T.C.

GEBZE TEKNİK ÜNİVERSİTESİ

TEMEL BİLİMLER FAKÜLTESİ

STAJ DEFTERİ

Öğrencinin;
Adı, Soyadı Rüveyda Akçin
Numarası 142204023
Bölümü Moleküler Biyoloji ve Genetik
Staj Yaptığı Yer İstanbul Üniversitesi Onkoloji Enstitüsü,
Temel Onkoloji Anabilim Dalı
Staj Tarihleri 09.07.2018 – 03.08.2018
YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: 09.07.2018 KAPSAMI: KOLON KANSERİ VE KRAS, NRAS, BRAF
GENLERİ NEDİR?

Kalın bağırsak, kolon ve rektumdan meydana gelmektedir. Kalın bağırsakta kolon bölümünde
ortaya çıkan kansere, kolon kanseri denmektedir. Hastalığa yakalanma yaşı erkek ve kadınlarda
50 ve 60’lı yaşlardır. Bu yaştaki kişiler risk altındadır. Aile bireylerinde kolon kanseri görülmüşse,
genetik yatkınlıktan dolayı kolon kanserine yakalanma riski artmaktadır. Ailesinde kolon kanseri
vakası olanların, bu hastalığa kaç yaşında yakalandıklarını öğrenip, bu yaşa ulaşmadan 10 yıl
öncesinde düzenli olarak kolonoskopi yaptırması önemlidir. HNPCC genindeki değişimler, kolon
kanserine yakalanma riskini artırmaktadır. Ailesel Adenomatöz Polipozis (FAP), kolon ve rektumda
yüzlerce polipin (kolon ve rektumun mukoza tabakasının anormal büyümesi sonucu gelişen ve
bağırsak lümeni içine doğru büyüyen kabartılardır) oluşmasıyla görülen nadir ve kalıtsal bir
hastalıktır. APC (Adenomatcus Polyposis Coli) denilen özel bir genin değişimi buna neden olur. FAP
tedavi edilmediği sürece 40 yaşına kadar çoğunlukla kolorektal kansere yol açar. FAP bütün
kolorektal kanser vakalarının yüzde 1’inden daha azına neden olmaktadır.
KRAS ve NRAS: KRAS proteini, normal hücre büyümesinde görev alan önemli moleküllerden
biridir. KRAS geni tarafından üretimi sağlanan protein, dış ortamdan alınan sinyallerin hücre
çekirdeğine iletiminde rol oynar. Mutasyona uğraması durumunda hücre anormal bir büyüme
gerçekleştirir. Mutasyonlu KRAS hücre dış ortamdan sinyal almasa bile sürekli “çoğal” komutunu
gönderir. KRAS, akıllı ilaçlara karşı gelişen ilaç direncinden de sorumludur. Kalın bağırsak (kolon ve
rektum) kanserinde % 30-40, küçük hücre dışı akciğer kanserlerinde % 10-30, pankreas kanserinde
ise % 90 oranlarında KRAS gen mutasyonları saptanmaktadır. Ayrıca kolon kanserli hastaların % 3-
4’ünde NRAS gen mutasyonları da görülmektedir. KRAS ve NRAS’ta mutasyon olması, o hastanın
tirozin kinaz inhibitörü (TKI) ve monoklonal antikor (mAb) tedavisi gibi anti-EGFR tedavilere iyi
yanıt vermeyeceğinin göstergesidir, yani kanser için bir biyolojik belirteçtir. Bu nedenle KRAS ve
NRAS mutasyon analizi özellikle kolon ve rektum kanseri başta olmak üzere çeşitli kanserlerin
tedavisinde belirleyici rol oynamaktadır.
BRAF: BRAF geninde mutasyon saptanan vakaların yaklaşık % 90’ında V600E mutasyonunu taşıyan
metastatik kolorektal kanserli hastalarda EGFR bloke eden monoklonal antikorlara karşı direnç
gelişimi görülmektedir. BRAF mutasyon
testi ile daha doğru tedavi planlaması
yapılabilmekte, gereksiz ilaç kullanımı
kaynaklı komplikasyonlardan ve etkin
olmayan tedavilere ait giderlerden
kaçınma mümkün olabilmektedir.
Not: KRAS mutasyonu tespit edildikten
sonra diğer yolakların kontrol edilmesine
gerek kalmaz çünkü mutasyonlu KRAS
diğer yolakları da etkileyecektir.

Figür 1 (Sinyal yolağında Ras proteinin aktifleştirilmesi

ve hangi yolakları uyardığı gösterilmektedir.)

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Staj Yapanın İmzası Adı, Soyadı, İmzası, Firma Kaşesi
YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: 10.07.2018 KAPSAMI: PARAFİN BLOKTAN DNA İZOLASYONU
YAPILDI

Bloklama işlemi, doku takibi biten dokuları, daha sonra katılaşacak sıvı bir kaplayıcı madde
içerisine yerleştirme işlemidir. Bu kaplayıcı madde katılaşınca mikrotom için standart olan bir
boyda bloklar hazırlanmış olur. Gömme işlemi için parafin, selloidin, jelatin, metakrilat, paraplast
gibi çeşitli maddeler kullanılır. Rutinde en sık parafin kullanılmaktadır. Bloklama işlemi dokuda
şekil bozukluğuna yol açmadan ince kesitler alınabilmesini sağlar. Bu, boyamada kalite,
mikroskobik incelemede de kolaylık sağlamaktadır.
Protokol:
 Parafin blok içine gömülü dokudan (Figür 2) mikrotom cihazı
(Figür 3 ) yardımıyla küçük parçalar alınır ve 0.5’lik tüp içine konulur.
 Üzerine 200 µl xylol konulur. Pipet ile dokuya zarar vermeden xylol
tekrar çekilir. (1-2 dakika bekledikten sonra)
 Üzerine 200 µl absolute alkol eklenir. 10000 rpm’de 3 dakika
santrifüj edilir. Üst sıvı pipetle alınır.
 3. aşama tekrar edilir.
Figür 2
 Tamamen alkolün uçması için VWR cihazında
uygun programda 5-6 dakika cihazın üstü açık
olarak tutulur.
 Alkol iyice uçtuktan sonra ekstraksiyon solüsyonu
(-20  C uç kutusu içinde) her bir pelletin üzerine 50
µl olacak şekilde dağıtılır.
 Tekrar önceki VWR cihazının programına konulur.
Üstü kapalı şekilde inkübe edilir.
 İşlem bittiğinde örnekler alınır. Santrifüj edilir.
Supernatant yeni tüpe aktarılır.
 Nanadropta ölçüm yapılır.

