You are on page 1of 141

Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

UNIVERZITET U NOVOM SADU


POLJOPRIVREDNI FAKULTET
DEPARTMAN ZA VETERINARSKU MEDICINU

Branislava Belić Marko R. Cincović

PRAKTIKUM IZ PATOLOŠKE FIZIOLOGIJE

Novi Sad, 2012.

1
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

Prof. dr Branislava Belić, Asistent MSc Marko R. Cincović


PRAKTIKUM IZ PATOLOŠKE FIZIOLOGIJE

Izdavaĉ:
Poljoprivredni fakultet, Novi Sad

Za izdavaĉa:
Prof.dr Milan Popović

Recenzenti:
Prof.dr Milan Popović
Prof.dr Senad Prašović
Prof.dr Katica Bajin Katić

Glavni i odgovorni urednik:


Prof.dr Milan Popović, Dekan Poljoprivrednog fakulteta

Tehniĉki urednik:
Marko R. Cincović

Štampa:

Tiraţ:
200

2
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

Biblioteĉki podaci

3
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

SADRŢAJ

1.PREDGOVOR

2.UVOD - LABORATORIJSKI RAD U PATOLOŠKOJ FIZIOLOGIJI

2.1 Mesto i uloga patofiziološke dijagnostike u veterinarskoj medicini


2.2 Uzimanje uzoraka za laboratorijska ispitivanja
2.3 Laboratorijske metode u Patološkoj fiziologiji
2.4 Dijagnostički paneli i skrining programi u kliničkoj patofiziologiji
2.5 Tumačenje rezultata u Patološkoj fiziologiji
2.6 Skraćenice, referentne vrednosti i merne jedinice u laboratorijskom radu

3.METODE DIJAGNOSTIKE U PATOLOŠKOJ FIZIOLOGIJI

3.1 Patofiziološka dijagnostika anemija i policitemija


3.2 Patofiziološka dijagnostika poremećaja bele loze i leukemija
3.3 Patofiziološka dijagnostika poremećaja hemostaze
3.4 Patofiziološka dijagnostika inflamacije i poremećaja imunog sistema
3.5 Patofiziološka dijagnostika poremećaja kardiovaskularnog sistema
3.6 Patofiziološka dijagnostika poremećaja digestivnog sistema
3.7 Patofiziološka dijagnostika poremećaja funkcije jetre i egzokrinog pankreasa
3.7 Patofiziološka dijagnostika poremećaja respiratornog sistema
3.9 Patofiziološka dijagnostika poremećaja urinarnog sistema
3.10 Patofiziološka dijagnostika poremećaja metabolizma tečnosti, acido-baznog statusa
i jona
3.11 Patofiziološka dijagnostika poremećaja endokrinog sistema
3.12 Patofiziološka dijagnostika poremećaja metabolizma ugljenih hidrata, masti i
proteina
3.13 Patofiziološka dijagnostika poremećaja nervnog i motornog sistema
3.14 Patofiziološka dijagnostika malignih neoplazija

4.ODABRANE LABORATORIJSKE METODE U PATOLOŠKOJ FIZIOLOGIJI

4.1 Određivanje koncentracije glukoze u krvi PAP metodom (Peroksidaza Aktivni


Princip)
4.2 Proba na acetonska tela u urinu natrijum-nitroprusidom
4.3 Određivanje koncentracije ukupnih lipida u krvnom serumu
4.4 Određivanje koncentracije holesterola u krvnom serumu (po King-u)
4.5 Biuretska reakcija za kvantitativno određivanje koncentracije proteina

4
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4.6 Određivanje proteina u krvnoj plazmi Phillips Van Slyke-ovom metodom


4.7 Određivanje koncentracije uree po Berteloth-u
4.8 Određivanje koncentracije kreatinina mokraće po Jaffe-u
4.9 Određivanje koncentracije kreatina mokraće po Benedict-Meiers-u
4.10 Određivanje kalcijuma u mokraći po Krammer-u i Tisdall-u
4.11 Određivanje aktivnosti alkalne fosfataze (AP) po King-u
4.12 Određivanje aktivnosti laktat dehidrogenaze (LDH) u krvnom serumu
4.13 Određivanje aktivnosti α-amilaze u krvnom serumu
4.14 Određivanje aktivnosti aspartat aminotransferaze (AST) u krvnom serumu
4.15 Određivanje masnih kiselina iz lipida gasno-tečnom hromatografijom
4.16 Određivanje neesterifikovanih masnih kiselina (NEFA) u krvi
4.17 Kvantitativno određivanje lipoproteina seruma elektroforezom na tankom sloju
agaroze
4.18 Razdvajanje pojedinih frakcija fosfolipida iz tkiva hromatografijom na tankom sloju
4.19 Kvantitativno određivanje slobodne i vezane HCl i celokupnog aciditeta želudačnog
soka
4.20 Određivanje stepena redukcije nitrata u buražnom sadržaju
4.21 Ispitivanje varenja glukoze u buragu
4.22 Dokazivanje amonijaka u buražnom sadržaju
4.23 Određivanje količine albumina u serumu metodom vezivanja boja
4.24 Odvajanje proteina krvnog seruma elektroforezom na papiru
4.25 Određivanje direktnog i indirektnog bilirubina po metodi Jendrassik-Grof-a
4.26 Određivanje bikarbonata seruma titrimetrijski po Scribneru
4.27 Određivanje protrombinskog vremena po Quick-u
4.28 Određivanje trombinskog vremena plazme po Hougie-u
4.29 Određivanje koncentracije fibrinogena u krvi po Rutberg-u
4.30 Određivanje euglobulinske fibrinolize po Buckella-u
4.31 Određivanje količine hemoglobina u krvi
4.32 Određivanje gvožđa u serumu krvi
4.33 Bojenje krvnih elemenata
4.34 Određivanje fagocitne aktivnosti neutrofila nitro-blu tetrazolium testom (NBT)
4.35 Test aktivacije limfocita mitogenima
4.36 Tripan-blu (tripan-palvo) metoda za određivanje vijabilnosti leukocita

5.LITERATURA

5
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

1.PREDGOVOR

Praktikum iz opšte i kliničke Patološke fiziologije je namenjen studentima veterinarske


medicine, koji nastavu iz ove oblasti slušaju na Departmanu za veterinarsku medicinu
Poljoprivrednog fakulteta u Novom Sadu.
Patološka fiziologija, kao bazična i klinička medicinska nauka, zahteva opšti i višestruki
pristup u radu. Praktikum iz navedenih razloga sadrži dva dela, a to su: Uvod u laboratorijski
rad u Patološkoj fiziologiji i Metode dijagnostike u Patološkoj fozologiji. Praktikum je napisan u
saglasnosti sa akreditovanim programom iz predmeta Patološka fiziologija i svojim sadržajem
prati sve ono što je po planu i programu predviđeno i u teoretskom delu ovog premeta. Na ovaj
način student i svi korisnici ovog praktikuma imaće mogućnosti da se upoznaju sa praktičnim
metodama patofiziološke dijagnostike i metodama rada u patofiziološkoj laboratoriji.
Ovaj pomoćni udžbenik, uz Priručnik za polaganje ispita sa radnom sveskom iz patološke
fiziologije koja ga po sadržaju i metodama prati, daje kompletno uputstvo za primenu stečenog
znanja iz patološke fiziologije i omogućava studentima da lakše savladaju ovaj predmet, koji je
neophodan za budući rad u veterinarskoj medicini.
Nadamo se da će sadržaj ovog praktikuma biti koristan, ne samo za studente veterinarske
medicine, već i za veterinare i druge biomedicinske stručnjake, koji stiču prva znanja iz oblasti
laboratorijskog rada..
U današnjoj savremenoj veterinarskoj medicine naročito u kliničkoj veterinarskoj
medicine je nemoguće doneti ni jedan dijagnostički zaključak bez primene metoda i znanja iz
Patološke fiziologije.
Patološka fiziologija predstavlja osnov za dobru klinički i dijagnostičku veterinarsku
praksu, te ovaj praktikum pomaže svim onima, koji žele da se bave i rade na polju veterinarske
medicine.

Autori

6
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

2. UVOD U LABORATORIJSKU MEDICINU

7
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

2.1 MESTO I ULOGA PATOFIZIOLOŠKE DIJAGNOSTIKE U VETERINARSKOJ


MEDICINI

Patološka fiziologija je nauĉna disciplina u ĉijoj metodologiji dominiraju postupci za


prepoznavanje uzroka i mehanizama razvoja poremećaja funkcije i strukture organa. Ona pripada
laboratorijskoj medicinskoj struci i daje neophodne i znaĉajne podatke u dijagnostiĉkim
postupcima.
Prilikom kliniĉkog pregleda pacijenta lekari kako veterinarske tako i humane medicine
mogu prikupiti ograniĉen broj podataka, koji se pre svega odnose na rezultate dobijene osnovnim
kliniĉkim metodama (adspekcija, palpacija, auskultacija i dr.). Na ovaj naĉin dobijeni rezultati
(nalazi) vrlo ĉesto nisu dovoljni za postavljanje konaĉne dijagnoze, pa veterinar opšte prakse
upućuje u laboratoriju pacijenta ili njegov biološki materijal (krv, serum, urin, likvor, transudat,
eksudat, feces i dr.) da bi se izvršile tzv. dopunske dijagnostičke metode.
Dopunske dijagnostiĉke metode treba koristiti kada je odgovor na jedno od navedenih
pitanja "da" ili "moţda": a) Moţe li povišen, normalan ili sniţen laboratorisjki dobijen nalaz
uticati na dijagnozu? b) Moţe li nalaz uticati na terapiju? c) Moţe li laboratorisjki nalaz uticati
na buduću prognozu za pacijenta? d) Moţe li bolest na koju sumnjamo biti asimptomatska i koji
je naĉin njenog leĉenja?
Dopunske dijagnostiĉke metode ne treba koristiti ako znamo da njihovi rezultati neće
doprineti dijagnostiĉkom i terapijskom postupku. Vrlo je vaţno da se primene prave
dijagnostiĉke metode po pravilnom redosledu i u pravom trenutku. Postupak podrazumeva
korišćenje metoda koje su nam dostupne na mestu pregleda pacijenta (mikroskopske metode,
elektrokardiografija, ultrazvuĉna dijagnostika), a potom i slanje materijala i pacijenta na dalje
preglede. Dinamika i uĉestalost upotrebe dopunskih laboratorijskih metoda zavisi od teţine
bolesti, vrste terapije i dinamike fizioloških promena u organizmu. Poznato je da se
koncentracija serumskih proteina ne menja u okviru 5-7 dana, dok koncentracija razliĉitih
transaminaza moţe da se menja u okviru jednoga dana kod akutnog hepatitisa. Navedeni naĉin
posmatranja je doveo do razvoja koncepta racionalne dijagnostike u patološkoj fiziologiji. U
drugom delu ovog praktikuma predstavljeni su metodi dijagnostike u patološkoj fiziologiji.

8
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

U ovakvim situacijama veterinar kliniĉar šalje uput u kome precizno oznaĉava šta je
potrebno za dalje laboratorijsko ispitivanje. Danas, komercijalne laboratorije imaju razvijene
sopstvene liste na kojima veterinar odreĊuje i šalje putem interneta obeleţene analize neophodne
za dodatna ispitivanja. Pored navedenog, bitno je navesti vrstu ţivotinje koju ispitujemo, rasu,
pol i starost uz opšti kliniĉki nalaz sa radnom dijagnozom.
Veterinar koji prima zahteve i uzorke u laboratoriji organizuje funkcionalna ispitivanja
tako da se na osnovu što manje uzetog uzorka po obimu ili što manjeg broja metoda mogu dobiti
validni rezultati. Dobijeni materijal se deli na neophodan broj uzoraka i po potrebi šalje
razliĉitim odeljenjima patofiziološke laboratorije (laboratorija za hematologiju, hemostazu,
kliniĉku biohemiju, endokrinologiju i drugo), gde veterinar specijalista obavlja testitranje
uzoraka. Rezultati ispitivanja se kompletiraju u prijemnoj laboratoriji i šalju kliniĉaru direktno ili
preko vlasnika ţivotinje. Veterinar kliniĉar tumaĉi dobijene nalaze, postavlja dijagnozu i
propisuje terapiju. U svakodnevnom kliniĉkom radu patofiziološke metode dijagnostike su
neizostavne.
Za dobijanje validnih rezultata potrebno je primeniti preanalitiĉke, analitiĉke i
postanalitiĉke postupke, a u skladu sa fiziološkim kretanjima i metodološkim pravilima, što
pokazuju objašnjenja u poglavljima ovog Praktikuma.

9
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

2.2 UZIMANJE UZORAKA ZA LABORATORIJSKA ISPITIVANJA

Za laboratorijska ispitivanja uzimaju se uzorci krvi/seruma, kostne srţi, sadrţaja iz


respiratornih puteva, ţeludaĉnog sadrţaja, buraţnog sadrţaja, fecesa, urina, likvora, sadrţaja iz
abdominalne i grudne duplje, delovi tkiva i dr. U odreĊenim dinamiĉkim ispitivanjima
neophodno je prisustvo ţivotinje i edukacija vlasnika o postupku sa ţivotinjom pre
laboratorijskog ispitivanja. Pojedine metode podrazumevaju funkcionalno ispitivanje na samoj
ţivotinji (EKG- elektrokardiografija, EEG-elektroencefalografija, ultrazvuĉne metode i drugo).
Krv se uzima punkcijom vena ţivotinje. Najĉešće se za punkciju koriste v. jugularis
externa, vena caudalis, v. cephalica, v.saphena i druge. Vene su pogodne za uzimanje krvi zbog
lakog pristupa, mada se u sluĉaju preciznih gasnih analiza koristi i uzima arterijska krv. Krv se
moţe uzeti iz vene uha, dok se kod ptica koristi vena krila, a uzima se pomoću šprica i igle ili
pomoću sistema epruvete sa vakutajnerom. Pre plasiranja igle neophodno je izvršiti šišanje,
brijanje i dezinfekciju koţe anatomske regije, gde se nalazi krvni sud iz koga će se uzimati
uzorci krvi.
Upotreba sistema epruvete sa vakutajnerom je vrlo pogodna za uzimanje krvi. To su
epruvete koje su pod vakuumom i prilikom stavljanja u drţaĉ sa iglom i plasiranja u lumen vene
negativni pritisak u epruveti uvlaĉi krv u epruvetu. Prednost upotrebe ovog sistema vakutajnera
je što jednom rukom moţemo uzeti krv a drugom smiriti ţivotinju. Za upotebu šprica i igle
najĉešće se koriste obe ruke. Vakutajneri mogu biti prazni ili mogu sadrţati sredstva za
spreĉavanje hemolize ili izdvajanje krvnog seruma. Boja ĉepa vakutajnera ukazuje na sadrţaj
supstance koja se nalazi u vakutajneru : svetlo plava (Na-citrat), zelena (Na ili Li-heparin),
ljubiĉasta (EDTA- ethylenediaminetetraacetic acid), siva (fluoridi), ţuta (SPS-Sodium
polyanetholesulfonate), tamno plava (EDTA), mramorno crvena ili zlatna (aktivatori zgrušavanja
i gel za separaciju seruma), mramorno ţuta ili narandţasta (trombin), mramorno ili svetlo zelena
(gel za separaciju plazme) i dr. Krv ili serum treba nakon uzimanja što pre odneti u laboratoriju
ili stabilizovati stavljanjem seruma na temperaturu friţidera (+4°) ili zamrzavanjem (-20°). Tako,
za odreĊivanje insulina iz seruma, uzorak se moţe ĉuvati 4-6 dana na sobnoj ili temperaturi
friţidera ili 6 meseci nakon zamrzavanja. Bilirubin se mora odmah odrediti, a krv se ne sme
izlagati sunĉevom zraĉenju. Da bi uzorak za ispitivanje glukoze bio validan, neophodno je da se

10
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

krv deproteinizira. Dakle, u zavisnosti od naĉina uzimanja krvi, transporta i ĉuvanja uzorka
zavisi i kvalitet uzoraka u dijagnostiĉkom postupku. Krvni serum je znatno stabilniji za ĉuvanje
u odnosu na celu krv. U uslovima uzimanja uzoraka na farmi i uvek kada je mesto uzimanja
uzoraka daleko od laboratorije, neophodno je da se odmah izdvoji serum od ostalih delova krvi.
Ukoliko ne posedujemo sistem epruveta sa vakutajnerom, serum se odvaja centrifugiranjem u
centrifugi u trajanju od 10 minuta i na 3000 obrtaja / min.
U toku uzimanja krvi i postupanju sa njom treba izbeći odreĊene greške. Jedan od
najĉešćih problemakoji se javlja je brza koagulacija krvi, te treba koristiti antikoagulanse. Drugi
problem je hemoliza uzorka, koja moţe nastati kao posledica kongestije, brze aspiracije krvi,
predugog stajanja krvi na sobnoj temperaturi, izlaganjem visokim temperaturama i sliĉno. U toku
hemolize raste kaliemija i koncentracija enzima koji se oslobaĊaju iz ćelija, što moţe dovesti do
nepravilnog tumaĉenja rezultata. Hemoliza moţe biti veliki problem prilikom odreĊivanja
koncentracije bilirubina. Vrlo ĉesto se javlja hiperlipemiĉna ili hiperproteinemiĉna plazma, zbog
ĉega treba izvršiti deproteinizaciju seruma (filtriranje ili hemijsko razlaganje) odnosno
ekstrakciju lipida. Ovaj postupak je neohodan jer povišene vrednosti lipida (iznad 4,5mmol/l) ili
proteina (iznad 70g/l) stvaraju penu, a u fotometrijskom postupku interferiraju sa drugim
materijama u krvi i daju neprecizne a ĉesto i pogrešne rezultate.
U toku uzimanja krvi za laboratorijska ispitivanja, neophodno je da ţivotinja 12 sati ne
uzima hranu. Naime, nakon uzimanja obroka povećava se koncentracija triglicerida u serumu,
koja onemogućava izvoĊenje velikog broja biohemijskih analiza i menja rezultate tih analiza. U
većini laboratorija koriste se epruvete sa pritiskom, koje se pune automatski do predviĊenog
nivoa (Vacoutainer system), mada se u mnogim laboratorijama još uvek koriste klasiĉne
epruvete.
Epruveta sa vakutajnerom sa ljubiĉastim ĉepom u kojoj se nalazi EDTA kao
antikoagulans se koristi za brojanje uobliĉenih krvnih elemenata i diferencijalnu krvnu sliku.
Kada se uzima krv u ovu epruvetu, ona treba da bude ispunjena više od polovine ili do oznake na
njoj. Manja koliĉina krvi sa teĉnim antikoagulansom dovodi do razreĊenja uzorka i do nevalidnih
rezultata. Epruveta sa plavim ĉepom u kojoj se nalazi Na-citrat se koristi za ispitivanja faktora
koagulacije krvi i hemostaze. Za odreĊivanje sedimentacije koristi se epruveta sa roze
zatvaraĉem i treba uzeti uzorak do oznake na samoj epruveti, dok se epruvete sa zelenim ĉepom i
antikoagulansom heparinom koriste kod hematološke analize krvi ptica. Nakon vaĊenja krvi

11
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

epruveta se lagano okrene nekoliko puta (da bi se izmešala uzeta krv i antikoagulans) i nakon
toga se šalje u laboratoriju. Ukoliko, nemamo mogućnosti da odmah pošaljemo uzorak krvi u
laboratoriju treba da je ĉuvamo na temperaturi od +2 do +4°C, maksimalno 24 ĉasa.
Za ispitivanja koagulacije krvi koristi se epruveta s plavim ĉepom u kojoj se kao
antikoagulans nalazi 3,8 % Na- citrat. Punu epruvetu treba lagano okrenuti desetak puta, vodeći
raĉuna pri tome da ne doĊe do zgrušavanja. Nakon toga, potrebno je punu krv u roku od pola
sata, centrifugirati na 3000 obrtaja 15 minuta i zatim plastiĉnim nastavcima uz pomoć
automatske pipete odvojiti plazmu. Plazmu se ĉuva na temperaturi od - 20°C do - 70°C. Vaţno
je napomenuti je u toku uzimanja uzorka krvi potrebno paţljivo izvršiti venepunkciju da ne bi
došlo do aktivacije faktora koagulacije i agregacije trombocita.
Za određivanje biohemijskih parametara potrebno je koristiti epruvete za dobijanje
seruma sa ţutim (crvenim) ĉepom, sa ili bez gela i aditiva. Nakon koagulacije, koja se kod
ţivotinja odvija tokom 5 – 10 minuta (kod goveda ½ h), epruvetu je potrebno centrifugirati na
3000 – 4000 obrtaja/minuti (goveda 5000 obrtaja/minuti) tokom 5 – 10 minuta. Ukoliko se
koriste epruvete s gelom, gel će odvojiti korpuskularne elemente od seruma te tako odvojen
serum ne treba posebno odvajati. Ukoliko nema gela, potrebno je odvojiti serum u drugu
epruvetu. Ako odreĊujemo glukozu u serumu ili plazmi, a uzorak nije moguće dostaviti
laboratoriji i uraditi analize za 2-3 h, dolazi do smanjenja vrednosti glukoze. Naime, nivo
glukoze izvan tela opada s vremenom u punoj krvi zbog glikolize. Nivo glikolize, proseĉno
iznosi 5-7% (~ 0,6 mmol/L) po satu, te se menja zavisno od koncentraciji glukoze, temperature,
broja leukocita i drugih faktora. Postoje male razlike izmeĊu rezultata dobijenih vršenjem analiza
iz seruma ili plazme, osim za neke parametre. Laktat dehidrogenaza (LDH), kalijum i fosfor se
nalaze više u serumu nego u plazmi, zbog oslobaĊanja tih parametara iz ćelija za vreme
koagulacije. Proteina i globulina ima više u plazmi nego u serumu jer plazma sadrţi i fibrinogen.
Vaţno je napomenuti većina biohemijskih parametara je stabilna 48 h na temperaturi friţidera.
Za duţe ĉuvanje potrebno je serum zamrznuti na – 20°C.
Kostna srţ se uzima u cilju ispitivanja celularnosti ili biohemijskih karakteristika
elemenata kostne srţi. Najĉešće se kostna srţ dobija sternalnom punkcijom, punkcijom iliaĉne
kriste ili istaknutih koštanih delova femura ili humerusa. Poštujući metode asepse i antisepse
posle pravljenja malog zareza na koţi plasira se igla na odabrano mesto i vrši se aspiracija 0,2-
0,5 ml, što je dovoljno za razmaz.

12
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

Za uzimanje urina u cilju patofizioloških ispitivanja postoje brojne indikacije. Kod


ţivotinja se urin moţe uzeti kateterizacijom ili cisticentezom u zavisonosti od vrste analize i
prohodnosti donjih urinarnih puteva. Prilikom sakupljanja dnevne diureze neophodno je izvršiti
kateterizaciju ţivotinje ili staviti ţivotinju u posebne metaboliĉke kaveze. Dinamika uzimanja
urina zavisi od kliniĉke pretpostavke. Jutarnja mokraća je najkoncentrovanija, pa tu mokraću
treba koristiti za biohemijske analize. Za ispitivanje glukozurije koristi se mokraća, koja se
uzima posle obavljenog obroka. U laboratorijskom radu najĉešće se koristi sveţ urin, ali se moţe
konzervisati sa timol-izopropanolom (osim prilikom ispitivanja ţuĉnih boja). Urin dnevne
diureze za ispitivanje steroida i kateholamina moţe se konzervisati sa 50ml 1mol/l HCl. Urin se
uzima u ĉistu posudu (minimalno 10 ml), a najbolje je kristitii prvi jutarnji urin. Tokom dva sata
uzorak je potrebno dostaviti u laboratoriju a ukoliko to nije moguće urin je potrebno staviti u
friţider na temperaturu od +2 do +8 °C (do 12 h). Produţeno stajanje uzorka moţe prouzrokovati
rast pH, proliferaciju mikroorganizama, razgradnju ćelijskih elemenata i hemijskih parametara.
Sadrţaj ţeluca moţe se dobiti sondiranjem oralnom ili nosnom (konj) sondom. Kod
ţivotinja koje teško povraćaju (konj, preţivari) najpre se nalije oko pola litre vode kroz sondu
kako bi se kardija lagano otvorila i omogućila prolaz sondi. Ovo je i terapeutski postupak za
evakuaciju sadrţaja. Kod preţivara sadrţaj buraga se dobija sondom, ruminocentezom ili posle
ruminotomije, što zavisi od potreba analize. Sadrţaj buraga se mora pregledati vrlo brzo, u
okviru nekoliko sati, na sobnoj temperaturi, zbog autolize i hemijskih i mikrobioloških promena
u ruminalnom sadrţaju. Ruminocenteza je posebno primenljiva ako ispitujemo pH i biohemijske
vrednosti sadrţaja.
Vrlo ĉesto je potrebno ispitati postojanje transudata ili eksudata u abdominalnoj duplji.
Za ta ispitivanja se koristi abdominocenteza. To je postupak punkcije abdomena, pomoću
ultrazvuka (posebno ako se radi o lokalizovanoj teĉnosti) ili se postupak radi slobodoruĉnom
punkcijom 1 cm desno i lateralno od ventralne medijalne linije i 1-2cm kranijalno od
umbilikulusa (desni kranijalni kvadrant). Ukoliko se u roku od jednog minuta ne pojavi teĉnost
izvući špricom oko 5 ml teĉnosti.
Bronhoalveolarna lavaţa je znaĉajna za citološka i mikrobiološka ispitivanjima donjih
disajnih puteva, a naroĉito je indikovana kod bolesti dubljeg plućnog tkiva. Varijacija ove
metode je transtrahealna aspiracija.

13
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

Uzimanje uzoraka cerebrospinalne tečnosti vrši se lumbalnom punkcijom (L4-L5 ili L5-
L6 regija) ili u regiji atlasa i okcipitalne protuberance. Preporuĉuje se opšta anestezija, a koristi
se igla od 2.5 inĉa (19-22G). Igla se lagano plasira milimetar po milimetar do trenutka dok se ne
pojavi cerebrospinalna teĉnost, koja izlazi a potrebno je uzeti do 2 ml cerebrospinalne teĉnosti.
Punkcijom zgloba (artrocenteza) moţe se uzeti zglobna teĉnost. Ovo je metoda koja
zahteva sve mere asepse i antisepse i vrši se u uslovima kada postoje razliĉiti ortopedski
poremećaji. Preporuĉuje se sedacija ili opšta anestezija za ţivotinju.
Transport uzetog materijala mora biti paţljiv i po propisima, naroĉito ako se sumnja da je
materijal potencijalno infektivan. Većina hematoloških i biohemijskih parametara se ne oštećuju
znaĉajno tokom transporta.
Pojedine metode zahtevaju direktna merenja na pacijentu (EKG,EEG i drugo) i o njima
ćemo govoriti u delu koji se odnosi na dijagnostiĉke metode.

14
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

2.3 LABORATORIJSKE METODE U PATOLOŠKOJ FIZIOLOGIJI

Patofiziološke metode se mogu podeliti na: metode razdvajanja i metode merenja, a


danas savremene metode omogućavaju da se u istom postupku vrši i razdvajanje (kvalitativna
analiza) i merenje (kvantitativna analiza) pojedinih materija.
Centrifugiranje predstavlja metodu razdvajanja, gde se odvajaju faze razliĉitog
agregatnog stanja. Taloţenje nerastvorenih ĉestica postiţe se povećanjem sile gravitacije
upotrebom centrifugalne sile. Centrifuga omogućava i razdvajanje materija razliĉitih specifiĉnih
teţina. Centrifugiranjem se dobija deo koji je ostao na dnu epruvete (talog, sediment) i deo koji
je iznad taloga (supernatant).
Dijaliza predstavlja naĉin odvajanja materija (ĉestica) pomoću selektivno propustljivih
membrana kroz koju prolaze iskljuĉivo ĉestice pravog rastvora.
Filtracija je metoda razdvajanja ĉvrstih nerastvorljivih ĉestica od rastvaraĉa u kome se
oni ne rastvaraju. U toku filtracije nerastvorene ĉestice ostaju na filtru, a teĉni deo prolazi kroz
pore filtra. U dijagnostiĉke svrhe se mogu koristiti i talog i filtrat, u zavisnosti od potreba i
metoda. Za filtraciju se koriste razliĉiti filter papiri (Schleicher-Schulovi papiri i Whatmanovi
papiri), koji su razliĉitog obima i preĉnika, a ĉesto su obeleţeni i brojevima, u zavisnosti od
brzine filtracije. Da bi filtracija bila kvalitetnija i brţa vrši se homogenizacija. Homogenizacija
tkiva se uvek vrši kada ţelimo da razbijemo veze meĊu ćelijama i oslobodimo sadrţaj tkiva za
dalju separaciju.
Hromatografija je vrlo ĉesta separaciona metoga u kliniĉkoj biohemiji i drugim
oblastima hemije. Pomoću ove metode moguće je odvojiti supstance iz bioloških smesa veće
(nekoliko grama) i manje koliĉine (pikogramske). Hromatografski sistemi se sastoje iz dve faze:
nepokretne-stacionarne (ĉvrsta, teĉna, ĉvrsta+teĉna) i pokretne-mobilne (teĉna ili gasovita).
Pokretna faza (ĉije ĉestice odreĊujemo) teĉe po nepokretnoj fazi ili se propušta kroz nju, a u toku
ove faze na molekul deluju dve sile sa suprotnom tendencijom: jedna je sklonost molekula ka
adsorpciji na površini nepokretnog medijuma (stacionarne faze), a druga je teţnja molekula ka
rastvaranju u rastvaraĉu koji protiĉe kroz medijum. Faze se biraju po koeficijentu raspodele
supstance. Razdvajanje supstanci hromatografijom nastaje kao posledica: uspostavljanja
apsorpcione ravnoteţe izmeĊu ĉvrste i teĉne faze (adsorpciona hromatografija), uspostavljanje

15
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

ravnoteţe izmeĊu jonoizmenjivaĉke smole i elektrolita (jonoizmenjivaĉka hromatografija),


ravnoteţa izmeĊu dve teĉne faze (distribuciona hromatografija), uspostavljanje ravnoteţe izmeĊu
nepokretne teĉne i pokretne gasovite faze (gasna hromatografija). Posle protoka ĉestica
ispitivanog rastvora u struji rastvaraĉa se vrši razvijanje hromatograma u odreĊene frakcije.
Frakcije dobijene u kolonama (staklene cevi) se prihvataju kontinuirano uz pomoć kolektora
(poseban sistem koji u jednakim vremenskim intervalima podnosi epruvetu pod kolonu), pa se
razdvojene frakcije nalaze u nizu od nekoliko epruveta. Ako se radi o tankoslojnoj
hromatografiji (na hartiji ili silika-gelu) frakcije se boje dok su još apsorbovane na medijum ili
se mogu spirati (eluirati) u rastvaraĉe koji su u posebnim posudama, pa odreĊivati njihove
kvantitativne i ostale karakteristike. Posebna vrsta hromatografije je teĉna hromatografija pod
visokim pritiskom (HPLC – High Pressure Liquid Chromatography). U ovom hromatografskom
postupku koriste se posebne pumpe za pokretanje mobilne faze, jer je stacionarna faza vrlo gusta.
Ovo omogućava visoku rezoluciju hromatografskog analitiĉkog postupka, a nedostatak metode
je skupa oprema i odrţavanje.
Elektroforeza predstavlja postupak razdvajanja molekula na osnovu njihove razlike u
elektriĉnom naboju. Migracija molekula u elektriĉnom polju zavisi od njihovih karakteristika
(veliĉina, oblik, naboj), pH vrednosti i viskoznosti medijuma u kome su one rastvorene.
Elektroforeza se deli u odnosu na medijum u kome se odvija. Razlikujemo: elektroforezu na
hartiji (koristi se Whatman hartija No1 ili No3) i gel-elektroforezu (poligalaktoza gel,
poliakrilamid gel, SDS-PAGE gel za subjedinice proteina – Sodyum Dodecyl Sulphate-
Polyacrilamide Gel Electrophoresis, izoelektroĉno fokusiranje u gel elektroforezi za
makromolekule). Postupak za izvoĊenje elektroforeze je sledeći: spremanje uzorka, nanošenje
uzorka, elektroforeza, bojenje gela, ispiranje gela i denzitometrija traka. Pre poĉetka
elektroforeze sve nosaĉe (osim gelova) treba dobro zasititi puferom, da bi se obezbedila
elektriĉna provodljivost. Rastvoreni uzorak se nanosi mikropipetom u vidu malog kruga ili crte,
a ako molekule koje ţelimo da izolujemo imaju suprotna naelektrisanja uzorak treba naneti na
sredinu trake. Ukoliko je naelektrisanje isto uzorak se nanosi na jednom kraju trake, što dalje od
elektrode ka kojoj će putovati. Kada je uzorak nanet aparat za elektroforezu se prikljuĉi na izvor
struje (sa ispravljaĉem). Proseĉno, niskovoltaţna elektroforeza traje od 2 - 20 h. Kada se nosaĉ
izvadi iz aparata suši se na vazduhu na 110ºC. Cilindriĉni gelovi i poliakrilamid se posle
vaĊenja fiksira u 7% rastvora sirćetne kiseline. Vizualizacija uzorka se vrši razliĉitim

16
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

hemikalijama koji u kontaktu sa izdvojenim materijama daju boju iz vidljivog spektra. Proteini
odvojeni u SDS PAGE elektroforezi se prenose na posebne membrane i obeleţavaju
monoklonskim antitelima uz razvoj bojene reakcije u postupku koji se naziva Western blot
analiza.
Postoje brojne metode za merenje koncetracije metabolita i drugih jedinjenja u
teĉnostima i tkivima organizma. U patofiziološkim merenjima najĉešće se koristi merenje
metodom kolorimetrije. Kolorimetrija je metoda kojom se pomoću kolorimetra odreĊuje
koncentracija neke materije u biološkom materijalu merenjem apsorpcije svetla u rastvoru.
Kolorimetrijske metode su vrlo pogodne jer ispitivanu materiju ne treba prethodno izolovati.
Suština kolorimetrijskih reakcija je da se na odreĊeni naĉin pripremi krv i doda reagens, koji sa
ispitivanom materijom daje bojeni kompleks. Prolaskom svetlosti kroz obojenu materiju,
odreĊeni deo svetlosti se apsorbuje a ostatak se propušta. Odnos se nazuva ekstinkcija i ona je
direktno proporcionalan koliĉini obojenog kompleksa. Merenje koncetracije ispitivane materije
se postiţe uporeĊujem ekstinkcija standarda i ekstinkcija ispitivanog seruma ili se dobijeni
rezultat ucrtava u standardnu krivu. Standardna (baţdarna) kriva predstavlja linearni grafik
zavisnosti stepena apsorpcije svetlosti u zavisnosti od koncentracije materije. Merenje
ekstinkcije na kolorimetru se vrši pomoću fotoelektriĉnog kolorimetra. Svetlost prolazi iz izvora
kroz filter i blendu, a potom odlazi do kivete (promera 1x1cm), gde se vrši apsorpcija dela
svetlosti, a ostatak prolazi do fotoćelije koja je povezana sa potenciometrom, pa se u odnosu na
izmenjenu voltaţu odreĊuje koncentracija bojene materije uzorka.
Talasne duţine svetlosti koje prolaze kroz filter kolorimetra su dosta široke, te je teško
razlikovati materije koje apsorbuju svetslost u uskim granicama talasnih duţina, te je zato
razvijen savršeniji metod koji se naziva spektrofotometrija.
Izvesna jedinjenja imaju sposobnost da apsorbuju svetlosnu energiju, a zatim da emituju
izvesnu koliĉinu apsorbovane i stvorene/pobuĊene energije u obliku vidljive svetlosti
(fluorescencija i fosforescencija - luminiscencija). Fluorimetar je po izgledu sliĉan kolorimetru,
ali pored izvora svetlosti i soĉiva poseduje primarni i sekundarni filter izmeĊu kojih se nalazi
uzorak i fotopojaĉivaĉ.
Potenciometrijske metode spadaju u posebna fiziĉka merenja. Ako se dve elektrode
poveţu naponom onda će njihovo uranjanje u isti medijum dovesti do promene napona i
elektriĉne struje koja se moţe meriti. Promena napona zavisi od koncentracije jona u rastvoru, a

17
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

ako se elektrode obloţe polupropusnim membranama koje propuštaju odreĊenu vrstu jona ta
elektroda će postati tzv. selektivna elektroda. Ove elektrode se koriste za odreĊivanje
koncetracije i parcijalnog pritiska kiseonika i ugljendioksida.
Imunometrijske metode predstavljaju veliki broj metoda kojim se ispituje
funkcionalnost celularnog i humoralnog imuniteta. U širem smislu u imunometrijske metode
spadaju sve metode u kojima se koriste antitela da bi se odredio neki antigen. Antigen moţe biti
bilo koja materija proteinskog ili drugog sadrţaja za koje postoji antitelo.
Reakcije antigen-antitelo u kojima je imuni kompleks odmah vidljiv su reakcije
aglutinacije i precipitacije. U osnovi su ove dve reakcije vrlo sliĉne. Od prirode antigena zavisi
koja će od ove dve reakcije nastati. Ukoliko su Ag molekularno dispergovani dolazi do
precipitacija, a ako se Ag nalaze na površini ĉestice ili ćelije dolazi do aglutinacija. Za
formiranje vidljivog precipitacionog kompleksa potreban je optimalni odnos antigena i antitela
(efekat prozone). Aglutinacija moţe biti aktivna i pasivna (indirektna). Indirektna aglutinacija je
najĉešća u patofiziološkim merenjima i ispoljava se kao hemaglutinacija, inhibicija
hemaglutinacije i lateks aglutinacija. U suštini se ĉestice antigena najpre lepe na ĉestice lateksa
ili eritrocita, zatim se izlaţu antitelima radi bolje vidljivosti spojenih ĉestica antigena i antitela.
Lateks aglutinacija daje reakciju vidljivu golim okom. Ukoliko su antigen-antitelo ĉestice jako
male i nevidljive golim okom koristi se metoda nefelometrije, kojom se meri intenzitet svetlosti
koja je odbijena od ĉestica antigen-antitelo kompleksa, pa se rezultati oĉitavaju kao pri
fotometriji.
Modifikacija precipitacionih reakcija je precipitacija u gelu (agar-gel imunodifuzija,
radioimundifuzija). Gel je najĉešće izliven u Petrijeve šolje u kojima se prave bazenĉići gde se
stavlja rastvor antitela odnosno antigena. IzmeĊu bazenĉića dolazi do transporta teĉnosti, zbog
kapilarnosti gela i na mestu susreta antigen i antitelo dolazi do stvaranja kompleksa koji je
vidljiv u obliku linije precipitacije. Kod radioimunodifuzije u gelu se nalazi antitelo, a u seriji
bazenĉića se dodaje serum sa opadajućom koncentracijom antigena. Antigeni difunduju u gel i
povećanjem njihove koncentracije javlja se i veći krug precipitacije oko bazenĉića. Dakle, ova
metoda moţe biti i kvalitativna i kvantitativna.
Veoma ĉeste metode u patofiziološkim merenjima su imunometrijske metode sa
obeleţavanjem imunokompleksa i to: ELISA (Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay), RIA
(radioimunološka metoda) i IRMA (imunoradiometrijska metoda).

