Validacija analitike metode

ta je to?
Postupak/procedura kojom se neka
analitika metoda dovodi u fazu njene
UPOTREBLJIVOSTI/SVRSISHODNOSTI
(eksperimentalni postupak utvrivanja i
provere karakteristinih analitikih
parametara na osnovu kojih utvrujemo da je
metoda pouzdana i primenjiva)

TESTIRANJE
VALIDACIJA
u emu je razlika ?
Testiranje identifikacija greaka

odnosno razlika izmeu oekivanih i

stvarnih rezultata dobijenih nekom
metodom

Validacija analitike metode

Eksperimentalni postupak dobijanja i

provere karakteristinih analitikih
parametara na osnovu kojih se
potvruje da je metoda pouzdana i
primenljiva

Koji su to parametri validacije?

specifinost/selektivnost,
osetljivost,
tanost,
preciznost,
linearnost,
limit detekcije (dokazivanja),
limit kvantifikacije (odreivanja),
analitiki opseg,
robustnost

Specifinost? (slinost/razlika)
mogunost metode da se njenom
primenom moe odrediti samo
tano odreeni analit u smei, bez
interferencija od strane drugih
komponenta te smee
Ca2+

Ba2+

Sr2+

Specifinost? (slinost/razlika)
Obino se koristi da opie metodu koja

daje analitiki odgovor za samo

jedan analit !

(signal odgovara iskljuivo odgovoru tog

analita)

Selektivnost
Odreivanje

grupe slinih
sastojaka u uzorku
(slini sastojci daju zasebne signale koji
meusobno ne utiu na rezultat)

Specifinost/Selektivnost analitike metode

U praksi samo mali broj

analitikih metoda daje odgovor na

samo jedan analit, te

formu selektivnosti mnogo

ee koristimo od
specifinosti.

Po IUPAC- u se termin
specifinost esto
zamenjuje selektivnou.

Osetljivost
Sposobnost metode da se njome
moe odrediti niska konc. analita.
nagib odreuje
osetljivost metode!
0,6
0,5

y = 0.01695x + 0.12762

)
a = nagib

0,4
0,3
0,2

0,1
b=odseak
0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

c, mg/mL

(izbor metode koja ima veu

osetljivost Tragovi analita)

Linearnost?
Dati analitiki postupak mora dati
linearnu zavisnost izmeu analitikog
signala i koncentracije u odreenom
opsegu koncentracija, bilo direktno, ili
nakon odreenih matematikih
transformacija.
analitiki
signal

C analita

Linearnost

mogunost da se metodom unutar radnog

opsega cANALITA dobije linearna proporcinalna
zavisnost analitikog signala od koncentracije
analita
y = ax + b
postupak - kalibracija

a=nagib

y
b=odseak

Kalibracioni dijagrami
Kalibraciona kriva je najbolja metoda

kalibracije ukoliko je uticaj matrice

zanemarljiv i ne zavisi od koncentracije
analita. Osim toga nuno je da su
instrumenti na kojima se meri stabilni.

Kalibracioni dijagrami
Kalibracijski, badarni ili radni dijagram prikazuje
zavisnost signala prema koliini analita (npr.
koncentraciji) dobijen merenjem signala serije
standarda (standardnih rastvora) pri tano odreenim
uslovima.
Jednaina prave: y = a + bx
gde je y signal dobijen s instrumenta,
a je signal slepe probe (tj. odseak na osi signala (y),
b je nagib pravca za ispitivani sastav (signal vs.
koncentracija) koji odgovara osetljivosti postupka, a
x je koncentracija analita.

Badarni dijagram

Badarni dijagram meren prema slepoj probi

Ako se dobija linearna zavisnost, neophodno je

izvriti njenu statistiku evaluaciju/procenu:

Metoda regresione analize (metoda

najmanjih kvadrata)
Jednaina prave:

y = ax + b
a -nagib

b- odseak

Koeficijenat korelacije,
r >0,99 * korelaciju (a) od (c)

Tanost?
razlika izmerene i tane vrednosti xi
(odreena greka SISTEMATSKA)

mera sigurnosti analitike metode

najtee se validira

Statistiki se definie preko:

*analize uzorka poznate koncentracije

standarda (SRM) sa kojom se poredi izmerena
vrednost i izraunava procenat prinosa ili
tzv.recovery vrednost.