Figür 3
Sample ID User Name Date and Time Nucleic Acid Conc. Unit A260 A280 260/280 260/230 Sample Type Factor
RSEF3138 nd 10.07.2018 11:47 99,6 ng/ml 1,992 1,349 1,48 0,39 DNA 50
RSEF3139 nd 10.07.2018 11:48 18,6 ng/ml 0,373 0,254 1,47 0,21 DNA 50
RSEF3140 nd 10.07.2018 11:49 236,9 ng/ml 4,738 3,251 1,46 0,48 DNA 50

Yukarıdaki tablo DNA izolasyonu sonucunda nanodropta ölçülen örneklerin saflık oranını
göstermektedir. 260/280 oranının yaklaşık 1.8 olması beklenmektedir. Örneklerin oranlarının bu
değere yakın olduğu görülmektedir. 260/230 oranının ise yaklaşık 2.2 olması gerekmektedir. Ama
örneklerden saflık değerinin düşük çıkmasının nedeni örneklerin parafin bloktan izole edilmesidir.
Çünkü parafin bloktan izole edilen DNA hiçbir zaman parafinden tam olarak saflaştırılamaz.

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Staj Yapanın İmzası Adı, Soyadı, İmzası, Firma Kaşesi
YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: 11.07.2018 KAPSAMI: KRAS REAL TİME ANALİZİ
YAPILDI

Kit protokolüne göre aşağıdaki KRAS mutasyonlarına bakılır. Mutasyona bakılırken Real-time pcr
yöntemi ile analiz yapılır.

Protokol (1 tüp için):

 2X master mix 10 ml
 Primer Probe Mix 4 ml
 dH2O 4 ml
 DNA 2 ml
Total = 20 ml olmalıdır.

Yukarıdaki Real-time pcr sonucuna göre örnekte KRAS mutasyonu görülmektedir. Bu durumda ras
sinyal yolağında mutasyon olduğu için hücre reseptörlerinin liganda bağlanması engellense bile
hücre kontrolsüz bir şekilde bölünmeye devam edecektir.

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Staj Yapanın İmzası Adı, Soyadı, İmzası, Firma Kaşesi
YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: 12.07.2018 KAPSAMI: NRAS REAL TİME ANALİZİ
YAPILDI

Aşağıdaki mutasyonlar NRAS protokolü ile belirlenir. Real-time pcr kullanılarak analiz yapılır.

Protokol (1 tüp için):

 2X master mix 10 ml
 Primer Probe Mix 4 ml
 dH2O 4 ml
 DNA 2 ml
Total = 20 ml olmalıdır.

KRAS mutasyonuna rastlanılmaz ise NRAS mutasyon varlığı kontrol edilir. Yukarıdaki gibi Real-time
pcr’da belirli bir noktadan sonra eşik değerini aşması bu hastada NRAS mutasyonu varlığından söz
edilir.

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Staj Yapanın İmzası Adı, Soyadı, İmzası, Firma Kaşesi
YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: 13.07.2018 KAPSAMI: BRAF REAL TİME ANALİZİ
YAPILDI

Aşağıdaki mutasyonlara BRAF mutasyonlarının 15. ekzon’unda meydana gelen mutasyonlar

aşağıda tabloda verilmiştir. KRAS ve NRAS’ta olduğu gibi BRAF’ın analizi de Real-time pcr ile
yapılmaktadır.

Protokol (1 tüp için):

 2X master mix 10 ml
 Primer Probe Mix 4 ml
 dH2O 4 ml
 DNA 2 ml
Total = 20 ml olmalıdır.

BRAF mutasyonu en son aşamada bakılan mutasyondur. Eğer hastada KRAS ve NRAS
mutasyonuna rastlanılmazsa bu durumda BRAF mutasyonuna bakılır. Yukarıdaki sonuçta BRAF
mutasyonu bakımından pozitif hasta görülmektedir.

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Staj Yapanın İmzası Adı, Soyadı, İmzası, Firma Kaşesi
YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: 16.07.2018 KAPSAMI: KANDAN LENFOSİT İZOLASYONU
YAPILDI

Lenfositler kanda dolaşan lökositlerin yaklaşık olarak yarısını oluştururlar. Fikol bütün
solüsyonlarda çözülebilen hidrofilik bir polisakkarittir ve kanı içeriğinde bulunan lenfosit, eritrosit
gibi komponentlere ayrıştırmayı sağlar. Santrifüj sonrasında ayrılan fazlarda en dipte eritrosit ve
granülositler pellet halinde, lenfositler ortada tüp çeperine yapışmış şekilde ve beyaz bir hücre
bulutu halinde, plazma ve diğer bileşenler ise en üstte sıvı şekilde gözlemlenirler. Lenfositler DNA
izolasyonunda kullanılabilecek materyaller olduğundan, hasta materyalinin yetersiz olduğu
noktalarda kullanılmak üzere izole edilip saklanmalıdır.

Protokol:
 Falkon tüp içine 10 ml izotonik solüsyon eklenir.
 Üzerine hastadan alınan 10 ml periferik kan ilave edilir.
 İzotonik ile karıştırılmış periferik kan fikollü tüplere yavaşça aktarılır.
 30 dk 1950 rpm’de santrifüj yapılır.
 Tüp içerisinde ortada hücre bulutu şeklinde görülen lenfositler pipet yardımı ile başka bir tüpe
 toplanır.
 10 dk 1950 rpm’de santrifüj yapılır.
 Üstteki sıvı dökülür.
 4000 µl PBS eklenir ve iyice karıştırılır.
 İsimlendirilmiş Cryo tüplere 1000 µl dağıtılır.
 2 dk 1950 rpm’de santrifüj yapılır.
 Üst sıvı tekrar dökülür.
 Lenfositler saklamak üzere hazır hale getirilir.
 Eğer hemen kullanılmayacak ise – 80  C’ye kaldırılır.