18
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

ELISA metoda je poznata poslednjih pola veka. Koristi se za dokazivanje antigena ili
antitela. Imuni kompleksi su obeleţeni bojom, a u zavisnosti od tipa ELISA-e prisustvo ili
odsustvo boje ukazuje na pozitivnu reakciju. Razlikujemo ELISA metode za dokazivanje
antigena (direktna-sendviĉ metoda, kompetitivna-blokirajuća metoda i inhibiciona metoda) i
antitela (direktna i indirektna metoda). Za izvoĊenje ELISA-e potrebno je: ĉvrsta površina
(mikrotitar ploĉa sa 8x12 polja obloţenih antigenom ili antitelom u zavisnosti od vrste ELISA-e),
Ag ili At koji se odreĊuju, pozitivne i negativne kontrole, konjugat (Ag ili At sa vezanim
enzimom), supstrat (oboji se kada doĊe u kontakt sa enzimom), teĉnost za pranje, stop rastvor
koji zaustavlja reakciju (jaka kiselina ili baza), ĉitaĉ rezultata (poseban fotometar za oĉitavanje
bojenih reakcija u mikrotitar ploĉi). Nakon inkubacije dolazi do antigen-antitelo reakcija u
mikrotitarskoj ploĉi a zatim se vrši ispiranje i dodaje enzimom obeleţeno antitelo/antigen uz
ponovno inkubiranje. Posle inkubacije se dodaje supstrat, koji sa enzimom daje bojenu reakciju.
Nakon ponovnog inkubiranja dodaje se stop rastvor i oĉitava reakcija.
RIA metoda se koristi za radioaktivno obeleţene hormone. U epruvetu se doda
radioaktivno obeleţen hormon (koji ţelimo da merimo) i ista koliĉina specifiĉnog antitela za taj
hormon, a zatim se doda hormon iz ispitivanog seruma. Tada dolazi do vezivanja hormona koji
je obeleţen i hormona iz seruma sa antitelom. Po završenoj reakciji višak hormona se dekantira i
meri se radioaktivnost vezanog hormona. Rezultati pokazuju da veća koncentracija hormona u
serumu daje manju radioaktivnost og zbog pomenutog jaĉeg vezivanja hormona iz uzorka krvi.
IRMA je metoda u kojoj je radioaktivnim izotopom obeleţeno antitelo. Zidovi epruvete
su obeleţeni antitelima za hormon, pa se hormon iz seruma lako vezuje za ova antitela. Posle
njihove inkubacije dodaje se antitelo koje je radioaktivno obeleţeno i inkubira se da bi se vezalo
sa hormonom. Višak antitela se odlije te se meri se radioaktivnost uzorka. Radioaktivnost je u
direktnoj proporciji sa koncentracijom hormona u serumu.
Za ispitivanje celularne imunosti koriste se: test aktivacije limfocita, ispitivanje antigena
limfocita protoĉnom citometrijom, ispitivanje aktivnosti NK ćelija, funkcionalna ispitivanja
neutrofila (ispitivanje motiliteta, prepoznavanje, ingestije i sposobnosti intracelularnog uništenja
nokse), ELISPOT (Enzyme-linked immunosorbent spot) analize za odreĊivanje produkcije
citokina i analize za ispitivanje komplementa. Navedene metode su primarno imunološke metode
i posebno će biti obraĊene u okviru veţbi iz Patološke fiziologije.

19
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

Citološke metode se koriste za odreĊivanje karakteristika oblika i granuliranosti ćelije. U


patologiji je klasiĉna metoda mikroskopska analiza tkiva. Automatizacijom procesa razvijaju se
metode protočne citometrije za ispitivanje karakteristika ćelije. Protoĉni citometar je
automatski aparat koji ispitivane ćelije (najĉešće krvi) obraĊuje i pomoću vrlo jakih pumpi
potiskuje kroz vrlo uske providne cevĉice kroz koje ćelije protiĉu pojedinaĉno. Na odreĊenom
mestu kroz cevĉicu se propušta uzan snop laserske svetlosti, koje ćelija apsorbuje, odbija i
raspršuje. Odbijena svetlost se pomoću razliĉitih ogledala sabira na senzore, koji mere veliĉinu i
granuliranost ćelije, nakon toga se softverski obraĊuje i predstavlja statistiĉkim poligonom,
histogramom ili trodimenzionalnom slikom. Protoĉna citometrija je vrlo znaĉajna metoda,
naroĉito ako se kombinuje sa metodama monoklonskih antitela ili biohemijskim metodama. Na
taj naĉin se mogu jasno videti broj ćelija koje su antigenske izmenjene i kombinacije antigenskih
izmena, što je posebno znaĉajno u dijagnostici leukemija (primena antitela na CD antigene i sl.).
Citološke metode su i brojne metode imunocitohemije, pomoću kojih se ispituje prisustvo
pojedinih enzima i njihova aktivnost u ćeliji ili se vrši vazualizacija razliĉitih patoloških materija
u ćeliji i dr.
Elektrokardiografija (EKG) je metoda registrovanja bioelektriĉnih potencijala koje stvara
srĉani mišić tokom depolarizacije i repolarizacije, a ti potencijali (bioelektriĉne struje) se šire na
periferiju tela, gde se registruju.
Elektroencefalografija (EEG) je metoda merenja sumarnih bioelektriĉkih potencijala
neurona CNS-a. Oni se registruju na površini lobanje, posle uvećanja i grafiĉkog predstavljanja.
Osnovni grafiĉki elemenat je talas, koji se javlja u odreĊenom ritmu. Postoji nekoliko vrsta
ritmova u zavisnosti od toga da li su oĉi zatvorene i postojanja uobiĉajene ili povišene paţnje.
Pojava šiljaka i oštrih talasa ukazuju na patološke nalaze. EEG se moţe kombinovati sa
svetlosnom stimulacijom, hiperventilacijom i dr.
Elektromiografija (EMG) je metoda koja ispituje elektriĉne aktivnosti nastale u mišićima
u uslovima mišićnog rada. Tehnika merenja se obavlja zabadanjem iglenih elektroda u odreĊene
taĉke mišića i beleţenjm aktivnosti mišića. Ovaj pregled se vrši u uslovima kada se sumnja na
kompresiju nerava korisno je uraditi ovaj pregled. Ispitivanje sprovodljivosti nerava vrši se
draţenjem perifernog nerva i registrovanjem na mišiću koji taj nerv inerviše. Ispitivanje
sprovodljivosti senzitivnog nerva izvodi se draţenjem mešovitog nerva i registrovanjem sa
koţnog nerva. Draţenje motornog nerva se postiţe draţenjem sa površine koţe.

20
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

U patofiziološkim merenjima se koristi i ĉitav niz drugih metoda kao što su ultrazvuĉna
merenja, razliĉite vrste mikroskopiranja ili druge metode, ali zbog svoje specifiĉnosti one će biti
pominjane u okviru racionalne dijagnostike poremećaja funkcije svakog pojedinaĉnog sistema.
U patofiziološkim merenjima postoji razvijen veliki broj metoda za trenutno merenje bez
posebne instrumentacije u vidu test trakica, brzi membranski testovi i sl., koji daju orijentacione
ali korisne rezultate za kliniĉki rad. Tako su poznate test trakice za analizu urina, na kojima se
nalaze polja sa reagensima koji sa odreĊenim materijama u mokraći (glukoza, ketoni, bilirubin i
dr) menjaju boju. UporeĊivanjem intenziteta boje sa kljuĉem odreĊenim od strane proizvoĊaĉa
trakica donosimo zakljuĉak o koncentraciji pojedinih materija u mokraći. U novije vreme postoje
kolorimetri koji analiziraju ove test trakice, te je na ovaj naĉin mogućnost greške svedena na
minimum. Pri izvoĊenju ovog testa veoma je bitno da se radi sa sveţim uzorcima i da se brzo
oĉita reakcija.
Na kraju, treba ponoviti neke osnovne pojmove iz hemije. Koncentracija rastvora je
odnos mase ili zapremine rastvorene materije i rastvaraĉa. Osnovna jedinica za merenje koliĉine
materije je mol i sadrţi 6,02x10²³ ĉestica (Avogadrov broj), a preraĉunavanje mola u grame se
vrši mnoţenjem relativne mase ĉestice (atomske ili molske) sa brojem molova. Molaritet
(molarna koncentracija) rastvora je broj molova rastvorene supstance u litri rastvora (oznaĉava se
sa M). Procentna koncentracija se koristi za izraţavanje koncentracije materija sa nepoznatom
molekulskom masom, pri ĉemu se koriste sledeće relacije: zapremina u zapremini, masa u
zapremini i masa u masi. Standardni rastvor predstavlja rastvor poznate koncentracije i
upotrebljava se pri merenjima kao referentna vrednost. Pravljenje razblaţenja u odreĊenom
odnosu, npr. 1:100 je upotrebu jednog dela rastvora da bi se dobilo 100 delova konaĉnog
razblaţenja. Ĉesto se koriste sukcesivna razblaţenja u sledećim koracima: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16... ili
1:10, 1:100, 1:1000 itd.

21
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

2.4 DIJAGNOSTIĈKI PANELI I SKRINING PROGRAMI U KLINIĈKOJ PATOFIZIOLOGIJI

Na osnovu detaljnog kliniĉkog pregleda i uvida u anamnestiĉke podatke u svakodnevnom


radu veterinar kliniĉar najĉešće prepoznaje simptome i sindrome bolesti i donosi radnu dijagnozu
koju treba potvrditi. Pošto je kliniĉka patologija sloţena i pošto se simptomi mogu pripisati
razliĉitim bolestima a etiopatogenski razliĉite bolesti mogu dati sliĉnu kliniĉku sliku neophodno
je odrediti koji je organ ili sistem organa primarno zahvaćen patološkim procesom. U situacijama
u kojima pouzdano ne moţemo vrstu bolesti i kada treba preventivno ispitati zdravstveno stanje
ţivotinje šalje se zahtev u laboratoriju da ispitaju metaboliĉki-dijagnostiĉki panel koji odgovara
odreĊenom organu/sistemu. Ovi paneli i programi, u kojima se odreĊuje više parametara
istovremeno pokazuju funkcionalni status organa i nazivaju se skrining programi. U tabeli 1. su
prikazane analize koje se najĉešće odreĊuju prilikom odreĊivanja funkcionalnog statusa
pojedinih sistema i organa. Preporuka za veterinare koji ţele da se primarno bave
laboratorijskom veterinom je da na sliĉan naĉin formiraju svoj plan ispitivanja u formi ovakvog
panela.

22
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

Tabela 1: Panel laboratorijske dijanoze

Osnovi

Srce

23
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

2.5 TUMAĈENJE REZULTATA U PATOLOŠKOJ FIZIOLOGIJI

Nakon izvršenih laboratorijskih analiza uvek sledi tumaĉenje rezultata. Poznavanjem


osnovnih i normalnih vrednosti prvo treba uoĉiti da li se radi o normalnom ili patološkom nalazu.
Postoje tablice normalnih vrednosti za sve laboratorijske analize, koje predstavljaju granice
normalnih vrednosti od najniţe do najviše. Razlikujemo: referentne vrednosti, normalne
vrednosti (referentna+laţno pozitivna i laţno negativna), laţno pozitivne vrednosti (test
pozitivan, bolest ne postoji), laţno negativne vrednosti (test negativan, bolest postoji) i
patološke vrednosti. Ove vrednosti dobijene su shodno njihovog rasporeda ispod krive
normalne distribucije.
U zavisnosti od navedenih kategorizacijama rezultata svaki test pokazuje odreĊenu
osetljivost-senzitivnost (pozitivni/(pozitivni+laţno negativni)),
specifiĉnost (negativni/( negativni+laţno pozitivni)) i
taĉnost ((pozitivni+negativni)/(pozitivni+laţno pozitivni+snegativni+laţno negativni)).
Ovakav naĉin tumaĉenja pojedinih kategorija rezultata je dobijen usavršavanjem testova
kroz duţi vremenski period, da bi oni sa vrlo visokim performansama do svake laboratorije gde
se primenjuju.
Kliniĉki, faktori koji utiĉu na prosuĊivanje rezultata mogu se podeliti na: faktore po
vremenu dejstva i faktore po svojoj prirodi. Faktori po vremenu dejstva su:
preanalitički (rasa, pol, starost, cikliĉne promene u organizmu, cikliĉne promene
sredine),
analitički (poreklom od bolesnika, poreklom od primenjene terapije, nastale zbog greški
u radu),
postanalitički (upisivanje laboratorijskih rezultata i laboratorijski informacioni sistemi).
Faktori po svojoj prirodi mogu biti: fiziološki (gladovanje, stres, diurnalni ritam i drugo) i
metodološki (uzimanje izoraka krvi, vrsta antikoagulansa, epruvete, naĉin ĉuvanja i transporta
uzoraka). Navedeni faktori će posebno biti opisani u daljem tekstu ovog Praktikuma i na
praktiĉnoj nastavi.Posebno treba istaći znaĉaj prvobitnog uzorka krvi koji ne sme biti
hemoliziran i lipemiĉan, jer se iz takvog uzorka ne mogu dobiti adekvatni rezultati.

24
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

Po preporuci Internacionalne federacije kliničkih hemičara svaka laboratorija treba da


odredi svoje referentne vrednosti, a ona se moţe dobiti na osnovu 120 uzoraka zdravih jedinki.
Analizu rezultata trebala bi da se vrši u svetlu izvedenog kliniĉkog pregleda i primenjenih
terapijskih postupaka, taĉnije bez saznanja o kliniĉlkoj slici i primenjenoj terapiji ne moţe se
vršiti taĉno tumaĉenje nalaza.

25
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

2.6 SKRAĆENICE, REFERENTNE VREDNOSTI I MERNE JEDINICE U


LABORATORIJSKOM RADU

Skraćenice se koriste zbog dugih naziva pojedinih analiza u komunikaciji izmeĊu


veterinara kliniĉara i laboratorije. Za nesmetani rad svake laboratorije i veterinara kliniĉara
neophodno je poznavanje najĉešćih skraćenica. Potreba za poznavanjem najĉešćih skraćenica
vaţna je i prilikom nabavke materijala za laboratorijski rad i ĉitanja štampanog rezultata koji
dolazi iz softvera analajzera koji se koristi u laboratoiji. Skraćenice koje se najĉešće koriste u
laboratorijskom radu:
A/G – odnos albumina i globulina
ALB – albumini
ALKP ili AP – alkalna fosfataza
ALT – alanin-aminotransferaza
AMYL – amilaza
AST – aspartat-aminotransferaza
Basoph – bazofili
BUN – urea azot
Ca – kalcijum
CHOL – holesterol
CK – kreatin kinaza
Cl – hloridi
CO2 – ugljen-dioksid
CREA – kreatinin
CSF – cerebrospinalna teĉnost
EDTA – etilendiaminotetraacetat
Eosinoph – eozinofili
G:E – odnos granulocitne i eritrocitne loze
G6P-DH – glukozo-6-fosfat dehidrogenaza
GGT – gama-glutamil-transferaza
GK – gliceol kinaza
GLDH – glutamat-dehidrogenaza

26
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

GLOB – globulini
GLU – glukoza
GOD – glukoza oksidaza
HCT – hematokrit
HGB – hemoglobin
Ig A,E,M,G – imunoglobulin A,E,M,G
K – kalijum
LDH – laktat-dehidrogenaza
LIPA – lipaza
Lym – limfociti
MCV – srednja vrednost zapremine eritrocita
MCH – srednji sadrţaj hemoglobina u jednom eritrocitu
MCHC – srednja koncentracija hemoglobina u eritrocitu
Mon – monociti
Mg – magnezijum
Na – natrijum
PHOS – fofati
PLT – trombociti
POD – peroksidaza
pO2, pCO2 – parcijalni pritisak kiseonika, p.p. ugljendioksida
RBC – eritrociti
RDW – koef.varijacije volumena eritrocita dobijen kalkulacijom iz MCV histograma
SDH – sorbitol dehidrogenaza
TAG – triacilglicerol
TP – ukupni proteini
UIBC, TIBC – slobodni transferin, ukupni transferin
URIC – mokraćna kiselina
WBC – leukociti
FSH, LH, T3, T4, CORT – ovo su skraćenice poznate iz fiziologije.

27
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

U tabeli 2 navedene su referentne vrednosti najĉešćih laboratorijskih parametara kod


razliĉitih vrsta ţivotinja.

Tabela 2: Referentne vrednosti najĉešćih laboratorijskih parametara

28
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

U tabeli 3 navedeni su osnovni parametri, njihove konvencionalne jedinice i faktori


kojima se vrši konverzija u SI jedinice, odnosno masa zapremina i koliĉina supstance. Pored
navedenih konverzija treba istaći da se za aktivnost enzima koristi i posebna meĊunarodna
jedinica IU/l.

Tabeli 3: Osnovni parametri i njihova konverzacija u SI sistemu

29
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

3. METODE DIJAGNOSTIKE U PATOLOŠKOJ FIZIOLOGIJI

30
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

3.1 PATOFIZIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA ANEMIJA I POLICITEMIJA

Anemija je poremećaj koji nastaje kao posledica smanjenog broja eritrocita i/ili smanjene
koncetracije hemoglobina u cirkulaciji. U odnosu na sadrţaj hemoglobina u eritrocitima
razlikujemo hipohromne i hiperhromne anemja, u odnosu na veliĉinu eritrocita razlikujemo
makrocitne i mikrocitne anemije. Za primenu terapije neophodno je odrediti mogućnost
kapaciteta kostne srţi za regeneraciju iste u odnosu na nastalu anemiju, pa se anemije dele na
regenerativne i neregenerativne.
Pri postavljanju dijagnoze kod procene anemija, neophodno je izvršiti više analiza, koje
su u smislu racionalne dijagnostike predstavljene od opštih ka specifiĉnim metodama prema
redosledu koji sledi: 1. analiza standardne krvne slike, 2. analiza razmaza periferne krvi, 3.
analiza koštane srţi.
Opšti postupak u dijagnostici anemija dat je na šemi 1.

Šema 1: Opšti postupak dijagnostike anemija

Analiza standardne krvne slike podrazumeva: 1. ispitivanje hematološkog statusa


(odreĊivanje hematokrita, broja eritrocita, koncentracije hemoglobina, eritrocitnih indeksa); 2.
ispitivanje biohemijskog statusa (serumsko gvoţĊe, feritin, kapacitet vezivanja gvoţĊa i slobodni
transferin); 3. ispitivanje markera hemolize (nekonjugovani bilirubin, hemoglobin u urinu,

31
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

haptoglobin, hemosiderin u urinu); 4. ispitivanje imunoloških markera (Coombsov test,


eritrocitna antitela i sl.)
Hematokrit se odreĊuje pomoću posebnih kapilarnih mikrocevĉica i centrifuge za
mikrohematokrit. Cevĉice su promera 1mm i duţine 7 cm. Postupak izvoĊenja testa: Cevĉica se
poloţi nakon toga se meri odnos korpuskularnog i teĉnog dela krvi (lenjirom ili posebnim
ĉitaĉem). Nakon oĉitavanja a uz primenu tabele referentnih vrednosti, moţemo konstatovati
sniţen hematokrit (koji se javlja u anemijama i uslovima hipehidratacije), povišenu vrednost
hematokrita (kod dehidratacije ili policitemiju) ili normalnu vrednost hematokrita. Na osnovu
vrednosti hematokrita anemije se dele na blage (Hct=30-37), umerene (Hct=20-29), teške
(Hct=13-19) i vrlo tešku (Hct<13). Navedeni primer je vezan za pse.
OdreĊivanje broja eritrocita vrši se automatski u hematološkom analajzeru ili brojanjem u
Thoma-Zeisovoj ili Neubauerovoj komorici. Za brojanje eritrocita u komoricama koristi se
melanţer sa crvenom perlicom. Za odreĊvanje što taĉnijeg broja erirocita neophodno je uraditi
razblaţenje rastvora, jer broj oĉitanih eritrocita zavisi od njihovog broja u jedinici zapremine
razblaţene krvi. Ukoliko se za brojanje eritrocita koriste mala razblaţenja eritrociti se preklapaju,
što oteţava brojenje. Veće razreţenje se postiţe kada se krv uvuĉe u eritrocitni melanţer (sa
crvenom kuglicom) do oznake 0,5; a potom se uvuĉe Haymov rastvor do oznake 101. Na ovaj
naĉin se krv razblaţi 200 puta. Pri sumnji da je ţivotinja obolela od aplastiĉne ili hemolitiĉke
anemije krv uvuĉemo do oznake 1,0 (razreĊenje od 100 puta), a potom prstom zatvorimo
melanţer i blago promućkamo u toku nekoliko minuta. Nakon mućkanja iz kapilarnog dela
melanţera ispusti nekoliko kapi krvi koja se nije izmešala. Za odreĊivanje broja crvenih krvnih
zrnaca u milijardama po litru mora se izvršiti sledeća raĉunska operacija:

BR.ER./L KRVI = N/80 x 400 x 10 x 200 x 10^6/L

N-eritrociti,
80-broj eritrocita u 80 kvaadratića komorice,
400-ukupan broj kvadratića u komorici,
10-zapremina mreţice je 0.1mm³, a mi ţelimo da izraĉunamo koliko će biti Er u 1mm³,
200-razblaţenje,
10^6/L-da bi izraĉunali broj eritrocita u litri krvi.

32
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

Kod anemija oĉekujemo smanjen broj eritrocita.


Uz pomoć hematološkog analajzera automatski se meri i koncentracija hemoglobina.
Koriste se kolorimetrijske metode po Drapkinu i Sahliju, dok pojedini analajzeri automatski
odreĊuju koncentraciju hemoglobina izraĉunavanjem. Na terenu se i dalje ĉesto primenjuje stara
ali dobra orijentaciona metoda za odreĊivanje koncetracije hemoglobina po Van Slyke-u. Ova
metoda je gravimetrijska i zasniva se na odreĊivanju specifiĉne mase krvi i krvne plazme.
Poznato je da da specifiĉna masa krvi zavisi od Hb eritrocita, a specifiĉna masa plazme od
proteina plazme. Ove specifiĉne mase se uporeĊuju sa specifiĉnom masom CuSO4, tako što se
napravi serija rastvora CuSO4, specifiĉne mase od 1,015-1,075. Uzima se kap krvi ili lancetom
ili kapilarom. Kap krvi ili kapilara ĉiji je vrh postavljen 2-3 cm iznad površine rastvora puštaju
se u seriju rastvora CuSO4. Zatim se vrši u toku prvih 5 sekundi posmatranje. Tumaĉenje
rezultata: 1. Kap krvi se penje naviše – krv/plazma ima veću specifiĉnu masu od CuSO4 –
vrednost hemoglobina je ispod normalne vrednosti; 2. Kap pada na dno – krv/plazma ima manju
specifiĉnu masu od CuSO4 –vrednost hemoglobina je normalne vrednosti; 3. Kap krvi pliva u
CuSO4 – krv/plazma i rastvor su iste specifiĉne mase – vrednost hemoglobina je graniĉna . Za
kvantifikaciju ove reakcije postoji i matematiĉka formula: Hb(g/L)=399x ((Specifiĉna masa krvi
– S.m.palzme)/ 1,0964- S.m. plazme).
Hemoglobin se moţe izdvojiti i elektroforezom, a ova metoda se koristi kada na osnovu
kliniĉkog i drugih nalaza sumnjamo na anemiju usled prisustva patoloških oblika hemoglobina.
U brojnim anemijama se javlja smanjena koncentracija hemoglobina. Za detaljniju
dijagnostiku bitno je odrediti eritrocitne indekse: MCV (mean cell volume, srednja vrednost
zapremine eritrocita), MCH (mean cell-corpuscular hemoglobine, srednja vrednost koliĉine
hemoglobina u ćeliji), MCHC (mean cell-corpuscular hemoglobine concentration, srednja
vrednost koncentracije hemoglobina u eritrocitima). Na osnovu vrednosti MCV anemije se dele
na normocitne, mikrocitne i makrocitne. Na osnovu MCH anemije se dele na normohromne i
hipohromne. Kod mikrocitne i hipohromne anemije dolazi do pada koncentracije hemoglobina,
hematokrita, MCV i MCH. Kod megaloblasne anemije se uz smanjenu koncetraciju
hemoglobina i hematokrita pokazuje se i povišena vrednost MCV i MCH. U kliniĉkoj praksi
najĉešće vrste anemije: makrocitna hipohromna anemija, normocitna normohromna anemija,
mikrocitna anemija sa ili bez hipohromazije.

33
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

Za procenu funkcionalnog statusa eritrocita, pored ispitivanja hemoglobina, znaĉajno je i


ispitivanje osmotske otpornosti (fragilnosti) eritrocita. Za ovaj test se krv uzima sa suvim
antikoagulansom. Suština teste je da se ista zapremina krvi stavlja u niz epruveta u kojima
postoji opadajuće razblaţenje NaCl (postiţe se povećanjem zapremine vode i smanjenjem
zapremine NaCl u nizu epruveta). Zbog osmoze teĉnosti dolazi do hemolize eritrocita. U prvoj
epruveti u kojoj je došlo do hemolize javlja se ţućkasti sadrţaj iznad sedimentiranih eritrocita, a
u poslednjoj epruvete u kojoj je došlo do hemolize sadrţaj je ruţiĉasto obojen (kompletna
hemoliza) i u njoj nema istaloţenih eritrocita. Rezultati koji se ovim ispitivanjem mogu dobiti su
sniţena osmotska fragilnost eritrocita, povišena osmotska fragilnost i normalan nalaz. Sniţena
osmotska fragilnost se javlja kod retikulocitoze, deficijencije gvoţĊa, bolesti jetre i prisustva
leptocita. Povišena osmotska fragilnost se javlja kod nasledne sferocitoze i eliptocitoze,
imunoposredovanih hemoliznih anemija, kod hroniĉne azotemije i dr. Minimalne vrednoti
rezistencije variraju od 0,74 g% NaCl (kod svinja) do 0,40 (kod ţivine); a maksimalne vrednosti
rezistencije je oko 0,5g%, osim kod ptica gde je vrednost 0,28.
Pored navedenih ispitivanja za dijagnostiku anemija je znaĉajno odrediti i koncentraciju
gvoţĊa. Ona je sniţena kod hipohromnih anemija (sideropenijska), ali i kod maligniteta i
infekcija. Povišena vrednost gvoţĊa ukazuje na hemolizu ili nekrozu hepatocita (depo Fe). Pored
gvoţĊa potrebno je odrediti transferin i stepen njegovog zasićena, koji zavisi od koncentracije
gvoţĊa i koncentracije transferina u krvi ţivotinja.
Za ispitivanje markera hemolize znaĉajno je odrediti: povišen nekonjugovani bilirubin,
sniţen haptoglobin, pozitivan hemoglobin u urinu, pozitivan hemosiderin u urinu,
hemoglobinemiju, povišenu aktivnost LDH, povišenu aktivnost AP. O ovim markerima
detaljnije govorimo u poglavlju Praktikuma koji se odnosi na dijagnostiku ikterusa.
Za odreĊivanje imunološki posredovanih anemija znaĉajan je Coombsov test. Direktan
Coombsov test se odreĊuje zbog utvrĊivanja autoantitela na eritrocitima u autoimunim
hemoliznim stanjima ili hemoliznim posttransfuzijskim reakcijama. Direktni antiglobulinski test
(DAT) je hemaglutinaciona proba na antitela ili komplement vezan za eritrocite. Isprani
fiziološke rastvori eritrocita se inkubiraju na 37°C i 4°C sa antiserumima koji sadrţe antitela,
poreklom od koza ili kunića, na IgG, IgM i komplement C3 pasa. Probu treba izvesti u
mikrotitarskim ploĉama, koristeći serijska dupla razreĊenja antiseruma. Na taj naĉin se
prevazilazi efekat prozone, koji daje laţno negativan rezultat, jer višak antitela spreĉava

34
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

unakrsno povezivanje potrebno za aglutinaciju. Titar koji predstavlja rezultat je poslednje


razreĊenje koje izaziva aglutinaciju eritrocita pacijenta. Na taj naĉin se dobija orijentaciona
ocena koliĉine antitela koja su vezana za eritrocite.
Kada se radi o mikroskopskoj analizi razmaza eritrocita vrlo je znaĉajno pravilno
izbrojanje, broj retikulocita na 1000 eritrocita, koji govore o regenerativnosti anemije.
Retikulociti se broje automatski pomoću hematološkog analajzera. U tabeli broj 4 opisane su
karakteristike pojedinih vrsta eritrocita koje se javljaju u pojedinim anemijama.

Tabela 4: Oblici eritrocita koji se nalaze u razliĉitim vrstama anemija

Oblik Opis Diferencijalna dijagnoza


MAKROCIT Veliĉina preko 9 mikrona; Megaloblasna eritropoeze (Deficit
Okrugao oblik, Smanjena b12 vitamina i folata).
bikonkavnost; Odsutno jedro i Diseritropoeza usled
jedarce; Acidofilna citoplazma mijelodisplastiĉnog sindroma.
sa ili bez centralnog Oštećenje lipidne membrane Er u
rasvetljenja; Povećana bolestima jetre. U aplastiĉnim
fragilnost (smanjena anemijama (nerazjašnjene
konkavnost i istanjenost). etiologije).
MIKROCITI Manji od 6 mikrona; Tanki; Anemija usled deficita Fe i Hb,
Okruglog do loptastog oblika; Anemija u hroniĉnim bolestima,
Bez jedra i jedarca; Acidofilna Anemija kod neoplazija, Talasemija,
citoplazma Sa ili bez Pojava patološkog hemoglobina,
centralnog rasvetljenja-ako ga Trovanja, Nasledna sideroblasna
ima prošireno je i veliko anemija, Nasledni nedostatak feritina
(anulociti – deficit Fe); Bez i sl.
inkluzija;
Nešto smanjena oksigenacija.

ŠISTOCITI Manji od 6 mikrona; Razliĉiti Hemolizne anemije usled


oblici-fragmenti; Bez jedarca i mikroangiopatija i
jedra; Acidofilna citoplazma traumatskih hemoliza
sa malim centralnim
rasvetljenjem ili znatno ĉešće Uremija
bez; Smanjene oksigenacije;
Manje elastiĉni i osetljivi- Tokom maligne arterijske
fragmentacija opne lako hipertenzije
nastaje (nepravilni oblici, u
vidu šlema, trougla, Nasledna piropoikilocitoza
polulopte).

35
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

STOMATOCITI Veći od normalnih Er; Imaju U vrlo malom procentu se


samo jednu konkavnu stranu; nalaze fiziološki
Citoplazma je acidofilna sa Bolesti jetre
neobojenom uzdušnom zonom Alkoholizam ljudi
(kao usne-stoma-Fish mouth Nasledna stomatocitoza
cells); Nešto tanji, Okrugli ili
ovalni; Diskretno smanjene
oksigenacije; Poremećen
katjonski transport kroz
membranu Er.
ELIPTOCITI Ovalni bikonkavni eritrociti; Nasledna eliptocitoza (ovalocitoza),
Duţe se zadrţavaju u slezini i Deficit Fe,
sporo prolaze kroz kapilare; Talasemija, Diseritropoeza,
Manji od 6 mikrona; Lako Megaloblastiĉna anemija,
hemoliziraju; Smanjena Mijeloftizna anemija.
oksigenacija.

EHINOCITI Normalni Er ili manji od 6 In vitro hemoliza, Renalna


mikrona; Okruglog i insuficijencija,
izduţenog oblika, sa Bolesti jetre, Hemoliza usled sudara,
nazubljenom opnom-oblik Malnutricija (hipomagnezemija,
ĉiĉka; Smanjena elastiĉnost; hipofosfatemija), Deficijencija
Lako hemoliziraju; Smanjena piruvat-kinaze
oksigenacija
AKANTOCITI Ovalnog i okruglog oblika sa Asplenija i hiposplenija, Bolesti
spikulama, razliĉite debljine, jetre, Abetalipoproteinemija,
liĉe na mamuze; Smanjene Neuroakantocitoza, Malnutricija,
oksigenacije; Smanjena Diseritropoeza
elastiĉnost, Sklonost ka
hemolizi.

DREPANOCITI Er srpastog izgleda Usled stvaranja štapićastih polimera


hemoglobina S ili drugih patoloških
hemoglobina. Usled razliĉitih
hereditarnih hemoglobinopatija.

DAKRIOCITI Er u obliku suze nastaju jer Mijelofibroza, Metastaze tumora u


(Teardrop cell) membrana eritrocita ne moţe koštanu srţ, Ekstramedularna
da uspostavi predhodni oblik eritropoeza, Diseritropoeza,
posle prolaska kroz uske krvne Megaloblasna anemija, Talasemija,
sudove ili zbog hiperplazije Akutne leukemije, Multipli mijelom
kostne srţi.
Mogu da se pojave i kao
artefakti na ivicama krvnih
razmaza.

36
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

PEĈURKASTI / Nasledni poremećaji eritrocitne


ER (Pincer cell) membrane
Diseritropoeza

KERATOCITI / Hemoliznih anemija ili izlaska


(Horn cell) Heinzovih i drugih inkluzija iz Er.
Diseritropoeza

SFEROCITI Manji od 6 mikrona; Povećana destrukcija Er, Nasledna


Loptastog oblika; Citoplazma sferocitoza, Autoimune hemolitiĉke
bez centralnog rasvetljenja; anemije, Hemolizna reakcija na
Lako nastaje fragmentacija transfuziju, Oksidativno oštećenje
opne zbog smanjene Er, Cl.Perfrigens toksin, Sepsa,
elastiĉnosti i savitljivosti; Intoksikacija vodom.
Teško prolaze kroz kapilare;
Zaostaju u slezini;
KODOCITI Pljosnat izgled sa smanjenjem Asplenija, Hiposplenija, Bolesti jetre
(Target cell) debljine i uvećanjem preĉnika; – makrokodocit, Izraziti deficit Fe,
Citoplazma acidofilna sa Hemoglobinopatija C,D,E,H i S
obojenom centralnom i
perifernom zonom;
Bez inkluzija, jedra i jedarca.
MEHURASTA Nastaju usled koncentracije DIK, Oksidativna oštećenja,
TELA U ER Hb u jednom delu Er, pa je Hemoglobin C bolest, Talasemija,
(Piknocit, Blister deo Er prazan. Diseritropoeza, Nestabilnost Hb
cell) Ova svetla polja mogu nastati RAZLIKOVATI OD
i kao posledica odstranjenja HIPOHROMNIH ĆELIJA!
Howel-Jollyevih telašaca.

HOWELL- Sliĉni Er; Okrugli do ovalni; Asplenija,


JOLY-eva Acidofilna citopalazma; Megaloblasna anemija,
TELAŠCA Telašca su ostaci jedra ili Hemolizna anemija,
odvojeni hromatin od Neonatalni period.
mitoznog vretena; Telašce
dimenzija 0,5-1 mikron;
Najĉešće prisutno jedno, mada
moţe biti prisutno
i nekoliko u jednom Er.

HEINZOVA Vidi se jedino u bojenju sa Enzimopatije (g-6DP deficijencija,


TELAŠCA kristali-violet (ne po Gimzi) Deficijencija piruvat-kinaze),
Hemoglobinopatije, Talasemija
RETIKULOCITI Prekursori eritrocita sa Povećan broj retikulocita ukazuje na
ostacima ribosoma i regenerativne anemije.
mitohondrija, zbog ĉega se
nazivaju i polihromatofili.

37
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

Za kompletnu dijagnostiku anemija znaĉajno je pregledati kostnu srţ i ispitati njenu


celularnost na razmazu, te koristiti objektiv koji uveliĉava 40x. Celularnost se broji na osnovu
broja ćelija sa jedrom u vidnom polju pri uveliĉanju sa objektivom 40x. Mijelogram ili
kvalitativni i kvantitativni odnos u ćelijama koštane srţi vrši se na osnovu brojanja i beleţenja
200-300 ćelija s jedrom. Na osnovu broja ćelija u vidnom polju dijagnostikujemo stanja od
aplazije do hiperplazije. Pored navedenog, znaĉajno je ispitati odnos ćelija granulopeze i
eritropoeze (koje su najzastupljenije u razmazu koštane srši) kako bi se dijagnostikovala hipo ili
hiperplazija neke od loza.
Policitemija nastaje kao apsolutan ili relativan poremećaj, prateći dehidrataciju, infekcije
odnosno leukemijsku reakciju. Postoji nekoliko kriterijuma za dijagnostiku policitemije i ukoliko
postoji veći broj nalaza koji su pobrojani moţemo dijagnostikovati policitemiju: povećana masa
eritrocita, normalna saturacija arterijske krvi kiseonikom u prisustvu eritrocitoze, splenomegalija,
trombocitoza i/ili leukocitoza, hipercelularna kostna srţ sa megakariocitnom hiperplazijom i
odsustvom depoa Fe, nizak nivo eritropoetina u prisustvu povećane mase Er i spontane eritroidne
kolonije bez dodavanja Epo u kulturama ćelija koštane srţi.

38
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

3.2 PATOFIZIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA POREMEĆAJA BELE LOZE I LEUKEMIJA

U toku hematološkog pregleda mogu se utvrditi broj elemenata bele loze, njihov
meĊusobni odnos (diferencijalna bela loza) i diferenciranost ćelija. Brojanje ćelija se vrši
automatski u analajzeru ili u nedostatku analajzera brojanje u Neubaureovoj komorici. Koristi se
Turkov rastvor i melanţer za leukocite (sa belom perlicom). Postupak: U melanţer za leukocite
do oznake 1 se uvuĉe kap krvi, nakon ĉega se obriše vrh melanţera i uvuĉe Turkov rastvor do
nivoa 11. Na ovaj naĉin se dobija razblaţenje 1:10. Potrebno je lagano mućkati melanţer
nekoliko minuta. Zatim, na komoricu staviti pokrovno staklo,tako da bude dobro fiksirano (vide
se Newtonovi obojeni koturovi). Nakon toga se broje leukociti pod mikroskopom. Broj leukocita
se odreĊuje prema formuli:

Br.leu./μL = N/4 x 10 x 10x 10^9


N/4 broj leukocita u jednom perifernom kvadratiću komorice,
10 – razreĊenje,
10 – broj leukocita u milimetru kubnom,
10^9 – broj leukocita u litru.

Moguće je naći povećan broj, smanjen broj i normalan broj leukocita.


Povećan ukupan broj leukocita (leukocitoza) nastaje usled: inflamacije, nekroze tkiva,
delovanja kortikosteroida i epinefrina, akutne limfoblasne leukemije, hroniĉne limfocitne
leukemije, akutne ili hroniĉne mijeloidne leukemije, limfoma, deficijencije adhezionih molekula
leukocita. Smanjenje ukupnog broja leukocita (leukopenija) se javlja prilikom: jake infekcije,
endotoksiĉnih stanja, aplastiĉne anemije, aleukemiĉnih akutnih leukemija, infektivnih bolesti
(FELV, FIV, štenećak, rikecijalne infekcije), mijelodisplastiĉni sindrom i dr.
Pored ukupnog broja leukocita znaĉajno je odrediti i diferencijalnu krvnu sliku sa brojem
bazofila, neutrofila, eozinofila, monocita i limfocita. Oni je mogu odrediti pomoću hematološkog
brojaĉa.