Kako proveravamo tanost ?

1. Analizom standardnih referentnih materijala
2. Odreivanje procenta prinosa ili tzv. recovery
vrednosti
3. Uporeivanjem sa metodom, koja je potvrena
kao tana

1. Analizom standardnih referentnih materijala (SRM)

ta je
SRM?

Materijal poznatog i potvrenog

sastava - osnove
i analita koji/koje odreujemo

a) primenom metode koja se validira odredi se c

analita u SRM i naem uzorku (ispitivani uzorak)
b) izrauna se % prinosa (recovery vrednost)
2. Odreivanje % prinosa ili tzv. recovery vrednost
a) u uzorak i slepu probu dodaje se poznata c analita
b) recovery = signal (uzorak + dodatak)
signal (dodatak)

3. Uporeivanjem 2 metode
... metode koja se validira sa drugom, koja je potvrena
kao tana

* Odreivanje procenta prinosa ili

tzv. recovery vrednost

Uzorku i slepoj probi doda se poznata

koliina istog standarda i meri se porast

analitikog signala, a recovery vrednost
se dobija:

recovery =

signal (uzorak + dodatak)

signal (dodatak)

*Tanost se moe odrediti i poreenjem test

rezultata sa rezultatima dobijenim sa
drugim validiranim metodama.

Metoda poznatog ili standardnog dodatka

Metoda standardnog (poznatog) dodatka sastoji se

od najmanje tri koraka. Prvi je merenje signala

analita iz uzorka, drugi dodavanje poznate
koncentracije analita a trei ponovljeno merenje
signala analita.
Sa samo jednim dodatkom poznate koncentracije
analita (drugi i trei korak) nuna je pretpostavka da
smo u linearnom delu odnosa signala i koncentracije
analita.
Sledei dodaci standardnog rastvora analita
omoguuju veu preciznost i dokazuju ili opovrgavaju
nau pretpostavku o linearnosti odziva prema
koncentraciji.
Najprecizniji rezultati se dobiju ako je koncentracija
prvog dodatka jednaka najmanje dvostrukoj
koncentraciji analita u uzorku.

Metoda poznatog ili standardnog dodatka

Metoda standardnog dodatka je posebno korisna

kada je uticaj matrice na odreivanje analita

znatan ili kada su koncentracije analita u uzorku
vrlo blizu granice odreivanja. Metodom
standardnog dodatka uticaj matrice postoji ali je
konstantan za sva merenja. I kod ovog postupka
kalibracije vana je stabilnost mernog
instrumenta.

Metoda poznatog ili standardnog dodatka

Kalibracija metodom standardnog dodatka

prikazana je na primeru merenja apsorbancije

(A) no na isti se nain primenjuje pri merenju
bilo kojeg signala (npr. potencijala u direktnoj
potenciometriji ili otklona galvanometra kod
plamene spektrometrije).
Iz grafikog prikaza (slika 3) koncentracija
analita u nepoznatom uzorku oita se kao
apsolutna vrednost na osi x u etvrtom
kvadrantu (negativni deo x ose).

Metoda unutranjeg standarda

Unutranji standard je supstanca dodata uzorku,

slepoj probi i svim standardima a koncentracija

unutranjeg standarda je konstantna i poznata i
poznata je vrednost signala koji odgovara
unutranjem standardu za odreenu koncentraciju.
Unutranji standard je supstanca potpuno razliita
od analita.

Ova metoda se koristi kada je osetljivost

instrumentalne metode promenjiva s vremenom, kod

znatnog uticaja matrice na signal analita, kada je
mogu gubitak uzorka za vreme odreivanja.

Metoda unutranjeg standarda

esto se upotrebljava u hromatografskim

odreivanjima, emisijskim
spektrometrijama (spektrografiji, plamenoj
spektrometriji), rendgenskoj difrakciji.

Signal unutranjeg standarda se meri

istovremeno sa signalom analita. Priprema

se poznata smesa unutranjeg standarda i
analita za merenje relativnog signala
detektora.