Plazma

Beyaz kan hücreleri

Fikol

Figür 4

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Staj Yapanın İmzası Adı, Soyadı, İmzası, Firma Kaşesi
YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: 17.07.2018 KAPSAMI: LENFOSİT HÜCRELERİNDEN DNA
İZOLASYONU YAPILDI

DNA izolasyonu, organik açıdan bozulmamış olan hücrelerde özel teknikler aracılığıyla DNA
molekülünün ortaya çıkarılmasıdır. Önceki deneyde elde edilen lenfosit hücrelerinin DNA
izolasyonu Zymo kit protokolüne göre yapıldı.

Protokol:
 400 µl DNA lysis buffer içinde hücreler çözüldü.
 1 dk 1200 rpm’de santrifüj yapıldı.
 Biriktirme tüpleri atılmaz RNA izolasyonu için kullanılır.
 Filtre üzerine 400 µl Miniprep buffer eklenir ve 1 dk 1200 rpm de santrifüj yapılır.
 Santrifüj sonrası alttaki sıvı atılır. 700 µl DNA wash buffer filtre üzerine eklenir ve 1200 rpm de
1 dk santrifüj yapılır.
 400 µl DNA wash buffer filtre üzerine eklenir ve 1200 rpm de 2 dk santrifüj yapılır.
 Santrifüj sonrası alttaki sıvı atılır. 100 µl DNA free buffer eklendi ve 2-5 dk bekletildi. 1 dk 1200
rpm’de santrifüj yapıldı.
 Alttaki kalan sıvı izole edilmiş olan DNA’dır. Uzun süre saklanılabilmesi için – 80  C’ye kaldırılır.

DNA izolasyonu sonrasında DNA saflığını ve konsantrasyonunu ölçmek için nanodrop’ta ölçüm
yapılır. Bu sonuca göre saf DNA örneklerinde 260/280 oranı yaklaşık 1.8 olmalıdır. Halkasal yapıya
sahip (aromatik) proteinler 280 nm’de yüksek absorbans gösterirler. Bu sebeple örnekteki protein
kontaminasyonu arttıkça 260/280 oranı azalır.

Sample ID Nucleic Acid Conc. Unit A260 A280 260/280 260/230 Sample Type Factor
Sample 1 30,9 ng/ml 0,618 0,32 1,93 0,57 DNA 50
Sample 2 100,9 ng/ml 2,019 1,055 1,91 1,23 DNA 50
Sample 3 95,1 ng/ml 1,902 0,995 1,91 1,24 DNA 50

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Staj Yapanın İmzası Adı, Soyadı, İmzası, Firma Kaşesi
YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: 18.07.2018 KAPSAMI: RNA İZOLASYONU YAPILDI

Protokol:

 DNA izolasyonu birinci basamağında elde edilmiş olan tüpteki sıvıya 350 µl alkol eklenir.
 1 dk 1200 rpm’de santrifüj yapıldı.
 Filtre üzerine 400 µl Miniprep buffer eklenir ve 1 dk 1200 rpm de santrifüj yapılır.
 Santrifüj sonrası alttaki sıvı atılır. 700 µl RNA wash buffer filtre üzerine eklenir ve 1200 rpm de
1 dk santrifüj yapılır.
 400 µl RNA wash buffer filtre üzerine eklenir ve 1200 rpm de 2 dk santrifüj yapılır.
 Santrifüj sonrası alttaki sıvı atılır. 40 µl RNA free buffer eklendi ve 2-5 dk bekletildi. 1 dk 1000
rpm’de santrifüj yapıldı.
 Alttaki kalan sıvı izole edilmiş olan RNA’dır. Uzun süre saklanılabilmesi için – 80  C’ye kaldırılır.

DNA izolasyonunda da olduğu gibi RNA izolasyonunda da saflık nanodrop ile ölçülür. RNA
örneklerinde 260/280 oranı yaklaşık 2.1’dir. RNA örneklerinin 260/280 değerine sahip olmasının
sebebi, RNA’da bulunan urasil’in DNA’daki timin’e kıyasla 3 kat daha fazla absorbans
göstermesidir. 260/230 oranı, örnek içindeki organik kontaminantların varlığını ölçmek için
kullanılır. Bunlar genellikle DNA veya RNA izolasyonunda kullanılan uygulanan metotlardan kalan
artıkları oluşturur. Genellikle bu değerinde 1.8’in altına düştüğü durumlarda sonraki basamakları
etkileyebilirler. Saf bir örnekte bu değer 2.0’a yakındır. 260/230 göre sample 3’ün neredeyse saf
bir örnek olduğunu söyleyebiliriz.

Sample ID Nucleic Acid Conc. Unit A260 A280 260/280 260/230 Sample Type Factor
Sample 1 58,5 ng/ml 1,462 0,703 2,08 1,69 RNA 40
Sample 2 701,4 ng/ml 17,54 8,425 2,08 2,25 RNA 40
Sample 3 284,5 ng/ml 7,112 3,435 2,07 2 RNA 40

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Staj Yapanın İmzası Adı, Soyadı, İmzası, Firma Kaşesi
YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: 19.07.2018 KAPSAMI: RETİNOBLASTOMA NEDİR?