39
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

Povećan broj bazofila (bazofilija) ukazuje na hipersenzitivne reakcije, tumor mast ćelija,
parazitizam, bazofilnu leukemiju i mijeloproliferativne bolesti. Bazopenija se vrlo teško
dijagnostikuje, jer vrednost od nula bazofila kod većine ţivotinjskih vrsta i ljudi ulazi u
referentne vrednosti.
Eozinofilija se javlja u hipersenzitivnim reakcijama, parazitozama, limfomima,
hipoadrenokorticizmu, eozinofilnoj leukemiji i dr. Eozinopenija je teška za dijagnostiku, jer nula
ulazi u referentnu vrednost, ali hroniĉna eozinopenija ukazuje na insuficijenciju koštane srţi.
Limfocitoza ukazuje na hroniĉnu antigensku stimulaciju, nelimfoidne neoplazme,
imunski posredovane bolesti, limfocitne i limfoblasne leukemije. Lmfopenija nastaje kao
posledica delovanja glukokortikoida, virusnih infekcija, imunosupresije, kod enteropatija sa
gubitkom proteina, imunodeficijentnih stanja i sl.
Monocitoza prati septikemiĉna stanja, hemolize, odgovor na glukokortikoide,
nehematopoezne neoplazme i oštećenje kostne srţi, dok se monocitopenija teško dijagnostikuje.
Neutrofilija se javlja kod inflamacija, kao odgovor na glukokortikoide i epinefrin, zatim
kod hroniĉne mijeloidne leukemije i deficijencije adhezionih molekula leukocita. Neutropenija
se dešava kod endotoksemija, aplastiĉne anemije, aleukemiĉnim leukemija, virusnih infekcija,
imunoposredovanih bolesti i dr.
Pored odreĊivanja broja leukocita i diferencijalne krvne slike znaĉajno je odrediti i
njihovu starost. Ona se odreĊuje na osnovu prisustva blasta i stepena segmentiranosti njihovog
jedra. Ako se u perifernoj krvi javljaju mlaĊi oblici razvoja granulocitne loze, sa velikim brojom
štapastih granulocita i metamijelocita, onda se takva pojava zove skretanje u levo. Skretanje u
levo uz leukocitozu govori u prilog aktivnoj produkciji ćelija bele loze, ali je skretanje u levo uz
leukopeniju prognostiĉki vrlo loš znak kod mnogih bolesti.
Leukemije su maligne bolesti krvi kod kojih postoji progresivno razmnoţavanje ćelija
jedne od leukocitnih loza, koje je ĉesto praćeno povećanjem leukocita u perifernoj krvi, kao i
povećanjem leukocitne mase u organizmu. Kod leukemijske proliferacije se zapaţa izraziti
poremećaj u diferentovanju i sazrevanju belih krvnih ćelija. Ovaj proces je izraţeniji što je
leukemija akutnija.
Leukemiĉna stanja se odlikuju anemijom, sklonosti ka krvarenju i infekcijama zbog
promene u odnosu populacija ćelija u koštanoj srţi. Kliniĉki se ĉesto leukemije otkriju posle
kliniĉke slike dugotrajne apatije ţivotinje, kada se ultrazvuĉnim pregledom otkrije tumorska

40
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

masa u parenhimatoznim organima. Na tabeli 5 prikazani su kliniĉki stadijumi u hroniĉnoj


limfocitnoj leukemiji koja ukazuje na kliniĉke osobine i riziĉne grupu pacijenta

Tabela 5: Kliniĉki stadijumi u hroniĉnoj limfocitnoj leukemiji.

Konaĉna dijagnoza tipa leukemije postavlja se na osnovu patomorfološkog pregleda


tumorske mase (ako postoji), citohemijskih metoda (bojene reakcije: mijeloperoksidaza, sudan
crno B, nespecifiĉne esteraze), imunofenotipskih ispitivanja ćelija leukocitne loze (odreĊivanje
CD subpopulacija i drugih leukocitnih antigena) i citogenskih ispitivanja (ispitivanje
hromozoma). Danas se razvijaju metode za upotrebu monoklonskih antitela za antigene razliĉitih
receptora na leukemiĉnim ćelijama što proširuje dijagnostiĉke mogućnosti. Ove metode po svom
obimu i sadrţaju prevazilaze potrebe za edukaciju studenata na integrisanim studijama i sadrţaj
Praktikuma.

41
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

3.3 PATOFIZIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA POREMEĆAJA HEMOSTAZE

Poremećaji hemostaznog sistema se manifestuju u nastanku sklonosti ka krvarenju ili u


nastanku tromboze. Ovi problemi u kliniĉkoj patologiji nastaju kao posledica naslednog
nedostatka nekog od faktora koagulacije, kao posledica trovanja (rodentici) ili kao posledica
nastanka sepse i delovanja endotoksina, a manifestuju se kao sklonost ka diseminovanoj
intravaskularnoj koagulaciji (DIK). Poremećaji u primarnoj hemostazi, koji su vezani za
trombocite, najĉešće dovode do petehija i ekhimoza, i nakon traume dolazi do neposrednog
poĉetka krvarenja. Problemi u proteinskom sistemu koagulacije praćeni su odloţenim vremenom
poĉetka krvarenja uz nastanak krvarenja u zglobovima i dubljim tkivima.
Pomoću automatskog hematološkog analajzera vrlo jednostavno se dobija podatak o
broju i veliĉini trombocita. Broj trombocita se moţe odrediti i brojanjem u Neubauerovoj
komorici, posle razreĊenja amonijum-oksalatom u melanţeru za leukocite, a po formuli:

N/80 x 400 x 10 x 20 x 10^6/L = Br.tr.x 10^9 /L,


gde je N/80 – broj trombocita u jedom polju;
400 – 1 polje je 1/400mm², broj tr. u 1mm²;
10 - Br. tr. u 1mm³; 20 –
Razblaţenje; 10^6 – broj trombocita u litri krvi.

Brojanjem trombocita moţemo dobiti sledeće rezultate: nepromenjen broj trombocita,


trombocitozu ili trombofiliju. Krvarenja nastaju kao posledica znaĉajnog smanjenja broja
trombocita, ali i kod trombocitoze mogu nastati spontana krvarenja, ako proteinski elementi
koagulacije ne funkcionišu optimalno.
Kod svih trombocitnih koagulopatija broj trombocita je poremećen, a kod pacijenta
moţemo odrediti test vremena krvarenja po Ajviju. Naĉin izvoĊenja testa: Stavi se manţetna ili
šira Esmarhovu povesku na nadlakticu i izvrši se blagi pritisak, a zatim se sa volarne strane
ekstremiteta izvrši ĉišćenje alkoholom i ubode sterilna lanceta pod koţu, pazeći da se ne
povrede krupniji krvni sudovi (vene) i ukljuĉi se štoperica. Paţljivo se, zatim, svakih 15 sekundi
filter-papirom upija krv koja spontano teĉe iz uboda. Ova procedura se ponavlja dok krvarenje ne

42
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

prestane. Tada se štoperica iskljuĉi i oĉita proteklo vreme. Normalno vreme krvarenja je od 2-7
minuta, a produţeno vreme ukazuje na smanjen broj ili poremećenu funkciju trombocita,
poremećaj fon Wilebrandovog faktora, poremećaj u kontraktilnosti krvnih sudova i drugo.
Pravljenjem umerenog pritiska na koţi ekstremiteta i brojanjem petehija posle skidanja manţetne
moţemo proceniti kapilarnu otpornost od koje zavisi koagulabilnost krvi.
Testovi kojima se moţe ispitati funkcionalni status hemostaznog sistema su: odreĊivanje
parcijalnog tromboplastinskog vremena (PTT), protrombinskog vremena (PT) i trombinskog
vremena (TT). PTT je grupni test za procenu nivoa i aktivnosti ĉinilaca unutrašnjeg sistema
aktivacije protrombina i zajedniĉkog koagualcionog puta. PT procenjuje funkcionalni status
spoljašnjeg sistema aktivacije protrombina i zajedniĉkog koagualcionog puta. TT predstavlja
vreme potrebno za zdrušavanje plazme nakon dodavanja odreĊene koliĉine trombina. Ovim
testom se iskljuĉuje uticaj svih koagulacionih faktora tj. puteva, osim delovanja fibrinogena na
funkciju koagulacije. Normalne vrednosti PTT su od 35-75 (preko 100 kod maĉaka) sekundi.
Protrombinsko vreme je od 11-23 sekundi zavisno od vrste aktivnosti tkivnog ekstrakta koji se
koristi u testu. Normalna vrednost TT iznosi izmeĊu 15 i 25 sekundi. Patološke vrednosti se
dobijaju produţenjem ili skraćenjem navedenih perioda. Za kliniĉki rad je znaĉajno da na osnovu
navedenih parametara moţemo dijagnostikovati vaskularni, trombocitni ili koagulacioni
poremećaj hemostaze, pomoću shodno kljuĉa datog u sledećoj tabeli.

Tabela 6: Poremećaji hemostaze i vrednosti parametara znaĉajni za dijagnostiku

Pored navedenih, postoje i brojni specifiĉni testovi koji se mogu dalje koristiti u
detaljnijoj proceni funkcionalnog statusa hemostaze. Tako se npr. moţe ispitati adhezivnost

43
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

(stepen adhezije trombocita iznad poveske, dobija se poreĊenjem broja trombocita pre stavljanja
poveske i u razliĉitim periodima nakon toga, uzimanjem krvi iz krvnog suda ispod poveske) i
agregabilnost trombocita (pomoću agregometra). Postoje posebne metode za kvantifikaciju
faktora koagulacije.
Diseminovana intravaskularna koagulacija (DIK) moţe da predstavlja veliki problem u
svakodnevnom radu, posebno u opstetriciji, hirurgiji, toksiĉnim i malignim stanjima. Kada
postoji izuzetna trombocitopenija i prolongirano parcijalno tromboplastinsko, trombinsko i
protrombinsko vreme treba posumljati na DIK. Tada je znaĉajno odrediti fibrinogen, razgradne
proizvode fibrina (fibrinolizni sitem) i parakoagulacione testove.
Fibrinogen se kvantitativno moţe odrediti kliniĉki orijentacionim precipitacionim
testovima ili se u sluĉaju specijalnih ispitivanja vrše detaljnija funkcionalna ispitivanja.
Koncentracija fibrinogena u DIK-u je sniţena.
Razgradni produkti fibrina jesu D i E molekul i D dimer, a to su periferni i centralni
domeni fibrinogena tj. fibrina. OdreĊuju se lateks aglutinacijom (lateks ĉestica obloţena
antitelima protiv D i E fragmenata) koja daje makroskopski vidljive komplekse. Povišene
vrednosti D i E molekula ukazuju na povišenu fibrinoliznu aktivnost koja se dešava u DIK-u.
Prilikom delovanja trombina na fibrinogen izvesna koliĉina molekula fibrin-monomera
se ne polimerizuje nego stvara rastvorljive komplekse sa molekulima fibrinogena. Prisustvo
pomenutih monomera i fibrinogena se dokazuje parakoagulacionim testovima, koji se zasnivaju
na ĉinjenici da neke materije razlaţu ove komplekse i izazivaju ţelatinizaciju ispitivane plazme.
Prisustvo ovih rastvorljivih kompleksa monomera govori o trombinskoj aktivnosti i
stimulisanosti koagulacionog sistema. U DIK-u se javljaju pozitivni parakoagulacioni testovi.
Pomenuti testovi mogu fiziološki biti izmenjeni kod infekcija i pri hirurškim zahvatima.
U pretromboznom stanju znaĉajan je dijagnostiĉki postupak, koji se odlikuje povišenom
aktivnošću hemostaznog sistema, jer se moţe završiti tromboznim stanjem i egzitusom ţivotinje.
Zbog toga je vaţno odrediti D-dimer, D i E fragment (markeri fibrinoliznog sistema); kao i
fibrinopeptide protrombinske fragmente i fibrinske monomere (markeri aktivacije koagulacije) i
metaboliĉke markere aktivisanih trombocita (trombospondin i tromboglobulin).
Referentne vrednosti produkata degradacije fibrina su ispod 10μg/ml seruma.
Koncentracija fibrinogena varira u odnosu na vrstu od 50 do 400 mg/dl.

44
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

3.4 PATOFIZIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA INFLAMACIJE I POREMEĆAJA IMUNOG


SISTEMA

Inflamacija je odgovor ćelija, tkiva i organa na štetne endogene i egrzogene faktore.


Osnovni znaci zapaljenja su: crvenilo, otok, bol, temperiatura i oštećenje funkcije. Postoje i
brojne sistemske promene koje nastaju tokom inflamacije, a predstavljaju odgovor akutne faze,
koji se manifestuje brojnim hematološkim i hematohemijskim promenama.
U postupku dijagnostike inflamacije postoje dva puta. Specifiĉne metode koje detektuju
uzroĉnika, biološki ogledi i serološke reakcije, koje spadaju u domen mikrobiologije i
imunologije. Patofiziološka dijagnostika predstavlja ispitivanje univerzalnog odgovora
organizma na inflamaciju. U toku ovog procesa dolazi do promena u hemodinamici: transudacija
i eksudacija, hemotaksa i fagocitoza. Sistemski efekti akutne inflamacije se manifestuju u vidu
febre, promena u plazmi, promena u broju leukocita i sedimentaciji eritrocita. Patofiziološko
ispitivanje zapaljenja predstavlja dokazivanje promena proteina plazme ili seruma, povećanja
koncentracije fibrinogena, ispitivanje sedimentacije eritrocita, dokazivanje proteina akutne faze i
nekih specifiĉnih belanĉevina krvne plazme, odreĊivanje diferencijalna krvne slike i dr.
U toku dijagnostiĉkog postupka najvaţnije je pravilno postaviti i protumaĉiti algoritam
ispitivanja koji podrazumeva pravilno postavljena pitanja i odgovore u postupku dijagnostike
inflamacija, a to su:
1. Da li u organizmu postoji proces upale ili nekroze? Ukoliko postoje trebao bi da postoji neki
kardinalni znaci upale i/ili neke od promena u krvnoj slici i promena u belanĉevinama krvne
plazme;
2. Da li je zapaljenje akutno ili hroniĉno? Ukoliko postoji povećanje koncentracije proteina
akutne faze, što se u elektroforezi ispoljava porastom alfa frakcije globulina, smatramo da postoji
akutni proces. Na hroniĉno zapaljenje ukazuje povećanje koncentracije svih klasa gama-
globulina;
3. Da li je zapaljenje izazvano bakterijama, virusima ili je aseptiĉno? Neutrofilija prati
bakterijske infekcije, limfocitoza prati virusne infekcije, dok blaga neutrofilija ukazuje na
aseptiĉni proces;

45
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4. Kakav je ishod zapaljenja? Najbolje je pratiti sedimentaciju eritrocita, belu krvnu sliku i
fibrinogen, ĉija normalizacije nalaza ukazuje na ozdravljenje.
Sedinemtacija eritrocita se odreĊuje u pipeti po Westergreenu, promera 2,5mm sa
podeocima od po 1 mm. Postupak je sledeći: pacijentu se izvadi krv, koja se pomeša sa
antikoagulansom tako da odnos krvi:citrat (antikoagulans) bude 4:1, krv sa antikoagulansom se
uvuĉe u pipetu do oznake 0, pipeta se postavi uspravno u stalak i oĉitava se za 1 ĉas, 2 ĉasa, a po
potrebi i duţe. U zapaljenskom procesu sedimentacija eritrocita je ubrzana, a brzina
sedimentacije govori o jaĉini inflamatornog procesa. Ubrzana sedimentacija je karakteristiĉan
nalaz kod anemije, oligocitemije i hiperlipemije. Sedimentacija je najbrţa kod konja, dok je
najsporija kod preţivara, kod kojih se preporuĉuje da se pipeta ukosi kako bi sedimentacija bila
vidljivija. Fiziološke vrednosti posle 1 sata sedimentiranja eritrocita u pipeti su: kod konja 69,
goveĉeta 1, ovce/koze 1-4, svinja 2-8, pasa 0,5-8, ĉoveka 1-3(muškarci) i 3-5 (ţene). Posle 2 sata
vrednosti sedimentacije su sledeće: kod konja 71, goveĉeta 2, ovaca/koza 3-10, pasa 1-26,
ĉoveka 4-6 (muškarci) i 6-10 (ţene).
Pri pregledu bele loze hematološkim analajzerom ili brojanjem u komoricama najĉešće se
primećuje povećan broj elemenata bele loze, osim u odreĊenim masovnim virusnim infekcijama.
Limfocitoza moţe biti apsolutna ili relativna. Neutrofilija u perifernoj krvi postoji kada je nalaz
neutrofila preko 75%.
Pri analizi bele loze treba misliti o odreĊenim species-specifiĉnim nalazima. Kod goveda
u akutnoj upali najpre dolazi do neutropenije i leukopenije, uz skretanje neutrofila u levo, a kako
inflamacija napreduje broj elemenata bele loze raste. Kod hroniĉnih infekcija dominiraju zreli
segmentirani neutrofili sa monocitozom, a ukupan broj leukocita moţe ostati u fiziološkim
granicama. Virusne infekcije goveda dovode do leukopenije uzrokovane neutropenijom. Kod
svinja dominiraju limfociti, a u upali se povećava broj neutrofila. Apsolutni broj neutrofila moţe
biti prediktivni faktor zaštite zdravlja svinja ĉak i pre infekcije. Kod pasa i maĉaka se javlja
leukocitoza, neutrofilija i ĉesto monocitoza. U toku teškog zapaljenskog procesa moţe se javiti
leukopenija sa neutropenijom i skretanje neutrofila u levo. Hroniĉna zapaljenja prati normalan ili
povećan broj leukocita sa nalazom zrelih neutrofila.
Sledeća metoda za ispitivanje zapaljenskog procesa je koncentracija fibrinogena.
Fibrinogen se odreĊuje reakcijom sa amonijum-sulfatom. Fibrinogen u prisustvu odreĊene
koncentracije amonijum-sulfata i pri odreĊenoj vrednosti pH koaguliše u vidu sitnih agregata,

46
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

koji prave zamućenje i odreĊuju se turbidimetrijski. Za izvoĊenje analize se koristi krv sa


oksalatom ili citratom, a pre analize treba odvojiti krvnu plazmu. U toku upalnih procesa
koncentracija fibrinogena kao proteina akutne faze je povišena.
Pored fibrinogena postoje i drugi znaĉajni proteini akutne faze ĉija koncetracija raste u
inflamaciji. Znaĉajni su haptoglobin, serum amiloid A, alfa kiseli glikoprotein, ceruloplazmin,
C-reaktivni protein (nema kliniĉki znaĉaj kod preţivara), alfa 1-antitripsin i alfa 2-
makroglobulin. U akutnoj inflamaciji proteini akutne faze mogu porasti više stotina i hiljada
puta, a odreĊuju se metodama ELISA testa ili nefelometrijom. Za odreĊivanje C-reaktivnog
proteina koristi se Latex-CRP reagens koji daje reakciju aglutinacije vidljivu golim okom
(rezultat se u odnosu na intenzitet obeleţava sa jednim do ĉetiri krstića).
C3 frakcija komplementa se odreĊuje imunometrijski. Koncetracija C3 frakcije raste
prateći proteine akutne faze, a moţe opadati zbog stvaranja imunih kompleksa. Istom metodom
se odreĊuju i interleukini.
Frakcije serumskih proteina se odreĊuju elektroforezom. Kod analize akutnog zapaljenja
nalazimo porast koncentracije α1 i α2 frakcije globulina (zbog porasta koncetracije proteina
akutne faze) i pada koncetracije beta frakcije (zbog izlaska transferina u intersticijum). Ukoliko
se javi porast koncentracije imunoglobulina govorimo o hroniĉnoj inflamaciji i aktivaciji
humoralnog imuniteta.
Kod akutnog bakterijskog zapaljenja dobijamo srednje izraţenu vrednost sedimentacije
eritrocita, leukocitozu, izraţenu neutrofiliju i relativnu limfopeniju. U razmazu krvi se vide
nesegmentirani leukociti sa skretanjem krvne slike u levo. Koncentracija fibrinogena je vrlo
povišena, a koncentracija albumina je sniţena zbog izlaska albumina iz krvotoka. U ovom
procesu proteini akutne faze su povišeni. Kod virusna zapaljenja u akutnom toku dolazi do
usporene sedimentacije, a broj leukocita u perifernoj krvi je sniţen (zbog hemotakse i infiltracije
u tkiva). U krvnoj slici je vidljiva relativna neutropenija, sa limfocitozom i monocitozom.
Koncentracija fibrinogena i proteina akutne faze je blago povišena. Kod nespecifiĉnih upala
postoji slab odgovor akutne faze i javljaju i znaci specifiĉne odbrane (antitela). Sedimentacija
eritrocita je vrlo ubrzana, a razvija se i eozinofilija, uz visoku koncentraciju fibrinogena. Kod
hroniĉne nespecifiĉne upale javljaju se znaci sliĉni akutnoj upali, uz razvoj anemije zbog gubitka
Fe i transferina.

47
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

Patogeneza poremećaja imunog sistema dovodi do nekoliko pravaca razvoja bolesti i to:
recidivirajuće infekcije, oportunistiĉke infekcije, sklonost ka neoplazmama i autoimune bolesti.
Veterinarskoj medicini je poznat veći broj autoimunih bolesti. Kod bolesti zglobova koji
daju kliniĉku sliku upale i ne reaguju na antiinflamatornu terapiju sumnja se na reumatoidni
artritis. Ovaj poremećaj se dijagnostikuje odreĊivanjem reumatoidnog faktora (autoantitela) u
reakciji aglutinacije. Pozitivan rezultat postoji kod imunoposredovanog reumatoidnog astritisa,
sistemskog lupusa eritematozusa, Sjogrenovog sindroma, bakterijskog endokarditisa,
dirofilarioze, osteoartritisa i hroniĉnih virusnih inefkcija. Pri korišćenju ovih analiza vaţno je
napomenuti da zamrznuti serumi ĉesto daju laţno negativnu reakciju, te zato uvek treba raditi sa
sveţim serumom.
Dijagnostika lupusa eritematozusa vrši se ispitivanjem neutrofila sa citoplazmatskim
inkluzionim fagocitovanim materijalom. Fagocitoza nastaje kao posledica opsonizacije ćelija
antinuklearnim autoantitelima (ANA). Fagocitovane inkluzije su ruţiĉasto ili tamnocrvene boje.
Ove ćelije se nazivaju ćelije lupusa eritematozusa (eng. abr. LE cells). U sistemskom lupusu
eritematozusu kliniĉki dominiraju znaci glomerulonefritisa i vaskulitisa, zbog taloţenja
kompleksa, što predstavlja vrlo znaĉajnu orijentaciju za kliniĉki rad.

48
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

3.5 PATOFIZIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA POREMEĆAJA KARDIOVASKULARNOG


SISTEMA

Ispitivanje kardiovaskularnog sistema je nezaobilazan postupak u prvim koracima


kliniĉkog pregleda, a vrši se pregledom srca (auskultacija) ili perifernih krvnih sudova (puls). Pri
inspekciji veterinar opšte prakse najpre zapaţa neke od sledećih znakova: slabost,
dezorijentaciju, umor, cijanoza, polidipsija, sinkopa, ascites, edem, dispnea, širenje v.jugularis,
širenje vena, slab puls, promene pulsa, tahikardija, palpatorni srĉani šum, bradikardija, aritmija,
hepatomegalija, kašalj, šumove, šumove trenja, ronhe, bronhijalne tonove, srĉani galop ( ĉujni
S3,S4 ton) i dr.
Ukoliko se primeti neki od kliniĉkih simptoma, ţivotinja se obavezno mora ispitati
pomoću specijalistiĉkih metoda, a to su: elektrokardiografija, sfigmogragija, flebografija,
pletizmografija, ultrzvuk srca i hematohemijski pokazatelji funkcije kardiovaskularnog sistema.
Elektrokardiografija (EKG) je najznaĉajnija i najrasprostranjenija metoda za ispitivanje
funkcije srĉanog mišića. Pomoću nje se registruju bioelektriĉni potencijali, koje stvara srĉani
mišić tokom depolarizacije i repolarizacije, a ti potencijali (bioelektriĉne struje) se šire na
periferiju tela, gde se registruju metodom EKG-a, pomoću elektrokardiografa. Elektrokardiograf
je aparat koji se sastoji od elektroda za beleţenje perifernih potencijala i sistema za grafiĉko
prikazivanje rezultata, tj. dobijanje elektrokardiograma. Najĉešće indikacije za primenu
elektrokardiografije su: promena srĉanih šumova tokom auskultacije, kardiogena disritmija
(tahi/bradikardije, ekstrasistole...), akutna dispnoja i cijanoza, rentgenski dijagnostikovana
promena srĉane senke, poremećaj stanja elektrolita u organizmu, sistemske bolesti (uremija,
piometra, pankreatitis) praćene kardiogenom disritmijom, dijagnostika razliĉitih oblika
kardiopatija, kontrola rada srca pre i tokom hirurških intervencija i sl. EKG metoda ima sledeća
ograniĉenja: nemogućnost utvrĊivanja patomorfoloških promena valvula, koronarnih arterija,
endokarda i perikarda.
Za pravilno izvoĊenje ove metode pacijenta je neophodno osloboditi od uznemiravanja i
treba ga postaviti u desni poloţaj po strani. Ponekad treba izvršiti sedacija pacijenta, ali ne i
anestezija. Uporedo sa smirivanjem pacijenta vrši se aplikaija štipaljki (elektroda) i to: elektrode
na prednjim ekstremiteta u regiji proksimalnog olekranona ili blizu polovine radijusa, elektrode
na zadnjim ekstremitetima preko patelarnog ligamenta, a prekordijalne elektrode se postavljaju u

49
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

srĉanoj regiji i interkostalnim prostorima. Elektrode aparata su najĉešće u vidu štipaljki (alligator
clips) i reĊe u vidu ravni. Pre njihove aplikacije neophodno je primeniti gel ili alkohol radi
boljeg prijanjanja koţe i elektroda.
Na aparatu razlikujemo nekoliko odvoda (naĉina registrovanja bioelektriĉne struje srca)
za snimanje srca EKG-om. Oni mogu biti bipolarni (dve elektrode se povezuju u galvanometru i
daju krivulju-derivaciju), unipolarni (kada dve elektrode budu povezane da daju nulti potencijal,
a treća snima potencijal miokarda) i prekordijalni (elektrode sa ekstremiteta se povezuju zajedno
dajući nulti potencijal, a posebna elektroda se vezuje na razliĉite taĉke grudnoga koša shodno
anatomskim karakteristikama srca). Bipolarni periferni odvodi (tzv. standardni) i raspored
naelektrisanja: odvod DI – desni prednji ekstremitet (-) i levi prednji ekstremitet (+), odvod DII –
desni prednji ekstremitet (-) i levi zadnji ekstremitet (+), odvod DIII – levi prednji ekstremitet (-)
i levi zadnji ekstremitet (+). Unipolarni periferni odvodi (ekstremitetni) i raspored njihovog
naelektrisanja je sledeći: odvod aVR – desni prednji ekstremitet (+) u odnosu na levi prednji i
zadnji ekstremitet (-), odvod aVL – levi prednji ekstremitet (+) u odnosu na desni prednji i levi
zadnji ekstremitet (-), odvod aVF – levi zadnji ekstremitet (+) u odnosu na desni i levi prednji
ekstremitet (-). Prekordijalni odvodi su sledeći: odvod V10 – iznad trnastog izdanka sedmog
torakalnog pršljena, odvod CV6LL (V2) – šesti levi interkostalni prostor u blizini ivice sternuma,
odvod V3 – blizu levog apeksa srca, odvod CV6LU (V4) – šesti levi interkostalni prostor kod
kostohondralne veze, odvod CV5RL (rV2) – peti desni interkostalni prostor u blizini ivice
sternuma.
U zavisnosti od radne dijagnoze treba odabrati i naĉin snimanja EKG-om. Pri ispitivanju
srĉanog ritma i poloţaja srca treba snimati standardne bipolarne odvode. Za otkrivanje
lokalizacije lezije i infarkta kao i za odreĊivanje poloţaja srca koristićemo ekstremitetne odvode.
U ispitivanju poremećaja ishrane miokarda koristićemo prekordijalne odvode.
Snimanje pomoću većeg broja elektroda neophodno je jer na taj naĉin procesi
depolarizacije i repolarizacije posmatraju iz razliĉitih ravni i uglova. Na taj naĉin se moţe
rekonstruisati poloţaj srca i izvršiti lokalizacija patološkog procesa u njemu. Standardne
bipolarne derivacije daju temena (aVR, aVL, aVF) ravnostranog (stranice D1, D2, D3)
Einthovenovog trougla, koji daje sliku srca u frontalnoj ravni.
Snimanje EKG talasa se vrši na traci sa odštampanom milimetarskom mreţom. Traka se
uvek kreće brzinom 25 cm/min. Osetljivost većine EKG aparata je takva da mali kvadratić u

50
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

milimetarskoj hartiji po širini predstavlja period od 0,04 sekunde, a po visini 0,1 mV. Veliki
kvadrat (koji obuhvata 5x5 malih kvadrata – Ashmanova jedinica) dug je 0,2 sekunde, a visok je
0,5 mV.
Posmatranjem elektrokardiograma moţe se utvrditi sledeći parametri: a) srĉana
frekvenca, b) srĉani ritam, c) merenje P, Q, R, S i T amplituda, d) merenje intervala P, PQ, QRS,
QT i e) utvrĊivanje oblika zubaca i linija.
Srĉana frekvenca se utvrĊuje deljenjem broja 60 sa rastojanjem dva R zupca izraţeno u
sekundama. Drugi naĉin odreĊivanje frekvence je odreĊivanje nomogramom. Nomogram treba
postaviti tako da se na vrhu jednog R zupca postavi podeok nula, dok sledeći R zubac pokazuje
frekvencu. Na taj naĉin moţemo razlikovati tahikardiju od bradikardije.
Promene u karakteristici zubaca najdirektnije ukazuju na prisustvo izmenjene funkcije ili
patološkog stanja srca, a navedeni najĉešći primeri ukazuju na patologiju srca.
Najĉešći primeri dijagnoza kod izmenjenih zubaca:

Visok zubac R:
Stenosis aortae
Insufficientia valvula semilunares aortae
Hipertrofija leve komore

Povećanje, proširenje i zaobljavanje zubca R:


Insufficientia valvulae mitralis

Negativan zubac R:
Stenosis a. pulmonalis
Insufficientia valvulae tricuspidalis
Cor pulmonalis

Visoka amplituda QRS kompleksa:


Ductus Botalli persistens

Sniţenje visine svih pikova EKGa:

51
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

Pericarditis

Totalni AV blok:
Adams-Stockesov sindrom

Proširen P talas, eventualno zaobljen:


Dilatacija leve pretkomore ĉesto usled insuficijencije mitralnih valvula

Povišen P talas sa pojavom oštrine vrha:


Dilatacija ili hipertrofila desne pretkomore

ST interval:
Promena oblika i visine kod eksudativnog perikarditisa

Produţen QT interval:
Hipokalcemija
Hipokalemija
Intoksikacija etilen-glikolom

Skraćen QT interval:
Hiperkalcemija
Hiperkalemija
Terapija digitalisom

Visok T talas:
Hiperkalemija, hipoksija, uremija, piometra

Pletizmografija je registrovanje pulsnog talasa putem neinvazivnog merenja arterijskog


protoka. Pletizmografi mogu raditi putem senzora osetljivih na promenu volumena (pritiska),
promene u elektriĉnoj sprovodljivosti i drugo. Bez obzira na metod rada dobija se kriva
(pletizmogram), na kojoj se meri vreme propagacije, vreme inklinacije i vreme vrha i amplituda

52
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

krivulje. Postoje još i modifikacije ove metode a to su oscilometrija i Doppler sonografija. Uz


pomoć ovih metoda posmatraju se sledeće osobine pulsa: frekvencija, ritam, visina, brzina
nastanka i išĉezavanja i tvrdoća pulsa. Kod okluzivnih bolesti arterija širenje pulsnog talasa se
usporava, amplituda mu se smanjuje a iza mesta potpune okluzije sasvim nestaje.
Beleţenje venskog pulsa vrši se flebografijom. Venski puls se najbolje odreĊuje na
v.jugularis i on je asinhron sa sistolom komora i arterijskim pulsom, pa zato kaţemo da je venski
puls negativan. Zupci flebograma su: a (kontrakcija desne predkomore), c (zatvaranje
trikuspidalnih zalistaka na poĉetku sistole komore), v (porast pritiska u desnoj komori tokom
sistole komora dok su trikuspidalni zalisci zatvoreni) i h (porast pritiska u desnoj komori u
periodu dijastaze). Silazni talasi na flebogramu su: x (dijastola predkomore), x' (pomeranje AV
prstena i desnog AV otvora prema apeksu srca za vreme sistole komora, što smanjuje pitisak u
desnoj predkomori) i y (pad pritiska u desnoj predkomori u toku otvaranja kuspidalnih zalistaka
za vreme rane dijastole komora).
Apekskardiografija predstavlja registrovanje srĉanog udara o grudni koš ĉiji je rezultat
apekskardiogram. Pacijent se postavlja na levu stranu. Na krivulji razlikujemo: mali talas (A),
koji odgovara sistoli predkomore, nakon malog useka sledi strmi uzlazni deo koji oznaĉava
izometrijsku kontrakciju leve komore do vrha (E) koji oznaĉava otvaranje aortnih zalistaka. Iza
te taĉke se javlja plato za vreme kojeg se vrši ejekciona faza, do drugog kolena koji oznaĉava
zatvaranje aortnih zalistaka i poĉetak dijastole. Nakon toga kriva naglo opada, što se poklapa sa
izometrijskom fazom relaksacije sve do najniţe taĉke krivulje u kojoj se otvaraju mitralni zalisci.
Posle taĉke O kriva ponovo kreće na gore, formirajući talas RF koji odgovara brzom punjenju
leve komore, a zatim pokazuje postepeni uzlazni deo SF za vreme sporog punjenja.
Ehokardiografija se zasniva na upotrebi ultrazvuka za morfo-funkcionalno ispitivanje
srca. Postoje razliĉite vrste ehokardiografije, a najznaĉajnija osobina je da se slika srca stvara na
monitoru ultrazvuĉnog aparata i da se ona moţe zamrznuti i iskoristiti za razlilĉita merenja.
Najbitniji parametar koji se meri je ejekciona frakcija:
(volumen u dijastoli – volumen o sistoli) / volumen u dijastoli.
Navedene metode se mogu paralelno izvoditi pri primeni metode polikardiografije,
kada se na istom papiru beleţi EKG i ostali parametri, da bi se videla sinhronizacija rada srca sa
perifernim krvotokom.

53
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

Procena funkcionalnog statusa srca vrši se i pomoću biohemijskih parametara, kao što su
kreatin-kinaza i natriuriĉni peptid.
Kreatin-kinaza se odreĊuje standardnim enzimskim metodama. Ovaj enzim se nalazi u
skeletnoj muskulaturi, mozgu i srcu. Kod akutnog infarkta miokarda aktivnost CK raste već
nekoliko ĉasova posle infarkta, a vrednost moţe biti i dvadeset puta uvećana. Posle 15-30 ĉasova
od infakta CK dostiţe svoj maksimum, pa u narednih nekoliko dana opada na poĉetnu vrednost.
Ukoliko je nekrotiĉno podruĉje veće, veći je porast CK. Pored CK korisno je odrediti i aktivnost
laktat-dehidrogenaze (LDH).
Natriuriĉni peptid daje dve osnovne forme atrialni tip i B-tip peptida (ANP i BNP), koji
nastaju kao posledica povišenog pritiska na zid srca. ANP i BNP izazivaju vazodilataciju,
povišenu diurezu i natriurezu, a antagonisti su renin-angiotenzin-aldosteron sistemu. OdreĊivanje
ovoga peptida je od velike koristi kod razlikovanja dispneje koja je kardiogenog i nekardiogenog
porekla. Posebno znaĉajno kod pasa, gde je dispneja ĉesto prvi znak srĉane slabosti, a sa druge
strane auskultacija i EKG nalaz mogu dati znake respiratorne disritmije srca. OdreĊivanje ovih
peptida je korisno i kod ispitivanja efekta terapije. Natriuriĉni peptid se odreĊuje standardnim
komercijalnim kitovima. Povišene vrednosti ukazuju na poremećaj zdravlja srca, dok višestruko
povećanje ukazuje na srĉane bolesti.

54
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

3.6 PATOFIZIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA POREMEĆAJA


DIGESTIVNOG SISTEMA

U veterinarskoj praksi najviše su zastupljeni poremećaji funkcije i bolesti alimentarnog


trakta. Posmatranjem poremećaja svih sistema moţe se zakljuĉiti da skoro svaki od njih u nekoj
odreĊenoj fazi ispoljava i poremećaje vezane za gastrointestinalne organe i regulaciju apetita. Sa
druge strane, poremećaji funkcije digestivnih organa veoma brzo dovode do promena i na
nedigestivnim organima. Zbog svega navedenog, znaĉajno je poznavati metode za procenu
finkcionalnog statusa ţeluce, creva, predţeludaca, jetre i egzokrinog pankreasa.
Poremećaj funkcije ţeluca ispoljava se u poremećaju motorike (hipermotilitet,
hipomotilitet i atonija) ili poremećaju stvaranja ţeludaĉnog soka (hipersekrecija, hiposekrecija i
achylia gastrica).
Hipomotilitet prestavlja usporeno praţnjenje ţeluca u duodenum. Ono nastaje kao
posledica inf1amacija, poremećaja metabolizma (hipokalijemija i hiperkalcemija, endokrini
poremećaji, kao što su hipotireoza, dijabetes melitus i hipoadrenokorticizam) i davanja lekova
kao što su antiholinergici, opijati i β-adrenergiĉki agonisti. Posledica hipomotiliteta je
nagomilavanje sadrţaja u lumenu ţeluca, dehidracija, hemokoncentracija, metaboliĉka alkaloza i
jak abdominalni bol. Pod atonijom se podrazumeva potpuni gubitak tonusa ţeluca, gubitak peris-
taltike i ref1eksa na povraćanje. Moţe biti posledica opšte anestezije, povrede vagusa,
kompresije duodenuma, spazma pilorusa ili opstrukcije creva. Atoniju ţeluca prati nemogucnost
praţnjenja ţeluca. Hipermotilitet ţeluca je najĉešće jatrogenog porekla. Ubrzano praţnjenje
ţeluca nastaje kod davanja lekova (metoklopramid) koji stimulišu njegovu peristaltiku.
Dijagnostika poremećaja motiliteta ţeluca vrši se radiografskim metodama, posle
sukcesivnog snimanja pacijenta koji je uneo barijum kao kontrastno sredstvo. Smatra se da u
zavisnosti od vrste hrane sadrţaj iz ţeluca u potpunosti preĊe u duodenum za 2-3 sata, osim
partikula manjih od pola milimetra, koje mogu znatno brţe ući u duodenum. Pasaţa ĉije trajanje
nije u pomenutom vremenskom intervalu uz prisustvo znakova drugih bolesti ukazuje da se radi
o poremećaju motiliteta.
Hipersekrecija je luĉenje ţeludaĉnog soka koje nije uvek praćeno aktivacijom fizioloških
regulatornih mehanizama i koje se prevashodno javlja u vreme kada bi kod ţivotinje trebala da
postoji samo bazalna sekrecija. Hipersekrecija je praćena pojaĉanim luĉenjem pepsinogena,

55
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

hiperhlorhidrijom i poslediĉnim hiperaciditetom ţeludaĉnog sadrţaja. Patogenetski mehanizmi


hipersekrecije hlorovodoniĉne kiseline (HCl) leţe u: povećanju koncentracije gastrina,
povećanju koncentracije kortikosteroida i povećanju koncentracije histamina. Hiposekrecija je
smanjenje zapremine izluĉenog ţeludaĉnog soka u periodu kada su ţlezde sluznice ţeluca
stimulisane na maksimalnu sekreciju. Praćena je smanjenjem luĉenja pepsinogena i
hipohlorhidrijom, odnosno hipoaciditetom ţeludaĉnog sadrţaja. Ovaj poremćaj se javlja kod
hroniĉnog atrofiĉnog gastritisa. Potpuni nedostatak luĉenja ţeludaĉnog soka naziva se Achylia
gastrica.
Poremećaj luĉenja ţeludaĉnog soka dijagnostikuje se odreĊivanjem slobodne
hlorovodoniĉne kiseline, odreĊivanjem ukupnog aciditeta ili odreĊivanjem bazalne sekrecije
luĉenja HCl (pogledati metode u 3. poglavlju). Pored metoda za odreĊivanje bazalne sekrecije
postoje i metode kojima se ispituje odgovor koji nastaje posle stimulacije sekrecije, a da bi se
odredio maksimalno izluĉivanje ţeludaĉne kiseline. Stimulacija luĉenja ţeludaĉnog soka se
moţe vršiti histaminom ili insulinom.
Nedostatak slobodne HCl se naziva ahlorhidrija, a javlja se prilikom propadanja i
razaranja parijetalnih ćelija. Ako u ţeludaĉnom soku ima manje HCl od normalne vrednosti,
dolazi do pojave hipohlorhidrije. Povećanu vrednost bazalne sekrecije (kod ljudi preko 5
mmol/h) nalazimo kod obolelih od duodenalnog ulkusa i hiperparatireoidizma, dok vrednosti
preko 15 mmol/h nalazimo kod Zollinger-Ellisonovog sindroma (gastrinom sa upornim
recidivima ulkusne bolesti i hipersekrecijom, a uzrok je tumor koji se nalazi u gušteraĉi i luĉi
gastrin). Smanjeno luĉenje HCl utvrĊeno je kod atrofiĉnog gastritisa i karcinoma ţeluca i kod
većine obolelih od ţeludaĉnog ulkusa. Kod ahilije nedostaje HCl, unutrašnji ĉinilac i pepsinogen.
OdreĊivanje poremećaja luĉenja ţeludaĉnog soka izazvane gastrinomom vrši se
standardnim kitovima, posle uzimanja krvi. Indikacije su: hroniĉno povraćanje, intemitentna
dijareja, progresivan gubitak telesne mase, pojava melene, hemameteze i abdominalnog bola.
Poremećaj funkcije predţeludaca kod preţivara se manifestuje u nastanku indigestija
buraga (kisela, bazna, penušavo vrenje) i dislokacije sirišta kao i drugih manje zastupljenih
poremećaja.
Posle uzimanja buraţnog sadrţaja (vidite uvodno poglavlje) vrši se ispitivanje njegovih
fiziĉko-hemijskih osobina u cilju procene funkcionalnog statusa buraga. Fiziĉke osobine
buragovog sadrţaja su: boja, miris, konzistencija i pH. Boja: Ovaj sadrţaj moţe biti u sledećim

56
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

bojama. Normalno je tamno siva, tamno maslinasta ili zeleno-crna. Zeleno-crna boja je znak
truleţnih procesa ili staze buraţnog sadrţaja. Svetlo siva, mleĉna boja se moţe zapaziti kad se
ţivotinja prejeda sa zrnastom hranom. Miris: Miris je normalno aromatiĉan. Truleţan miris
srećemo kod staze buragovog sadrţaja ili raspadanja belanĉevina (bazna indigestija). Kiseo miris
srećemo kod ţivotinja koje su se prejele ţitarica. Normalna konzistencija je viskozna, sa ĉesto
izraţenom tegljivošću. Ukoliko postoji prisustvo pene, to ukazuje na patološki proces. Normalna
vrednost pH je 6,2-7,2. Vrednosti iznad normalnih ukazuju na baznu indigestiju i truleţne
procese, a vrednosti ispod normalnih su znak kisele indigestije. Ukoliko se javi vrednost pH
ispod 5 proces kisele indigestije postaje ireverzibilan.
Nakon inspekcije moţe se vršiti sedimentacija i flotacija buraţnog sadrţaja. Sveţe uzet
sadrţaj pomoću sonde treba procediti kroz grubo sito. Tako proceĊen sok treba sipati u stakleni
sud (široka epruveta, menzura) i posmatrati u uspravnom poloţaju. Nakon formiranja sistema
sitnije partikule sadrţaja, koje plutaju u gornjem sloju teĉnosti, poĉinju polako da se spuštaju na
dno. Partikuje iz donjih slojeva se zajedno sa mehurućima penju na gore, a grublje konĉaste
partikule formiraju sloj na površini. Ovaj proces traje 5-10 minuta. Kod gladovanja,
pothranjivanja i indigestija zapaţa se vrlo brza sedimentacija i spora flotacija. Vrlo brza flotacija
uz stvaranje penušavog sadrţaja javlja se kod naduna.
U proceni funkcionalnog statusa buraga sledeći znaĉajan korak je pregled infuzorija. U
buragovom sadrţaju se nalazi više desetina vrsta protozoa, a u jednom ml buragovog soka ima
10^6 infuzorija. Veliĉina infuzorija je od 20 do 200 mikrona, te se dela na: male, srednje i
krupne. U zavisnosti od broja i veliĉine infuzorija procenjujemo funkcionalni status buraga.
Postupak procene infuzorija: Uzima se kap buraţnog soka i stavi na predmetno staklo. Poklopi se
ljuspicom i posmatra pod malim uvećanjem 80-100x. Dobijeni rezultati se obeleţavaju sa -
,+,++,+++, u zavisnosti od sadrţaja infuzorijama. Da bi posmatranje bilo uraĊeno ispravno, treba
malo ugrejati preparat na plameniku ili odrţavati 30°C, jer se stavljanjem na predmetno staklo
infuzorije brzo umire, te nije moguće obaviti pregled. Pri posmatranju treba uoĉiti broj
progresivno pokretljivih i nepokretnih-odumrlih infuzorija. Kod poremećenog varenja iz
buraţnog soka najpre išĉezavaju krupne infuzorije, zatim srednje, dok se sitne gube poslednje.
Kod acidoze ili alkaloze buraga, infuzorije mogu brzo nestati. Novija istraţivanja pokazuju da je
punjenost infuzorija glikogenom (posle bojenja Lugolovim rastvorom) pokazatelj energetskog
statusa kod mleĉnih krava.

