Analitičke tehnike u kliničkom laboratoriju: elektroforetske i

kromatografske separacije

Uvod u kromatografske
separacije
Dario Mandić, KBC Osijek
1. Povijest kromatografije

chroma & graphein = KROMATOGRAFIJA

 2. Kromatografija – osnovni pojmovi
• KROMATOGRAFIJA - metoda razdvajanja smjese na osnovu različite raspodjele između
stacionarne i mobilne faze
Komponenta
smjese koja se
najviše zadržava na
SP
Stacionarna faza

Mobilna faza
Komponenta
smjese koja se
najmanje zadržava
na SP
2. Kromatografija – osnovni pojmovi
3. Fizikalno-kemijske osnove kromatografije
Načini poboljšanja separacije:
• povećanje selektivnosti (brzina
odjeljivanja) → B
• povećanje djelotvornosti (širenje
zona) → C
3.1. Selektivnost kromatografske separacije
• selektivnost → razlika u brzini
gibanja analita

• faktor zadržavanja (retencije) (k)

odnosno faktor kapaciteta (k’)
→ idealno 1-5

𝑞𝑆 𝑐𝑆 𝑉𝑆 𝑡𝑅 − 𝑡𝑀 𝑡′𝑅
𝑘 = 𝑘′ = = 𝑘= =
𝑞𝑀 𝑐𝑀 𝑉𝑀 𝑡𝑀 𝑡𝑀

• koeficijent selektivnosti (α)

𝐾𝐵 𝑘𝐵 𝑡𝑅 𝐵 − 𝑡𝑀 𝑡′𝑅 𝐵
𝛼= = 𝛼= =
𝐾𝐴 𝑘𝐴 𝑡𝑅 𝐴 − 𝑡𝑀 𝑡′𝑅 𝐴
3.2. Djelotvornost kromatografske separacije
• djelotvornost → stupanj širenja
kromatografskih vršaka (zona)

• broj teorijskih tavana (N) i visina

teorijskog tavana (H)
𝐿
𝑁=
𝐻
𝑡𝑅 2
𝑁 = 16
𝑊

𝐿𝑊 2
𝐻=
16𝑡𝑅2
 3.2. Djelotvornost kromatografske separacije
• Van Deemterova jednadžba → djelomice objašnjava pojavu širenja
kromatografskih zona (gubitak djelotvornosti kolone) gibanjem kroz kolonu
𝐵
𝐻 =𝐴+ + 𝐶𝑆 𝑢 + 𝐶𝑀 𝑢
𝑢

Varijable koje utječu na djelotvornost kolone

linearna brzina mobilne faze (brzina protoka) u
koeficijent difuzije analita u mobilnoj fazi DM
koeficijent difuzije analita u stacionarnoj fazi DS
faktor zadržavanja analita k
promjer zrna punila stacionarne faze dp
debljina tekućeg sloja na stacionarnoj fazi df
4. Optimizacija kromatografske separacije
Razlučivanje → mjera odjeljivanja dvaju analita

2 𝑡𝑅 𝐵 − 𝑡𝑅 𝐴
𝑅𝑆 =
𝑊𝐴 + 𝑊𝐵

𝑁 𝛼−1 𝑘′𝐵
𝑅𝑆 =
4 𝛼 1 + 𝑘′𝐵

• opći problem eluacije

 4. Kromatografske analize
Kvalitativne
tR, detektor (MS)
Kromatografske Vanjska
analize kalibracija
Kvantitativne
Matriks kalibratori Matriks kontrole
visina (h), površina (A)
Unutarnja
kalibracija

derivatizacija unutarnji
standard
biološki
uzorci

Priprema!

taloženje ekstrakcija tekuće- ekstrakcija na

online SPE
proteina (PPT) tekuće (LLE) čvrstoj fazi (SPE)
 5. Podjela kromatografije Stacionarna
faza
Nosač Kromatografija na papiru
Planarna (plošna)
kromatografija Tankoslojna kromatografija (TLC)
Tankoslojna (TLC)
Mobilna
faza
Plinsko-adsorpcijska kromatografija (GSC)
Plinska Plinska
kromatografija
kromatografija
(GC) (GC)
Plinsko-tekućinska kromatografija
Plinsko-tekućinska kromatografija(GLC)
(GLC)