Retinoblastoma (RB) çocukluk çağında en sık karşılaşılan malign intraoküler tümördür. Tüm
çocukluk çağı tümörlerinin %1’ini oluşturmaktadır. Retinoblastoma geni (RB1) retinoblastoma
olarak adlandırılan çocukluk çağı kanserlerinde mutasyona uğramış tümör baskılayıcı bir gendir.
RB1 geninin keşfinden sonra bu genin birçok kanserde inaktif olduğu gösterilmiştir.
Retinoblastoma tümör baskılayıcı gen yolağı, birçok kanserde mutant haldedir.
Rb proteini, G1 kontrol noktasında sorumludur ve gereksiz S fazı tekrarlarını önleyerek hücre
bölünmesini düzenler. Yani tümör yapıcı gereksiz hücre bölünmesinin önlenmesinde önemli bir
rol oynar. Rb gen aile üyeleri, DNA replikasyonu, mitoz, kromatin yapısı, hücre metabolizması,
hücresel farklılaşma ve hücre ölümü gibi fonksiyonları da düzenlemektedirler. Rb’nin biyolojik
fonksiyonları tümör baskılanması, hücre döngüsünün düzenlenmesi ve apoptozu içermektedir.
Rb’nin bu fonksiyonları çok sayıda hücresel protein ile etkileşim sonucu gerçekleşmektedir.
Retinoblastoma, hücre döngüsünün S fazına girişinde anahtar inhibitör olarak görev almakta ve
bu yolla hücre proliferasyonunu düzenlemektedir.
Retinoblastoma proteini, hücre döngüsünü düzenlemesine ek olarak, apoptoz gibi hücre ve
organizmanın diğer fonksiyonlarını da düzenler. Rb, apoptoz düzenleyicilerin ekspresyonlarının
kontrolü ile apoptozu direkt düzenleyebildiği gibi hücre döngü progresyonunu düzenleyerek
indirekt olarak da bu düzenlemeyi yapabilmektedir. Rb gen yolağı ayrıca proapoptotik faktörlerin
transkripsiyonel düzenleyicisi olarak da apoptozu düzenleyebilmektedir.
Retinoblastoma yolağı gelişmiş organizmalardaki hücrelerin farklılaşmasında önemlidir.
Gelecekteki kanser terapilerinin tümörün büyümesini durdurabilmesi, farklılaşma yolaklarının
tekrar aktif hale getirilebilmesi ile başarılı olacağı düşünülmektedir. Bu yolla tümör hücreleri
farklılaşma ve proliferasyonu durdurabilirler. Rb yolağının farklılaşmanın düzenlenmesindeki
rolünün anlaşılması bize kanser hücrelerinde farklılaşmanın tamamlanması ve proliferasyonun
bloklanması için yeni hedefler sunacaktır. Rb gen fonksiyonu olmayan hücrelerin, hücre
döngüsünden çıkamadığı ve farklılaşmayı sonlandırana kadar proliferasyona devam ettiği
gözlenmektedir.
Retinoblastomanın kanser hücrelerinde en az üç farklı fonksiyonu bulunmaktadır. Kanserlerin
birçoğunda Rb yolağı, ya Rb geninin mutasyonu ya da onun fonksiyonel inaktivasyonuyla etkisiz
hale getirilmektedir. Rb gen fonksiyonunun kazanıldığı çok az sayıda kanser tipi bulunmaktadır.
Rb yolağındaki genetik ve epigenetik değişiklikler birçok sporadik kanserlerde saptanmıştır.

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Staj Yapanın İmzası Adı, Soyadı, İmzası, Firma Kaşesi
YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: 20.07.2018 KAPSAMI: QIAGEN KİT İLE RNA-DNA, PROTEİN
İZOLASYONU YAPILDI

İzolasyona başlamadan önce RLT ve -ME karıştırılır. 600 ml RLT’ye 6 ml -ME eklenir.
Protokol:
 RLT hücre miktarına göre konulur. Eğer orta miktarda ise 350 ml, fazla ise 600 ml konulur.
 Hücreler iyice çözüldükten sonra DNA kolonuna koyuldu. 10.000 rpm’de 1 dk santrifüj edildi.
 Filtre çıkartılıp yeni bir biriktirme tüpüne konuldu.
 Altta kalan sıvıdan RNA izolasyon işlemine devam edildi. (Buzdan çıkarılmaması
gerekmektedir.)
 Altta kalan sıvıya 250 ml absolute ethanol eklendi ve pipetaj yapıldı.
 Bu karışımdan 700 ml RNA filtresine konuldu. (600 ml RLT’ye 400 ml absolute ethanol eklendi
ve 2’ye bölünerek 10.000 rpm’de 1 dk santrifüj edildi.)
 RNA filtreye tutundu ve altta kalan sıvı protein izolasyonu yapmak üzere ayrılır.
 Filtreden RNA izole etmeye devam edilir ve filtre yeni bir biriktirme tüpüne konuldu.
 Üzerine RW1’den 700 ml konuldu. 10.000 rpm’de 1dk santrifüj yapıldıktan sonra altındaki
supernatant dökülür.
 500 ml rpe buffer eklendi ve 10.000 rpm’de 1 dk santrifüj edildi. (Bu işlem birkaç defa tekrar
edildi.)
 Biriktirme tüpü boşaltıldıktan sonra hiç bir şey konulmadan son hızda 1 dk santrifüj edildi. (
İstenmeyen maddelerin uzaklaştırılmasını sağlar.)
 Daha sonra biriktirme tüpü atıldı.
 Filtre RNA’nın saklanacağı tüpe konuldu.
 Filtrenin üzerine 35 ml RNase free water eklendi. (Bu ortalama bir değerdir. Hücre daha az
miktarda ise daha az konulur.)
 10.000 rpm’de 1 dk santrifüj edildi.
 Filtre atıldı. Altta kalan sıvı yükleme için hazırdır. (RNase free water iki kere konulur ise RNA
daha sağlıklı olur. Önce 20 ml ve sonrasında 10 ml konulabilir.)
 DNA izolasyon için ayrılmış olan filtreden devam edildi.
 500 ml AW1’den konuldu ve 10.000 rpm’de 1 dk santrifüj yapıldı.
 Altındaki supernatant döküldü.
 Filtrenin üzerine tekrardan AW2 konuldu ve 10.000 rpm’de 1 dk santrifüj yapıldı.
 Biriktirme tüpü atıldı.
 Asıl DNA tüpüne filtre konuldu. Filtrenin üzerine 100 ml konuldu ve 10.000 rpm’de 1 dk
santrifüj yapıldı.
 Filtre atıldı. DNA yükleme için hazırdır.
 Protein izolayonu yapmak için ayrılan sıvı 2’lik tüplere aktarıldı. Üzerine 600 ml APP eklendi.
(C 1:1 oranında) 10 dk bekletildi.
 Son hızda 10 dk santrifüj yapıldı. Üst fazı döküldü. Pelletin üzerine %70’lik alkol 500 ml
eklendi.
 10.000 rpm’de 1 dk santrifüj yapıldı.
 Üst faz döküldü ve kuruması için biraz bekletildi.
 Alo buffer’dan 100 ml eklendi. Su banyosunda (95 C) 10-15 dk bekletildi.