57
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

Hemijske karakteristike buragovog sadrţaja i njihovo odreĊivanje opisane su u poglavlju


3. kroz posebno odabrane metode.
Ispitivanje funkcionalnog statusa creva se vrši prilikom postojanja sindroma vezanih
za tanka creva: sindrom malresorpcije, dijareje, konstipacija i opstipacija, zapaljenje creva,
meteorizam i neprohodnost creva.
Pri dijagnostici dijareja neophodno je ispitati da li je dijareja poreklom iz tankih ili
debelih creva. Dijareja iz tankih creva ima sledeće osobine: znaĉajno uvećana zapremina fecesa,
retko prisustvo sluzi, odsustvo hematohezije, prisustvo steatoreje i nesvarenih delova hrane,
odsutnost hitnosti u defekaciji, povećana frekvenca defekacije, odsutnost dishezija, mršavljenje,
povraćanje (eventualno). Dijareja iz debelih creva ima sledeće osobine: normalnu ili neznatno
povećanu zapreminu fecesa, ĉesta prisutnost sluzi, odsutnost melene, ĉesta prisutnost
hematohezije, bez steatoreje i tragova nesvarene hrane, prisutnost hitnosti i tenezama, viša
frekventnost defekacije, prisutnost dishezije i izuzetno retka izraţenost gubitka telesne mase i
povraćanja.
Testovi za dijagnostiku poremećaja funkcije tankih creva i egzokrinog pankreasa i jetre
zasnivaju se na ĉinjenici da se pojedine materije apsorbuju iz creva u nepromenjenom obliku
zbog funkciji crevnih enzima ili mikrobne flore.
Test opterećenja D-ksilozom se zasniva na principu da se D-ksiloza, kao pentoza
apsorbuje difuzijom u duodenumu i jejunumu, bez obzira na funkcionalni status jetre i
pankreasa. Oko 20% unete koliĉine izluĉuje se putem mokraće i ta koliĉina je proporcionalna
koncentraciji u serumu. Za utvrĊivanje koncentracije ksiloze radi se klasiĉna fotometrijska
metoda u tri peruvete (proba, kontrola, standard) sa p-brom anilin reagensom. Koncentracija
ksiloze u krvi se odreĊuje pre hranjenja, zatim 30, 60, 90 i 120 minuta nakon peroralnog davanja
0,4 g ksiloze na kilogram telesne mase. Najviši nivo ksiloze, iznad 60 mg/dl, kod normalnih pasa
dobija se nakon 60 do 90 minuta, dok je nivo ksiloze u krvi kod malapsorpcije mnogo niţi.
Digestivna i apsorbtivna uloga creva se procenjuje testom opterećenja skrobom (STT –
skrob tolerans test), jer se skrob pod dejstvom amilaze razlaţe do glukoze i u tako se apsorbuje.
OdreĊivanjem glikemije tokom STT testa dobija se uvid u poremećaj pomenutih funkcija. Ovaj
test je pozitivan u smanjenoj amilolitiĉkoj aktivnosti digestivnih sokova, kao posledica
napredovale insuficijencije pankreasa (hroniĉni pankreatitis, karcinom pankreasa).

58
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

Za procenu intestinalne apsorpcije vitamina B12, koja se obavlja u terminalnom delu


ileuma, a za šta je potreban i unutrašnji faktor iz ţeluca koristi se Šilingov test. Nedostatak
unutrašnjeg faktora dovodi do megaloblasne anemije i nervnih poremećaja. Reakcija se zasniva
na per os aplikaciji vitamina B12 obeleţenog radioaktivnim izotopom Co-57. Pošto je vitamin
B12 hidrosolubilan, višak koji se u organizmu formira posle aplikacije izluĉuje se putem
bubrega. Ukoliko je smanjena reapsorpcija vitamina iz creva, biće smanjena i njegova koliĉina u
mokraći. Test pruţa mogućnost procene efikasnosti apsorpcije i lokalizacije patološkog procesa.
Nivo folata u krvi ukazuje na stepen apsorpcije u proksimalnom delu jejunuma, a nivo
kobalamina ukazuje na stepen apsorpcije u distalnom delu ileuma. Vrednosti ova dva testa mogu
biti promenjene kod prerastanja bakterijske flore: nivo folata u krvi je veći usled pojaĉane
bakterijske sinteze, dok je nivo kobalamina manji, obzirom da bakterije vezuju vitamin B12
spreĉavajući njegovu apsorpciju. Postupak izvoĊenja metode: ţivotinji se per os daje kapsula
vitamina B12 sa radioaktivnim elementom našte i skuplja se urin u toku 24h. Dva sata nakon
aplikacije kapsule, aplikuje se 1mg obiĉnog vitamina B12. Sutradan (nakon 24 h od poĉetka) se
donosi urin na analizu. Standard za uporeĊivanje radioaktivnosti se postiţe rastvaranjem kapsule
u 200 ml vode i merenjem radioaktivnosti.
Nitrozonaftol test zasniva se na pojavi da u uslovima prerastanja bakterijske flore creva,
bakterije povećano koriste nitrozonaftol, dovodeći do njegovog metabolizovanja i povećanja
ekskrecije preko bubrega. Za ovo ispitivanje postoji komercijalni reagens za brzu detekciju
parahidroksifenil-acetata u urinu (bojena reakcija), koja predstavlja produkt bakterijske
razgradnje tirozina u crevima.
Test opterećenja sa mastima je sledeći test koji se koristi za procenu funkcionalnog
statusa creva i egzokrinog pankreasa i jetre (ţuĉi). Izvodi se nakon gladovanja preko noći, kada
se per oralno se daje 6 ml/kg Lipomala ili obiĉnog kuhinjskog ulja. Nakon 2 - 3 h uzima se krv i
procenjuje zamašćenost seruma. Ako je apsorpcija normalna, krvna plazma će biti zamućena –
lipemiĉna. Pored navedenog, masti se mogu odreĊivati i u stolici, mada je metoda tehniĉki teško
izvdljiva, jer feces treba sakupljati nekoliko dana.
BT-PABA apsorpcioni test se koristi za merenje aktivnosti pankreasnog himotripsina i
pokazatelj je hroniĉnog pankreatitisa. Naĉin izvoĊenja testa: BT-PABA (n-benzoyl-l-tryosyl-p-
aminobenzojeva kiselina) se aplikuje peroralno u koliĉini od 50 mg/kg, himotripsin hidrolizuje
peptidnu komponentu kojom se oslobaĊa i apsorbuje PABA, a tokom 6 ĉasova ona se izluĉuje

59
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

preko bubrega. Ukoliko se paraaminobenzojeva kiselina traţi u krvi, uzorci krvi se uzimaju na 0,
30, 60, 90, 120 i 150 minuta nakon peroralne aplikacije reagensa, a ukoliko se traţi u urinu, urin
se sakuplja tokom 6 h. U normalnim okolnostima nakon 60 do 90 minuta od davanja BT-PABA
nivo PABA u krvi je obiĉno veći od 10 mikrograma u mililitru plazme.
Mikroskopski pregled stolice na svarljivost hrane je pregled dela stolice na
mikroskopskoj ploĉici posle uoĉavanja nesvarenih delova hrane. Test se izvodi na tri ploĉice.
Ploĉica sa fiziološkim rastvorom (nativni preparat) se koristi za traţenje mišićnih i nesvarenih
vezivnih vlakna koja su vidljiva kada ţeludaĉno varenje nije dovoljno (jer samo ţeludaĉni sok
moţe primarno da razori pomenuta vlakna). Ploĉica sa Sudanom III se koristi za pregled na
prisustvo masti. Neutralne masti se boje narandţasto-crveno, a kristali masnih kiselina ostaju
neobojeni. Pojava većeg broja ovih kapljica ukazuju na steatoreju i druge poremećaje koji utiĉu
na apsorpciju masti. Ploĉica sa Lugolom se koristi za posmatranje prisustva ovalnih zrna skroba,
koji su plavkaste boje. Pojava nesvarenog skroba naziva se amiloreja.

60
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

3.7 PATOFIZIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA POREMEĆAJA


FUNKCIJE JETRE I EGZOKRINOG PANKREASA

Jetra ima brojne uloge u organizmu, koje se mogu podeliti na: uloga u metabolizmu
bilirubina, detoksikaciji, kao i brojne biosintetske uloge i uloge u metabolizmu. Ova podela je
korisna sa aspekta poremećaja funkcije jetre, obzirom da većina bolesti jetre daje neke od
navedenih znakova: poremećaj opšteg zdravlja, ikterus, anemija, disproteinemije i dislipidemije.
U procesu dekompenzacije nastaje i ascites, endokrinološki poremećaji i hepatiĉna koma.
Ikterus/ţutica nastaje retencijom konjugovanog ili nekonjugovanog bilirubina.
Vrstu ţutice odreĊuje odnos nekonjugovanog bilirubina i konjugovanog bilirubina u krvi.
Prehepatiĉka ili hemolitiĉka ţutica nastaje u hemolitiĉkim stanjima kada razgradnja eritrocita i
oslobaĊanje bilirubina u ćelijama RES-a prevazilazi kapacitete jetre za njegovo preuzimanje.
Hiperbilirubinemija je posledica povećanja koncentracije nekonjugovanog bilirubina u krvi.
Hepatiĉka ili hepatocelularna ţutica je najĉešći oblik ţutice, koji nastaje pod dejstvom raznih
etioloških agenasa, koji dovode do neposrednog oštećenja jetre. Kao posledica oteţanog
izluĉivanja već konjugovanog bilirubina javlja se holestaza koja se karakteriše stazom ţuĉi u
intrahepatiĉkim ţuĉnim kanalima, usled ĉega dolazi do regurgitacije ţuĉi u krvotok.
Ekstrahepatiĉka ili opstruktivna ţutica nastaje u sluĉaju parcijalne ili potpune opstrukcije glavnih
ţuĉnih puteva. Kod pasa i maĉaka se ne javlja ĉesto, mada je opisano više sluĉajeva, najĉešće
kao posledica spoljašnje kompresije ţuĉnih puteva tumorima, opstrukcije holelitima i kod nekih
upala i striktura ţuĉnih puteva i duodenuma.
Kao posledica poremećene sinteze proteina, skraćenog ţivota eritrocita, zbog
hipersplenizma ili teških gastrointestinalnih krvarenja i portne hipertenzije nastaje anemija uz
koju se najĉešće javlja i promena u broju leukocita i trombocita.
Ascites primarno nastaje kao poremećaj ravnoteţe izmeĊu intravaskularnog (v. porte) i
intersticijalnog prostora (teĉnost u peritonealnoj duplji). Osnovni ĉinioci poremećaja
hidrostatskog i onkotskog pritiska su portna hipertenzija i hipoalbuminemija. Ascites najĉešće
nastaje u sluĉajevima istovremenog razvoja hipoalbuminemije i portne hipertenzije. Hepatiĉka
portna hipertenzija je izazvana intrahepatiĉkim poremećajima koji ometaju cirkulaciju u
sinusoidima - najĉešće kao posledica difuzne fibroze jetre, hroniĉnog hepatitisa, lipidoze,
tromboze vena unutar jetre, zastoja ţuĉi, neoplazmi, itd. Hipoalbuminemija u prvom redu nastaje

61
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

kao posledica insuficijencije jetre. Prehepatiĉka portna hipertenzija je izazvana poremećajima


portnog krvotoka presinusoida i moţe da nastane usled kompresije ili tromboze portne vene i
njenih ogranaka i usled arterijsko-venskih malformacija. Posthepatiĉka portna hipertenzija
nastaje kao posledica poremećaja u predelu vene hepatike, kaudalne šuplje vene ili srca. Tako, na
primer, do sekundarnih smetnji u portnoj cirkulaciji moţe da doĊe kod insuficijencije srca, kon-
striktornog perikarditisa, tamponade srca, opstrukcije vene kave kaudalis tumorima ili trombima,
tromboze vene hepatike, itd.
Hepatiĉna encefalopatija nastaje zbog nemogućnosti jetre da preuzme i neutrališe
toksiĉne produkte iz portne krvi. Do ove pojave dolazi kod teških oštećenja jetrinog parenhima
kada hepatociti nisu u stanju da neutrališu preuzete toksine, ili kod porto-kavalnih šantova kada
portna krv sa toksinima apsorbovanim u crevima zaobilazi jetru. Osnovni mehanizam nastanka
ove pojave je vezan za sledeći mehanizam: toksini iz intestinalnog trakta portnim krvotokom
kroz jetru ili zaobilazeći jetru dospevaju u sistemski krvotok. Najvaţniji toksini koji se javljaju
su amonijak i kratkolanĉane masne kiseline.
Najĉešće bolesti pankreasa su: pankreatitis (akutni i hroniĉni), insuficijencija egzokrinog
pankreasa i neoplazme pankresa. Nije dovoljno ispitano gde primarno nastaju patološke promene
na pankreasu tokom zapaljenskog procesa (na endotelu krvnih sudova pankreasa, na acinusnim
ćelijama ili ćelijama izvodnih kanala), ali bez obzira na tok ovog procesa krajnji ishod je autoliza
pankreasa. U kliniĉkoj slici pankreatitisa dominira bol u epigastrijumu, anoreksija, depresija,
povraćanje, hipertermija, eventualno krvav proliv, teška dehidracija, ikterus i šok, dok u
prolongiranim i hroniĉnim upalama nastaju i nervni poremećaji, anemije, steatoreja, mršavost,
promene na koţi i drugo.
U ispitivanju funkcionalnog statusa jetre vrši se odreĊivanje i analiza hepatograma.
Hepatogram se sastoji od nekoliko jetrinih profila, koji zajedno ĉine neki od hepatiĉnih
sindroma: sindrom zapaljenske reakcije, sindrom bilijarne retencije, sindrom insuficijencije
hepatocita i sindrom nekroze hepatocita.
Sindrom zapaljenske reakcije podrazumeva opšte principe za dijagnostiku zapaljenskog
procesa: odreĊivanje leukograma, sedimentacije krvi, gama globulina i dr. Navedeni nalazi su
nespecifiĉni.
Sindrom bilijarne retencije obuhvata odreĊivanje: koncentracije ukupnog i direktnog
bilirubina u krvi, koncentracije urobilinogena u krvi, koncentracije ţuĉnih boja u mokraći i

62
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

fecesu, koncentracije holesterola u krvi, serumska aktivnost AP i GGT i test ekskrecije


bromsulfaleina.
Parametri koji ukazuju na smanjenje pojedinih funkcija jetre (sindrom insuficijencije
jetre) su: koncentracija albumina u krvi, koncentracija amonijaka u krvi, koncentracija
proteinskih faktora koagulacije krvi, protrombinsko vreme, ekskrecija bromsulfaleina,
koncentracija holesterola i ţuĉnih kiselina u krvi.
Parametri koji ukazuju na nekrozu jetrinog parenhima (sindrom nekroze hepatocita)
odgledaju se u aktivnosti sledećih enzima: Alanin aminotransferaza (ALT), Asparat
aminotransferaza (AST), Izocitrat dehidrogenza (ICD), Sorbitol dehidrogenaza (SDH), Ornitin-
karbamil transferaza (OCT), Laktat dehidrogenaza (LDH), Alkalna fosfataza (AP), Holinesteraza
i dr.
Bilirubin se odreĊuje diazo-reagensom, a na osnovu odnosa konjugovanog i
nekonjugovanog bilirubina razlikujemo tri osnovna tipa ikterusa. U hemolitiĉkom ikterusu je
znaĉajan nalaz povećanje koncentracije nekonjugovanog bilirubina. Kod hepatocelularnog
ikterusa postoji znaĉajno povećanje koncentracije konjugovanog (preko 50%) i nekonjugovanog
bilirubina. Kod posthepatiĉnog opstruktivnog ikterusa znaĉajno je povećana koncentracija
konjugovanog bilirubina (do 90%). OdreĊivanje urobilinogena je znaĉajno za dodatnu
dijagnostiku ikterusa, tako da je urobilinogen uvek prisutan kada su ţuĉni putevi prohodni, dok
kod posthepatiĉnog opstruktivnog ikterusa njegovo prisustvo izostaje. Sterkobilinogen i
sterkobilin izmeta daju uvek pozitivnu reakciju kod zdravih jedinki.
Amonijak se odreĊuje posle izolacije putem jonoizmenjivaĉkih smola. OdreĊivanje se
vrši enzimski preko NADH ili u reakciji sa natrijum hipohloritom i fenolom. Koncentracija
amonijaka je povišena u bolestima jetre, posebno u dekompenzovanim stanjima. Za ispitivanje
sposobnosti jetre da detoksikuje organizma od amonijaka izvodi se test opterećenja amonijakom
na sledeći naĉin: per oralno se aplikuje amonijum hlorid - 100 mg/kg telesne mase, a 30 minuta
kasnije se ispituje koncentracija amonijaka u krvi. Normalna koncentracija amonijaka kod pasa i
maĉaka iznosi 35-70 mmol/L, dok je kod konja ona 0-40 mmol/L. Nakon peroralne primene
amonijum hlorida, koncentracija amonijaka u krvi se kod zdravih pasa ne podiţe iznad 117
mmol/L.
Biosintetska funkcija jetre se odreĊuje merenjem koncentracije albumina i
imunoglobulina, uz odreĊivanje faktora koagulacije, ali i drugih proteina (npr. proteina akutne

63
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

faze). Porast Ig ukazuje na hroniĉne procese u jetri (poliklonska gamopatija), što se na


elektroforetskoj traci oĉitava kao beta-gama fuzija (jer se frakcije beta i gama spajaju).
OdreĊivanje holesterola moţe imati dijagnostiĉki znaĉaj jer povećanje holesterola
ukazuje na opstruktivni ikterus, dok se kod teških oštećenja jetre javlja smanjena koncetracija
holesterola.
Ţuĉne kiseline u krvi se mere u ĉetiri faze: za vreme gladovanja, 2 h posle obroka, posle
peroralnog unošenja soli ţuĉnih kiselina i kao brzina izluĉivanja intravenski unetih soli ţuĉnih
kiselina obeleţenih radioaktivnim izotopima.
Test ekskrecije bromsulfaleina (BSP) je specifiĉan test ekskrecione sposobnosti jetre.
Naĉin izvoĊenja testa: Intravenski se ubrizga 0,1 ml/kg telesne mase bromsulfaleina i nakon 30
minuta ispituje se koncentracija boje koja se zadrţala u krvi. U normalnim okolnostima za 30
minuta izluĉuje se više od 95% bromsulfaleina.
Enzimi se odreĊuju enzimatskim kolorimetrijskim i drugim metodama. Kretanje
koncentracije ALT nema prognostiĉki znaĉaj jer nije u korelaciji sa stepenom oštećenja jetre.
Poluvreme ALTa iznosi 1-2 dana, a moguće je da njegova koncentracija raste i prilikom aktivne
regeneracije jetre. Uzrok ove pojave je ĉinjenica da je ALT enzim citosola. AST je
mitohondijalni enzim, pa njegovo prisustvo govori o nekrozi hepatocita. Ipak, AST nije dovoljno
specifiĉan za hepatiĉna oboljenja, jer moţe biti povišen i prilikom muskularnih bolesti, hemolize
i dr. Serumska alkalna fosfataza (AP) predstavlja grupu više izoenzima koji potiĉu iz razliĉitih
tkiva i organa. Kod maĉaka se u jetri nalazi znatno manje AP, pa njen porast najĉešće ukazuje na
bubreţne bolesti. Porast AP uz jetrene sindrome najĉešće govori o holestazi. Posebno
interesantan enzim je arginaza, s obzirom da se posle uspešne terapije brzo vraća u normalne
granice, pa ima prognostiĉki znaĉaj. Kod kopitara je znaĉajna sorbitol-dehidrogenaza.
Kod pankreasnog profila korisno je odrediti amilazu, lipazu i TLI (eng. Trypsin-Like
Immunoreactivity). Rezultati koncetracije serumske amilaze i lipaze nisu u korelaciji sa teţinom
pankreatitisa. Amilaza i lipaza nisu potpuno specifiĉni za pankreas. Bubreţna funkcija utiĉe na
amilazu i lipazu, dok steroidi mogu da povise koncentraciju ovog enzima. Amilaza i lipaza nisu
znaĉajne za dijagnostikovanje pankreatitisa kod maĉaka.
Interesantno je ispitivanje funkcije pankreasa prilikom dislokacije sirišta mleĉnih krava,
kada su vidljivi sledeći rezultati: hiperglikemija (kod jake dislokacije i preko 10 mmol/l,
odrţavanje hiperglikemije posle hirurškog tretmana je loš prognostiĉki znak, smanjena

64
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

tolerancija na glukozu, hiperlipidemija, ketonemija, povećana aktivnost jetrinih enzima,


hemokoncentracija, leukocitoza sa neutrofilijom, hipokalemija, hipohloremija, hiponatremija,
hipokalcemija i hipofosfatemija (ĉesto kod krava u postpartalnom periodu pojava ovog nalaza
predisponira krave ka nastanku dislokacije zbog atonije).
TLI (Trypsin-Like Immunoreactivity) odreĊuje se specifiĉnim imunoesejom seruma u
cilju dijagnostike insuficijencije egzokrinog pankreasa. Ovim testom se primarno meri
pepsinogen, inaktivnog prekursora tripsina u serumu. TLI testom se dokazuje oslobaĊanje
tripsinogena iz pankreasa. Kod pankreatitisa TLI test će dati povišene vrednosti (ali i kod jake
insuficijencije bubrega), dok će vrednosti biti sniţene kod insuficijencije pankreasa. Normlne
vrednosti TLI su: 5,7-45,2 μg/L kod pasa, 12-82 μg/L kod maĉaka, ali rezultati variraju u odnosu
na razliĉite laboratorije.

65
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

3.8 PATOFIZIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA POREMEĆAJA RESPIRATORNOG SISTEMA

Primarna uloga respiratornog sistema ogleda se u razmeni gasova. Ovaj proces je


difinisan alveolarnom ventilacijom (ubacivanjem i izbacivanjem vazduha iz pluća), perfuzijom
(cirkulacijom krvi kroz mali krvotok) i difuzijom pluća (razmenom O2 i CO2 preko alveolarnog
zida). Poremećaji respiratornih organa na osnovu navedenog dele na : poremećaje ventilacije
(opstruktivne i restriktivne bolesti), poremećaje difuzije (promene vezane za alveo-kapilarnu
membranu: zadebljanje membrane, smanjenje difuzijske površine zbog smanjenja alveolarnih
prostora ili površine kapilara) i poremećaje perfuzije (vezani za pojavu plućnog edema, plućne
hipertenzije, plućne embolije, infarkta pluća i hroniĉnog plućnog srca). Opstruktivne bolesti (ili
bolesti disajnih puteva) se karakterišu povećanim otporom prema protoku vazduha zbog
parcijalne ili potpune opstrukcije na bilo kom nivou respiratornog sistema. Restriktivne bolesti se
karakterišu smanjenim širenjem plućnog parenhima i smanjenjem ukupnog plućnog kapaciteta.
U okviru procene funkcionalnog statusa respiratornog sistema najpre se primeti dinamika
i karakteristike respiracije. Produţena inspiratorna faza disanja ukazuje na lezije gornjih
respiratornih puteva, obiĉno laringsa i traheje, restriktivnih bolesti pluća ili lezija koje zauzimaju
pleuralnu šuplinu. Produţena ekspiratorna faza disanja ukazuje na obstruktivne bolesti donjih
disajnih puteva, kao što je hroniĉna opstruktivna bolest pluća. Kašalj je sledeći simptom, koji je
znaĉajan u proceni lokalizacije promena u respiratornim organima. Jak, prodoran i eksplozivan
kašalj u napadima ukazuje na oboljenja prednjih respiratornih organa. Slab kašalj, koji je uĉestao
(kašljucanje) ukazuje na probleme u donjem respiratornom traktu (bronhiole, alveole). Svaki vid
dispnee mora biti detaljno analiziran, jer dispnea moţe biti izazvana brojnim respiratornim, ali i
ekstrarespiratornim uzrocima.
Funkcionalno ispitivnaje pluća obuhvata ispitivanje: pleuralnog izliva, sputuma,
spirometrijska/volumetrijska ispitivanja, gasne analize krvi i pulsnu oksimetriju.
Pleuralni izliv nastaje kao odgovor plućnog tkiva na razliĉite inzulte. Moţe biti u formi
transudata ili eksudata, a za njegovu dijagnostiku se koristi Rivaltina proba. Naĉin izvoĊenja
metode: U cilindar sa 100 ml destilovane vode se dodaju dve tri kapi acidum aceticum glaciale i
dobro promeša. U ovu mešavinu se spusti iz pipete kap teĉnosti, koja se ispituje i prati njeno
ponašanje tokom spuštanja na dno cilindra. Ako se kap koja pada na dno suda zamuti u vidu
dima onda je to eksudat; a ako zamućenja nema to je transudat. Zamućenje izaziva materija koja

66
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

se zove seromucin, koje ima u eksudatu, ali ne i u transudatu. Dešava se da i transudat da


pozitivnu reakciju, tako da je Rivaltina reakcija orijentaciona. Druga metoda za ispitivanje
pleuralnog izliva je aerometrija. Aerometrom se moţe odrediti specifiĉna teţina pleuralnog
izliva, gde teţina od preko 1,015 ukazuje na eksudat. Ovo proba je vrlo znaĉajna, jer kod pojave
eksudata postoji prisustvo inflamacije.
Ispitivanje sputuma podrazumeva ispitivanje na mikroorganizme, neoplastiĉne i druge
ćelije. Kvalitetniji materijal za ispitivanje jeste materija dobijena transtrahealnom aspiracijom
ili bronhoalceolarnom lavaţom. U sadrţaju dobijenom transtrahealnom aspiracijom moţemo
primetiti mukopurulentnu inflamaciju (mukoidni materijal bazofilno obojen ili eozinofilno ako je
zapaljenje jaĉe). Bakterije se mogu videti kao intracelularne, posebno kod degenerisanih
neutrofila. Ako postoji mukopurulentni nalaz obavezno treba staviti u uzorak u transportni
medijum i poslati na analizu patologu. Nepurulentne inflamacije daju visok procenat vidljivih
makrofaga, eozinofila ili obe populacije. Diferencirani makrofagi ukazuju na prolongiranu
inflamaciju, dok eozinofii dominiraju kod parazitskih i alirgijskih procesa. Od ostalih ćelija
primećuju se reaktivne epitelijalne ćelije, posebno kod maĉaka, sa vidljivom bazofilnom
citoplazmom i izraţenim jedrom sa nukleolusima. Ove ćelije razlikovati od malignih ćelija. U
postupku ispitivanju bioptata posmatra se prisustvo malignih ćelija. Ĉesto su vidljive i ćelije
srĉane greške, koje se odlikuju prisustvom velike koliĉine hemosiderina u makrofagima.
Spirometrija je metoda za ispitivanje ventilacije pluća, koja je kljuĉna za normalnu
razmenu gasova. Pneumotahografija je metoda kod koje pacijent (posle postavljanja posebne
maske) diše kroz cev poznatog preĉnika, a aparat meri vreme protoka vazduha i elektriĉnim
putem meri ukupni volumen vazduha koji je udahnut ili izdahnut. Na taj naĉin se dobija krivulja,
koja govori o odnosu protoka i volumena gasova. S obzirom, da se ţivotinja ne moţe naterati da
po ţelji diše forsirano, stimulacija se moţe vršiti fiziĉkim kretanjem (tredmil) ili aplikacijom
lobelina (alkaloida koji stimuliše disanje). Direktnim putem moţe se izmeriti respiratorna
frekvencija, respiratorni volumen, ventilacija (L/min), vrh ekspiratorne i inspiratorne linije (L/s) i
respiratorna rezerva, što se radi u mirovanju i po stimulaciji. Ispitivanja su pokazala da kod
goveda sa sniţenim vrednostima vitalnog kapaciteta i maksimalne ventilacije posle stimulacije
ĉešće nastaju gubici usled respiratornih bolesti.
Za procenu hroniĉne opstruktivne bolesti kod kopitara, koristi se ultrazvučna
spirometrija i volumetrijska kapnografija. Volumetrijski kapnogram je grafik koncentracije

67
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

izdahnutog CO2 merenog u funkciji zapremine izdahnutog vazduha. Grafiĉko predstavljanje se


naziva "dijagram CO2 iz jednog daha" (SBD-CO2 – single-breath diagram for CO2). Ova metoda
je ekonomiĉna i neinvazivna.
Gasne analize krvi su ispitivanja arterijske i venske krvi. One se rade odmah nakon
uzimanja krvi, a uzorak ne sme da bude u kontaktu sa vazduhom. Nakon dobijenih vrednosti
analize dobijeni rezultat parcijalnog pritiska kiseonika i CO2 se mnoţi sa odreĊenim korektivnim
faktorima, koji zavise od vremena, koje je prošlo od momenta uzimanja krvi do same analize
krvi. Parcijalni pritisak kiseonika (PO2) odreĊuje se Klarkovim principom, dok se parcijalni
pritisak PCO2 se odreĊuje Severinghausovim principom. Dobijeni rezultati se koriste za analizu
respiratorne insuficijencije pluća. Latentna respiratorna insuficijencija pluća se karakteriše
normalnim PO2 i PCO2 u mirovanju, uz sniţenje i izraţen porast PCO2 u naporu. Manifestnu
respiratornu insuficijenciju karakteriše sniţen PO2 mirovanju, a PCO2 je povišen ili normalan
(kod parcijalne insuficijencije), dok se merenja u naporu ne vrše, zbog toga što mogu naškoditi
pacijentu.
Stanje kardio-respiratorne insuficijencije je posebno zanimljivo kod konja i naziva se
sipnja kod konja. Ova bolest je ĉesto skrivena mana konja i uzrok mnogih sudskih sporova u
kupoprodajnim ugovorima, te je zato i spominjemo u smislu edukacije naših studenata o
metodama procene sipnje kod konja. Sipnja predstavlja oteţano disanje kod konja, koje je
uzrokovano hroniĉnim, neizleĉivim bolestima ili patološkim stanjima u plućima i srcu i oni
smanjuju radnu sposobnost konja u odreĊenoj meri. Naziv sipnja se moţe zameniti rnazivom
dispnoja, što govori o bolesnom stanju i posebnom patološkom entitetu. Po uzroku sipnja moţe
biti: plućna (uzroci – hroniĉni alveolarni emfizem, hroniĉni kataralni bronhitis, hroniĉna
pneumonija, a reĊe i hroniĉni pleuritis i razliĉiti tumori), srĉana (uzroci – hroniĉna hipertrofija i
hroniĉna srĉana dilatacija, insuficijencija zalistaka i stenoza otvora kao i bolesti miokarda) i
mešovita (posledica funkcionalne povezanosti kardio-respiratornog sistema).
Procena na sipnju vrši se njegovom opservacijom: u mirovanju, u pokretu/radu i
odmaranju posle kretanja/rada. Normalna frekvencija disanja je 10-14 udisaja u minutu. Kod
zdravih konja naviknutih na rad ona moţe da bude 40-80 u minutu, ali se tokom odmora od 5
minuta ove vrednosti smanjuju, a za 10-20 minuta vraćaju u fiziološke granice. Kod sipnje konja
frekvenca disanja u mirovanju je oko 30, u radu 80-120/min.,a u fazi odmora tek posle 30-60
minuta se vraća u vrednosti zabeleţene pre poĉetka rada. Znaĉajno je napomenuti i kaudalno

68
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

pomeranje kaudalne granice plućnog perkusionog polja. Zbog toga se primećuje i pomeren ictus
cordis za 1-2 meĊurebarna polja i povećane srĉane mukline. Frekvencija srĉanog rada zdravih
konja je 40-60/min., a pri radu do 100/min. Kod sipnje konja puls je ubrzan i posle umerenog
kretanja iznosi 100-120/min., slabo je punjen, iregularan, uz ĉesto lupanje srca i prvi srĉani ton
ĉesto slabo izraţen. Proba rada se vrši tri puta u razmaku od 1-2 dana. Ţivotinja se izlaţe
fiziĉkom radu i svakih 5 – 30 minuta zaustavljati se fiziĉki rad i meri puls, telesna temperatura i
disanje. Nakon 30 minuta ţivotinja se odmara (ili ranije ukoliko krenu jaki napadi sipnje uz
obilno znojenje i sl., a da bi se spreĉila ruptura pluća ili ugušenja od srĉane slabosti). Za vreme
odmora se uzimaju navedena tri nalaza (puls, temperatura, disanje, tj. trijas) i to 10., 20., 30.
minuta, ali moţe i duţe ukoliko postoji potreba.

69
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

3.9 PATOFIZIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA POREMEĆAJA


URINARNOG SISTEMA

Urinarni sistem ima brojne funkcije u organizmu jer uĉestvuju u regulisanju metabolizma
vode i jona i ima endokrinu ulogu. Svi poremećaji funkcije urinarnog sistema mogu biti
uzrokovani prerenalnim (hipovolemija i/ili hipotenzija mogu da smanje protok krvi kroz bubrege
i izazovu poremećaj funkcije bubrega), renalnim (glomerulske: nefritiĉne (primarno
zapaljenjske) i nefrotiĉne (primarno degenerativne), neglomerulske: vaskularne, tubularne i
intersticijalne) i postrenalnim uzrocima (koji izazivaju opstrukciju bubreţnih puteva).
Svetska zdravstvena organizacija je dala klasifikaciju bubreţnih bolesti, koja je
napravljena po etiopatogenezi i moţe se primenutu u veterinarskoj medicini. Tako se bubreţne
bolesti dele na: akutni nefritisni sindrom, nefrotski sindrom, asimptomatska urinarna
abnormalnost (grupa 2 i 3 – kao posledica hroniĉnog glomerularnog nefritisa), akutna bubreţna
insuficijencija, hroniĉna bubreţna insuficijencija, infekcija urinarnog trakta, opstruktivna bolest
urinarnog trakta, funkcijski defekti bubreţnih tubula, hipertenzivna nefropatija i nefrolitijaza i
nefrokalcinoza.
Osnovni simptomi poremećaja urinarnih organa su: 1) prisustvo oligurije, poliurije ili
anurije, 2) nespecifiĉni simptomi (depresija, letargija, inapetenca, groznica, povraćanje...), 3)
karakteristiĉni nalaz urina (proteinurija, hematurija, glukozurija, kristalurija...) i 4)
karakteristiĉan nalaz u krvi (azotemija, uremija, dislipidemija, anemija i drugo).
Patofiziološka procena funkcionalnog statusa urinarnog sistema se vrši pomoću sledećih
procedura.
1) Uzimanje i pregled mokraće
– Fiziĉki pregled
– Hemijski pregled
2) Laboratorijski ispitivanje proteinurije
– Kvalitativno i kvantitativno odreĊivanje belanĉevina u mokraći
– Diferenciranje tipa proteinurije
– OdreĊivanje selektivnosti proteinurije.
3) Pregled sedimenta mokraće
– Cilindri

70
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

– Er/Le/Epitelne ćelije
– Broj ćelija.
4) Metode za procenu globalne funkcije oba bubrega
– OdreĊivanje koncentracije uree u serumu
– OdreĊivanje koncentracije kreatinina u serumu i mokraći
– OdreĊivanje konc. mokraćne kiseline u serumu i mokraći.
5) Testovi za procenu pojedinih funkcija oba bubrega
– Diluciona proba po Volhardu
– Koncentraciona proba po Fischbergu
– OdreĊivanje osmotske koncentracije plazme i mokraće.
6) Određivanje ukupnih bubreţnih klirensa (kvantitativni pokazatelji ukupne
bubreţne funkcije)
– Opšti principi merenja bubreţnih klirensa
– Klirens endogenog kreatinina
– Klirens ureje
– OdreĊivanje klirensa bubrega radioizotopskom metodom
– Izraĉunavanje frakcije filtracije i tumaĉenje rezultata klirensa.