Metoda unutranjeg standarda

vreme (min)

Hromatogram uz dodatak unutranjeg standarda; A analit, B unutranji standard

Metoda unutranjeg standarda

Na hromatogramu (slika 4) povrine ispod krivih za

supstance A (analit) i B (unutranji standard)

proporcionalne su koncentracijama. Detektor pak daje
najece razliit odziv za svaku komponentu.
Odnos povrina ispod krivih (ili bilo kojeg signala pri

merenju) za iste koncentracije analita i unutranjeg

standarda naziva se odnos odziva (F):
F = signalA/signalB
odnosno ukljuujui koncentracije analita i unutranjeg
standarda:
signalA/signalB = F x [A]/[B]

Metoda unutranjeg standarda

S istim unutranjim standardom mogue je u

jednom hromatografskom odreivanju

odrediti koncentraciju svih razdvojenih
komponenti uz prethodno odreivanje
odnosa odziva za svaku komponentu smee.
Ako je signal s detektora jednak za analit i
unutranji standard za istu koncentraciju oba,
odnos odziva je 1.

Preciznost?
Oznaava bliskost ili slaganje izmeu serije

ponovljenih merenja iste veliine uzorka

... procenjuje se preko SD (s) ili RSD

Testiramo je na nekoliko naina:

ponovljivost: jedan analitiar, jedna

laboratorija, viestruko ponovljene procedure
srednja preciznost: jedna laboratorija, ista
aparatura vie analitiara u vie dana
* testiranje radimo preko:
S2 , S, KV ili RSD (%)
potrebno je minumum 5 ponovljenih merenja

Preciznost analitike metode

Zavisnost RSD(%)
od koncentracije analita

s
RSD(%) 100
x

3,0

RSD, %

2,5
2,0
1,5
1,0
0,5

1,0

1,5

2,0 2,5 3,0

c, mg/mL

3,5

4,0

Preciznost i Tanost

Dobra preciznost ne
garantuje visoku tanost!

Analitiki opseg ili

Opseg koncentracija (conc. range)
to je interval izmeu najnie i najvie

koncentracije analita/uzorka u kome se

taj analit odreuje
dobija se iz studija linearnosti:
jednaina prave definie opseg unutar
koga postoji linearna zavisnost

Limit detekcije, LD
(Limit Of Detection, LOD)
To je najmanja koliina analita u uzorku koja

se moe, DETEKTOVATI datom anal. metodom

pod optimalnim uslovima, ali ne i odrediti.

3 SD
LD
a
a nagib
kalibracione krive

Kako se odreuje?
Zavisi... da li je metoda instrumentalna

(spektrohemijska, elektrohemijska, hromatografska,...)

ili neinstrumentalna.

vizuelno

signal/um
- prihvatljivo: 2:1ili 3:1

SD dobijena viestrukim
merenjem slepe probe,
a nagib kalibracione prave

Limit kvantifikacije, LQ
(limit Of Quantification; LOQ)
To je najmanja koliina analita koja se moe

kvantitativno odrediti (MERITI) sa

prihvatljivom tanou i preciznou pod
datim experimentalnim uslovima

10 SD
LQ
a

Kako se odreuje?
Isto kao i LD, ali se nivoi znaajnosti razlikuju.

- signal/um S/N
- prihvatljivo: 10:1

10 SD
LQ
a

S/N
signal-to-noise ratio

signal
um

ROBUSTNOST
ukazuje koliko je metoda osetljiva na
nekontrolisane promene parametara kao to
su: koliina uzorka, temp., pH rastvora, c
reagenasa, vreme reakcije, itd. ili

instrumentalne parametre koji se

ciljano menjaju, sa namerom da se metoda
testira koliko je ne/osetljiva na ove promene

Analitiki parametri za Validaciju metode

zavise od analize koja je zahtevana !!

Validacioni

Identifikacija Analiza neistoa

parametar

Kvantitativna

kvant.

limit

analiza

Tanost

Preciznost

Specifinost

LD (LOD)

- (!)

LQ (LOQ)

Linearnost

Analitiki opseg

Gde se primenjuje?
Registracija lekova/preparata zahteva kao prvi

korak postojanje ili uspostavljanje validirane

analitike metode za odreivanje sadraja aktivne
komponente leka, kao i svih prateih ingredijenata
u gotovoj formulaciji, kao i kontroli gotovog
proizvoda
Metoda mora biti u celosti opisana, uz sve vane
operativne parametre (pripremu uzorka,
odgovarajue referentne standarde, reagense
...td. ..)
Svi ovi podaci se prilau, uz dokumentaciju
:hromatograme, NMR spektre....
Ekspertsko miljenje o pogodnosti predloenog
analitikog postupka....