Adsorpcijska

Razdjelna
Kromatografija na Tekućinska
Tekućinska
stupcu (koloni) kromatografija
kromatografija (LC)
Ionsko-izmjenjivačka

Kromatografija isključenjem

Afinitetna kromatografija

Kromatografija sa superkritičnom
tekućinom (SFC)
5.1. Plinska kromatografija
Injektor Pećnica
• mobilna faza (MP) → inertni
plin (N2, He, Ar, H2) Regulator protoka
Kolona (SP) Detektor
• separacija na temelju plina
hlapljivosti i interakcije sa
stacionarnom fazom (SP)

Izvor plina nositelja

(MP)
 Mikrolitarska

5.1. Plinska kromatografija staklena injekcija

Septum
Plin nositelj

INJEKTOR

prevodi hlapljive temperatura → 30-50°C veća

sastojke uzorka u od vrelišta najmanje
plinovito stanje hlapljivog sastojka
Komora za
isparavanje
programabilni
split/splitless headspace
(PTV)

Kolona
 5.1. Plinska kromatografija
Punjene
(packed)
KOLONE
Kapilarne
(capillary)

PEĆNICA

Izotermalna Temperaturno
eluacija programiranje
 5.1. Plinska kromatografija
granica
vrsta detektora selektivnostInjektor linearnost
detekcije
detektor toplinske
univerzalan Pećnica
105 10-9 g
vodljivosti (TCD)
plameno ionizacijski 10-12 g analiza alkohola i drugih
Detektor organski spojevi 107 lakohlapljivih analita
detektor (FID) ugljika

detektor apsorpcije spojevi s elektronegativnim

104 10-15 - 10-13 g
elektrona (ECD) skupinama sveobuhvatni toksikološki
probir i identifikacija lijekova,
spektrometar masa (MS) univerzalan 106 10-12 - 10-11 g sredstava ovisnosti i njihovih
metabolita
struktura
MS detekcija
analita
analita
(m/z)
5.2. Tekućinska kromatografija
• mobilna faza (MP) → tekućina
(eluens)
• separacija na temelju interakcije C18, C8, C6, C4…
sa stacionarnom fazom (SP) i
mobilnom fazom (MP)
Reverzna SP nepolarna, MP
(reverse phase) polarna
Razdjelna
kromatografija Normalna SP polarna, MP
(normal phase) nepolarna
 Pećnica i
Pumpa Detektor
5.2. Tekućinska kromatografija kolona (SP)

Izokratična
eluacija
Gradijentna
eluacija Spremnik MP

promjena
sastava
mobilne faze

Autosampler:
injektorska
petlja i ventil
 5.2. Tekućinska kromatografija
ECD-1
granica
vrsta detektora primjena
detekcije

analiti koji sadrže kromofore koji

detektor apsorbancije Degasser FLD
apsorbiraju svjetlost u UV ili 10-10 g
(UV/VIS, PDA)
vidljivom području Pumpa-1
UV/VIS
detektor Pumpa-2
analiti koji sadrže fluorofore 10-12 g
fluorescencije (FLD) Pećnica
i kolona
elektrokemijski Autosampler:
elektrokemijski aktivni analiti 10-11 g
detektor (ECD) injektorska
ECD-2
petlja i ventil

Spremnik MP
 5.2. Tekućinska kromatografija
• hemoglobinske varijante
detektor • oksalati, citrati
apsorbancije • lijekovi i metaboliti lijekova
• vitamin D

• vitamini
detektor • lijekovi
fluorescencije • DPD
• porfirini

• kateholamini
elektrokemijski • primarni metaboliti kateholamina
detektor • sekundarni metab. kateholamina
• serotonin i metabolit
 5.2. Tekućinska kromatografija
• TDM (AED, BZO, NL, AD, TCA, imunosupresivi,
maseni antibiotici…)

detektor LC-MS/MS • metanefrini u plazmi

• MMA
• vitamin D
• steroidni hormoni
QQQ • toksikologija

HPLC
MASENA
IONIZACIJA ANALIZA DETEKCIJA

ESI APCI
Kromatografija u kliničkom laboratoriju?

• osjetljivost • cijena instrumenta

• specifičnost
• raznovrsnost
• simultano određivanje više
analita odjednom
• mogućnost samostalnog
razvoja metoda
• cijena? (po analizi)
• nedostatak random-access
načina rada
• TAT? (priprema uzorka +
analiza + obrada podataka) →
automatizacija!
• osoblje