Koliĉina mokraće (diureza) zavisi od oĉuvane funkcije bubrega, hrane i vode koja se
unosi tokom dana. Na koliĉinu mokraće utiĉu resorpcija razliĉitih edema, dijabetes, poremećaji
vezani ADH i Na, kao i vazopresin.
Boja i prozirnost mokraće se posmatra na beloj pozadini. Mokraća kod konja je ţuta ili
ţuto-zelena boja; kod psa svetlo-ţuta do ćilibarno ţuta; kod goveda slamno-ţuta (svetlo do
tamno). Veoma tamna boja mokraće se javlja kod paralitiĉke mioglobinurije, dok se izrazito
svetla boja javlja kod šećerne bolesti. Mokraća je tamnija kod dehidratacije i febrilnih stanja.
Razliĉite nijanse ţute i crvene moguće su kod babezioze. Mrko-crvena boja javlja se kod davanja
fenotiazina, ali i kod ţivotinja sa porfirinurijom. Kod ekvida mokraća je neposredno po
izluĉivanju mutna, a nakon duţeg stajanja se obrazuje talog. Kod ostalih ţivotinjskih vrsta,
mokraća je bistra, a posle duţeg stajanja se stvara neznatan talog. Zamućenost mokraće zavisi
od sadrţaja soli, prisustva epitelnih ćelija, masti ili mikroorganizama.

71
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

Miris mokraće je dosta specifiĉan za pojedine ţivotinjske vrste i njegov intenzitet zavisi
od koncentrovanosti mokraće. Na miris mokraće utiĉu i razliĉita patološka stanja. Tako npr.
acetonemija kod krava, koja dovodi do acetonurije daje specifiĉan miris mokraće na aceton, koji
moţe biti toliko jak da cela štala miriše aceton.
Specifiĉna teţina mokraće se odreĊuje urometrom koji je baţdaren izmeĊu 1,000 i 1,060.
Ona je u obrnutoj srazmeri sa koliĉinom izluĉene mokraće. U šećernoj bolesti, se uz povećanu
diurezu povećava i specifiĉna teţina mokraće (prelivna glukozurija).
pH vrednost mokraće je kisela kod mesojeda i bazna kod biljojeda. Bazna mokraća kod
mesojeda ukazuje na nekrotiĉne procese u bubregu ili na zapaljenje mokraćne bešike. Kisela
mokraća kod biljojeda se javlja tokom gladovanja, enteritisa, pneumonije i dugotrajnih proliva.
Hrana bogata azotom zakišeljava mokraću biljojeda. OdreĊivanje pH se vrši pH-metrom ili test-
trakama.
Hemijsko ispitivanje pomoću test traka se vrši po sledećoj proceduri – Test traka se uroni
u sveţ urin i drţi najviše 1 sekund. Nakon 30-60 sekundi se uporeĊuje boja na trakici sa bojom
na standardnoj skali. Nakon dva minuta stajanja rezultati su nevalidni. Test trakama se odreĊuje
više parametara, kao što su: Glukoza- normalno nalaz je negativan, a pozitivan je kod prelivne
glukozurije i diabetesa; Bilirubin- normalno nalaz je negativan, a pozitivan nalaz se dobija u
sklopu ikterusa; Ketoni- prisutni prilikom metaboliĉki neregulisane šećerne bolesti; Krv- test
trakice tolerišu odreĊeni broj eritrocita, tj. odreĊenu koncentraciju hemoglobina (reakcija je
vezana za Hb), a reakcija je pozitivna kod hematurije; Belanĉevine- normalan nalaz je negativan,
a test traka toleriše odreĊenu koncentraciju proteina; Urobilinogen- normalan nalaz je lako
pozitivan, a ne moţe se koristiti za dijagnostiku opstruktivne ţutice; Nitriti- normalan nalaz ovog
pregleda je negativan, dok pozitivan nalaz ukazuje na bakterijsku uroinfekciju (kod biljojeda se
moţe dobiti laţno pozitivan nalaz zbog sadrţaja nitro jedinjenja u biljkama); Leukociti- nalaz
ukazuje da u mokraći ima manje od 10x10^6/L, a leukociturija ukazuje na zapaljenje.
Za dijagnostiku ketoze krava posebno je znaĉajno odreĊivanje ketonskih tela u mokraći
krava. Za dijagnostiku se koristi acetat-test po Lestradetu (Rothera test), koji se zasniva na
promeni boje natrijum-nitro prusida promeni u prahu od ruţiĉaste (+) do tamnoljubiĉaste (++++)
ukoliko postoje ketonska tela. Ipak, za preciznu dijagnozu je potrebno odrediti koncentraciju
ketona u mmol/l (spektrofotometrijski, kolorimetrijski), a rezultati se tumaĉe na sledeći naĉin:
0,5-2,5 mmol/l normalno, 2,5-13 subkliniĉka ketoza i 13-600 kliniĉka ketoza.

72
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

Proteini u mokraći se odreĊuju kvalitativnom ili kvantitativnom metodom. Od


kvalitativnih metoda koristi se reakcija sa sulfasalicilnom kiselinom. Naĉin izvoĊenja testa: Kap
sulfasalicilne kiseline se kapne u epruvetu sa mokraćom i posmatra zamućenje. Zamućenje se
posmatra prema crnoj podlozi i moţemo dobiti sledeće nalaze: negativan (bistar), belanĉevine u
tragu (+, jedva primetno zamućenje), jasno pozitivna (++, vidljivo zamućenje), jako pozitivna
(+++, stvaranje sitnih pahuljica), i sirast talog ++++ (taloţenje na dnu epruvete).
U mokraći se ĉesto kod obolelih od multiplog mijeloma nalaze Benc-Dţonsovi proteini,
laki lanci imunoglobulina. Znaĉajna karakteristika ovih proteina je da se taloţe na temperaturi
izmeĊu 45 i 55°C, a rastvaraju se na višim temperaturama, što koristi za dokazivanje njihovog
prusustva.
Kvantitativno odreĊivanje proteina moţe se vršiti putem taloţenja u Esbahovom
albuminometru ili biuretskom reakcijom. Pri tome je vaţno izvršiti razdvajanje frakcija proteina
ili dokazivanje prisustva pojedinih frakcija imunoenzimskim i drugim preciznim metodama. Pri
pojava proteina u mokraći potrebno je izvršiti dodatna ispitivanja i posebo obratiti paţnju na
donje urinarne puteve, iz kojih se eksudacijom tokom upale izdvajaju proteini. Konaĉna
dijagnoza se postavlja ispitivanjem tipova proteina, te se tokom oštećenja glomerula javlja puno
albumina i visokomolekulskih proteina u mokraći (transferin, IG, komplement), a tokom
oštećenja tubula albumini sa niskomolekulskim proteinima, a moguća je i pojava prelivne
proteinurije.
Pregled sedimenta mokraće se izvodi sledećom procedurom – Mokraća se centrifugirati
5-10 min na 1500-2000 obrtaja/min. Nakon toga se mokraća odlije a 1-2 kapi se stave na
predmetnicu, pokriju ljuspicom i posmatraju pod mikroskopom na uveliĉanju 100-400x. Pojavi
sedimenta pogoduje nizak pH, proteinurija, usporeno oticanje filtrata, prisustvo mukoidin-
sumporne kiseline. Mikroskopskim nalazom sedimenta moţemo videti: leukocite, eritrocite,
cilindre i kristale, itd.
Leukociti – Najĉešće vidimo 4-8 u vidnom polju. Povećan broj ukazuje na infekciju ili
hemijsku leziju urinarnog trakta.
Eritrociti – Normalno se vidi 1-3 eritrocita u vidnom polju. Povećan broj eritrocita se
javlja kod hematurije, koja se moţe videti golim okom (prisutna promena boje -
makrohematurija) ili mikroskopom (mikrohematurija). Eritrociti mogu biti sveţi (oĉuvan oblik i
oštre ivice, ţućkasto-crveni) ili disformiĉni vidljivi kao blede senke i nepravilnog izgleda.

73
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

Hematurija moţe biti prerenalna, renalna i postrenalna. Eritrociti u mokraći mogu da potiĉu i iz
genitalnih organa ţenke, posebno kod kuja tokom ciklusa, što moţe dati laţno pozitivan rezultat.
Kod hemoglobinurije je koncentracija hemoglobina povišena, a broj eritrocita nije, dok kod
mioglobinurije (koja je ĉesta kod kraš i blast sindroma, prazniĉne bolesti konja i drugo) javlja
bistru mokraću uz porast koncentracije kreatinfosfokinaze.
Cilindri, ćelije, neorganski sediment – To su istaloţene proteine u obliku distalnih
bubreţnih kanalića. Razlikujemo više vrsta cilindara: eritroidni – ruţiĉaste boje, ĉesto kod
glomerulonefritisa; leukocitni – tipiĉno kod pijelonefritisa, ali i kod nekih vrsta
glomerulonefritisa, mogu biti pojedinaĉni leukociti ili masa; epitelni – pri teţem oštećenju
tubula, akutna zapaljenja bubrega; granulirani – kod izrazite tubulske lezije bubrega; hijalini –
homogeni svetli cilindri, koji prate proteinuriju, ali ne ukazuju uvek na odreĊeni tip oštećenja
bubrega; široki – stvaraju se u sabirnom kanaliću bubrega, prilikom bubreţne insuficijencije;
masni – cilindri sa masnim kapljicama na površini (dţinovske epiteloidne ćelije bogate
mastima); voštani cilindri – nastaju zbog dugog boravka u lumenu tubula i izrazito smanjenog
protoka urina u tubulima, u sklopu glomerularnih oboljenja. Cilindroidi nisu pravi cilindri, već se
radi o grupisanju pojedinih elemenata, kristala, belanĉevina bakterijskih ćelija i dr. OdreĊen broj
epitelnih ćelija se normalno nalazi u mokraći i potiĉe iz bilo kog tela urinarnog trakta. Za
detekciju je najvaţnije uoĉiti epitelne ćelije, koje potiĉu iz tubulskog epitela, jer one ukazuju na
zapaljenske procese i bubreţnu insuficijenciju. Te ćelije su veće od leukocita, sa okruglim
jedrom i ĉesto jasno vidljivim nukleolusom. Pojava repastih epitelnih ćelija mogu biti znak
dublje nekroze epitela urinarnog trakta, a izbledele i isprane ćelije, najĉešće ukazuju na nefritis.
Sveţi eritrociti ukazuju na zapaljenje kontaćne bešike (cistitis), a smeţurane ćelije se nalaze u
hiperosmolarnoj mokraći.
Razne materije u amorfnom ili kristalnom obliku. U baznoj mokraći se ĉesto vide kristali
fosfatnog porekla, dok se kristali mokraćne kiseline i uratni kristali vide u kiseloj mokraći. Neki
lekovi (sulfonamidi) se izluĉuju putem kristala i mogu biti razliĉitog su oblika.
Pri detekciji eritrocita, leukocita i drugih celularnih elemenata u sedimentu mokraće,
zbog taĉnosti je potrebno izbrojati ih u komorici za krv, u poznatoj zapremini. Proteinurija sa
velikim brojem izbrojanih eritrocita ukazuje da je hematurija bubreţnog porekla. Pojava
eritrociturije, proteinurije i eritrocitnih cilindara u mokraći dokazuje da je hematurija

74
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

najverovatnije posledica glomerulske bolesti bubrega. Leukociturija sa pojavom leukocitnih


cilindara ukazuje na bakterijsku infekciju bubrega, odnosno mokraćnih puteva.
OdreĊivanje ureje, kreatinina i mokraćne kiseline su klasiĉne biohemijske metode i
opisane su u poglavlju 3. Povećana koncentracija ureje dovodi do uremije, koja moţe biti
bubreţna i vanbubreţna. Bubreţna je vezana za smanjenu funkcionalnu sposobnost bubrega, a
vanbubreţna nastaje pojavom hipovolemije, dehidratacije, obilnih krvarenja u
gastrointestinalnom traktu, bolestima jetre i dr. Znatno smanjeno luĉenje kreatinina ukazuje na
razvoj bubreţne insuficijencije. Luĉenje kreatinina zavisi od mišićne mase tela, a kreatinin se ne
reapsorbuje ni u jednom nefrotskom segmentu. Povišenje koncentracije mokraćne kiseline u
serumu nastaje kod akutne ili hroniĉne bubreţne insuficijencije, u sklopu opšte retencije azotnih
materija u krvi i kod ekstrarenalne azotemije. Porast koncentracije mokraćne kiseline u serumu je
hiperurikemija i moţe biti primarna (giht) i sekundarna. Primarna hiperurikemija je vezana za
enzimsku disregulaciju metabolizma mokraćne kiseline, a sekundarna za razliĉite proliferativne
bolesti, leukemije i policitemiju veru, citotstatsku terapiju malignih bolesti i u svim bolestima
gde se javlja povećan katabolizam sopstvenih proteina.
Ispitivanje dilucione sposobnosti bubrega – Naĉin izvoĊenja metode: Izvrši se
opterećenje vodom i uzima se mokraću na svakih 15-30 minuta i meri njena specifiĉna teţina. U
toku dva ĉasa zdravi bubrezi izluĉe polovinu unete teĉnosti. Ukoliko specifiĉna teţina nije na
donjoj fiziološkoj granici ili ispod nje, a ne izluĉi se kompletna koliĉina vode u periodu od
nekoliko ĉasova, smatra se da postoji problem sa dilucionom sposobnošću bubrega. Proba
dilucije ukazuje na funkciju glomerula, tj. njihovu moć filtracije i na nju utiĉu mnogi
vanbubreţni faktori (aldosteron, ADH i srĉana pumpa). Ovu metodu ne treba primenjivati kod
pacijenata sa edemima, a kod pacijenata sa izraţenom dehidratacijom ne dobijamo pouzdane
rezultate. Ovaj test je manje specifiĉan od testa koncentracione sposobnosti bubrega.
Ispitivanje koncentracione sposobnosti bubrega – Naĉin izvoĊenja metode: Ovaj test vrši
se posle uskraćivanja vode (u periodu od 12 ĉasova) ili nakon aplikacije antidiureznog hormona.
Nakon 1 i 2 sata uzima se uzorak mokraće i meri specifiĉna teţina koja treba da bude blizu
gornje fiziološke granice ili preko nje. Pad koncentracione sposobnosti se javlja kod hroniĉnog
pijelonefritisa, hroniĉne opstruktivne uropatije i uznapredovale bubreţne insuficijencije.
Osmometrija mokraće – Koncentraciona sposobnost bubrega se najpeciznije odreĊuje
uporeĊivanjem osmolarnosti urina i seruma. Osnova osmometrije je u 4 koligativne osobine

75
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

rastvora i to su: smanjivanje taĉke mrţnjenja i isparavanja i povišenje taĉke kljuĉanja i


osmotskog pritiska. Za ovu metodu koristi se konduktometar.
OdreĊivanje bubreţnih klirensa – Bubreţni klirens je deo volumena plazme koji se moţe
indirektno izmeriti i koji se zahvaljujući radu bubrega u jedinici vremena oslobodi neke materije
tako što je bubreg iz krvi prenese u stvorenu mokraću. Klirens je odnos koliĉine klirensne
supstance klirensa izluĉene mokraćom u jedinici vremena i koncentracije te supstance u plazmi.
Klirensi materija prirodno prisutnih u plazmi nazivaju se klirensi endogenih supstanci (urea,
kreatinin, vodonikovi joni), dok su klirensi egzogenih materija klirens para-aminohipurne
kiseline (PAH), insulina, radioaktivni Cr-EDTA. Klirensi inulina, Cr-EDTA i kreatinina ukazuju
na jaĉinu glomerulske filtracije (JGF) – jer se ove materije izluĉuju samo putem glomerulske
filtracije. PAH i J-hipuran se izluĉuju putem JGF i tubulske sekrecije, govore o efektivnom
bubreţnom protoku plazme (EBPP). Frakcijska filtracija (FF) predstavlja odnos izmeĊu JGF i
EBPP i daje uvid u stanje glomerulsko-tubulske ravnoteţe u bubregu.
Za odreĊivanje klirensa endogenog kreatinina uzima se 24-ĉasovna diureza. Klirens
kreatinina se preraĉunava u odnosu na površinu tela pacijenta. Kod odreĊivanja klirensa ureje
treba isprazniti mokraćnu bešiku, dati pacijentu odreĊenu koliĉinu vode i u narednih sat vremena
izmeriti klirens ureje. Klirens ureje je znatno osetljiviji na protok krvi kroz bubreg i znatno je
promenljiviji.
PoreĊenjem parametara, posebno osmolarnosti mokraće i seruma, koncentracije Na
mokraće i seruma, odnosa BUN/kreatinin u plazmi, JGF i FF vrši se lokalizacija urinarnog
poremećaja (prerenalna, renalna i postrenalna), uzroci akutne bubreţne insuficijencije
(insuficijencija bez nekroze, insuficijencija sa nekrozom kore i insuficijencija sa nekrozom srţi
bubrega) i faze hroniĉne bubreţne insuficijencije (hipofunkcija, kompenzacija, dekompenzacija i
uremija).

76
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

3.10 PATOFIZIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA POREMEĆAJA METABOLIZMA TEĈNOSTI,


ACIDO-BAZNOG STATUSA I JONA

Postoje ĉetiri osnovne osobine telesnih teĉnosti a to su: izovolemija (odrţavanje stalne
zapremine i odnosa telesnih teĉnosti), izotonija (odrţavanja stalnog osmotskog pritiska – koji se
javlja izmeĊu dva rastvora razliĉite koncentracije jona.), izojonija (odrţavanjue stalnog
kvalitativnog i kvantitativnog sastava i meĊusobnog odnosa jona) i izohidrija (odrţavanje stalne
koncentracije vodonikovih jona, tj. acido-bazne ravnoteţe telesnih teĉnosti).
Poremećaj prometa telesnih teĉnosti se javlja u vidu: promene volumena telesnih teĉnosti
(dehidratacija i hiperhidratacija), promene osmolarnosti (hiperosmolarnost/hipertonija ili
hipoosmolarnost/hipotonija), promene koncentracije pojedinih jona (u smislu hiper ili hipo
izmena) i promene acidobazne ravnoteţe (acidoza i alkaloza).
Primarni poremećaj telesnih teĉnosti, jona i acidobazne ravnoteţe je redak sluĉaj, te se
dijagnostiĉki postupci vezani za ovaj sistem, najĉešće izvode kao dopunski, uz obaveznu analizu
svih mogućih faktora koji mogu da dovedu poremećaja ovog sistema. Neophodno je poznavati
osnovne uzroke, koji dovode do poremećaja metabolizma teĉnosti, acidobazne ravnoteţe i jona.
Uzroci dehidratacije su: smanjen unos vode, povećano odavanje vode (dijareja,
povraćanje, znojenje, eksudacija, poliuriĉna faza bubreţne insuficijencije, u dijabetes melitusu i
insupidus).
Uzroci hiperhidratacije su: povećan unos vode i/ili soli, infuzije natrijuma ili bikarbonata,
hiperadrenokorticizam, oliguriĉna faza bubreţne insuficijencije, primarni aldosteronizam i
dekompenzovana srĉana slabost.
Uzroci respiratorne acidoze su: opstrukcija vazdušnih puteva, depresija respiratornog
centra (nervne bolesti, lekovi, toksemije), kardiopulmonarni arest, neuromuskularne bolesti
(botulizam, miastenija gravis, polimiozitis, hipokalemijska miopatija maĉaka), restriktivne
bolesti (diafragmatska hernija, pneumotoraks, piotoraks, hemotoraks i fibroza pluća), plućne
bolesti (respiratorni distres sindrom, pneumonija, plućni edem, COPD i fibroza pluća).
Uzroci metaboliĉke acidoze su: diabetiĉna ketoacidoza, uremiĉna acidoza, laktiĉna
acidoza, hipoadrenokorticizam, dijareja i renalna tubularna acidoza.

77
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

Uzroci respiratorne alkaloze su: levo-desni šant, kongenitivne srĉane bolesti, plućne
bolesti, neke vrste anemija, nervne bolesti, hepatiĉne bolesti, bol, groznica i hipertireoidizam,
mehaniĉka ventilacija.
Uzroci metaboliĉke alkaloze su: povraćanje, diuretska terapija, oralna primena organskih
anjona, hiperadrenokorticizam i primarni hiperaldosteronizam.
Uzroci hiperkalemije su: pseudohiperkalemija (trombocitoza, povećan broj leukocita,
hemoliza), smanjenja urinarna ekskrecija kalijuma (uretralna obstrukcija, ruptura uretera,
anurijsko ili oligurijsko oštećenje bubrega, hipoadrenokorticizam) i povećan unos kalijuma.
Uzroci hipokalemije su: povraćanje, dijareja, hroniĉne bubreţne bolesti, opstruktivna
diureza, diureza u ketoacidozi i aplikacija furosemida.
Uzroci hipernatremije su: gubitak vode bez gubitka soli ili gubitak hipotoniĉne teĉnosti
(povraćanje, dijareja, opstrukcija tankih creva, pankreatitis, peritonitis, osmotska dijareja u
diabetesu) i povećan unos soli.
Uzroci hiponatremije: poremećaji sa normalnom osmolarnošću (hiperlipidemija, izraţena
hiperproteinemija), poremećaji sa povišenom osmolarnošću (hiperglikemija) i poremećaji sa
smanjenom osmolarnošću (hiperhidratacija, bolesti jetre sa ascitesom, kongestivne srĉane
bolesti, nefrotski sindrom, uznapredovale renalne bolesti, proliv, dijareja, gubici preko koţe,
peritonemua, psihogena polidipsija, sindrom nedovoljnog luĉenja ADH i miksedemska koma u
hipotireoidizmu).
Uzroci hiperkalcemije: višak PTH, vitamina D3 i veliki unos Ca putem hrane.
Uzroci hipokalcemije: malapsorpcija promene u luĉenju i delovanju PTH i promene u
metabolizmu vitamina D3.
Uzroci hiperhloremije: jak selektivni gubitak natrijuma, primena hlorida, renalna
retencija hlorida, hiperhloremijska metaboliĉka acidoza usled dijareje i gubitka bikarbonata.
Pojava perzistentne hiperhloremije indikuje pregled na Na, K i gasne analize krvi.
Uzroci hipohloremije: su sliĉni kao u hiponatremiji, a najĉešće hroniĉmo povraćanje i
agresivna terapija tiazidina. Perzistentna hipohloremija zahteva dalja ispitivanja.
Dijagnostiĉki postupak poremećaja metabolizma teĉnosti je ispitivanje promena u
ekstracelularnoj teĉnosti (ispitivanje volumena i osmolarnosti), promena u intracelularnoj
teĉnosti, izojonije i izohidrije.

78
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

Promene volumena ekstracelularne teĉnosti ispituju se analizom koncentracije ukupnih


proteina i brojanjem eritrocita. Dehidratacija dovodi do porasta koncentracije proteina i
povećanja broja eritrocita po mililitru krvi. Ove pojave se mogu otkriti i manje pouzdanom
metodom ispitivanja hematokrita. U istraţivaĉke svrhe koristi se odreĊivanje volumena teĉnosti
dilucionom radioizotopskom tehnikom.
Promene osmolarnosti se odreĊuju u odnosu na promenu koncentracije natrijuma u
serumu, a merenje osmolarnosti moţe se vršiti i direktno osmometrom. Hipernatremija znaĉi i
hiperosmolarnost, osim u sluĉaju hiperlipidemije ili hiperproteinemije (kada lipidi i proteini
zauzimaju odreĊenu zapreminu u teĉnosti i ne sadrţe Na) ili u sluĉaju dijabetesa kada teĉnost
izlazi ekstracelularno, ĉime razblaţuje natrijum, te je osmolarnost povećana zbog glukoze.
Promene u intracelularnoj teĉnosti se ispituju na osnovu promena srednjeg volumena
eritrocita i srednje koncentracije hemoglobina u eritrocitima. Diferencijalno dijagnostiĉki
postupak dat je u tabeli 7 .

Tabela 7: Diferencijalna dijagnoza dehidratacije i hiperhidratacije pomoću parametara krvne


slike, proteinemije i koncentracije Na

Dehidratacija Hiperhidratacija
Hipoton. Izoton. Hiperton. Hipoton. Izoton. Hiperton.
HT +++ + + + -- ---
MCHC -- 0 + + 0 --
MCV + 0 -- + 0 --
Na -- 0 + - 0 +
PROT + + + -- -- --

Kod toplotnog stresa mleĉnih krava koncentracija proteina, broj eritrocita i eritrocitni
indeksi mogu dati nejasnu sliku, jer dominira smanjen unos hrane i povišen unos teĉnosti, pa
treba dati adekvatno tumaĉenje dehidratacije.
Ispitivanje izojonije podrazumeva biohemijsko odreĊivanje koncentracije Na, K, Ca, Mg,
H i OH. Za odreĊivanje jona se koriste klasiĉne titrimetrijske metode ili klasiĉnim komercijalnim
kitovi u plamenom fotometru, odnosno selektivne elektroda koje su prilagoĊene za odreĊene
vrste jona. Sa kliniĉkog aspekta treba posmatrati odnos (K, Na i OH) / (Ca, Mg i H). Kada
koncentracija jona iz brojioca raste ili koncentracija jona iz imenioca opada nastaju grĉevi

79
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

skeletne muskulature i poremećaji u radu srca, dok obrnuti proces smanjuje tonus muskulature i
srĉani rad.
Za procenu stanja izojonije treba posmatrati pH seruma, koncentraciju bikarbonata,
parcijalni pritisak kiseonika i ugljenik-4-oksida kao i odnos Na-bikarbonata i ugljene kiseline
koji bi trebao da je 20:1 (Henderson-Haselbahova jednaĉina). U tabeli 8 su prikazani parametri
vezani za poremećaj acidobazne vrednosti.

Tabela 8: Koncentracija bikarbonata i pH vrednost krvi u razliĉitim acido-baznim


poremećajima

Mmol/l
pH Poremećaj
bikarbonata
20-26 7,35-7,45 Normalno stanje
14-20 7,35-7,45 Kompenzovana acidoza
Ispod 14 Ispod 7,35 Dekompenzovana acidoza
26-40 7,35-7,45 Kompenzovana alkaloza
Iznad 40 Iznad 7,45 Dekompenzovana alkaloza

80
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

3.11 PATOFIZIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA POREMEĆAJA


ENDOKRINOG SISTEMA

Za dijagnostiku endokrinog sistema neophodna su merenja koncentracije hormona u


perifernoj krvi ili serumu pacijenta. Merenja se vrše sledećim metodama: kliniĉko-hemijskim
metodama (spektrofotometrija, fotometrija, fluorimetrija, hromatografija), metodom HPLC-a,
radioimunološkim i imunohemijskim metodama. Na osnovu dobijenih rezultata razlikujemo:
normoskereciju, hiposekreciju ili hipersekreciju ţlezda endokrinog sistema. Ovakvo tumaĉenje
rezultata je objektivno ako su razgradnja i izluĉivanje hormona u granicama normale, ako ne
postoji gubitak hormona i ako koncentracija transportnih proteina u krvi nije izmenjena.
Ispravnije je zbog navedenih razloga vršiti merenje koncentracije slobodnih hormona, a ne
ukupne koncentracije hormona. Gubitak hormona se javlja kod pacijenata koji se nalaze na
dijalizi. Kod insuficijencije jetre postoji smanjena razgradnja hormona. Tokom gravidnosti moţe
se povećati koncentracija transportnih proteina za hormone. Merenje hormona u krvi i merenje
koncentracije metabolita hormona putem mokraće (metaboliti kortizola) ili mleka (progesteron
ili vaniliĉna kiselima kod krava) posebno je pogodno kada je neophodno ispitatii funkcionisanje
endokrine ţlezde tokom 24 h.
Za sigurnu dijagnozu hipo/hiperfunkciji neophodno je da poznajemo fiziološki dnevni
ritam luĉenja hormona kod ispitivane jedinke. Ukoliko sumnjamo na hiperfunkciju ţlezde sa
povećanim luĉenjem hormona, uzorak krvi se ispituje kada je fiziološki produkcija hormona
ţlezde minimalna. Ukoliko sumnjamo na hipofunkciju, krvni uzorak uzimamo kada oĉekujemo
maksimalno luĉenje hormona u diuralnom ritmu.
Zbog povezanosti endokrinog sistema (hipotalamus-hipofiza-ţlezda), ĉesto se u cilju
ispitivanja funkcionalnog kapaciteta ţlezde i viših centara i njihove meĊusobne veze izvode
testovi stimulacije ili supresije. Testovi supresije se najĉešće izvode da bi se ustanovilo
prekomerno luĉenje hormona. Ţivotinji se daje supstanca koja pokreće negativnu povratnu
spregu i inhibiciju luĉenja hormona. Izostanak supresije ukazuje da luĉenje hormona nije pod
kontrolom povratne sprege, tj. da je sekrecija autonomna. Ovi testovi se primenjuju kod
ispitivanja nedovoljnog luĉenja hormona. Pacijentu se daje tropni hormon, koji normalno
stimuliše izluĉivanje, a zatim se meri reakcija. Normalan odgovor ukazuje da ţlezda nije

81
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

oštećena, dok izostanak reakcije ukazuje da oštećenje ţlezde. Kod ovih testova, treba uzorak krvi
uzimati posle aplikacije po proceduri proizvoĊaĉa, da bi se utvrdila dinamika odgovora.
Na tabeli 9 je prikazana diferencijalna dijagnoza izmeĊu hipo i hiperfunkcije ţlezde.

Tabela 9: Diferencijalna dijagnoza hipo i hiperfunkcije ţlezde na osnovu koncentracije


hormona
HIPOFUNKCIJA
Koncentracije u Primarna Sekundarna
krvi Bazalno Simulacija Supresija Bazalno Simulacija Supresija
Hormon Sniţena 0 - Sniţena + -
Tropni hormon Povišena +++ - Sniţena 0 -
HIPERFUNKCIJA
Koncentracije u Primarna Sekundarna
krvi Bazalno Simulacija Supresija Bazalno Simulacija Supresija
Hormon Povišena - 0 Povišena + 0
Tropni hormon Sniţena 0 - Povišena 0 0

Modifikovana koncetraciona proba (modified water deprivation test) se koristi za


ispitivanje neurohipofize. Pomoću nje se odreĊuje postojanje sekrecija endogenog vazopresina i
odgovor bubrega na njegovo prisustvo u krvotoku. Test se izvodi kada postoji polidipsija i
poliurija, posebno u uslovima ako je specifiĉna teţina urina ispod 1,006. Pre samog izvoĊenja
funkcionalnog ispitivanja mora se precizno izvršiti diferencijalna dijagnoza: hiperglikemija
ukazuje na dijabetes melitus, bubreţni profil moţe da ukaţe na poliuriĉnu fazu insuficijencije,
diferencijalna krvna slika moţe da ukaţe na pijelonefritis, piometra na polidipsiju i poliuriju, a
pojava koţnih promena u vidu simetriĉne alopecije moţe da ukaţe na druge endokrine
poremećaje. Kada se iskljuĉe ostale bolesti modifikovana koncentraciona proba se izvodi kroz 4
faze po sledećoj proceduri:
1 – Priprema-ograniĉenje unosa voda: 72 sata pre testa ograniĉava se unos vode na 120
ml/kg/dan u manjim porcijama, 48 sati pre testa ograniĉava unos vode na oko 90 ml/kg/dan i 24
sata pre testa ograniĉiti unos vode na 60-80 ml/kg/dan.
2 – Uskraćenje vode: Pre poĉetka testa se uskraćuje voda i hrana, potpuno prazni
mokraćna bešika, precizno meri telesna masa, odreĊuje se osmolarnost/specifiĉna teţinu urina,
odreĊuje se osmolarnost krvnog seruma, odreĊuje se BUN, stepen hidratacije i status CNS-a. U
toku testa se potpuno prazni mokraćna bešika na svakih 60-120 minuta, precizno meri telesna

82
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

masu na svakih 60 minuta, odreĊuje se osmolalnost/specifiĉna teţina urina na svakih 60 minuta,


odreĊuje se stepen hidratacije i status CNS na svakih 60 minuta, proverava se vrednost BUN-a i
osmolalnost krvnog seruma. Na kraju druge faze, kada specifiĉna teţina urina preĊe 1,030, kada
je pas kliniĉki dehidrirao ili izgleda bolesno i kada pas gubi više od 3-5% telesne mase treba
uzeti uzorak seruma za odreĊivanje vazopresina, isprazniti mokraćnu bešiku, proveriti
osmolaritet/specifiĉnu teţinu urina, proveriti BUN i proveriti osmolalnost seruma.
3 – Odgovor na egzogeni vazopresin: treba aplikovati vodeni rastvor vazopresina 2-5 IU
im, nastaviti sa uskraćenjem vode i hrane, pratiti pacijenta (prazniti bešiku na svakih 30 minuta
tokom 2h, odrediti osmolalnost/specifiĉnu teţinu urina, odrediti osmolalnost krvnog seruma,
BUN, stepen hidratacije i status CNS-a).
4 – Kraj testa: Na kraju testa treba ţivotinji dati male koliĉine vode (10-20 ml/kg) svakih
30 minuta tokom 2h, pratiti pojavu povraćanja, stepen hidratacije i stanje CNS-a, te ako se
pacijent dobro oseća 2h nakon završetka testa dati mu vodu ad libidum.
Rezultati ove probe pokazuju da kada se aplikuje vazopresin zdravom psu u toku
koncentracione probe ne dešavaju znaĉajne reakcije u pogledu promene osmolarnosti i specifiĉne
teţine mokraće, jer kod ovih ţivotinja već postoji maksimalna stimulacija endogene sekrecije
vazopresina. Smatra se da promene osmolarnosti ili specifiĉne teţine mokraće u okviru ±10%
nemaju dijagnostiĉki znaĉaj. Normalnim vrednostima se smatraju vrednosti osmolariteta urina
znaĉajno više od osmolariteta seruma. Kod zdravih pasa i maĉaka se nakon dehidratacije postiţu
vrednosti osmolaliteta urina od preko 1100 mOsm/kg i specifiĉna masa urina raste preko 1,030,
pa ako se tokom koncentracionog testa preĊu ove granice, ne treba vršiti aplikaciju vazopresin,
jer je hipofizna sekrecija vazopresina u fiziološkim granicama.
Test odgovora na dezmopresin je alternativna metoda u odnosu na predhodnu metodu,
u kojoj se vrši aplikacija navedenog sintetskog vazopresina. Pre izvoĊenja testa vlasnik ţivotinje
treba da stekne uvid u koliĉinu vode koju ţivotinja pije, 2-3 dana pre testa jednom dnevno
sakupiti mokraću i odrediti njenu specifiĉnu teţinu i osmotsku koncentraciju. Nakon navedenog
krenuti sa aplikacijom dezmopersina u toku 5-7 dana. U tom periodu svakodnevno treba meriti
unos vode, odrediti specifiĉnu teţinu i osmolaritet urina. Dijagnoza centralnog dijabetes
insipidusa se potvrĊuje znaĉajnim smanjenjem unosa vode i/ili povećanim stepenom
koncetrovanja urina (za preko 50%).

83
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

Test stimulacije klonidinom se zasniva na njegovoj sposobnosti da stimuliše sekreciju


endogenog GNRH, koji dalje stimuliše luĉenje hormona rasta. Za vreme testa raste koncetracija
STH i glukoze, a opada koncentracija insulina. Najĉešće se za test koristi doza od 10 μg/kg
klonidina IV, a uzorak krvne plazme se uzima: pre samog testa, 15, 30, 45, 60 i 120 minuta posle
aplikacije klonidina. Kod zdravih pasa koncentracija hormona rasta raste brzo nakon aplikacije
klonidina i dostiţe maksimum posle 15-30 minuta, a potom brzo opada na bazalni nivo.
Maksimalni nivo STH kod pasa prelazi 10 ng/ml.
Štitna ţlezda se ispituje sledećim testovima: odreĊivanje koncetracije ukupnog tiroksina
(TT4), odreĊivanje slobodnog tiroksina (eng. free TT4, fTT4), odreĊivanje ukupne
koncentracije trijodtironina (TT3), odreĊivanje koncetracije slobodnog trijodtironina (fTT3),
odreĊivanje koncentracije rezervnog T3 (rT3), odreĊivanje koncetracije TSH i funkcionalni test
TSH-stim.
Bazalna koncetracija ukupnog tiroksina (TT4) je najbolji test za dijagnozu
hipotireoze. Treba znati da mnogi terapijski i dijetetski postupci deluju na tireoidnu ţlezdu.
Potrebno je ispravno tumaĉenje nalaza koncetracije T4 (μg/dl) za procenu hipotireoze kod pasa:
>2 μg/dl se tumaĉi kao vrlo malo verovatna šansa da postoji hipotireoza, 1,5-2,0 malo verovatna
šansa da postoji, 1,0-1,5 nejasno (ponoviti testiranje kada je vrenost u rasponu 1,2-1,5), 0,5-1,0
verovatno postoji hipotireoza, <0,5 vrlo verovatno da postoji hipotireoza. OdreĊivanje fTT4 je
znaĉajno, jer su njegove promene znatno manje podloţne faktorima koji su van štitne ţlezde, ali
je to testiranje znatno skuplje i dugotrajnije.
TSH-stim test (test stimulacije tireostimulirajućim hormonom) izvodi se tako što se
odreĊivanjem baziĉne koncetracije TT4 u serumu 6 sati pre i posle apliakcije 0,1 IU/kg TSH i.v..
Ako je pas oboleo od hipotireoze koncetracije TT4 u oba uzorka će biti vrednosti ispod 1,5 μg/dl.
ACTH-stim test (test stimulacije nadbubrega sa ACTH) je vrlo jednostavan i
ekonomiĉan test. Znaĉajan je za procenu adaptabilnih sposobnosti kod ţivotinja, a u kliniĉkom
smislu je znaĉajan za dijagnostiku Kušingove bolesti. Psi i maĉke koje boluju od Kušingove
bolesti ili imaju tumor kore nadbubrega koji luĉi kortizol, imaju povišenu sposobnost da reaguju
na stimulaciju, što se manifestuje u povišenom koncetracijom kortizola nakon aplikacije ACTH.
Test se izvodi u jutarnjim ĉasovima i krv se uzima 1-2 sata posle stimulacije. Referentne
vrednosti za bazalnu koncentraciju kortizola su 5 i 6,0 μg/dL, dok je nakon stimulacije nivo
kortizola izmeĊu 6 i 17 μg/dL. Ukoliko je vrednost izmeĊu 17 i 22 μg/dL moţe se posumnjati na

84
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

hiperadrenokorticizam, a ako koncentracija kortizola preĊe 22 moţe se i postaviti dijagnozu


hiperadrenokorticizma. Koncentracija kortizola se meri pre i nakon stimulacije.
Deksametazonski skrining test (Low-dose Dexametasone test, LDD test) se koristi za
dijagnostiku sekundarnog hiperadrenokorticizma (97% taĉnost). Kod zdravih pasa i maĉaka nivo
kortizola se po aplikaciji deksametazona sniţava već posle 2-3 h od aplikacije, a nizak nivo se
zadrţava duţe od 8h (ĉesto 24 - 48h). Kod zdravih pasa koncentracija kortizola opada na ispod
1,0 μg/dL. Kod sekundarnog hiperadrenokorticizma nivo kortizola u krvnoj plazmi 8h nakon
testa iznosi 1,4 μg/dL i više. Ukoliko je hiperadrenokorticizam posledica tumora kore
nadbubrega koji luĉi kortizol, tada je endogena sekrecija ACTH sniţena, a deksametazonski test
ne dovodi do promene nivoa kortizola u krvnoj plazmi. Ţivotinje sa sekundarnim
hiperadrenokorticizmom, izazvanim nekontrolisanim luĉenjem ACTH, imaju slabiju reakciju na
deksametazon.
Supresioni deksametazonski testovi – se koriste za diferencijalnu dijagnostiku
primarnog i sekundarnog hiperadrenokorticizma, a razlikujemo: Low-dose dexamethasone
suppression test (LDDS) (apl 0,01 mg/kg IV) i High-dose dexamethasone suppresion test
(HDDS) (apl 0,1 mg/kg IV). Kod oba testa uzorak krvi se uzima pre njegovog izvoĊenja da bi se
odredila bazalna koncentracija kortizola. U toku LDDS testa uzorci se uzimaju 4 i 8h nakon
aplikacije. Kod HDDS testa uzorci se uzimaju samo 8h posle aplikacije deksametazona.
Kriterijumi za procenu hiperadrenokorticizma su sledeći: nivo kortizola u krvnoj plazmi 4 h je
niţi od 1,4 μg/dL, nivo kortizola u 4 h je ispod 50% u odnosu na bazalnu vrednost i nivo
kortizola u krvnoj plazmi 8 h od aplikacije je ispod 50% od baziĉne vrednosti. Ispunjenje jednog
od tri navedena kriterijuma ukazuje da ţivotinja vrlo verovatno boluje od sekundardnog
hiperadrenokoricizma (Kušingova bolest).
Koncentracija kortizola u krvi nije najpouzdaniji pokazatelj funkcionalnog kapaciteta
stresne ose i sposobnosti prilagoĊavanja na stres. Kvalitetniji pokazatelj kapaciteta kore
nadbubrega su rezultati dobijeni inhibicionim i stimulacionim testovima.
Inhibicioni testovi (testovi inhibicije) se izvode kada postoji sumnja na hiperkorticizam.
Kod goveda hiperkorticizam najĉešće nastaje kao posledica tumora kore nadbubrega. Test se
izvodi aplikacijom sintetskog glukokortikoida (deksametazon), posle ĉega se oĉekuje znaĉajan
pad koncentracije kortizola u organizmu. Kod hiperkorticizma, koncentracija kortizola se nakon
aplikaciji ne menja, zbog izostanka povratne sprege ili razvoja tumora.