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Staj Yapanın İmzası Adı, Soyadı, İmzası, Firma Kaşesi
YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: 23.07.2018 KAPSAMI: MEME KANSERİ NEDİR?

Meme kanseri, kadın sağlığını olumsuz olarak etkileyen önemli ve sık görülen, aynı zamanda
kansere bağlı ölümlerde başı çeken bir kanserdir. Tüm kanser olgularının %23’ünü ve kanser
ölümlerinin %14’ünü oluşturur. Meme kanseri tek bir hastalık değildir. Tam tersine heterojen bir
hastalık olarak adlandırılmaktadır. Meme kanserinin genetik, epigenetik ve transkriptomik
değişiklikler nedeniyle çok farklı histolojik ve biyolojik özelliklere sahip, klinik bulguları farklı olan
ve tedaviye cevapları farklılık gösteren, beraberinde multiple antiteleri içeren heterojen bir
hastalık olduğu görülmektedir. Bu fenotipik farklılık, çok belirgin olarak meme kanserinin tanısını,
tanıya göre uygulanacak tedaviyi ve bunun sonucunda da prognozunu etkilemektedir. Meme
kanseri estrogen receptor, progestron reseptor, human epidermal growth factor receptor 2
proteinlerine ait moleküler belirteçlerinin ekspresyon özelliğine göre alt tiplere ayrılmaktadır.
Triple negatif meme kanseri tümörün estrogen receptor, progesteron reseptor, human epidermal
growth factor receptor 2 ekspresyonunun olmayışı ile karakterizedir. Bu tip tümörler sistemik
endokrin tedaviye yanıt vermeyişi ve kötü prognoz nedeniyle agresif klinik seyir gösterir.
Meme kanserinin moleküler alt tipleri için triple negatif meme kanseri, p53 geni, BRCA geni, ETV4,
mRNA’dan bahsedilebilir.
Triple Negatif Meme Kanseri:
Triple negatif meme kanseri (TNMK) meme tümörleri içinde ER /PR / HER-2 gen ekspresyonu
olmayan minör bir grubu tanımlar ve yeni tanı konmuş hastaların %15-20’sini oluşturur. TNMK
tümörler biyolojik olarak daha agresif davranış gösterir. Genellikle, tümör boyutunda artış, yüksek
grade, tanı esnasında lenf nodu tutulumu, kötü prognoz gösterir. Bunun en önemli nedeni,
tedaviye uygun hedefin olmaması nedeniyle anti-reseptör tedavinin etkili olmamasıdır. TNMK gen
ekspresyon profiline göre Bazal-like ve Claudin-low olmak üzere birden fazla moleküler alt tip
gösterir.
p53:
Tümör protein p53 hücre döngüsü kontrolünde rol oynayan tümör baskılayıcı gendir. Son
zamanlarda üç farklı çalışmada dizi analizi sonucunda TNMK’de somatik mutasyon en çok (%53.8-
%85.7) p53 geninde bulunmuştur.
Sonuç olarak, meme kanseri oluşum safhasında farklı mutasyonlar ve değişken gen
ekspresyonlarının meydana gelmesi nedeniyle oldukça heterojen ve kompleks bir hastalıktır.
Moleküler alt tipleri ve özelliklerinin daha ayrıntılı olarak belirlenmesi, tümör davranışının
anlaşılmasına katkı sağlayacaktır. Günümüzde meme tümörlerinin spesifik moleküler özelliklerinin
bilinmesi bireye özgü tedaviyi mümkün kılmaktadır.

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Staj Yapanın İmzası Adı, Soyadı, İmzası, Firma Kaşesi
YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: 24.07.2018 KAPSAMI: BRCA GENİ

Meme kanseri olgularının %5 ila %10’unun kalıtımsal olduğu, yani ebeveynden çocuğa geçen
normal olmayan genler nedeniyle oluştuğu düşünülmektedir. Genlerimizin yapı taşı olan DNA’da
meydana gelen ve mutasyon adını verdiğimiz değişiklikler, farklılıklara yol açabilirler. Bu
değişiklikler de hücre büyümesini ve fonksiyonunu olması gerekenden farklı bir yöne çekerek,
kanserin de dahil olduğu çeşitli hastalıklara yol açabilirler. Meme kanserine yatkınlık yaratan
mutasyonlar başlıca BRCA1 ve BRCA2 genlerindedir. Bunun yanı sıra TP53, PTEN, STK11/LKB1,
CDH1, CHEK2, ATM, MLH1, MSH2 genlerindeki mutasyonlar da meme ve-veya yumurtalık
kanserine yatkınlık yaratabilirler.
BRCA1 ve BRCA2 genleri normal hücrelerde DNA’nın stabilitesini sağlayıp, kontrolsüz hücre
büyümesini engellemeye yardımcı olurlar. Bu nedenle tümör baskılayıcı genlerdir. Bu genlerdeki
tehlikeli mutasyonlar, genlerin bu fonksiyonunu baskılayarak kalıtımsal meme ve yumurtalık
kanseri gelişimi yatkınlığını arttırır. Eğer bir birey BRCA1 veya BRCA2 geninde tehlikeli bir
mutasyon taşıyorsa, bu bireyin hayatı boyunca meme ve/veya yumurtalık kanseri geliştirme riski
büyük ölçüde artmıştır. Hayat boyu risk hesaplamalarına göre genel nüfusta bir bireyin hayat boyu
meme kanserine yakalanma riski %12 iken, tehlikeli BRCA1 veya BRCA2 geni mutasyonları taşıyan
bir birey için bu risk %60-80 civarındadır. Bu da en düşük ihtimalle beş kat artmış bir riske işaret
etmektedir. Benzer şekilde hayat boyu risk hesaplamalarına göre genel nüfusta bir kadının hayat
boyu yumurtalık kanserine yakalanma riski %1,4 iken, tehlikeli BRCA1 veya BRCA2 geni
mutasyonları taşıyan bir kadın için bu risk % 15-40 dolaylarına çıkmaktadır.

