - 1 30 .
1 0 5 . Ya m a m o t o , T. , a n d R . E . M c L a u g h l i n . 1 9 8 1 . I s o l a t i o n o f a
p r o t e i n f r o m t h e p a r a s p o r a l c r y s t a l o f B a c i l l i u s t h l i n g i i e n s i s
v a r . k i u r . s t a t k i t o x i c t o t h e m o s q u i t o l a r v a , A e d e s t a e C i O r h y n -
( l u l l s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 1 0 3: 4 1 4 - 4 2 1 .
1 0 6 . Ya m a m o t o , T. , 1 . A . W a t k i n s o n , L . Ki m , M . V . S a g e , R .
S t r a t t o n , N. A k a n d a , Y. L i , D. - P . M a , a n d B . A . R o e . 1 9 8 8 .
Nu c l e o t i d e s e q u e n c e o f t h e g e n e c o d i n g f o r a 1 30 - k Da m o s q u i -
t o c i d a l p r o t e i n o f B a c i l l i u s t l h u i r i n i g i e n s i s i s r a e l e n s i s . G e n e 6 6 :
1 0 7 - 1 2 0 .
V O L . 5 3, 1 9 8 9

o
n

J
u
n
e

2
9
,

2
0
1
2

b
y

g
u
e
s
t
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m