85
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

Testovi stimulacije se izvode kada postoji sumnja na hipokorticizam. Kod goveda se


hiperkorticizam izuzetno retko javlja, a insuficijencija kore nadbubrega je znatno veći problem
kod mleĉnih krava. Poznato je da glukokortikoidi znaĉajno ulaze u laktogenezu, a da je visoka
proizvodnja mleka stresogen, pa se moţe predpostaviti da mleĉna ţlezda troši znaĉajne koliĉine
kortizola, koji bi posluţio u kvalitetnom savlaĊivanju eustresa. Krave sa izraţenim
hipokorticizmom u peripartalnom periodu pokazuju veću stopu mortaliteta i ĉešće oboljevaju od
ketoze.
Jedan od prvih testova koji se koristio za ispitivanje hipokorticizma je Thornov test. Za
izvoĊenje ovog testa intramuskularno treba aplikovati ACTH u dozi 25 IJ / 100 kg telesne mase.
Potom treba uzeti krv iz vene jugularis, pre davanja kao i 4 i 8 h nakon davanja ACTH. Nakon
venepunkcije treba vršiti diferenciranje elemenata bele krvne loze. Smatra se da je kora
nadbubrega stimulisana ako je 10 h posle aplikacije ACTH broj eozinofila smanjen za više od
50%, broj neutrofila povećan za više od 100%, ukupan broj leukocita povećan za više od 10% i
glikemija povišena za više od 5%. Da bi se test smatrao pozitivnim potrebno je da budu
ispunjena tri od navedenih kriterijuma.
Za dobijanje preciznih rezultata aktivnosti nadbubrega posle stimulacije sa ACTH mora
vršiti merenje koncentracije kortizola. Veliki broj rezultata koncentracije kortizola su razliĉiti, jer
je odgovor posle stimulacije sa ACTH varirao od 80-350 nmol/l kortizola. U cilju standardizacije
stimulacionog testa istraţivaĉi su došli do vrednosti prema kome se koncentracija kortizola
linearno penje ukoliko se aplikuje do 12 IJ ACTH, a nakon te vrednosti visoka koncentracija
kortizola nestaje. Neophodno je primanjivati što manju dozu ACTH, aplikovati intravenski u
dozi od 6IJ, test izvoditi u periodu 7-10 h pre podne. Ako se navedena procedura ispoštuje
koncentracija kortizola u uzorcima prikupljenim u toku 60-90 minuta daju adekvatnu informaciju
o funkcionalnom kapacitetu nadbubrega.
Ispitivanje endokrinog pankreasa – Ispitivanje endokrinog pankreasa je od izuzetnog
znaĉaja za dijagnostiku diabetes mellitus-a. Testovi za dijagnostiku dijabetesa su sledeći:
1) Test tolerancije glukoze (IVGTT) –
1. Pacijent se hospitalizuje 24 sata pre testa.
2. Postavi se kruti kateter u v.jugularis ili v.saphenu medialis (ako je za
postavljanje katetera potrebna narkoza, omogućiti 24h oporavka).
3. Prekida se nepotrebna terapija 24-48h pre testa.

86
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4. Uskraćuje se hrana 12 sati


5. Prikuplja se bazalni uzorak krvne plazme za odreĊivanje insulina i glukoze.
6. Aplikuje se 0,5 ili 50% dekstroza/kg TM u roku 30 sec (za ovaj postupak se ne
koristiti kateter za uzimanje krvi). Uzorci krvi za odreĊivanje glukoze i insulina se
sakupljaju 1, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90 i 120 min nakon aplikacije glukoze.
Kod ţivotinja obolelih od dijabetesa glikemija je znatno viša od samog poĉetka testa.
Maksimalna vrednost glikemije postiţe se u 15. minutu testa, a potom naglo opada blizu poĉetne
vrednosti.
2) Test tolerancije glukagona (Intravenous glucagon tolerance test) –
Test se izvodi kao predhodni do momenta aplikacije ( taĉka 5) ista procedura kao
i za IVGTT, kada se
6. Aplikuje 0,5 mg (maĉka) ili 1 mg (pas) glukagona IV u roku od 30 sec.
7. Uzorci za odreĊivanje glukoze i insulina se prikupljaju 5, 10, 20, 30, 45 i 60
min nakon aplikacije glukagona.
3) Oralni glukoza tolerans test (Oral glucose tolerance test, OGTT) –
Test se izvodi kao predhodni do momenta aplikacije ( taĉka 5) ista procedura kao
i za IVGTT, kada se
6. Aplikuje 50g dekstroze (100ml 50% dekstroze) razbleţeno sa vodom, putem
gastriĉne sonde.
7. Uzorci za odreĊivanje glukoze i insulina se prikupljaju 15, 30, 60, 90 i 120
minuta nakon oralne aplikacije glukoze.
Kod maĉaka obolelih od spontanog dijabetesa uoĉava se znatno viša poĉetna
koncentracija glukoze u krvi i porast glikemije nakon i.v. aplikacije glukoze, koji po aspolutnoj
vrednosti odgovara zdravim ţivotinjama. Maĉke obolele od insulin-zavisnog dijabetesa imaju
znatno sporiji pad glikemije u periodu 5-60 minuta od poĉetka testa. Kod dijabetiĉnih ţivotinja
koncetracija insulina je na bazalnom novou, dok se kod zdravih jedinki nivo insulina u krvi se
povećava 2-3 puta.
Kod preţivara se za procenu funkcionalne sposobnosti pankreasa u sekreciji insulina,
odreĊuje se K vrednost: K= [(logG1-logG2)ln10] / t
G1-glikemija (mmol/l) u 30. minutu posle opterećenja glukozom
G2- u 60. min.

87
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

t-60‘-30 ‘= 30
ln10=2,3
Normalna K vrednost se kreće od 1,2 do 2,2, sumnjiva je od 1 do 1,2 i patološka je manja
od 1. Kada se ispituju mleĉne krave potrebno je obavezno odrediti i koncentraciju insulina, da bi
se otklonila mogućnost razvoja insulinske rezistencije.
Aciklija kod ţenke – se vrši nakon iskljuĉenja graviditeta, a zatim se odreĊuje
koncetraciju polnih hormona i eventualno izvršili stimulacione testove za hipofizu. Povišena
koncentracija gonadotropnih hormona (posebno FSH), uz smanjenu koncentraciju estradiola,
ukazuje da nema funkcije jajnika. Normalna koncentracija gonadotropina uz sniţen estradiol
upućuje na mogućnost tzv. testikularne feminizacije, te treba odrediti koncentraciju muških
polnih hormona i kariogram. Sniţena koncentracija estradiola uz sniţenu koncentraciju
gonadotropnih hormona ukazuje da postoji eventualni problem u hipofizi ili hipotalamusu.
Potrebno je izmeriti prolaktin u plazmi. Visoka koncentracija ukazuje na problem u
hipotalamusu ili hipofizi. Ako je povišena koncentracija treba ponoviti ispitivanje, da bi
odstranili faktor stresa Na osnovu testa otpuštanja gonadotropina moţemo zakljuĉiti: normalna
reakcija gonadotropina ukazuje da je uzrok verovatno u hipotalamusu, a subnormalna reakcija
ukazuje na oštećenje hipofize. Kod mleĉnih krava je znaĉajno oderĊivanje progesterona u mleku
za ranu detekciju gravidnosti, dok progesteron u krvi u peripartalnom periodu moţe ukazati na
brzinu reuspostavljanja estrusog ciklusa.
Sterilitet muţjaka se ispituje koncentracijom LH. Povišena koncentracija LH uz sniţenu
koncentraciju testosterona znaĉi da su zatajile Lajdigove ćelije. Povišen LH uz uz normalan
testosteron upozorava na manji stupanj oštećenja testisa i kompenzatorni porast izluĉivanja LH.
Sniţen LH uz sniţen testosteron ukazuje na oboljenje hipotalamusa ili hipofize, te treba odrediti
koncentraciju prolaktina u plazmi. Ukoliko je ona znatno povišena moguće je da postoji tumor
hipofize, te treba uraditi stimulacione testove. Bez obzira na vrednost koncentracije testosterona,
povišena koncentracija FSH ukazuje na prestanak rada seminifernih tubula, sa malo
spermatozoida. Oligospermija (smanjena koncentracija spermatozoida) uz nisku koncentraciju
FSH ukazuje na bolest hipofize ili hipotalamusa koju treba dalje dijagnostikovati.

88
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

3.12 RACIONALNA PATOFIZIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA POREMEĆAJA


METABOLIZMA UGLJENIH HIDRATA, MASTI I PROTEINA

Poremećaji metabolizma ugljenih hidrata se ispituje kroz funkcionelane testove za


endokrini pankreas. Mnoge ţivotinje imaju latentnu sklonost ka nastanku dijabetesa, pa se kod
ovih ţivotinja vrši glukoza tolerans test uz aplikaciju kortizola. Latentni dijabetes moţe brzo
preći u manifestnu formu usled stresa, ĉiji je kortizol glavni medijator.
Testovi za ispitivanje glikogenskog depoa u jetri i njene sposobnosti da odrţi
normoglikemiju su:
1) Test tolerancije epinefrina se zasniva na osobini epinefrina da povećava glikogenolizu
aktivacijom adenilat-ciklaze. Ako jetra nije oštećena, nakon parenteralne aplikacije epinefrina
već za 40-60 minuta glikemija se povećava za 50% u odnosu na fiziološku vrednost, a za 1h
vraća se u okvire normoglikemije. Izostajanje epinefrinskog efekta javlja se kod insuficijencije
jetre ili kod praznih glikogenskih depoa tokom gladovanja.
2) Test opterećenja galaktozom se zasniva na sposobnosti galaktoza, koja je
monosaharid, da se pretvori u glukozu. Ovaj proces je enzimatski regulisan i odvija se u više
etapa.Test se izvodi tako što se i.v. aplikuje rastvor galaktoze, a zatim se u vremenskim
intervalima prati njeno nestajanje u krvi. Test se primenjuje kod preţivara, konja i pasa
korišćenjem 10 mL/kg telesne mase rastvora galaktoze, koncentracije 2,8 mM. Kod zdravih
ţivotinja, galaktoza se u vremenu od 1h metaboliše u glukozu, ali ako je oštećena jetra,
galaktoza se duţe ili kraće zadrţava u krvotoku i nakon toga se javlja galaktozurija.
Glavni lipidi krvi su: holesterol (slobodni i esterifikovani), trigliceridi, ukupni fosfolipidi
i neesterifikovane masne kiseline. Lipoproteini su sloţeni transportni oblici koji se sastoje od
lipida i glikoproteina-zvani apoproteini. Prema kretanju u elektroforezi dele se na: hilomikrone,
pre beta-liporoteine, beta-lipoproteine i alfa-liporpoteine. Prema sastavu tj. gustini posle
ultracentrifugiranja dele se na: VLDL (Very low density lipoproteins) – lipoproteini veoma niske
gustine, LDL (Low Density Lipoproteins) – lipoproteini niske gustine, HDL (High Density
Lipoproteins) – lipoproteini visoke gustine i VHDL (Very high Density Lipoproteins) –
lipoproteini vrlo visoke gustine.
Povećana koncentracija lipida u krvi naziva se hiperlipidemija i ona moţe biti:
postprandijalna, primarna (idiopatska hiperlipoproteinemija, idiopatska hiperhilomikronemija

89
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

kod maĉaka, deficijencija lipoproteinskih lipaza i idiopatska hiperholesterolemija), sekundarna


(hipotireoidizam, diabetes mellitus, hiperadrenokorticizam, pankreatitis, holestaza, hepatiĉna
insuficijencija i nefrotski sindrom).
Holesterol se odreĊuje standardnom fotometrjskom metodom. Reagens za holesterol je
holesterol-oksidaza koja reaguje sa hromogenom i daje promenu boje u intenzitetu koja je
proporcionalna sa koncentracijom holesterola. Indikacije za odreĊivanje koncentracije
holesterola su: primarna hiperlipoproteinemija, diabetes mellitus, nefrotski sindrom, bolesti
tireoidee, bolesti jetre, malapsorptivni sindrom i dr. Povišene vrednosti holesterola se javljaju
kod sledećih poremećaja: familijarna hiperliporpoteinemija, nefrotski sindrom, nekontrolisani
dijabetes, opstruktivna ţutica, miksedem, ksantomatoza, akutne hemoragije i hipotireoidizam.
Hipoholesterolemija se javlja kod: anemije, bolesti jetre, infekcije, kaheksije, glomerulonefritisa,
stresa, dekompenzovanog srca, koronarne tromboze, akutnog infarkta miokarda, karcinoma i dr.
Trigliceridi se takoĊe odreĊuju klasiĉnom fotometrijskom metodom. Indikacije za
odreĊivanje triglicerida su: hiperlipoproteinemije, trovanja teškim metalima, bolesti štitnjaĉe,
malapsortivni sindrom itd. Hipertrigliceridemija se javlja kod sledećih poremećaja:
hiperlipoproteinemija, diabetes mellitus-a, nefrotskog sindroma, uremije bez nefroze,
pankreatitisa, nekih glikogenoza, trovanja teškim metalima i dr. Sniţene vrednosti triglicerida se
javljaju kod sledećih poremećaja: hroniĉna opstruktivna bolest pluća, infarkt mozga,
hipertireoidizam, malapsorpcijski sindrom, nasledni nedostatak holesterol-acil transferaze i dr.
Friţiderski test se koristi za ispitivanje tipa hipertrigliceridemije. Test se izvodi na sledeći
naĉin: serum ispitanika se ostavi na temperaturi od +4ºC, pa se nakon stajanja 18-24h vrši
procena njegovog izgleda. Normalan serum i serum u izolovanoj hiperholesterolemiji je bistar.
Kod nakupljanja VLDL (hipertrigliceridemija) serum pokazuje odreĊeni stepen zamućenja.
Lagane ĉestice hilomikrona formiraće flotacijom hilomikronski ĉep.
U humanoj populaciji razlikujemo 5 tipova hiperlipoproteinemije u zavisnosti od tipa
lipoproteina koji dominira, friţiderskog test i kakva je koncetracija holesterola i triglicerida.
Sliĉna klasifikacija postoji i kod pasa.
Kod mleĉnih krava je vrlo znaĉajna pojava zamašćenja jetre, koja nastaje kao posledica
negativnog energetskog bilansa u peripartalnom periodu, tj. na poĉetku lakracije. Negativni
energetski bilans se ogleda u stepenu lipomobilizacije ĉiji je pokazatelj koncetracija slobodnih
masnih kiselina. Kada je njihova koncetracija 0,3-0,5 mmol/l smatra se da je proces

90
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

lipomobilizacije u fiziolškim granicama, dok vrednosti preko 0,7 mmol/l ukazuju na intenzivnu
nekontrolisanu lipomobilizaciju. Intenzivna lipomobilizacija narušava transport triglicerida iz
jetre (nema dovoljno VLDL jer je narušena sinteza proteina) pa se oni nagomilavaju u
hepatocitima.
Poremećaj metabolizma proteina je objašnjen kroz predhodna poglavlja. Osnovne
indikacije za ispitivanje metabolizma proteina su: ispitivanje hidriranosti organizma, ispitivanje
uzroka edema, ispitivanje uzroka infekcija, dokazivanje upale, ispitivanje autoimunih procesa,
ispitivanje bolesti jetre, ispitivanje proteinurije, dokazivanje paraproteinemije, ispitivanje
proteinskih nosaĉa seruma, ispitivanje malognih neoplazmi, ispitivanje opekotina i dr.
Posebni proteini koji su znaĉajni za dijagnostiĉki postupak su enzimi. Oni i njihova
katalitiĉka aktivnost odreĊuju se razliĉitim kolorimetrijskim metodama, imunoenzimskim
metodama i radio-imunoenzimskim metodama, razliĉitim histohemijskim metodama bojenja a
aktivnost im se izraĉunava posebnim formulama. Uzorak za ispitivanje enzima mogu biti: krv,
serum, limfa, peritonealna teĉnost, pleuralni izliv, bioptat, saliva, suze itd. Enzimi koji imaju istu
ili sliĉnu enzimsku aktivnost, a razliĉite fiziĉke ili fiziĉko-hemijske osobine nazivaju se
izoenzimi i nastaju kao posledica stvaranja u razliĉitim delovima ćelije. Prema mestu gde
obavljaju svoju ulogu dele se na enzime luĉenja (sekretorne) i intracelularne enzime. Organski
enzimski profil se odreĊuje na osnovu: nivoa aktivnosti enzima glavnih metaboliĉkih puteva,
koji se porede jedan sa drugim, pomoću organospecifiĉnih enzima i raspodele izoenzima. Enzimi
izlaze u ekstracelularni prostor gde postoji koncentracioni gradijent izmeĊu intracelularnih i
ekstracelularnih prostora. Kod ţivotinjskih ćelija postoji brza izmena enzima kroz ćelijske
membrane, tako da kod najmanjeg oštećenja ćelija intracelularni enzimi izlaze ekstracelularno.
Serumski enzimski profil se dobija ispitivanjem enzima u serumu ako postoji neko oboljenje.
Mali broj enzima su organospecifiĉni, pa se dijagnostika pomoću serumskih enzima vrši
uporeĊivanjem dobijenih rezultata iz seruma i poznatim enzimskim profilom organa. Za
poklapanje ovih profila potrebno je da postoji teško oštećenje organa, kao i da je tom prilikom
zahvaćen samo jedan organ, kako se ne bi došlo do mešanja sa profilima drugih organa.

91
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

3.13 PATOFIZIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA POREMEĆAJA


NERVNOG I MOTORNOG SISTEMA

Za patofiziološku dijagnostiku poremećaja nervnog i motornog sistema znaĉajno je:


1) Ispitivanje likvora se vrši sa nekoliko pregleda:
Pritisak likvora se meri spinalnim manometrom nakone punkcije kiĉmenog stuba.
Pritisak likvora zavisi od poloţaja tela, a kod pasa je fiziološka vrednost izmeĊu 5 i 12 mm Hg.
Kod ljudi vrednosti pritiska likvora variraju od 0,5-1,5 kPa, dok se vrednosti preko 2 kPa
smatraju povišenim. Povišen pritisak likvora nastaje kod povećanje zapremine mozga i njegovih
opni, lezija, apscesa, tumora, hematoma i opstrukcije u cirkulaciji krvi ili likvora.
Boja likvora – Likvor je bistra i bezbojna teĉnost, koja se zamuti ako ima više od 500
ćelija u μL likvora ili kod povećane koncentracije proteina. Crvena boja likvora uz primese ţute
boje ukazuje na krvarenje. Ako je krvarenje posledica patološkog procesa likvor će biti iste boje
u tri uzete epruvete, a ako je boja arteficijalnog porekla kod tri sukcesivno uzete epruvete likvor
će biti sve svetliji u svakoj epruveti.
Ćelije u likvoru se ispituju pomoću sledeće metode, za koju je poterban sledeći
materijal: melanţer za leukocite, Fuks-Rozentalova komora, reagens za razreĊenje likvora i
mikroskop. IzvoĊenje brojanja se vršiti odmah nakon uzimanja likvora, najbolje u toku 30
minuta zbog brzog propadanja ćelija. Likvor se moţe ĉuvati u friţideru uz dodavanje kapi
konzervansa ili u 1/3 10% rastvora goveĊeg albumina u 2/3 likvora kada je potrebno duţe se
pozabaviti ćelijama i kada se vrši centrifugiranje likvora. U melanţer za leukocite se navuĉe
rastvor za likvor do 1, a likvor do oznake 11. Dalji postupak je kao kod brojanja leukocita.
Izraĉunavanje se vrši na sledeći naĉin: (broj ćel./3,2) x (11/10) x 10^6/L. Ako se koristi
Nojbauerova komorica broje se ćelije u 4 spoljašnja kvadranta, a formula za izraćunavanje broja
ćelija je: (N/4) x 11 x 10^6/L.
Tokom brojanja ćelija moţe se izvršiti orijentaciono diferenciranje izmeĊu
polimorfonukleara i mononukleara, ali je ponekad potrebno (naroĉito kod jake pleocitoze)
detaljnije diferenciranje, koje se vrši u koncentratu likvora. Likvor se predhodno pripremi u
Slajkovim komorama za koncentrovanje. Slajkova komora je šuplja cevĉica kod koje se na jedan
kraj postavi gaza i ispod nje predmetno staklo na kome je ucrtan krug istog preĉnika kao i
cevĉica. U cevĉicu se sipa likvor i dok gaza upija teĉni deo, na predmetnoj ploĉici se

92
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

sedimentiraju ćelije koje se kasnije boje na nekoliko naĉina i posmatraju pod mikroskopom.
Pored navedenog moţe se vršiti centrifugiranje likvora.
Tumaĉenje rezultata: U likvoru zdravih pasa i maĉaka se nalaze 0-3 ćelije u mikrolitru (0-
3000 u ml). Najviše su prisutni mononukleari (limfociti i monociti), a normalno likvor ne sadrţi
eritrocite. Kod arteficijalnog krvarenja, treba izdvojiti leukocite, koji potiĉu iz krvi, tako da se na
svakih 700 izbrojanih eritrocita oduzme jedan leukocit. Formula:
W = WBCF – [ (WBCB x RBCF) / RBCB]
W = postojeći ili izraĉunati broj leukocita u CSF;
WBCF i WBCB = izbrojane ćelije bele loze u CSF i krvi;
RBCF i RBCB je broj eritrocita/μl u CSF i krvi.
Povećan broj ćelijskih elemenata u likvoru se naziva pleocitoza koja moţe biti: laka 5-50
ćelija u mikrolitru, srednja 50-200 ćelija (laka do srednja: virusne bolesti CNSa, toksiĉni
meningitis, sterilni meningitis, polineuropatije, tumori blizu mozga) i teška preko 200 ćelija (jak
gnojni meningitis). Pleocitoza sa predominantnim limfocitima i plazma ćelijama se moţe
zapaziti kod virusnih infekcija, hroniĉni steroidnog responsive meningitis-arteriitisa (SRMA),
granulomatoznom meningoencefalitisa i nekrotiĉnog encefalitisa. Neutrofilna pleocitoza se javlja
kod akutne SRMA i bakterijskih infekcija. Plazma ćelije se zapaţaju kod hroniĉne virusne
infekcije i apscesa mozga, a eozinofili kod neuroparazitoza (ehinokokoza, cisticerkoza i dr...),
kod nekhi autoimuni encefalitisa, FIP-a, nekih tumora i dr. Treba uraditi i imunocitohemiju
likvora, zbog subpopulacije limfocita koji ukazuju na imunološke aktivnosti CNS-a.
Glukoza likvora se paralelno odreĊuje sa odreĊivanjem glikemije, jer se parametri
meĊusobno prate, a koristi se glukoza-oskidaza test (GOT). Kliniĉki je znaĉajno ukoliko se javi
pad koncentracije glukoze u likvoru, što ukazujue na: bakterijski i gljiviĉni meningitis, difuznu
meningealnu neoplaziju i dr. Povećan broj ćelija likvora povećano troši glukozu.
Proteini likvora se odreĊuju Pandijevom reakcijom koja se izvodi na sledeći naĉin: U
sahatno staklo treba staviti malu koliĉinu Pandijevog reagensa i dodati 1-2 kapi likvora. Rezultat
reakcije se posmatra na tamnoj podlozi uz osvetljenje postavljeno sa strane. Pozitivna reakcja
daje zamućenje, a stepen zaućenja se obeleţava sa +, ++, +++. Ovi proteini se odreĊuju i None-
Apeltovom reakcijom koja se zasniva na mešanju amonijum-sulfata i likvora i nastanka
odreĊenog stepena zamućenja koji je srazmeran koncentraciji proteina u likvoru. Reakcija se ĉita
u okviru 3 min., a obeleţava se sa +,++ ili +++. Proteini likvora se mogu odreĊivati i

93
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

elektroforetski izdvajanjem proteina likvora, odreĊivanjem imunoglobulina i odreĊivanjem


nervno-specifiĉnih belanĉevina (mijelinski baziĉni protein koji je znaĉajan pokazatelj aktivnog
procesa demijelinizacije).
Kod pasa i maĉaka je normalna koncentracija proteina u likvoru manja od 25mg/dl
(0,25g/l), a moţe biti viša ukoliko je likvor uzet lumbalnom punkcijom. Povećana koncentracija
proteina se javlja u razliĉitim patološkim procesima, a ukoliko se u likvoru naĊe krv na svakih
750 eritrocita treba oduzeti oko 0,01g belanĉevina. U oboljenjima kod kojih postoji poremećaj
funkcije krvno-moţdane barijere smanjuje se albuminsko/globulinski indeks, formula je: (IgG
likvora/IgGseruma)/(ALBlikvora/ALBseruma). Ovakva situacija se kliniĉki javlja kod razliĉitih
limfoma mozga i kod razliĉitih inflamacija. Povećan IgA ukazuje na SRMA.
Ostali metaboliti u likvoru – Sniţenje koncentracije GABAe dijagnostikuje se kod pasa
sa epilepsijom. Promena u nivou laktata i piruvata ukazuje na mitohondrijalnu smrti, a odnos
laktat/piruvat ukazuje na redoks potencijal mozga. Glutamat je povišen kod razliĉitih oboljenja
mozga, a treba ga analizirati kod kompresivnih lezija (promene intervertebralnih diskova, diskus-
hernija i dr.). Promene u serotoninu, dopaminu i norepinefrinu se mogu zapaziti kod ţivotinja sa
bihejvioralnim izmenama. Pored navedenih mogu se odreĊivati i drugi metaboliti.
Ispitivanje elektromotorne aktivnosti – Za pravilno izvoĊenje i tumaĉenje rezultata
potrebno je poznavati osobine elektroda koje se koriste i izvršiti njihovu kalibraciju. Oprema je
najĉešće podešena u milivoltima i mikrovoltima, a vremenska kalibracija u milisekundama.
Pregledi se vrše na sediranoj ili trankviliziranoj ţivotinji da bi se izbegli pokreti. Mere se
spontane ili izazvane (evocirane aktivnosti) aktivnosti, a principi merenja talasa sliĉni kao kod
EKG-a.
Elektroencefalografija (EEG) je metoda merenja sumarnih bioelektriĉkih potencijala
neurona CNSa. Oni se registruju na površini lobanje, posle uvećanja i grafiĉkog predstavljanja.
Osnovni grafiĉki element je talas, koji se javlja u odreĊenom ritmu. Postoji nekoliko vrsta
ritmova u zavisnosti od poloţaja kapaka oĉiju i postoji li povišena paţnja pacijenta. Pojava
šiljaka i oštrih talasa ukazuju na patološke nalaze. EEG se moţe kombinovati sa svetlosnom
stimulacijom, hiperventilacijom i dr.
Elektromiografija (EMG) se zasniva na ispitivanju elektriĉne aktivnosti koja nastaje u
mišićima u uslovima mišićne aktivnosti. Tehnika rada se zasniva na zabadanju iglenih elektroda

94
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

u odreĊene taĉke mišića i beleţi se aktivnost. U svim uslovima kada se sumnja na kompresiju
nerava korisno je uraditi ovaj pregled.
Ispitivanje sprovodljivosti nerava vrši se draţenjem perifernog nerva i registrovanjem na
mišiću koji taj nerv inerviše. Ispitivanje sprovodljivosti senzitivnog nerva izvodi se draţenjem
mešovitog nerva i registrovanjem sa koţnog nerva. Draţenje motornog nerva se postiţe
draţenjem sa površine koţe.
Elektriĉna aktivnost u centralnom nervnom sisetmu se meri upotrebom sledećih metoda:
spontana aktivnost u mozgu i EEG, izazvana (evocirana) aktivnost u kiĉmenoj moţdini, izazvana
aktivnost u mozgu (auditorno, somatosenzualno i vizuelno evociranje potencijala) i izazvana
aktivnost retine (brzi elektroretinogram ERG).
Izazvana aktivnost u kiĉmenoj moţdini predstavlja registrivanje elektriĉnih promena u
kiĉmenoj moţdini posle draţenja perifernog nerva. Meri se perkutano, a talasi su uvek polifazni.
Ovaj metod je koristan za beleţenje lokalizacije i stepena promena u kiĉmenoj moţdini, posebno
kod hijatus hernije pasa.
Auditivno izazvana aktivnost se ispituje kod gerijatrijskih pacijenata i mladih kuĉića kod
kojih zbog inbredinga ĉesto nastaju problemi sa sluhom, što umanjuje vrednost ţivotinje.
Somatosenzorna izazvana aktivnost se javlja kada se senzorni receptori stimulišu negde
iz tela (soma). Za dijagnostiku je korisno aktivnost izazvana u kiĉmenoj moţdini.
Elektroretinogram je izuzetno koristan za procenu bolesti oĉiju, glaukom, dijabetiĉna
retinopatija i sl.
Elektriĉna aktivnost u muskulaturi se meri: elektromiografijom, kao spontana ili izazvana
mišićna aktivnost.
Pored navedenog bolesti mišića se procenjuju analizom znaĉajnih enzima i metaboliĉkog
profila mišića, što je posebno indikovano kod trkaćih konja. Kod akutne mišićne povrede, prvo
dolazi do povećanja CK, a 24h kasnije do povećanja AST. Kao indikator mišićne povrede u
serumu se moţe meriti i koncentracija: mleĉne kiseline, troponina, mioglobina i ugljene
anhidraze III. Akutna mišićna povreda moţe se ustanoviti i scintigrafijom, posle aplikacije
radioaktivnog tehnicijuma.
U proceni lokomotornog sistema znaĉajno je ispitati i zglobove tj. sinovijalnu tečnost.
Zglobna teĉnost se dobija postupkom artrocenteze. Normalna sinovijalna teĉnost: svetla,
bledoţućkasta, bez fibrinskih vlakana, koncentracija proteina 0,5-1,9 g/100ml, odnos alb/glob je

95
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

1,1-2,9, broj ćelija sa jedrom (leu) je manji od 0,5x10^9/L, konc.hijaluronske kiseline 45-56
mg/100ml. Kod sinovijalitisa povećan je volumen sinovijalne teĉnosti, dok je volumen smanjen
kod hroniĉnih degenerativnih bolesti zglobova. Krvarenje ukazuje na intraartikularnu frakturu.
Pojava fibrinogena ukazuje na promenu permeabiliteta sinovijalne membrane. Tamnoţuta boja
sinovijalne teĉnosti moţe ukazivati na hroniĉnu traumu ili na septiĉni artritis. Koncentracija
ukupnih proteina veća od 3g/L ukazuje na jaku septiĉnu upalu zgloba. Tokom upale raste
frakcija α2 i gama globulina, AP, AST i LDH. Broj ćelijskih elemenata raste preko 5 x 10^9/L.
Za degeneraciju hijaline hrskavice odreĊuje se koncentracija kolagenskih fragmenata tipa I i II i
osteokalcin. Danas se za dijagnostiku bolesti zglobova vrši merenje koncentracije prostaglandina
E2 u sinovijalnoj teĉnosti.

96
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

3.14 PATOFIZIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA MALIGNIH NEOPLAZIJA

Kancerogeneza je proces maligne transformacije ćelija organizma, koja nastaje pod


dejstvom fiziĉkih, hemijskih i bioloških kancerogena. Kancerogeni izazivaju genetiĉku grešku
ćelije, a posledica je njeno pretvaranje u tumorsku ćeliju koja nekontrolisano i nesvrsishodno
buja i deli se, zbog nemogućnosti imunološkog sistema da iskontroliše ćelijski ciklus.
Osobine maligne ćelije su:
– Izmenjena morfologija,
– Nemogućnost odgovora na regulatorne signale,
– Autonoman rast ćelija,
– Invazivno rastu preko granica tkiva kome pripadaju,
– Metastaziranje u okolinu i u udaljene organe,
– Monoklonalno poreklo ćelija, mada se u kasnijim fazama moţe otkriti
heterogenost, i još
– Antigenska, metaboliĉka, endokrina i druga aktivnost itd.

Paraneoplastični sindrom (PNS) ima preko 90% populacije obolele od kancera. Ĉesto
prvi znak oboljenja od maligniteta. Nastaje kao posledica aktivnosti malignih ćelija i pomoću
njega nekad se moţe predpostaviti tip maligniteta. Ponekad je on, a ne tumor, glavni uzrok smrti.
Veoma je znaĉajan za prognozu bolesti.
Hiperkalcemija se javlja delovanjem malignih ćelija koje luĉe protein sliĉan
paratireoidnom hormonu ili ektopiĉno luĉe PTH. Do pojave hiperkalcemije dolazi i kod:
povećane reapsorpcije kostiju i osteoklastne aktivnosti i kod povećanog zadrţavanje Ca od strane
bubrega. Kliniĉka slika: polidipsija, poliurija, urinarna kalcinoza, znakovi renalne disfunkcije,
depresija, inapetenca, bradikardija, aritmija i drugo. Javlja se kod: adenokarcinoma analnih
vrećica psa (25-90% sluĉajeva), limfoma (oko 20% sluĉajeva), multiplog mijeloma, tumori sa
metastazom na kostima, tumor paratireoidee, itd.
Hipoglikemija se javlja zbog stalne gladi malignih ćelija za glukozom, a dovodi i do
neuroloških simptoma. Javlja se kod: insulinoma, tumora jetre, malignog limfoma, leukemije,

97
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

melanoma i dr. Hipoglikemija kod ekstrapankreasnih tumora je ĉesto udruţena sa niskim nivoom
insulina.
Kaheksija se javlja kao posledica inapetence i poremećaja metabolizma ugljenih hidrata,
proteina i masti, kao i stvaranja prokahektiĉkih citokina (TNF, IL1,IL6, INFgama). Ona je
negativan prognostiĉki znak i prati većinu malignih bolesti.
Poremećaj acido-baznog statusa nastaje zbog anaerobne glikolize tumorskih ćelija.
Hiperurikemija nastaje zbog ubrzanog stvaranja i raspadanja tumorskih ćelija i
oslobaĊanja njihovih nukleoproteina.
Ĉesto se dešavaju i endokrine izmene kod tumora koji produkuju hormone.
Citodijagnostika malignih tumora – Maligne ćelije pokazuju sledeća morfološka
svojstva: povećane dimenzije, izmenjen oblik i hiperhromazija jedra, atipiĉna mitoza, povećana
zapremina jedarca, veći broj jedara, veći broj jedaraca u okviru jedra, izmenjen afinitet
citoplazme prema boji i vakuolarizacija citoplazme, promena oblika ćelija i povećane ćelije.
Diferencijacija ćelija i ozbiljnost malignog procesa mogu se podeliti u pet nivoa (G1-G5): G1 –
prisustvo normalnih ćelija odreĊenog organa; G2 – prisustvo ćelija svojstvenih za zapaljenski
proces; G3 – prisustvo atipiĉnih ćelija, sa promenama u citoplazmi i jedru, ali bez sigurnih
znakova maligniteta; G4 – izolovane i pojedinaĉno smeštene maligne ćelije (pozitivan nalaz na
maligni proces) i G5 – brojne kancerske ćelije (pozitivan nalaz na maligni proces).
Tumor-markeri su supstance (glikoproteini ili glikolipidi) koje su normalno odsutne ili
ih ima u malim koliĉinama u zdravom organizmu, a nazivaju se i tumor-asocirani antigeni.
OdreĊivanje tumor markera se najĉešće vrši RIA metodom. Njihov znaĉaj je u diferenciranju
malignih od benignih tumora, proširenosti tumora, recidiva i metastaza i u praćenju efekata
terapije.

98
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4. ODABRANE LABORATORIJSKE METODE U PATOLŠKOJ FIZIOLOGIJI

99
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4.1 ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE GLUKOZE U KRVI PAP METODOM


(PEROKSIDAZA AKTIVNI PRINCIP)

Glukozo-oksidaza katalizuje proces oksidacije glukoze u glukonsku kiselinu i vodonik


peroksid (H2O2). OsloboĊeni vodonik peroksid u prisustvu enzima peroksidaze reaguje sa 4-
aminoantipirinom (4-AAP) i 2,4-dihlorfenolom (2,4-DNP), gradeći iminohinon i vodu.
Iminohinonska boja je crvena i njen intenzitet je direktno proporcionalan koncentraciji glukoze u
uzorku.
Naĉin izvoĊenja metode: Odmeriti 1 mL PAP reagensa u epruvetu i dodati 0,1 mL
krvnog seruma. Epruvetu lagano promućkati i ostaviti u vodenom kupatilu na 37°C tokom 20
minuta. Oĉitati apsorpciju na talasnoj duţini λ=505 nm. Koncentracija glukoze se izraĉunava
prema sledećoj formuli:
koncentracija glukoze (mmol) = ((Euz-Esp)/(Est-Esp))xCst.
Euz – ekstinkcija uzorka, Esp – ekstinkcija slepe probe, Est – ekstinkcija standarda,
Esp – ekstinkcija slepe probe, Cst – koncentracija standarda.

100
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4.2 PROBA NA ACETONSKA TELA U URINU NATRIJUM-NITROPRUSIDOM

Acetonska tela reaguju sa natrijum-nitroprusidom gradeći komplesno obojeno jedinjenje.


Boja ovog jedinjenja je crvena, a intenzitet se pojaĉava dodatkom sirćetne kiseline.
Materijal za izvoĊenje metode je: 50% NaOH, natrijum-nitroprusid, koncentrovana
sirćetna kiselina.
Naĉin izvoĊenja metode: U epruvetu uliti 3 mL mokraće i doda se par kapi 50% NaOH.
U drugu epruvetu se doda na vrh noţa natrijum-nitroprusid i rastvori se sa nekoliko mL
destilovane vode, pa se po rastvaranju dodaje mokraći i mešavini se dodaje 1 mL sirćetne
kiseline.
Ako posle dodavanja sirćetne kiseline doĊe do intenziviranja crvene boje mokraća sadrţi
aceton, a ukoliko boja izostaje ili nastane ţućkasta boja reakcija je negativna .

101
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4.3 ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE UKUPNIH LIPIDA U KRVNOM SERUMU

Masne kiseline u reakciji sa fosfovanilinom kiselinom daju crveno obojeni kompleksi.