Tehlikeli BRCA1 mutasyonları rahim ağzı, rahim, pankreas ve kolon kanseri, tehlikeli BRCA2
mutasyonları da pankreas, mide, safra kesesi, safra yolları kanserleri ve melanom için de ilave risk
getirmektedirler. BRCA1 ve BRCA2 genlerindeki tehlikeli mutasyonlar yalnızca kadınlar için değil
erkekler için de risk getirmektedir. BRCA2 geninde tehlikeli mutasyon taşıyan bir erkeğin, 80
yaşına gelene dek geçen süre içinde meme kanseri olma riski bu mutasyonu taşımayan bir
erkekten 80 kat daha fazladır. BRCA1 geninde tehlikeli mutasyon taşıyan bir erkek prostat kanseri
için bu mutasyonu taşımayan bir erkeğe göre 7 kat daha fazla artmış riske sahiptir. Ayrıca cilt ve
sindirim sistemi kanserleri için de artmış risk söz konusudur.

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Staj Yapanın İmzası Adı, Soyadı, İmzası, Firma Kaşesi
YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: 25.07.2018 KAPSAMI: NGS (NEXT-GENERATION SEQUENCING)

BRCA1 ve BRCA2 genlerinde meydana gelen mutasyonları belirlemek için Illumina’nın NGS sistemi
kullanılır. Kullanılan dizileme cihazı ise MiSeq’tir. (Figür 5) Sanger dizileme yöntemi ile
karşılaştırıldığında NGS sisteminde çok daha az miktarda örnek kullanılarak çalışılabilir. Primerlere
ek olarak adaptör denen moleküller bulunmaktadır. Bu adaptör moleküller de 5 ve 7’in farklı
kombinasyonları olarak kullanılır. Buradaki temel amaç her hasta için farklı ikili oluşturmaktadır.
Aile öyküsü ve yaş durumu genetik testin yapılması için aranan iki temel kriterdir. Tespit edilen
mutasyonlarla hastaya daha etkili bir tedavi uygulanabilir veya hasta sürecin devamı için daha net
kararlar verebilir. NGS yönteminde tek yönlü değil çift yönlü okuma, genetik düzenlemelerin,
tekrarlı dizilerin tespitinde ve ayrıca gen füzyonlarının belirlenmesinde kolaylık sağlar. Bir referans
dizi baz alınarak okuma gerçekleştirilir ve bütün illumina NGS sistemleri çift yönlü okuma için
uygundur. (Figür 6) Analiz sonucunda Q20 ve Q30 gibi değerler elde edilir. Bu değerler kalite
skorlarıdır. Q20 değeri ve %99 doğruluğu gösterirken, Q30 değeri is %99.9 doğruluğu
göstermektedir. Bu değerler şu şekilde yorumlanır: Q20 değeri %85 olarak elde edildiyse bu sonuç,
örneklerin %85’inin %99 doğrulukla okunduğunu gösterir. Elde edilen %90 Q30 değeri ise
örneklerin %90’ının %99.9 doğrulukla okunduğunu belirten bir sonuçtur. Çalışmalarda genellikle
Q30 değerlerine bakılır.
İlk aşamada “Multiplicom BRCA MASTR Dx” bileşeni kullanılır. Kullanılan bu kit BRCA1 ve BRCA2
genlerinin kodlanan bölgelerindeki mutasyonları belirlemek için kullanılır. Bu bölgelerde
mutasyona sahip bireyler meme, over veya ilişkili diğer kanserler için yüksek risk taşırlar. Her iki
gendeki mutasyon kalıtsal meme ve over kanserleri ile bağlantılıdır. Mutasyon taşıyan bayanların
%60-80 meme kanseri veya %20-50 over kanseri olma riskleri vardır. Erkekte tespit edilen BRCA2
mutasyonu ise %6-8 oranında pankreas veya prostat kanseri ile ilişkilidir. Bu mutasyonlar
çocuklara aktarılabilir. BRCA MASTR Dx’in çalışma prensibi belirli bölgeleri seçici olarak
çoğalmasına dayanır ve multipleks PCR tabanlı bir yöntemdir. İlk adımda, bu genlerin kodlanan
bölgeleri 93 amplikon (5 farklı reaksiyon için bölünmüş haldedir) kullanılarak çoğaltılır.

Figür 4 Figür 5

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Staj Yapanın İmzası Adı, Soyadı, İmzası, Firma Kaşesi
YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: 26.07.2018 KAPSAMI: NGS-İKİNCİ PCR YAPILDI

Protokol:

 Birinci PCR işleminden sonra elde edilen ve -20 C’de saklanan örnekler çözülerek
santrifüjlendi.
 Elde edilen PCR ürünleri çalışmanın devamı için çok yoğun olduğundan dilüsyon işlemi yapıldı.
 Toplamda 1:1000 oranında yapılması gereken dilüsyon 1:50 ve 2:40 oranlarında iki seferde
yapıldı.
 Birinci dilüsyon için PCR ürünlerinden 1 ml alındı ve 49 ml su ile dilüe edildi.
 Vorteks ve santrifüj işlemlerinden sonra bu karışımdan 2 ml alınıp 38 ml su ile dilüsyon yapıldı.
 Bu sırada PCR karışımı hazırlandı:
- 52 ml evrensel primer
- 0,65 ml Taq polimeraz
- 52 ml tampon (amlification reagent-AR1)
- 10 ml adaptör
12 hasta için 12 ayrı karışım hazırlandı.
 Karışım içerisinde kullanılan adaptörler 7 ve 5’in farklı kombinasyonları şeklindedir. Buradaki
temel amaç her hasta için 7 ve 5’in aynı olmayan birleşimini oluşturmaktadır. Böylece çalışan
hastalar birbirinden ayrılmış olur.
 12 hasta için hazırlanan adaptörler şu şekildedir:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
P7-01 P5-01P7-01 P5-02 P7-01 P5-03 P7-01 P5-04P5-01 P7-05 P7-01 P5-06 P7-02 P5-01P7-02 P5-02 P7-02 P5-03P7-02 P5-04P7-02 P5-05P7-02 P5-06

 Toplam 120 ml PCR karışımı hazırlandıktan sonra 5 plex için 24’er ml olarak dağıtıldı.
 1:1000 oranında dilüe edilen örneklerden 1’er ml alınarak karışımların üzerine dağıtıldı.
 Tekrar vortekslenip santrifüj edilen örnekler Thermal Cycler cihazına yerleştirildi.
 Bu PCR işleminden sonra elde edilen örnekler jele yüklenerek her birinde DNA materyal olup
olmadığı kontrol edildi.
 Bu amaçla 250 ml %1,5’luk agaroz jel hazırlandı.