Materijal za izvoĊenje metode: koncentrovana H2SO4, o-fosforna kiselina, 0,6 g vanilina
(C8H8O3) u 100 mL vode, fosfovanilinski reagens, standard maslinovog ulja 5g/L u etanolu.
Naĉin izvoĊenja metode: U tri epruvete pipetom se ukapaju reagensi prema sledećoj
šemi:

Proba Standard Slepa proba


Serum 10 μL / /
Standard / 10 μL /
H2SO4 0,2 mL 0,2 mL 0,2 mL

Sumporna kiselina se dodaje tako da se sa zida epruvete skinu zaostaci proteina. Epruvete
se stave 10 minuta u vodeno kupatilo sa kljuĉalom vodom, nakon ĉega se ohlade. Po hlaĊenju u
epruvete se dodaje po 6 mL fosfovanilinskog reagensa. Sadrţaj epruveta se izmeša i ostavi da se
tokom 30 minuta razvije boja. Zatim se meri ekstinskciju na 530 nm.
Koncentracija ukupnih lipida u serumu se izraĉunava prema sledećoj formuli:
C(g/L)=(Euz/Est)xCs.

102
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4.4 ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE HOLESTEROLA U KRVNOM SERUMU (PO


KING-U)

Reakcija po Kingu koja sluţi za dokazivanje holesterola je dvofazna. Najpre anhidrid


sirćetne kiseline oduzima vodu i oksidiše holesterol. Novoformirano jedinjenje, koje je
nezasićeni ugljovodonik, kondenzuje se u duţe nizove. U drugoj fazi nizovi reaguju sa
koncentrovanom H2SO4 i obrazuju obojene kompleksne produkte. Prvo se razvija crvena boja,
koja prelazi u plavu i zatim u stabilnu zelenu.
Materijal za izvoĊenje metode: 96% alkohol, etar i hloroform; anhidrid sirćetne kiseline;
koncentrovana H2SO4; standard holesterola (100 mg holesterola rastvoreno u 100 mg
hloroforma. 0,5 mL ovog rastvora, 4,5 mL hloroforma, 2 mL anhidrida sirćetne kiseline i 5 kapi
koncentrovane H2SO4).
Naĉin izvoĊenja metode: U konusnu epruvetu za centrifugiranje ulije se 8 mL 96%
alkohola, 2 mL etra i 0,2 mL ispitivanog seruma. Epruveta se zatvoriti gumenim ĉepom, dobro
promućka i ostavi poloţena pola sata na sobnoj temperaturi i potom izvršiti centrifugiranje. Bistri
supernatant se odlije u Erlenmajerovu boĉicu od 50 mL. Teĉnost iz boĉice treba da ispari
zagrevanjem u kupatilu sa kljuĉalom vodom. Suvom ostatku dodaje se 5 mL hloroforma, 2 mL
anhidrida sirćetne kiseline i 5 kapi koncentrovane H2SO4. Ostavi se da stoji u mraku na 37°C
tokom 7 minuta i oĉita ekstinkcija standarda pa ekstinkcija probe na 660 nm.
Koncentracija holesterola se izraĉunava prema sledećoj formuli:
C(mg/L)= (Euz/Est)x250x10.

103
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4.5 BIURETSKA REAKCIJA ZA KVANTITATIVNO ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE


PROTEINA

Biuretska reakcija se odvija na peptidnim vezama proteina, a pozitivna je ako ispitivani


materijal sadrţi barem dve peptidne veze. Kompleksno biuretsko jedinjenje ljubiĉaste boje dobija
se kada proteini/peptidi doĊu u reakciju sa razblaţenim rastvorom bakar-sulfata u prisustvu
NaOH. Intenzitet boje biuretskog kompleksa direktno je proporcionalan koncentraciji proteina u
uzorku. Fotometrijsko merenje se vrši pomoću ţuto-zelenog filtera (545 nm). Boja je stabilna
nekoliko sati.
Materijal za izvoĊenje metode i njegova priprema: biuretski reagens, rastvor NaOH
masene koncentracije 30 g/l. Biuretski reagens se pravi na sledeći naĉin: rastvori se 17,3 g
CuSO4 x 5H2O u 100 ml destilovane vode. U posebnoj ĉaši se rastvori 173 g Na-citrata i 100 g
Na2CO3 (anhidrida) u 800 ml destilovane vode uz zagrevanje. Sadrţaj se profiltrira u normalan
sud od 1000 ml. Posle hlaĊenja dodaje se rastvor CuSO4 i dopunjava sa destilovanom vodom do
1000 ml.
Naĉin izvoĊenja metode: 1. 4,9 ml NaOH, 0,1 ml seruma, 1,0 ml biuretskog reagensa; 2.
5 ml NaOH i 1,0 ml biuretskog reagensa (slepa proba). Epruvete se izmešaju i stavljaju da
odstoje 15 minuta na sobnoj temperaturia zatim se oĉitava intenzitet razvijene boje na
kolorimetru.
Koncentracija proteina u serumu se izraĉunava prema sledećoj formuli:
koncentracija proteina (g/l) = (Euz/Est)xCstx10.

104
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4.6 ODREĐIVANJE PROTEINA U KRVNOJ PLAZMI PHILLIPS VAN SLYKE-OVOM


METODOM

Metoda je gravimetrijska, gde se koncentracija proteina odreĊuje na osnovu rezultata


merenja relativne gustine krvne plazme pomoću rastvora bakar sulfata poznate koncentracije.
Naĉin izvoĊenja metode: Kap krvne plazme se spusti u rastvor bakar sulfata i na njenoj
površini se formira bakar-proteinat. Kap pada na dno (ako mu je specifiĉna teţina veća od
specifiĉne teţine rastvora bakar sulfata) ili lebdi (15-20 sekundi ako je specifiĉna teţina ista) ili
se penje naviše (ako je specifiĉna teţina kapi manja).
Za izvoĊenje reakcije potrebno je napraviti seriju rastvora bakar sulfata gustine od 1,015
do 1,075 i krvna plazma.
Pomoću pipete krvna plazma se sipa (kap) u seriju rastvora bakar sulfata razliĉite
specifiĉne gustine. Zapisuje se relativnu gustinu onog rastvora u kome je kap plazme posle
stavljanja u rastvor lebdela 15-20 sekundi.
Ukupna koncentracija proteina plazme se odreĊuje prema formuli: P=Kx(S-A)
P – proteinemija izraţena u gramima na 100 ml plazme
S –relativna gustina
A – relativna gustina ultrafiltrata krvne plazme 1,006-1,007
K – konstanta koja iznosi 364 tj. 343 shodno vrsti ţivotinje.

105
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4.7 ODREĐIVANJE KONCETRACIJE UREE PO BERTELOTH-U

Metoda sluţi za odreĊivanje koncentracije ureje u krvnom serumu i urinu. Ureja se, u
prisustvu ureaze, razlaţe na amonijak, ugljen dioksid i vodu. Amonijak u baznoj sredini reaguje
sa fenolom i hipohloritom, pri ĉemu nastaje indofenol plave boje. Kao katalizator se koristi
natrijum-nitroprusid. Za oĉitavanje se koristi zeleni filter (540 nm).
Potrebni reagensi u ovoj reakciji su: ureaza u fosfatnom puferu (pH 7,4), standardni
rastvor ureje 5M, fenolni reagens, hipohloritni reagens, serum ili urin (razreĊenje 1:100).
Reagensi se u epruvete razlivaju po sledećoj šemi:

Serum (ml) Urin (ml) Standard Slepa proba


(ml) (ml)
Epruveta br. 1 2 3 4
Ureaza 0,1 0,1 0,1 0,1
Serum 0,02 / / /
Urin / 0,02 / /
Standard / / 0,02 /
Voda / / / 0,02
Zatim se sadrţaji epruvete promešaju i inkubiraju 15 min na 37°C,
a nakon toga se dodaju reagensi po sledećoj šemi
Fenolni 2,5 2,5 / /
reagens (ml)
Hipohlorni 2,5 2,5 2,5 /
reagens (ml)
Potom se vrši fotometriranje

Koncentracija uree u mmol se izraĉunava prema sledećim formulama:


konc.uree u serumu = ((Eser-Esp)/(Est-Esp))xC
konc.uree u urinu = ((Eur-Esp)/(Est-Esp))xCx100x1,5
Eur – ekstinkcija ispitivanog urina
1,5 – proseĉno dnevno izluĉivanje mokraće (ĉovek)
100 – razblaţenje mokraće (1:100)

106
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4.8 ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE KREATININA MOKRAĆE PO JAFFE-U

Kreatinin sa pikrinskom kiselinom u alkalnoj sredini daje obojenu reakciju, koja stvara
crveni tautomer kreatinin-pikrata. Po razvoju boje na kolorimetru se oĉitava vrednost apsorbance
(490 nm).
Potrebni reagensi su: pikrinska kiselina (12 g/L), rastvor NaOH (2,5 mol/L) i standard
kreatinina (0,1 mg/ml).
Naĉin izvoĊenja metode: U ĉašu od 100ml sipa se 2 ml mokraće i dodaje 3 ml zasićenog
rastvora pikrinske kiseline i 1 ml NaOH. Potom se sipa destilovana voda do 100 ml. U drugom
sudu se ponavlja procedura ali se umesto mokraće dodaje standard.
Koncentracija kreatinina se izraĉunava prema sledećoj formuli:
Konc.kreatinina (mg/l) = (Est/Eur)x0,2x50x10

4.9 ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE KREATINA MOKRAĆE PO


BENEDICT-MEIERS-U

Metoda se zasniva na hidrolizi kreatina zagrevanjem sa kiselinom, kada kreatin prelazi u


kreatinin.
Naĉin izvoĊenja metode: U ĉašu od 100 ml se stavi 50 ml mokraće, doda se 5 ml HCl
(mol/l) i zagreva se u toku 5 minuta na 117°C. Potom se vrši hlaĊenje i neutralizacija sa 5 ml
NaOH (mol/l). Zatim se doda destilovana voda do 100 ml, dobro promućka i uzme 4 ml za dalje
odreĊivanje sadrţaja kreatinina metodom po Jaffe-u.

107
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4.10 ODREĐIVANJE KALCIJUMA U MOKRAĆI PO KRAMMER-U I TISDALL-U

Princip ove analize je u taloţenju kalcijuma rastvorom amonijum-oksalata u obliku


kalcijum-oksalata. Taloţenje magnezijuma spreĉava se dodatkom amonijum-hlorida. Kalcijum-
oksalat pod dejstvom sumporne kiseline oslobaĊa oksalnu kiselinu, koja se titrira sa
permanganatom.
Amonijum-hlorid u kristalima, amonijak, koncentrovana sirćetna kiselina, zasićen rastvor
amonijum-oksalata, HCl masene koncentracije 100 g/l, H2SO4 konc. 200 g/l, KMnO4 konc. 0,1
mol/l, ĉaše, pipete, birete i epruvete.
Naĉin izvoĊenja metode: U ĉašu od 250 ml staviti: 100 ml mokraće, 3 g amonijum
hlorida i 3 ml amonijaka, koji dodajemo kap po kap. Obrazovani talog fosfata gubi se dodatkom
koncetrovane sirćetne kiseline. Sve se zagreva do kljuĉanja, dodaje se 5 ml zasićenog rastvora
amonijum-oksalata, zatim se filtrira do sledećeg dana. Zatim se talog koje skupio na filtru ispira
toplom vodom sve dok filtrat sadrţi oksalnu kiselinu (filtrat kontrolisati sa AgNO3). Posle ovoga,
isprani talog staviti u staklenu ĉašu. Da bi se sav talog sa filter-papira isprao, preko filter papira
se sipa HCl (da razori filtar) i topla destilovana voda. Zatim se u ĉašu dodaje 10 ml H2SO4 i
zagreva se do 60°C. OsloboĊena oksalna kiselina pod dejstvom H2SO4 titrira se sa KMnO4 do
pojave postojane roze boje.
1 ml KMnO4 odgovara 0,05 mmol CaO, pa se koncentracija Ca (mmol/l) izraĉunava
mnoţenjem broja utrošenih mililitara pomnoţenih sa 0,05 i sa 10.

108
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4.11 ODREĐIVANJE AKTIVNOSTI ALKALNE FOSFATAZE (AP) PO KING-U

Prema Kingu i Armstrongu jedinica alkalne fosfataze (AP) je ona koliĉinu enzima koji
oslobaĊa 1 mg fenola za 15 minuta, tj. 3 mg fosfora za isto vreme. Za odreĊivanje AP se koristi
osloboĊeni fenol, fosfor ili Ca-glicerofosfat, koji se dobijaju reakcije sa dinatrijum-fenilfosfatom.
Za izvoĊenje reakcije potrebni su sledeći reagensi: a) pufer 0,1 mol/l natrijum bikarbonat;
b) 0,01 mol/l dinatrijum fenilfosfata (rastvor najpre prokljuĉa, a potom se ohladi i ĉuva uz malo
hloroforma); c) Folin-Ĉukalto reagens; d) osnovni standard fenola (1 g kristalnog fenola
rastvoriti i dopuniti do litra sa 0,1 mol/l HCl); e) standard fenola (5 ml standardnog fenola se
odmeri u balon od 500 ml, dodaje se 100 ml razblaţenog (1:3) Folin-Ĉukaltovog reagensa i
dopuni se vodom do 500 ml).
Naĉin izvoĊenja metode: u konusnu epruvetu od 10 ml sipa se pipetom 2 ml pufera i 2 ml
supstrata (dinatrijum fenilfosfat). Stavlja se u vodeno kupatilo na 37°C i inkubira tokom 3
minuta. Zatim se doda 0,2 ml krvne plazme i promeša. Vraća se da još 15 minuta stoji u
vodenom kupatilu. Dodati 1,8 ml razblaţenog Folinovog reagensa, izmeša se i centrifugira
(2500 obrtaja, 5 min). Kontrola: U epruvetu za centrifugiranje uspe se 2 ml pufera i 2 ml
supstrata uz dodatak 1,8 ml Folinovog razblaţenog reagensa i 0,2 ml krvne plazme.
Centrifugirati kao predhodno (2500 obrtaja, 5 min). U epruvetu se uzme po 4 ml supstrata ili
filtrata i svakoj dodaje 2 ml karbonata (150 g/l) i po 4 ml vode. Stavlja se u vodeno kupatilo 10
minuta na 37°C, da se razvije boja. Pravljenje standarda podrazumeva da se u epruvetu stavi 4 ml
standardnog fenolnog rastvora, doda 2 ml karbonata i 4 ml vode. Drţi se u vodenom kupatilu
zajedno sa probom. Nakon navedenog vrši se fotometriranje na 660 nm.
Broj jedinica alkalne fosfataze u 100 ml plazme izraĉunava se prema sledećoj formuli:
Uap = ((Ep-Ek)/Est)x30
Ep – ekstinkcija probe, Ek – ekstinkcija kontrole, Est – ekstinkcija standarda.

109
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4.12 ODREĐIVANJE AKTIVNOSTI LAKTAT DEHIDORGENAZE (LDH) U KRVNOM


SERUMU

Za ovo odreĊivanje koristi se Warburg-ov test. Potrebno je: 0,1 mol/l fosfatni pufer (pH
7,4); 0,1 mol/l rastvor Na-piruvata; 0,1 mol/l rastvor NADH. U kivetu fotometra dodati reagensle
po sledećem redosledu i u sledećoj koliĉini: pufer (1,5 ml), Na-piruvat (0,1 ml), NADH (0,05
ml), voda (0,32 ml) i serum (0,05 ml).
Naĉin izvoĊenja metode: Pre dodavanja enzima sadrţaj treba dobro promešati plastiĉnim
štapićem i izmeriti ekstinkciju na 340 ili 366 nm. Poĉetna ekstinkcija se ponovo proverava posle
1-2 minuta. Reakcija poĉinje dodavanjem enzima (sveţeg seruma krvi), pa se po dodavanju i
mešanju ekstinkcija oĉitava svakih 30 sekundi. Posle završenog višeminutnog oĉitavanja
izraĉunava se promena ekstinkcije u minutu.
Promena ekstinkcije u minutu na nivou 0,001 odgovara jednoj jedinici enzimske
aktivnosti.

110
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4.13 ODREĐIVANJE AKTIVNOSTI α-AMILAZE U KRVNOM SERUMU

Za odreĊivanje aktivnosti ovog enzima koristi se metoda po Wohlgemuth-u. Princip


reakcije se zasniva na sposobnosti da amilaze razlaţu skrob do maltoze, preko serije
intermedijernih proizvoda – dekstrina. Skrob i njegovi meĊuprodukti daju bojene reakcije sa
jodom. Skrob sa jodom boji plavo, a dekstrini od ljubiĉaste preko crvene do bezbojne. Jedinica
aktivnosti amilaze je ona koliĉina enzima koja je u stanju da hidrolizira 1 ml rastvora skroba pod
odreĊenim uslovima. Ĉitanjem razblaţenja dobija se broj jedinica amilaze u ispitivanom serumu,
te ako je razblaţenje 1:32 to znaĉi da koliĉina enzima u 1/32 ml krvi hidrolizuje 1 ml rastvora
skroba.
Materijal za izvoĊenje ove metode: a) pufer (1 litar rastvora KH2PO4 0,066 mol/l i 1 litar
rastvora Na2HPO4 0,066 mmol/l, ĉuvaju se u odvojenim bocama sa po 5 ml hloroforma); b)
fiziološki rastvor NaCl u puferu pH=7,3 (1 g NaCl u 77ml Na2HPO4 i 23 ml KH2PO4); c)
Lugolov rastvor (R=1:2), 10 g/l i d) rastvor skroba 10 g/l.
Naĉin izvoĊenja metode: Uzme se 9 epruveta i obeleţe se brojevima od 2 do 10. U svaku
epruvetu se sipa po 1 ml puferizovanog fiziološkog rastvora. U epruvetu obeleţenu brojem 2
dodaje se 1 ml krvnog seruma. Zatim dobro izmeša, pa se 1 ml smeše iz epruvete broj 2 prenese
u epruvetu broj 3, pa se iz epruvete 3 uzme 1 ml i sipa u epruvetu 4 i tako redom do epruvete 10.
Na kraju iz epruvete 10 izbaci 1 ml smeše. U sve epruvete se doda po 1 ml rastvora skroba.
Epruvete se promešaju i stavljaju u vodeno kupatilo na 37°C na inkubiranje 30 minuta. Nakon
inkubacije epruvete se ohlade pod mlazom tekuće vode. U svaku epruvetu, poĉevši od 10. do 2.,
dodati po jednu kap razblaţenog Lugolovog rastvora.
U epruvetama gde postoji veliko razblaţenje seruma aktivnost enzima je niska, pa skrob
ostaje nehidrolizovan i daje plavu boju sa Lugolovim rastvorom. Sa smanjenjem razblaţenja
aktivnost enzima je viša, pa dolazi do postepene hidrolize skroba.
U tabeli su prikazani brojevi epruveta, razblaţenja seruma i broj jedinica:
Epruveta br. 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Razblaţenje
1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024
seruma
Broj jedinica 4 8 16 32 64 128 256 512 1024

111
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

Za odreĊivanje broja jedinica alfa-amilaze uzimamo epruvetu sa najvećim razblaţenjem u


kojoj je aktivnost enzima takva da hidrolizuje skrob. Stepen razblaţenja odgovara broju
Wohlgemuth jedinica (WU) aktivnosti amilaze. Fiziološke vrednosti za serum su 32, a za urin 8-
64 WU.

112
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4.14 ODREĐIVANJE AKTIVNOSTI ASPARTAT AMINOTRANSFERAZE (AST) U


KRVNOM SERUMU

AST se u sveţem serumu odreĊuje dinamiĉkom metodom, putem indikatorske reakcije.


L-asparat i alfa-ketoglutarat daju, pod katalitiĉkom aktivnošću AST, L-glutamat i oksalacetat.
Koliĉina nastalog oksalacetata ukazuje na stepen aktivnosti AST. Povećanje koncentracije
oksalacetata odreĊuje se pomoću indikatorske reakcije sa NADH (malat dehidrogenaza
katalizator), gde se dobija L-malat i NAD+. Promena koncentracije NADH registruje se na 340
ili 366 nm i predstavlja indirektno meru aktivnosti AST.
Neophodni su sledeći reagensi: a) 0,1 mol/l fosfatni pufer pH=7,4; b) 40 mM L-aspartata
(0,5324 g L-aspartata rastvoriti u 100 ml 0,1 M fosfatnog pufera pH=7,4); c) 12 mM redukovani
nikotinamid-adenin-dinukleotid NADH (0,008551 g NADH se rastvara u 1 ml redestilovane
vode); d) 2,5 mg malat dehidrogenaze (MDH) rastvara se u 10 ml demineralizovane vode; e)
0,25 M alfa-ketoglutarat (3,652 g alfa-oksigluterne kiseline se rastvara u 100 ml redestilovane
vode i kontrolisati pH).
Fotometriranje se vrši na 340 ili 366 nm, pri temperaturi od 25°C (drţati kivetu u
temperiranom drţaĉu). U kivetu se pipetom dodaje: 3,0 ml fosfatnog pufera, 0,05 ml NADH,
0,05 ml MDH i 0,5 ml ispitivanog krvnog seruma. Sadrţaj se dobro promeša i ostavi da odstoji 5
minuta na 25°C.
Reakcija zapoĉinje dodatkom 0,1 ml rastvora alfa-ketoglutarata, brzo se promeša,
poĉetna ekstinkcija se podesi na 0,5, ukljuĉi se štoperica i meri se promena ekstinkcije na svaka
2 minuta, tokom 6-10 minuta. Radi se nekoliko paralelnih proba.
Iz dobijenih rezultata se izraĉunava razlike vrednosti dobijenih po isteku svaka dva
minuta, pa naći srednju vrednost. Dobijeni rezultat se podeli sa dva da bi se dobila promena u
minuti. Mnoţenjem promene sa brojem 2,242 (ako je vršeno merenje na 366 nm) odnosno 1,190
(ako je vršeno merenje na 340 nm) dobija se vrednost AST u milijedinicama po mililitru krvnog
seruma (mU/ml).

113
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4.15 ODREĐIVANJE MASNIH KISELINA IZ LIPIDA GASNO-TEĈNOM


HROMATOGRAFIJOM

U ovoj vrsti hromatografije mobilna faza je gasovita, a stacionarna faza je teĉna. Za


odreĊivanje masnih kiselina obiĉno se koristi azot kao mobilni gas, uz primenu hidrogen-
plamenog jonizacionog detektora. Inertni gas, kao mobilna faza, ima funkciju nosaĉa ili
transportera slobodnih masnih kiselina kroz kolonu. Kolona je izgraĊena od inertnog ĉvrstog
materijala i predstavlja nosaĉ stacionarne faze, koju ĉini neisparljiva teĉnost uniformno
dispergovana duţ kolone. Ta stacionarna faza selektivno zadrţava razliĉite slobodne molekule
rastvora, tako da ovi napuštaju kolonu u razliĉito vreme. Prolaskom gasa kroz odgovarajući
detektor mogu se dobiti, pomoću pisaĉa ili na monitoru, koliĉine razdvojenih masnih kiselina.
Gasni hromatograf se sastoji od: a) injektirane kutije sa brzim grejanjem, b) metalne ili
staklene dugaĉke kolone smeštene u termostatiranoj peći, c) detektor za registrovanje pikova koji
se odnose na koliĉinu selektivno razdvojenih masnih kiselina.
Postupak odreĊivanja masnih kiselina gasnom hromatografijom odvija se u tri faze: 1)
pripremanje apsolutno suvog metanola, 2) metanoliza i esterifikacija masnih kiselina, 3)
hromatografsko razdvajanje i oĉitavanje.
Priprema apsolutnog metanola – U destilacioni balon (2 lit.) se stavlja 5 g
magnezijumovih opiljaka i 0,5 g resublimovanog joda i spajia se sa povratnim kondenzatorom.
Kroz otvor kondenzatora unosi se u balon 50 ml apsolutnog metanola i smeša se zagreva sve
dok jod ne išĉezne (nestanak boje), pri ĉemu se vodonik energiĉno izdvaja, a magnezijum prelazi
u Mg-metoksid. U sluĉaju slabog toka reakcije dodaje se naknadno 0,5 g joda i ponovo zagreva
do potpunog formiranja metoksida. Sistemu zatim dodati 900 ml metanola i zagrevati u toku 30
min. Destiliše se metanol pod anhidrovanim uslovima umetanjem jedne suve otvorene cevi
napunjene sa CuSO4 i spojene sa kolektorskim adaptorom. Odbacuje se prvih 50 ml destilata.
Balon sa suvim metanolom, koji je pokriven, stavlja se na vagu i vrlo lagano se pušta mehuriće
HCl kroz metanol sve dok vodonikhlorid ne dostigne 6% od ukupne teţine. Ovaj balon sadrţi
dva lateralna otvora sa polietilenskim zatvaraĉima, pri ĉemu se kroz jedan od njih uvodi HCl u
metanol, a drugi sluţi za izvoĊenje neapsorbovanog gasa. Gas HCl se predhodno propušta kroz
koncentrovanu sumpornu kiselinu. Neapsorbovana HCl se hvata u posebnu bocu koja sadrţi

114
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

zasićeni vodeni rastvor NaOH. 6%-HCl-metanol se u polietilenskim balonima od 250 ml ĉuva na


-20°C do jedne godine.
Naĉin izvoĊenja metode:
Esterifikacija pojedinih klasa izolovanih lipida HCl-metanolom – U kivete koje sadrţe
pojedine frakcije lipida, predhodno razdvojene hromatografijom na tankom sloju, dodaje se 4 ml
predhodno pripremljenog metanol-HCl rastvora i odmah uz povratni kondenzator drţi se na
suvom (pešĉanom) kupatilu na 86°C u trajanju od 2 ĉasa (vreme potrebno za metanolizu
triglicerida) odnosno 24 ĉasa (za sfingomieline, cerebrozide i voskove). Posle esterifikacije
kivete se odvoje od kondenzatora, zatvore se zapušaĉem i ohlade na sobnoj temperaturi. U tako
ohlaĊenu kivetu dodaje se 8 ml destilovane vode i energiĉno promeša. Smeši se potom doda 5 ml
petrol-etra, dobro promeša i ostavi da se emulzije razdvoje u faze. Gornja faza (petrol-estarska
faza) se ukloni paţljivo pipetom i stavi se u graduisanu kivetu za centrifugiranje.
Hromatografija metilnih estara – Odredi se stabilnost instrumenata registrovanjem bazne
linije na pisaĉu, u periodu 2h okvir u kome ta linija treba da je potpuno ravna i sledi najniţu
horizontalnu liniju na registratorskom papiru. Posle stabilizacije injektirati 0,1 do 4 μl standardne
smeše metil estara (sastoji se od laurata, miristata, palmitata, palmitoleata, stearata, oleata,
linoleata, linolenata i arahidonata). Sadrţaj se brzo unosi i izlaĉi brizgalica. Na pisaĉu se odmah
obeleţi poĉetna-referentna taĉka merenja (sa O), znaĉajnu za izraĉunavanje vremena retencije.
Ako postoji raĉunarsko kontrolisan proces, baţdarenje i poĉetno obeleţavanje se automatski vrši.
Promene koje registruje detektor se upisuju u formi pikova na papiru pisaĉa ili na
raĉunarskom dijagramu, pri ĉemu svaki pik treba da se po visini nalazi u okviru širine papira,
ako je pisaĉ u pitanju. Ukoliko je potrebno u toku analize smanjiti visinu pika, onda se pik mora
obeleţiti. Ako je razdvajanje u koloni kvalitetno pikovi će biti simetriĉni sa ravnom baznom
linijom i neće se preklapati meĊusobno. MeĊutim, perfektno dobijanje pikova je vrlo teško ako
se u uzorku-smeši nalazi dosta razliĉitih kiselina sa razliĉitim koncentracijama.
Posle završetka razdvajanja i registrovanja neophodno je odrediti vreme retencije za
svaki pik (estar), merenjem rastojanja od obeleţene taĉke O do centra svakog pojedinaĉnog pika.
Razdvojeni pikovi iz standardne miksture imaju redosled odvajanja: 12:0, 14:0, 16:0, 16:1, 18:0,
18:1, 18:2, 18:3 i 20:4.

115
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

Nakon hromatografisanja standardne miksture i odreĊivanja vremena retencije za svaki


metil-estar iz smeše se u kolonu injektira 5 μl metil-estarskog ekstrata iz uzorka kao u
predhodnoj analizi standarda. Odredi se vreme retencije.
UporeĊivanjem vremena retencije kiselih estara iz standardne smeše sa onima iz
analiziranog uzorka moţe se identifikovati kiselinski sastav (metil-estri) uzorka i njihov odnos
koncentracija.
Površina pika se lako odreĊuje softverski. MeĊusobnim uporeĊivanjem površine pika i
ukupne površine svih pikova lako se odreĊuje zastupljenost pojedine masne kiseline, tj. njenog
metil-estra.
Prilikom rada sa gasnim hromatografom mora se paziti da kolone budu u dobrom stanju,
tako da kapacitet razdvajanja i retencija za metil estre treba da budu nepromenjeni tokom dana.
Kada se to više ne moţe postići kolonu treba zameniti.
Sjedinjenjem solventa i posebnom obradom, on se moţe konzervisati i ĉuvati za
eventualne dodatne analize.

116
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4.16 ODREĐIVANJE NEESTERIFIKOVANIH MASNIH KISELINA (NEFA)

NEFA vezane za albumin predstavljaju vrlo znaĉajni pokazatelj energetskog


metabolizma, a njihovo odreĊivanje je posebno indikovano kod krava u peripartalnom periodu.
NEFA se u svakodnevnom kliniĉkom radu odreĊuje enzimatskom metodom
upotrebljavajući Acil-CoA oksidazu, koja daje odliĉnu specifiĉnost i standardizovanu proceduru.
Kao bojeni indikator koristi se 3-metil-N-etil-N-(β-Hidroksietil)-anilin, koji se boji ljubiĉasto.
Tok reakcija je sledeći: 1) aktivacija slobodnih masnih kiselina uz delovanje acil-CoA-
sintetaze; 2) oksidacija cil-CoA sa acil-CoA-oksidazom uz nastanak vodonik peroksida; 3)
oksidativno spajanje 4-aminofenazona i 3-metil-N-etil-(β-Hidroksietil)-anilina sa vodonik
peroksidom u ljubiĉato-crvenkast proizvod.
Rastvori:
Rastvor 1 – acetil-CoA, ATP i acetil-CoA-sintetazu u tris puferskom rastvoru pH 7,6;
Rastvor 2 – acil-CoA-oksidaza, peroksidaza, 4-aminofenazon i 3-metil-N-etil-(β-Hidroksietil)-
anilina.
Merenje se vrši standardnom fotometrijskom metodom pri talasnoj duţini od 546 nm, na
37°C, a meri se apsorbanca nasuprot slepoj probi reagensa.
U tabeli su prikazani sadrţaji epruveta:

Slepa proba Standard Uzorak


Dejonizovana voda 0,05 ml / /
Kalibracioni pool
/ 0,05 ml /
serum
Serum/plazma / / 0,05 ml
Rastvor 1 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml
Epruvete zaĉepiti, sadrţaj dobro promućkati i staviti ih
u vodeno kupatilo tokom 10 minuta.
Rastvor 2 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml

117
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

Posle stavljanja rastvora 2 u epruvete ponovo dobro promućkati epruvete i 10 minuta ih


staviti u vodeno kupatilo. Zatim se epruvete hlade na sobnoj temperaturi i meri se absorbanca
rastvora. Postojanost obojenog proizvoda trebala bi da bude najmanje 20 minuta.
Izraĉunavanje se vrši po sledećoj formuli:
NEFA (mmol/l)= (Aps.uzorka/Aps.standarda) x Konc.standarda.

118
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4.17 KVANTITATIVNO ODREĐIVANJE LIPOPROTEINA SERUMA ELEKTROFOREZOM


NA TANKOM SLOJU AGAROZE

Za izvoĊenje ove metode potrebno je: serum, puferski rastvor Na-barbitala koncentracije
supstance 0,05 mol/l, pH 8,6 sa rastvorom EDTA koncentracije mase 0,35g/l; kolorimetrijska Fat
Red 7B boja u smeši metanol-voda u odnosu 2; kadica za elektroforezu sa ugljenim elektrodama
i poklopcem sa drţaĉem za gel; agarozni gel; mikrolitarska pipeta; transformator jednosmerne
struje i komora za sušenje gelova (temperatura 70°C).
Naĉin izvoĊenja metode: U oba dela kadice sipa se po 100 ml pufera tako da se ne ovlaţi
pregradni zid. Paţljivo se izvadi ploĉica gela iz vrećice i na obeleţeno mesto prema katodnom
delu nanese 0,1 μl seruma. Ploĉa gela agaroze smesti se u poklopac, poklopi se kadica tako da
krajevi gela budu uronjeni u pufer, a potom ukljuĉiti izvor jednosmerne struje. Razvijanje
reakcije traje 45 minuta od uspostavljanja elektroĉnog kola. Po završenoj elektroforezi gel se
izvadi iz poklopca, ocedi višak pufera i suši 30 minuta u komori za sušenje, a potom se na
površinu gela se nanese 10 ml radnog rastvora boje. Bojenje gela traje 4 minuta, posle ĉega se
boja ocedi, a gel ispira 20 sekundi u kadi sa smešom metanola i vode. Ukoliko se gel
denzitometrira ispiranje se vrši samo u destilovanoj vodi. Po ispiranju gel se suši u komori oko
15 minuta, posle ĉega se koncentracija lipoproteina odreĊuje denzitometrijski na 520 nm.

119
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4.18 RAZDVAJANJE POJEDINIH FRAKCIJA FOSFOLIPIDA IZ TKIVA


HROMATOGRAFIJOM NA TANKOM SLOJU

Za izvoĊenje ove metode potrebni su: dobijeni ekstrakt lipida, mešavina hloroform-
metanol-voda (65:25:5, v/v), pripremljene ploĉe sa silika-gelom, kade, tegla sa jodom i fen.
Naĉin izvoĊenja metode: Za hromatografiju se upotrebljavaju staklene ploĉe, dimenzija
20x20 cm. Na ploĉu se celom širinom stavlja tanak sloj adsorbensa (0,5 mm debljine). Kao
adsorbens sluţi silika-gel, koji sadrţi odreĊenu koliĉinu kalcijum-sulfata. Posle sušenja u sušilici,
ploĉe se ĉuvaju u eksikatoru. Za razvijanje hromatograma na ploĉu se nanosi odreĊena koliĉina
pripremljenog ekstrakta, na rastojanju 2 cm od osnove ploĉe. Ukoliko se ekstrakt nanosi na više
mesta, razdaljine izmeĊu mesta nanošenja ne sme biti manje od 1 cm. Supstance se nanose vrlo
paţljivo da se ne naruši integritet sloja adsorbensa. Za razvijanje hromatograma upotrebljava se
mešavina hloroform-metanol-voda (65:25:5, v/v).
Vreme razdvajanja traje oko 60 minuta. Posle razvijanja ploĉe se vade, osuše fenom i
stave u teglu sa elementarnim jodom radi otkrivanja pojedinih lipidnih frakcija.
Pored opisane, kvalitativne metode, dobijene frakcije mogu se i kvantitativno odrediti. U
tom cilju, frakcije se sastruţu sa ploĉe, prenesu u retorte, eluiraju pomoću organskih rastvaraĉa a
njihova koliĉina se odreĊuje kolorimetrijskim metodama, preko jedne od komponenata (P,
holina, šećerne komponente, itd.).

120
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4.19 KVANTITATIVNO ODREĐIVANJE SLOBODNE I VEZANE HCl I CELOKUPNOG


ACIDITETA ŢELUDAĈNOG SOKA

Kiselost ţeludaĉnog soka se izraţava u obliku tzv. titracijske kiselosti. Titracijska kiselost
mera je koliĉina NaOH koncentracije supstance 0,1 mol/l utrošenog za neutralizaciju 100 ml
ţeludaĉnog soka.
Potrebni reagensi: ţeludaĉni sok, NaOH koncentracije supstance 0,1 mol/l, alkoholni
rastvor dimetilamidoazobenzola (indikator) koncentracije mase 5,0 g/l, alkoholni rastvor
fenolftaleina masene koncentracje 10 g/l, epruvete, birete, ĉaše, pipete.
Naĉin izvoĊenja metode: U staklenu ĉašu se stavi 5 ml ţeludaĉnog soka i doda 2-3 kapi
indikatora. Ukoliko u ţeludaĉnom soku ima slobodne HCl, sadrţaj će dobiti izrazito crvenu boju.
U biretu se sipa NaOH, a zatim se ţeludaĉni sok iz birete lagano titrira do pojave narandţaste
boje, koja pokazuje da je slobodna HCl neutralisana. Zabeleţi se broj utrošenih ml NaOH.
Produţava se titracija do pojave limunţute boje, koja je znak da je u ţeludaĉnom soku
neutralisana i vezana HCl. Zabeleţi se ponovo utrošak mililitara NaOH i potom se sadrţaju koji
titriramo doda 2-3 kapi fenolftaleina i oprezno produţi titracija. Posle par dodatih kapi pojavljuje
se crvena boja, što je znak da je neutralizacija završena. Zabeleţi se i ova vrednost utroška
NaOH (broj mililitara).
Vrednost kiselosti ţeludaĉnog soka izraţava se u mmol/l. Broj utrošenih ml NaOH
odgovara broju mmol HCl. Pošto smo titrisali 5 ml ţeludaĉnog soka, da bi smo dobili vrednost u
1000 ml (1 litar) vršimo mnoţenje sa 200.
Primer: ukoliko je za neutralizaciju slobodne HCl utrošeno 2 ml NaOH, aciditet
ţeludaĉnog soka biće 200x2=400 mmol/l, ako je za neutralizaciju vezane HCl potrošeno još 0,8
ml NaOH aciditet će biti 560 mmol/l ((2+0,8)x200), a rezultat utroška još 0,2 ml NaOH do
potpune neutralizacije je celokupni aciditet od 600 mmol/l ((2+0,8+0,2)x200).
Pored navedenog u kliniĉkim ispitivanjima se vrši i merenje hlorhidriĉne proizvodnje, što
podrazumeva ispitivanje sukcesivno uzetih frakcija ţeludaĉnog soka, kako bi se stekao uvid u
stanje ţeludaĉne sekrecije. Hlorhidriĉna proizvodnja se odreĊuje tako što se ukupna koliĉina
ţeludaĉnog soka pomnoţi sa vrednošću aciditeta slobodne HCl u svakoj porciji i proizvod podeli
sa 1000.

121
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

Vrednost HCl se moţe izraziti i u gramima, ako se broj utrošenih ml NaOH pomnoţi sa
0,0356 i sa 200. Ako je vrednost za ukupnu HCl 600 mmol/l, koliĉina HCl će biti 21,36 g.

4.20 ODREĐIVANJE STEPENA REDUKCIJE NITRATA U BURAŢNOM SADRŢAJU

Naĉin izvoĊenja metode: U 3 epruvete se nalije po 10 ml proceĊenog buraţnog soka. U


epruvete se dodaje u prvu 0,2; u drugu 0,5 i u treću 0,7 ml 0,025% rastvora kalijum-nitrita i sve
se stave na 39°C na inkubiranje. Svakih 5min. iz svake epruvete stavljene u termostat uzima se
po 1 kap sadrţaja i na porcelanskoj ploĉici meša sa REAGENS-om I i REAGENS-om II. Sve
dok u test epruvetama ima još neredukovanog nitrita, na porculanskoj ploĉici se pojavljuje
crvena boja. Normalno bi trebalo da se crvena boje više stvara sa sadrţajem iz epruvete br. 1
posle 5-10 min., a iz epruvete 2 posle 25-30 minuta. Odstupanja od normalnih vrednosti su
vezana za ubrzano iščezavanje crvene boje (kod pojaĉanog aktiviteta-ishrana zelenom hranom,
penušavi meteorizam i truljenje u buragu). Moţe da se javi i usporeno iščezavanje crvene boje,
tj. kada se boja stvara znatno duţe nego što je to oĉekivano (kod razliĉitih vrsta gladovanja i
bolesti predţeludaca). Sastav REAGENS-a I je Acid.sulfanil 2,0; Acid. Acetic 30% ad 200ml.
Sastav REAGENS-a II je Alfa-naphthylamin 0,6; Acid acetic. Conc. 16,0; Aquae destil. 140 ml.