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Staj Yapanın İmzası Adı, Soyadı, İmzası, Firma Kaşesi
YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: 27.07.2018 KAPSAMI: NGS İÇİN AGAROZ JEL HAZIRLANDI

Protokol:

Agaroz jel hazırlanması:

 Gerekli miktarda agaroz tartıldı, erlene konuldu.

 Gerekli miktarda TBE eklendi.
 Hafifçe çalkalanıp mikrodalga fırına konuldu.
 Mikrodalga fırın örnek kaynamaya başlayana kadar yüksek ayarda çalıştırıldı.
 Aralıklarla erlen mikrodalgadan çıkarılıp çalkalandı.
 Kaynama başladıktan sonra mikrodalganın ayarı düşürüldü. Tamamen eriyene kadar
çalkalanarak ısıtıldı.
 EtBr eklendi ve çalkalayarak tüm çözeltiye dağılması sağlandı.
 Trayin çatlamaması için çözelti muslukta biraz soğutuldu.
 Traye yavaşça döküldü ve polimerize olması için en az 15 dakika bekletildi.

Örneklerin Jele Yüklenmesi:

 Jel tanka yerleştirildi.

 Tank jelin üstünü kapatacak kadar TBE ile dolduruldu.
 Küçük bir parça parafilm alındı ve yüklenecek örnek sayısı kadar yükleme tamponu (yaklaşık
1’er μl) üstüne koyuldu.
 5 μl örnek yükleme tamponu ile karıştırılıp jele yüklendi.
 Bir kuyucuğa da markır koyuldu.
 80 V da 20 dakika yürütüldü.

Figür 6 (NGS için yapılan agarozun sonucunda her örnekte bant

oluşumu görülmektedir. Bu örnekler ile çalışmaya devam edilebilir. )

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Staj Yapanın İmzası Adı, Soyadı, İmzası, Firma Kaşesi
YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: 30.07.2018 KAPSAMI: NGS SAFLAŞTIRMA YAPILDI

Protokol:

 5 plex için hazırlanan örnekler içlerindeki ekzon sayısına göre değişken miktarlarda alınarak
birleştirildi.
 Bu aşamada alınan miktarlar:
- 1. Plexten: 8 µl
- 2. Plexten: 11 µl
- 3. Plexten: 13 µl
- 4. Plexten: 8 µl
- 5. Plexten: 10 µl
12 hasta için hazırlanan bu örnekler belirtilen miktarlarda karıştırıldı. Birleştirmede sorun
olmaz. Çünkü artık her hastaya ait adaptörler farklıdır.
 Saflaştırma işlemi için kullanılan temel bileşen “Agencourt AMPure XP” dir. Bu karışım,
santrifüj ve filtrasyon gerektirmeyen yüksek etkinlikte bir sistemdir.
 Agencourt AMPure XP solüsyonu içerisindeki manyetik boncuklar bulunmaktadır. Bu
boncukların özelliği ise alkolle muamele edildiğinde DNA molekülünü tutup, su eklendiğinde
ise DNA’yı bırakmasıdır.
 Her örnek için bu solüsyondan 34 µl eklendi.
 Başlangıçta hazırlanan 50 µl karışımdan her solüsyona 40 µl olacak şekilde dağıtılır ve pipetaj
yapılarak tamamen karışması sağlandı.
 6 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edildi.
 Manyetik boncuk ve örneklerin karıştırıldığı petri bir mıknatıs sistemine yerleştirildi.
 Bir süre sonra mıknatısların olduğu taraflarda ve üst kısımlarda siyah birikintiler gözlendi.
 Dip kısımlarda biriken sıvılar dikkatli bir şekilde uzaklaştırılır ve her örneğin üzerine 175 µl
%100’lük soğuk etanol eklendi.
 3 dakika bekletildikten sonra alkol uzaklaştırıldı ve yeni alkol eklendi.
 Bu sırada örneklerin bulunduğu petri öne ve arkaya hareket ettirilerek boncukların tüp
duvarında hareket etmesi, buna bağlı olarak da daha iyi yıkanması sağlanır.
 Tekrar 3 dakika bekledikten sonra alkol atılır ve üzerlerine 25 µl su eklendi.
 Eklenen su ile birlikte tüpteki biriken materyaller pipetaj yapıldı ve tekrar mıknatıs sistemine
yerleştirildi.
 Alkolle birlikte manyetik boncuklara bağlanan DNA, suyun eklenmesiyle boncuklardan ayrılır
ve alttaki sıvıya geçer. Manyetik boncuklar tekrar tüpün duvarında mıknatısların olduğu
taraflarda toplanırlar.
 Alt kısma geçen DNA örnekleri toplanırken boncuklara değmemek ve pipetle onlardan
çekmemeye dikkat edilmelidir.
 Sıvılar her alındığında kontrol edilmeli, içerisinde boncuk olmadığına emin olunmalıdır.
 Saflaştırılan DNA örneklerinin konsantrasyon değerleri Nanodrop cihazında ölçüldü, sonuçlar
kaydedildi.
 Bu örnekler dizileme cihazına yükleme işlemi yapılana kadar -30 C’de saklanır. Toplamda 36
örnek olduğunda ise dizileme süreci başlatılır.