4.21 ISPITIVANJE VARENJA GLUKOZE U BURAGU

Naĉin izvoĊenja metode: U Eichhornovu cev stavlja se 10ml buragovog soka i u to


dodaje 0,5ml 16% sveţe glukoze. Ovako formiran sistem se stavlja u termostat na 39°C. Rezultat
probe se oĉitava posle 30 i 60 minuta. Normalni sok buraga stvara 1-2ml gasa za 1 ĉas. U sluĉaju
inaktivnosti buraţnog soka gasa ima manje ili se u opšte ne stvara. Ako se radi o penušavom
nadunu stvaranje gasa je znatno obimnije nego normalno, a pri tome se stvara i pena.

122
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4.22 DOKAZIVANJE AMONIJAKA U BURAŢNOM SADRŢAJU

ProceĊeni sadrţaj buraga, 73,6 mmol/l rastvor sublimata, 670 mmol/l rastvor
kalijumjodida, 1,25mmol/l rastvora NaOH; epruvete, dermatograf, termometar, grejalica,
vodeno kupatilo i ureja.
Naĉin izvoĊenja metode: Pripremi se sveţ Nesslerov reagens stavljanjem u epruvetu 2-
3ml rastvora sublimata i dodavanjem rastvora KJ, sve dok se ţuto-crveni talog merkurijodida,
koji pri tom nastaje potpuno ne rastvori u višku KJ i onda dopuni epruveta rastvorom NaOH.
Isproba se Nesslerov reagens, odlivanjem u epruvetu i duvanjem u nju paru amonijaka iz boce.
Ako je reagens dobar, javlja se crveno-ţuta boja. U epruvetu se sipa 5-6ml proceĊenog sadrţaja
buraga, dodati na vrh noţa ureje in supstantia. U drugu epruvetu uzeti samo 5-6ml proceĊenog
sadrţaja buraga. Epruvete se obeleţe i stave u vodeno kupatilo na 39°C. Posle 30-60 minuta
izvade se obe epruvete iz kupatila. U dve epruvete sipa se po 5-6 ml sveţeg Nesslerovog
reagensa. U jednu epruvetu dodaje se nekoliko kapi sadrţaja buraga u kome je dadata ureja, a u
drugu nekoliko kapi sadrţaja bez ureje.
Pojava crveno-ţute boje u prvoj epruveti dokazuje prisustvo amonijaka.

123
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4.23 ODREĐIVANJE KOLIĈINE ALBUMINA U SERUMU METODOM VEZIVANJA BOJA

Za izvoĊenje ove metode potrebni su sledeći reagensi: fosfatni pufer pH 6,4 i rastvor boje
2-(4'-hidroksi benzazo) heuroĉne kiseline (razblaţenje osnovnog rastvora 1:9).
Naĉin izvoĊenja metode: Razblaţi se 0,5 ml seruma fosfatnim puferom (1:10). Od toga se
po 1 ml prenese u dve epruvete. Jednoj epruveti (I) se dodaje 5 ml boje, a drugoj (II) 5 ml
fosfatnog pufera. Sadrţaj se odmah promeša. Pripreme se dve slepe probe. U jednu se sipa 1 ml
pufera i 5 ml rastvora boje (slepa proba boje, epruveta III), a u drugu se sipa samo pufer (slepa
proba boje seruma, epruveta IV). Standard (epruveta V) sadrţi 1 ml 1:10 razblaţenog rastvora
albumina (4g/100ml) i 5 ml boje. Podesi se nula na fotometru sa sadrţajem epruvete III i zatim
se proĉitaju epruvete I i V.
U tabeli su prikazani brojevi epruvete sa sadrţajem u komentarom:

ml ml
Broj
razblaţenog ml boje ml pufera razblaţenog Komentar
epruvete
seruma albumina
I 1 5 / / Uzorak
II 1 / 5 / Boja seruma
III / 5 1 / Slepa proba za I i V
IV / / 6 / Slepa proba za II
V / 5 / 1 Standard

Podesi se nula sa epruvetom IV i proĉita se sadrţaj epruvete II. Oduzme se vrednost za


boju seruma od test-ĉitanja i dobijene vrednosti uporedi sa ĉitanjem standarda. U toku reakcije
boja se menja od ţute u braon zbog vezivanja boje sa albuminima. Ĉitanje se vrši prema slepoj
probi boje na 490 nm. Serum je ţućkaste boje, pa ga treba ĉitati na istoj talasnoj duţini pufera.

124
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4.24 ODVAJANJE PROTEINA KRVNOG SERUMA ELEKTROFOREZOM NA PAPIRU

Ova metoda se izvodi pomoću aparata za elektroforezu. On se sastoji iz tri osnovna dela:
vlaţne komore, elektroda i elektromagnetnog stabilizatora struje. Vlaţna komora je sud koji se
hermetiĉki pokriva staklenom ploĉom. U komori se sa strane nalaze dve manje posude (komore),
koje su ispunjene puferom. Ove posude su nepokretnom pregradom podeljene na spoljašnji i
unutrašnji deo. U spoljašnjem delu priĉvršćene su elektrode (sa jedne strane anoda+, a sa druge
katoda-), koje su okruţene staklenim labirintnim sistemom, što onemogućuje elektrolitiĉke
promene u pufernom rastvoru. U unutrašnji deo boĉnih posuda, koji je takoĊe ispunjen puferom,
umaĉu se papirne trake za elektroforezu. Boĉne posude su vezane spojnim mostom od plastike.
Pošto se nakvase puferskim rastvorom, papirne trake se postave na spojni most, a zatim urone u
unutrašnje pregrade boĉnih posuda. Posle nanošenja materijala na papirne trake komora se
hermetiĉki poklopi staklenom ploĉom, da bi se postigla zasićenost vazduha vodenom parom, što
spreĉava isušivanje traka. Elektromagnetski stabilizator daje jednosmernu struju konstantnog
napona. Obiĉno se upotrebljava napon od 110 V ili 300-400 V, pri jaĉini struje od 2-4 mA.
Elektroforetska komora je povezana sa stabilizatorom preko koga se aparat i ukljuĉuje, a
pomenute komponente zahtevaju uzemljenje.
Za izvoĊenje ove metode potrebni su reagensi i pribor: a) fosfatni pufer pH=7,5
(odvojeno se rastvara 11,9 g Na2HPO4x12H2O i 9,1 g KH2PO4 u destilovanoj vodi se svaki
rastvor dopuni do 1 litra. Za dobijanje pufera potrebno je 900 ml rastvora Na2HPO4 sa 100 ml
rastvora KH2PO4); b) boja (rastvor brom-fenol plavila masene koncentracije 5,0 g/l – rastvori se
2 g NH4Cl u 1 litar rastvora sirćetne kiseline masene koncentracije 50 g/l i doda se 1 g kristalnog
brom-fenolskog plavila, dobro se promeša i ostaviti da stoji 24h, uz povremeno mešanje, a
sledećeg dana se profiltrira rastvor sirćetne kiseline masene koncentracije 2,0-5,0 g/l); c) sveţ
serum; d) pribor za elektroforezu; e) list hartije za filtraciju; f) mikropipete za nanošenje seruma
na papir za elektroforezu; g) štipaljke; h) kivete za boju; i) kivete za kiselinu; j) stativ; k)
staklena ploĉa; l) ureĊaj za sušenje traka.
Naĉin izvoĊenja metode: 1) napune se boĉne posude fosfatnim puferom, tako da pufer
prekrije gornju ivicu nepokretne pregrade, a nivo pufera u obe boĉne pregrade mora biti
izjednaĉen; 2) u spoljne pregrade postave se elektrode; 3) puferom iz kiveta nakvase se trake

125
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

filtar-papira za elektroforezu i postave se preko spoljnog mosta, tako da im krajevi budu uronjeni
u pufer, koji se nalazi u unutrašnjim pregradama boĉnih posuda; 4) na rastojanju 6-8 cm od kraja
spojnog mosta nanos sei mikropipetom na papirne trake 0,010-0,015 ml seruma. Serum se nanosi
sa strane katode. Pokrije se komora i spoji sa ispravljaĉem. Proveri se voltaţa i snaga
elektroĉnog polja; 5) razdvajanje frakcija belanĉevina traje 6-24h, u zavisnosti od voltaţe.
Po završenom odvajanju napon se snizi na nulu, a potom se pribor iskljuĉi. Papirne trake
se paţljivo vade i stave u komoru za sušenje (90-110°C) tokom 20-30 minuta. U toku sušenja
frakcije se fiksiraju na hartiji.
Suve trake se prenesu pincetom u kivete sa bojom (kiseli rastvor brom-fenolskog plavila).
Bojenje traje 20-30 minuta. Višak boje se ispere u 2,5% rastvoru sirćetne kiseline. Kiselinu treba
menjati 2-3 puta. Po bojenju trake se osuše na vazduhu.
Za kvantitativno odreĊivanje pojedinih frakcija proteina postoji više metoda. Obojene
trake se mogu eluirati i potom fotometrirati na 550-600 nm, pa se ekstinkcija pojedinih frakcija
odreĊuje iz sledeće formule: (ekstinkcija frakcije x 10)/ekstinkcija svih frakcija. Drugi metod je
da se trake stave direktno u aparat (denzitometar), kada se kroz trake propušta snop svetlosti i
intenzitet gašenja svetlosti proporcionalan je gustini frakcije. Propuštenu svetlost hvata fotoćelija
i pretvara je u elektriĉni impuls, pa se formira kriva sa pikovima koji odgovaraju odreĊenoj
frakciji belanĉevina. Kvantitativni odnos frakcija proteina izraĉunava se preko površine pikova.
Treća metoda za odreĊivanje frakcija je da se neobojene trake izreţu ekstrahuju a koliĉina
proteina odredi po Kjeldahlu. Lokacija frakcije se odreĊuje pomoću bojene trake istog uzorka.
Pri izvoĊenju ove metode serum mora biti sveţ i nehemoliziran.

126
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4.25 ODREĐIVANJE DIREKTNOG I INDIREKTNOG BILIRUBINA PO METODI


JENDRASSIK-GROF-A

Bilirubin-diklukuronid reaguje direktno sa diazonijumhloridom (diazotovana sulfonilna


kiselina) dajući pri tom azo-boju koja ima indikatorske osobine. Ako je sredina neutralna, azo-
boja je crvena, a ako je jako kisela ili bazna, azo-boja je zelena ili plava, zavisno od
koncentracije bilirubina. Slobodan bilirubin raguje sa diazonijum-hloridom, ali je potrebno da se
najpre raskine njegova veza sa albuminom, što se postiţe dodatkom etanola, kofeina, Na-
benzoata, Na-acetata i dr. Zbog ovakvog odnosa prema diazo-reaktivu bilirubin-diglukuronid je
nazvan direktnim, a slobodni bilirubin indirektnim.
Reagensi i pribor: serum, rastvor kofeina (25g Na-acetata x 3H2O rastvoriti u oko 150 ml
destilovane vode uz dodatak 15 g Na-benzoata. Kada se obe soli rastvore, doda se 10g kofeina i
mućkanjem rastvori kofein. Dopuni se vodom do 200 ml), diazonijum hlorid (10 ml Diazo I i
0,25 ml Diazo II. Sastav reagensa Diazo I: 5 g sulfanilne kiseline rastvori se u destilovanoj vodi
uz dodatak 15 ml koncentraovane HCl, potom dopuniti vodom do jednog litra. Sastav reagensa
Diazo II je rastvor Na-nitrata koncentracije mase 5,0 g/l, koji se ĉuva u tamnoj boci i obnavlja
svake nedelje), rastvor Feling II (100g NaOH i 350 g kalijum-natrijumtartarata rastvori se u
destilovanoj vodi i dopuni vodom do 1 litra), NaCl 0,16 mol/l, standardni rastvor bilitubina 85,5
μmol/l (5 mg ĉistog bilirubina se rastvori u hloroformu i dopuni hloroformom do 100 ml),
etanolni rastvor Na-bikarbonata (0,6 g Na-bikarbonata i 0,3 g NaCl rastvori se u etanolu i dopuni
istim do 100 ml), epruvete, pipete, stakleni štapić, kolorimetar.
Ukupni bilirubin: U tri epruvete sipati po 1 ml seruma i po 2 ml kofeina. U epruvete 1 i 2
(analiza) se doda po 0,5 ml diazonijum-hlorida (diazo-reagensa), a u epruvetu 3 (slepa proba) 0,5
ml sulfanilne kiseline. Sadrţaj u epruvetama se promeša i ostavi 10 minuta. Zatim se u sve tri
epruvete doda po 1,5 ml Felinga II, sadrţaj promeša i odmah fotometrira prema slepoj probi na
610 nm (crveni filter). Rezultat se ĉita sa standardne krive.
Direktni bilirubin: U tri epruvete se sipa po 1 ml seruma i po 2 ml NaCl. Ostali deo
metode je identiĉan kao odreĊivanje ukupnog bilirubina.

127
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

Pravljenje standardne krive vrši se po sledećim razblaţenjima prikazanim u tabeli:

Br.epruvete 1,2 3,4 5,6 7,8


ml standarda rastvora 1,0 0,5 0,2 0,1
Koliĉina bilirubina
85,5 42,75 17,1 8,55
μmol/l
Ekstinkcija (E)

Brojevima od 1-8 obeleţe se epruvete i u njih sipa onoliko ml standardnog rastvora


koliko je naznaĉeno u tabeli. Stave se epruvete u kupatilo sa kljuĉalom vodom dok sav hloroform
ne ispari, a zatim se izvaditi iz kupatila. Bilirubin u epruvetama rastvoriti u 1 ml Na-bikarbonata
u etanolu. Sadrţaj epruveta se mućka dok se ne izbistri. U bistar rastvor se doda po 2 ml kofeina
i 0,5 rastvora diazonijum-hlorida. Posle 10 minuta dodaje se po 1,5 ml rastvora Felinga II i
odmah fotometrira na 610 nm, pa iz proĉitanih ekstinkcija napravi standardna kriva.

128
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4.26 ODREĐIVANJE BIKARBONATA SERUMA TITRIMETRIJSKI PO SCRIBNERU

Dodata u višku, azotna kiselina istisne iz bikarbonata ugljenu kiselinu, pri ĉemu se
stvaraju nitrati. Višak azotne kiseline se titrira sa bazom istog molariteta. Koliĉinu bikarbonata
izraĉunavamo tako što od ukupne koliĉine HNO3 (u ml) oduzmemo koliĉinu baze (u ml) koja je
utrošena za titriranje viška kiseline.
Za izvoĊenje reakcije potrebno je: sveţ serum, HNO3 konc.0,01 mol/l, difenilkarbazon
koncentracije mase 4 g/l u alkoholu koncentracije mase 950 g/l (indikator), NaOH koncentracije
supstance 0,01 mol/l, pipete, birete i Erlenmajerova boĉica.
U Erlenmajerovu boĉicu od 50 ml staviti 1 ml sveţeg seruma i 10 ml HNO3. Meša se 30
sekundi, da se smeša u tankom sloju sliva niz zidove posude. Potom se doda 5 kapi indikatora, pa
promeša. Sadrţaj se titrira sa NaOH do crvene boje.
Od 10 ml dodate HNO3 oduzme se broj utrošenih ml NaOH za titraciju. Raĉunski
postupak za izraţavanje u vol% i mmol/l je sledeći: (10-X) x 22,4 x 0,4492, gde je X – broj
utrošenih ml NaOH, 22,4 – da bi se izrazilo u vol% CO2 i 0,4492 – faktor za pretvaranje
zapreminskih procenata u mmol/l.

129
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4.27 ODREĐIVANJE PROTROMBINSKOG VREMENA PO QUICK-U

Uticaj faktora protrombinskog kompleksa na brzinu koagulacije plazme ili krvi ispituje se
u prisustvu viška tromboplastina i optimalne koliĉine kalcijuma. Pod takvim uslovima vreme
koagulacije plazme odreĊuje aktivnost protrombina i faktora protrombinskog kompleksa – V,
VII i X. Na obrazovanje trombina utiĉu i inhibitori koagulacije (supstance tipa heparina).
Potrebni reagensi: CaCl2 koncentracije supstance 0,025 mol/l, rastvor tromboplastina,
ispitivana plazma, vodeno kupatilo na 37°C, serološke epruvete.
Naĉin izvoĊenja metode: U serološku epruvetu se sipa 0,1 ml suspenzije tromboplastina i
0,1 ml CaCl2 (zagrejanog nekoliko minuta na 37°C u vodenom kupatilu). Posle 10 sekundi doda
se 0,1 ml ispitivane plazme. Odmah po dodavanju plazme ukljuĉi se štoperica i zabeleţi vreme
koagulacije. Normalna vrednost vremena koagulacije u ovim uslovima je 11-13 sekundi.
Rezultat se moţe izraziti i u procentima normalnih vrednosti, ako se radi sa plazmom
obolelih. Ako se izraţava u procentima normalnih vrednosti, onda se prave razliĉita razblaţenja
normalne plazme i za svako razblaţenje odredi aktivnost, koja se prenese na koordinatni sistem
(razblaţenje na pasciju, a vreme koagulacije na ordinatu) i konstruiše kriva iz koje se moţe
odrediti procenat protrombinske aktivnosti plazme. Postoji i tabela za direktno oĉitavanje.

4.28 ODREĐIVANJE TROMBINSKOG VREMENA PLAZME PO HOUGIE-U

Ako je koncentracija fibrinogena u plazmi u normalnim granicama, plazma će koagulisati


posle dodavanja viška trombina za 9-11 sekundi.
Za izvoĊenje reakcije potrebno je: rastvor trombina u imidazolskom puferu (5 jedinica po
mililitru), citratna plazma koja se ispitije, fiziološki rastvor NaCl, serološke epruvete, vodeno
kupatilo.
Naĉin izvoĊenja metode: U serološku epruvetu se sipa 0,1 ml ispitivane plazme i 0,1 ml
fiziološkog rastvora. Sadrţaj epruvete se promeša i stavi u vodeno kupatilo na 37°C. Posle 10
sekundi doda se 0,1 ml rastvora trombina i zabeleţiti vreme koagulacije plazme.

130
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4.29 ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE FIBRINOGENA U KRVI PO RUTBERG-U

Za izvoĊenje ove reakcije potrebni su krv (ili citratna plazma), Na-citrat koncentracije
mase 38 g/l. CaCl2 koncentracije mase 50 g/l, centrifuga, filtar papir, torziona vaga, epruvete.
Naĉin izvoĊenja metode: U epruvetu za centrifugiranje se sipa 0,5 ml natrijum-citrata i
doda 2 ml krvi uzete iz vene. Posle centrifugiranja uzme se 1 ml plazme u drugu epruvetu. Toj
plazmi se doda 0,5 ml CaCl2 i ĉeka da koaguliše. Pod normalnim okolnostima koagulum se
obrazuje za 7-15 minuta. Koagulum staklenim štapićem preneti na filter-papir i sušiti ga drugim
filter-papirom dok ne išĉeznu tragovi vlage. Osušeni fibrinogen se izmeri na vagi i vrednost
izrazi u mg. Da bi dobili koliĉinu fibrinogena u g/l dobijena koliĉina se pomnoţiti sa
koeficijentom 0,222.

131
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4.30 ODREĐIVANJE EUGLOBULINSKE FIBRINOLIZE PO BUCKELLA-U

Euglobulinska frakcija plazme sadrţi sve faktore koagulacije i fibrinolize. Euglobulini se


taloţe u kiseloj sredini na niskoj temperaturi. Glavna komponenta euglobulina je plazminogen, a
pored toga sadrţi dosta protrombina i ostalih faktora koagulacije.
Reagensi i pribor: Rastvor sirćetne kiseline koncentracije mase 10 g/l, rastvor borata
(odmeri se 1 g natrijum-tetraborata, Na2B4O7 x 10H2O, i 9 g NaCl, prenese se u normalan sud i
dolije vodom do oznake 100 ml), CaCl2 konc. 0,025 mol/l, destilovana voda, epruvete,
centrifuga, filtar papir, vodeno kupatilo, štoperica i epruveta od 20 ml.
Naĉin izvoĊenja metode: U epruvetu od 20 ml se sipa 0,5 ml citratne plazme, 0,1 ml
sirćetne kiseline i 9 ml destilovane vode (pH 5,3). Da bi se staloţila euglobulinska frakcija,
epruveta se ostavi pola sata na 4°C. Potom se vrši centrifugiranje na 3000 ob/min, a formirana
gornja teĉnost se odbaci i epruveta okrene na filter-papir da se osuši. Osušeni talog se rastvori u
0,5 ml rastvora borata, ostavi 3 minuta u vodenom kupatilu na 37°C, a potom doda 0,5 ml
kalcijum-hlorida i zabeleţi vreme koagulacije. Epruveta se i dalje ostavi u vodenom kupatilu i
posmatra svakih 30 minuta, dok ne doĊe do lize koaguluma.
Kod zdravih ljudi liza koaguluma se javlja u roku od 3 sata od momenta obrazovanja
fibrinskog koaguluma do potpunog rastvaranja.

132
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4.31 ODREĐIVANJE KOLIĈINE HEMOGLOBINA U KRVI

Ova metoda se zasniva na ĉinjenici da se hemoglobin pretvara u cijanmethemoglobin (tj.


hemiglobincijanid) u prisustvu KCN i [K3Fe(CN)6] pri pH vrednosti 7,0-7,4.
Naĉin izvoĊenja metode: Rastvori se u destilovanoj vodi 200 mg [K3Fe(CN)6], 50 mg
KCN, 140 mg KH2PO4 i 0,5 ml konc. Sterox Se, pa se dopuni do 1 litra. pH rastvora treba da
bude 7,0-7,4 (pehametrirati). Rastvor se moţe ĉuvati duţe vremena u tamnoj boci na +4°C.
Potrebni su i fotoelektriĉni kolorimetar ili spektrofotometar, pipeta po Salyu od 0,02 ml, pipeta
od 5 ml i epruveta duţine oko 10 cm.
Odmeri se u epruvetu 5 ml reagensa i 0,02 ml (20μl) krvi, pa dobro promeša. Ostavi se da
stoji 2 minuta, kako bi se hemoglobin pretvorio u cijanmethemoglobin. Ekstinkcija se ĉita pri
talasnoj duţini od 540 nm uz odgovarajući filter. Ako se ekstinkcija ĉita na spektrofotometru,
dobijena vrednost se pomnoţi sa koeficijentom 367,7 da bi se dobio hemoglobin u g/l. Ako se
upotrebljava fotoelektriĉni kolorimetar predhodno se napravi kalibraciona kriva.

133
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4.32 ODREĐIVANJE GVOŢĐA U SERUMU

Potrebni su sledeći reagensi: HCl 3 mol/l, trihlorsirćetna kiselina (TCA) masene konc.
200g/l, rastvor o-fenantrolina masene koncentracije 10 g/l apsolutnog alkohola, tioglikolna
kiselina masene konc. 890 g/l, carbo animalis.
Smeša natrijum-acetata i amonijaka: Rastvori se u vodi (uz zagrevanje) 600g natrijum-
acetata i zapremina se dopuni do 1000 ml, pa se doda 20 ml glacijalne sirćetne kiseline i po 40
mg o-fenantrolina. Kada se o-fenantrolin rastvori, dodati se 200-300 mg natrijum-hiposulfata.
Ostavi se rastvor da stoji 24 sata. Potom se rastvoru doda oko 400 mg carbo animalis, promeša i
ostavi da stoji oko 1 sat. Profiltrira se, kroz dupli filtar, u bocu koja nema gvoţĊa. Filtrat ne sme
sadrţati tragove ţivotinjskog uglja. Odmeri se 1000 ml ovog rastvora i doda oko 75 ml
amonijaka masene koncentracije 250 g/l.
U epruvetu se posebno odmeri po 2 ml HCl, TCA i vode. Od toga se uzme 4 ml i doda 2
ml smeše natrijum-acetat-amonijaka. Poslednja smeša se koristi za slepu probu. pH ovog
rastvora treba da bude 4,8-5,0.
U epruvetu od 15 ml se sipa 2 ml seruma, a zatim lagano 2 ml HCl 3 mol/l (da bi se
proteini homogeno taloţili). Lagano se promeša sadrţaj epruvete i ostavi da stoji 10 minuta.
Centrifugira se 20 minuta na 3000 ob/min. U drugu epruvetu se sipa 2 ml smeše natrijum-acetat-
amonijaka, 4 ml gornje teĉnosti dobijene posle centrifugiranja, 0,1 ml o-fenantrolina, pa se
snaţno promućka i doda 0,2 ml tioglikolne kiseline. Sve se promeša staklenim štapićem i ostavi
da stoji najmanje 1 sat i za to vreme će se u potpunosti razviti boja.
Ekstinkcija se ĉita na spektrofotometru pri talasnoj duţini od 510 nm, prema vodi.
Uz svaku analizu gvoţĊa u serumu rade se po tri slepe probe. Srednja vrednost njihovih
ekstinkcija odbije se od ekstinkcije probe seuma, radi korekcije gvoţĊa koje se nalazi u vodi
reaktiva. Koliĉina gvoţĊa izraĉunava se iz standardne krive. Za pravljenje standarda koristi se
rastvor Mohrove soli (fero-amonijum-sulfat), ĉiji se osnovni rastvor razblaţi na odgovarajući
naĉin. Sve analize treba da se rade u duplikatu.

134
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4.33 BOJENJE KRVNIH ELEMENATA

Postoji nekoliko vrsti bojenja krvnih elemenata.


BOJENJE PO GIMZI – U graduisanu epruvetu od 25 ml sveţe pripremi se rastvor
Gimza-boje, tako da se u 1 ml destilovane vode doda 1-2 kapi boje i dobro promeša. Preparat sa
razmazom krvi se fiksira 10-30 minuta u alkoholetru i osuši na vazduhu. Osušeni preparat se
stavi u stakleni sud sa bojom ili boju sipamo pipetom na preparat. Ako boju sipamo pipetom
mikroskopsku ploĉicu treba staviti iznad nekog suda da se boja ne prosipa po stolu. Po ovoj
metodi bojenje traje oko 20 minuta, posle ĉega se preparat pere u desilovanoj vodi, dok ne dobije
ruţiĉasto crvenkast izgled, potom osuši na vazduhu i posmatra. U preparatu razmaza bojenom
ovom metodom vide se: ruţiĉaso-crveno obojeni eritrociti, slabo plavo obojeni trombociti,
neutrofili sa plavim jedrom i bezbojnom citoplazmom, eozinofili obojeni tamno crveno, tamno
plavi bazofili i limfociti sa tamno plavim jedrom i svetloo-plavom citoplazmom.
BOJENJE PO WRIGHT-U – Postoji gotov preparat boje u prahu. 0,1 g boje dobro
rastreti u avanu, da bi dobili što sitniji prah. Postepeno se doda 60 ml hemijski ĉistog
metilalkohola, pa se ostavi dve nedelje da stoji u dobro zapeĉaćenoj tamnoj boci. Po isteku
navedenog vremena boja je spremna za upotrebu. Predhodno fiksiranje preparata nije potrebno.
Na osušen preparat krvi sipa se boja i bojenje traje 1 minut. Potom se dodaje kap po kap
destilovanje vode, uz naginjanje preparata, da se preparat izmeša i ostavi 3 minuta. Potom se
boja odliuje, preparat se pere i destilovanom vodom osuši na vazduhu. Skraćena Wright-ova
metoda se izvodi na sledeći naĉin: na vazduhu osušen preparata razmaza krvi najpre se fiksira u
metanolu i boji 2-3 minuta 30% alkoholnim rastvorom Wtight-ove boje u destilovanoj vodi.
Posle bojenja vidljive su sledeće ćelije: ţuti eritrociti, purpurna jedra leukocita, crvenkasto-
ljubiĉaste neutrofilne granule, jasno crveni eozinofili, bazofili tamno plave boje, tamnoljubiĉasti
trombociti, plava citoplazma limfocita i slabo plaviĉast monocit.
MAY GRÜNWALD BOJENJE – Za ovu metodu dovoljno je da preparat bude samo
osušen na vazduhu, jer boja istovremeno i fiksira. Preko preparata razmaza sipa se boja uz
pomoć pipete i boji 2-3 minuta. Zatim se, vrlo oprezno, pipetom doda ista kolĉina destilovane
vode i boji još 5-10 minuta. Na kraju se vrši ispiranje vodom dok preparat ne dobije svetlo
ruţiĉastu boju. Pod mikroskopom se vide: crvenkasti eritrociti, plava jedra, plave ili ljubiĉaste

135
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

bazofilne granule, acidofilne svetlo crvene granile, neutrofilne ljubiĉasto-crvenkaste granule,


sivo-ljubiĉasti trombociti i negranulisana svetlo-plava protoplazma.
BOJENJE PO PAPPENHEIMU – Na vazduhu osušen preparat, bez predhodnog
fiksiranja, pokrije se originalnom May-Grünwald bojom i boji 2-3 minuta. Potom se iz pipete
doda 2 puta destilovane vode i ostavi da se boji još 3-4 minuta. Nakon tog vremena boja se odlije
i, bez predhodnog spiranja destilovanom vodom, preparat prekrije sveţim rastvorom Gimza boje,
3 kapi boje na 2 ml destilovane vode, i boji se još 5-15 minuta. Posle toga preparat se opere u
destilovanoj vodi, osuši i pregleda. Ova metoda pokazuje jasno bojenje jedra i granula.
PEROKSIDAZA BOJENJE PO MOSKOVSKI-U – Razmaz krvi fiksira se 3 minuta u
90% alkoholu i boji naroĉito spremljeno Gimza bojom tokom 15-20 minuta. Za ovu Gimza boju
mesto destilovane vode koristimo rastvor benzidin-perhidrola. Rastvor mora biti sveţe
napravljen na sledeći naĉin: rastvori se nekoliko kristalića benzidina u vodi, energiĉno
promućka, filtrira i na svakih 2 ml filtrata doda 1 kap 30x razblaţenog perhidrola. Granule
eozinofilnih i neutrofilnih polimorfonukleara boje se zlatno-ţutom do ţuto-smeĊom bojom.
Limfociti i bazofili ostaju neobojeni, dok se monociti i mijeloblasti oboje. Ova reakcija se radi u
cilju dokazivanja oksidaza, kako bismo diferencirali ćelije limfatiĉne i mijeloidne grupe, koji se
ponašaju pozitivno prema ovoj reakciji. Ova metoda je znaĉajna kod dijagnostike leukemija i
leukemiĉnih reakcija.
PAS BOJENJE – Ovo je reakcija za lakše prepoznavanje limfatiĉnih ćelija na osnovu
prisutnosti polisaharida, najviše glikogena. Perjodna kiselina cepa C-C vezu u polisaharidima,
ako sadrţe oba C-atoma OH-grupe. OH-grupe se tom prilikom oksidišu u aldehidne grupe i
reaguju sa Schiff-ovim reagensom (fuksin sumporna kiselina) uz nastanak jedinjenja crvene boje.
Polisaharidi mogu biti slobodni (glikogen) ili u vidu mukopolisaharida, glukoproteina i
mukoproteina. Na vazduhu osušene preparate venske krvi ili koštane srţi fiksiramo 5-15 minuta
u metanolu. Preparate peremo destilovanom vodom i prenesemo u posudicu sa rastvorom
perjodne kisleine tokom 10 minuta. Preparate peremo destilovanom vodom (5 minuta) i
prenesemo u posudicu sa Schiff-ovim reagensom u kome će stajati 45 minuta. Zatim ih peremo
tri puta sa SO2-reagensom (kalijum metabisulfat sa rastvorom sone kiseline) i prenesemo u
rastvor hematoksilina tokom 20 minuta, radi kontraksnog bojenja. Preparate peremo tekućom
vodom, sušimo ih na vazduhu i pregledamo pod mikroskopom.

136
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4.34 ODREĐIVANJE FAGOCITNE AKTIVNOSTI NEUTROFILA NUTRO-BLU


TETRAZOLIUM TESTOM (NBT)

Neutrofili su ukljuĉeni u fagocitnu aktivnost elemenata bele loze. Oni aktiviraju enzime
koji su in vitro sposobni da redukuju nitro-blu tetrazolium u tamno-plave kristale formazana.
Monociti su normalno pozitivni na redukciju NBT. Normalne neutrofilne ćelije koje su negativne
na NBT redukciju, posle aktivacije endotoksinom daju pozitivnu reakciju. Negativna reakcija
bez i sa stimulacijom endotoksinom ukazuje na deficijentno stanje.
Materijal za izvoĊenje metode: nitro-blu tetrazolium hlorid 100 mg, E.coli endotoxin
O.55:B5 100 mg, 0,15 M fosfatni pufer pH 7,2 i vodeno kupatilo na 37°C.
Naĉin izvoĊenja metode: 1) Uzme se krv u vakutajner sa heparinom ili u epruvetu uz
dodatak 75-100 jedinica heparina na ml krvi. EDTA se ne sme koristiti kao antikoagulans jer
interferira sa ovim testom. 2) Promeša se 0,1 ml heparizovane krvi sa 0,1 ml NBT rastvora. 3)
Inkubira se 15 minuta na 37°C u vodenom kupatilu i potom zaklopiti tube. 4) Ostaviti epruvete
na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta. 5) Napravi se razmaz krvi i oboji ga po Wright-u. 6)
Posmatra se pod mikroskopom razmaz i traţe se tamni depoziti samo u neutrofilima. Izbroji se
100 neutrofila i izraĉuna % neutrofila sa pozitivnom reakcijom (5-10% se tumaĉi kao negativna
reakcija, dok 30% i više neutrofila sa prisutnim depozitima daje pozitivan rezultat). 7) Ako je
rezultat negativan inkubira se 0,05 ml endotoksina sa 0,5 ml heparizovane krvi i inkubira se na
sobnoj temperaturi tokom 15 minuta. 8) Ponove se svi koraci od 1-6. Tumaĉenje nalaza je
identiĉno.

137
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4.35 TEST AKTIVACIJE LIMFOCITA MITOGENIMA

Normalni limfociti mogu biti stimulisani mitogenima, kao što je fitohemaglutinin (PHA).
Transformisane blastne ćelije, koje tako nastaju, mogu se vizuelizovati i kvantifikovati bojenjem
po Wright-u, kao i akridin-oranţ bojom, ĉije je florohromsko bojenje citohemijski specifiĉno za
RNA-DNA.
Materijal za izvoĊenje metode – laboratorijska oprema: sterilna heparinska tuba, oprema
za iskorišćavanje buffy coat sloja ćelija i suspenzija plazme aspiracijom, 5 ml sterilnih tuba,
police za sedimentaciju, inkubator 37°C, predmetno i pokrovno staklo za mikroskop i
fluorescentni mikroskop.
Materijal za izvoĊenje metode – reagensi: heparin sa benzil alkoholom (ne fenol),
hromozomski medijum sa i bez PHA 2-4 ml u 4-5 sterilnih tuba, reagensi za regularno Wright-
ovo bojenje, akridin-oranţ, 2% sirćetne kiseline u izotoniĉnom rastvoru, izotoniĉni fiziološki
rastvor, 2% etanol u izotoniĉnom rastvoru.
Naĉin izvoĊenja metode: 1) sakupi se venska krv u sterilnu heparinsku tubu, 2) potom se
vrlo lagano vrši sedimentacija i sloj leukocita se uzima aspiracijom, 3) 0,1 ili 0,2 ml buffy coat
ćelija i suspenzija plazme sa PHA dodaju se u svaku od 4 sterilne tube, a bez PHA u dve sterilne
tube, 4) inkubiraju se tube na 37°C, 5) posle 5 dana se sklone 2 tube sa PHA i 1 tubu bez PHA,
6) odvoji se medijum od ćelija aspiracijom i naprave dva razmaza od ćelija iz svake tube, 7)
izvrši se bojenje po Wright-u i bojenje sa akridin-oranţ bojom, 8) Koraci 5, 6 i 7 se ponove sa
preostalim epruvetama posle 7 dana inkubacije.
Blastne ćelije se prepoznaju kao velike ćelije sa visokim odnosom nekleus:citoplazma i
vidljivim nukleolusima. Minimualno 1010 limfocita mora se izbrojati u jednom razmazu.
Akridin-oranţ bojenje daje zelenkastu (DNA) odnosno crvenu (RNA, nukleolus) fluorescenciju.
Ostale ćelije pokazuju prebojenja u zavisnosti od toga koliko im je citoplazma bogata sa RNA.
Tako na primer neutrofili ne pokazuju najminimalnije prebojenje, dok monociti pokazuju
crveno-braon prebojenje.
Rezultat se procenjuje pomoću izraĉunavanja odnosa transformisanih limfocita prema
ukupnom broju limfocita i pomnoţi sa 100, da bi se dobio rezultat u %. Smatra se da je
transformacija na nivou oko 50% i više normalna.

138
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

4.36 TRIPAN-BLU (TRIPAN-PLAVO) METODA ZA ODREĐIVANJE VIJABILNOSTI


LEUKOCITA

Tripan-blu predstavlja boju za DNA, koja se koristi za razlikovanje vijabilnih od mrtvih


ćelija, a pomaţe i u vizualizaciji ćelijske strukture. Vijabilne ćelije imaju oĉivan integritet
membrane i ne dozvoljavaju da boja prodre, dok nekrotiĉne ćelije koje gube integritet membrane
dozvoljavaju bojenje DNA unutar ćelije, pa one postaju plave.
Naĉin izvoĊenja metode: Pripremi se hemocitometar (grid), 500 μl suspenzije ćelija meša
se sa 500 μl rastvora tripan-blu. Potom se uzima 50 μl dobijenog obojenog rastvora i lagano se,
uz ivicu pokrovnice, pipetira u komore hemocitometra i saĉeka da se teĉnost rasporedi, po
zakonu kapilarnosti. Brojanje se vrši u centralnom kvadratu i to brojanjem u 4 periferna i jednom
centralnom malom kvadraticu sa 4x4 polja (0,04 mm). Izvrši se brojanje ćelija i odrediti njihov
odnos. Konaĉan broj ćelija u mililitru se odreĊuje po sledećoj formuli:
ćel./ml = broj ćelija x 5 x razblaženje x 10000.

139
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

5. L I T E R A T U R A

140
Praktikum iz patološke fiziologije – patofiziološka dijagnostika

1. Belić B.: Priruĉnik za polaganje ispita iz patološke fiziologije, Poljoprivredni fakultet-


Departman za veterinarsku medicinu, Novi Sad, 2009.
2. Cawley P.L. (Ed): Immunopathology – clinical laboratory concepts and methods, Little
Brown and Company, Boston, 1974.
3. Cincović M.R.: Toplotni stres mleĉnih krava – fiziologija i patofiziologija, Monografija,
Zaduţbina Andrejević, Beograd, 2010.
4. Jesenovec N.: Izabrani postupci analiza u kliniĉko-biohemijskim laboratorijima, Društvo
medicinskih biohemiĉara Jugoslavije, 1990.
5. Kulić-Japundţiĉ I., Rakić Lj., Stojanović T.: Biohemija-praktiĉna nastava za studente
medicine i priruĉnik za laboratorijske analize, Zavod za udţbenike, Beograd, 1997.
6. Latimer K.S., Mahaffey E.A., Prasse K.W., Robert Duncan J.: Duncan & Prasse's
veterinary laboratory medicine – clinical pathology, Wiley-Blackwell, 2003.
7. Rusov Ĉ.: Hematologija ptica, Nauĉni institut za veterinarstvo Srbije, Beograd, 2002.
8. Šamanc H.A.: Bolesti organa za varenje goveda, Fakultet veterinarske medicine,
Beograd, 2009.
9. Stefanović S., Baklaja R.: Hemostaza i njeni poremećaji, Medicinska knjiga Beograd-
Zegreb, 1981.
10. Thrall M-A., Baker C.D., Duane Lassen E.: Veterinary hematology and clinical
chemistry, Wiley-Blackwell, 2004.
11. Trailović D.R.: Gastroenterologija pasa i maĉaka- etiopatogeneza, dijagnostika i terapija,
Fakultet veterinarske medicine, Beograd, 1999.
12. Varcoe S.J.: Clinical biochemistry – techniques and instrumentation – a practical course,
World Scientific, 2001.

141

You might also like