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Staj Yapanın İmzası Adı, Soyadı, İmzası, Firma Kaşesi
YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: 31.07.2018 KAPSAMI: NGS KÜME OLUŞUMU VE DİZİLEME
YAPILDI

Figür 7 (Agencourt AMPure XP solüsyonu konulduktan sonraki aşamalar)

Küme oluşumu ve dizileme NGS sürecinin basamaklarındandır.

Küme oluşumu: Bu yapının oluşması için, hazırlanan kütüphane “flow cell” denen yapıya yüklenir.
Fragmentler, adaptörlere komplement olan oligolar tarafından yakalanır. Her fragment köprü
amplifikasyonu ile çoğaltılır. Klonal yapıların oluşturduğu kümeler bu işlemin devamında dizilenir.
“Flow cell” adı verilen yapı, 1, 2 veya 8 bölüme ayrılmış cam bir parçadır. Üzerindeki her bir bölüm
adaptör moleküllere komplementer oligolarla kaplanmıştır. Köprü amplifikasyonu süreci ise bu
cam yapı üzerinde gerçekleşen amplifikasyon reaksiyonudur. Bu süreçte, yapının üzeri p5 ve p7
denilen iki farklı oligonükleotid ile kaplanır. Amplifikasyonun ilk adımında, adaptör uçları içerek
dizileme kütüphaneleri cam yapıya yüklenir. Kütüphanedeki her bir molekül, camdaki
komplementer oligo ile köprü oluşturur. Devamındaki denatürasyon ve uzama aşamaları PCR
sürecine benzer şekilde gerçekleşir. Bu basamak da kümelenme veya gruplaştırma olarak
adlandırılır.

Figür 8 (Köprü amplifikasyonu)

Dizileme: İşlemin bu basamağı SBS (sequencing by synthesis) teknolojisi ile yapılır. Bu teknolojide,
dizileme işlemi için dört floresan işaretli nükleotid kullanılır. Her bir dizileme döngüsü boyunca bir
işaretli nükleotid kullanılır. Her bir dizileme döngüsü boyunca bir işaretli dNTP molekülü nükleik
asit zincirine eklenir. Nükleotid işaretli polimerizasyonda “reversible terminator (tersinir
sonlandırıcı)” olarak görev yapar. Yani bir dNTP eklendiğinde floresan boya tespit edilir ve sonra
enzimatik olarak kesilir. Bu da bir sonraki eklenmeye olanak sağlar. Bu yöntemden diğer
teknolojilere göre hata oranı daha azdır.

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Staj Yapanın İmzası Adı, Soyadı, İmzası, Firma Kaşesi
YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: 01.08.2018 KAPSAMI: NGS VERİ ANALİZİ GÖRÜNTÜLENDİ

Veri analizi kısmı bu işlemin son basamağıdır. Bu süreçte hedef dizi okutulur ve bir referans dizi ile
karşılaştırma yapılır. Ver analizi için bilgisayarda kullanılan farklı yazılımlar bulunmaktadır örneğin;
Amazon, Sophia, Alamut. Referans dizi ile karşılaştırma işleminden sonra çeşitli varyasyonlarla
karşılaştırılabilir. Bunlar nükleotid polimorfizmleri (SNP), eklenmeler ve silinmeler şeklinde
olabilir.
NGS yöntemiyle elde dilen sonuçlar Sanger dizileme ve MLPA deneyleriyle de doğrulandıktan
sonra sonuç raporu yazılmalıdır. Eğer ilk sonuçta bir silinme veya nükleotid değişimi tespit
edildiyse aynı sonucun ek yöntemlerle de bulunması gerekir. Uygulanan yöntemlerde farklı
sonuçlar elde edilmesi durumunda test tekrarı yapılmalıdır.

Figür 8 (NGS sürecinin tüm adımları)

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Staj Yapanın İmzası Adı, Soyadı, İmzası, Firma Kaşesi
YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: 02.08.2018 KAPSAMI: BRCA1, BRCA2 GEN ANALİZİ (SANGER
YÖNTEMİYE) YAPILDI

Protokol:

 Bu iki genin 70 fragmenti PCR yapıldı.

 PCR örnekleri kontrol amaçlı agaroz yapıldı. (DNA’nın çoğalıp çoğalmadığı kontrol edilir.)
 High Pure PCR Product Purification Kiti ile saflaştırma yapıldı.
- Kolon sistemiyle saflaştırma yapıldı. (pH 6.6 da olmalıdır yoksa bağlanma gerçekleşmez.)
- Washing buffer ile yıkama yapıldı. (Binding buffer ve washing buffer pH eşit olmalıdır.)
- Elution buffer’ın pH’ı, binding buffer’ı çözüp DNA’nın filtreden geçebilmesi için 8 civarında
olmalıdır.
 Nanodropta ölçüm yapıldı. (DNA saflığının 1.8 olmalıdır.)
 Tekrar elektroforez yapıldı ve DNA bantlarına bakıldı.
 DTCS yapıldı. (Dye terminator cycle sequencing)
- Sanger dizi analizi yöntemiyle kapiler elektroforezi yapmak için DTCS reaksiyonu yapılır.
 Saflaştırılan ürünler nanodrop ölçümüne göre 1-2 µl arasında küçük tüplere konuldu.
 Üzerine bir reaksiyon için 5 µl DTCS konuldu.
 0.7 µl primer konuldu.
 Toplam hacim 20 µl olacak şekilde su eklendi.
- DTCS floresan etiketleme yöntemiyle yapıldı.
 DTCS reaksiyonu gerçekleşmesi için 3 saat inkübasyona bırakıldı.
 İnkübasyondan sonra etanol çöktürmesi ile bir saflaştırma daha yapıldı.
- Etanol çöktürmesinde; Glikojen (Pellette DNA’yı görünür hale getirir.), Na2EDTA, Sodyum
asetat eklenir.
- Etanol çöktürmesinde eklenen bu maddeler DTCS reaksiyonunda enzim aktivitesini
durdurur. Daha iyi çökmesi için etanolün soğuk olması gerekir.
- Sonrasında SLS (Formamid) eklendi. Kapiler jel elektroforezi için DNA’nın denatüre olması
gerekir. Bu SLS’nin içindeki formamid ile sağlanır.
 Kapler jel elektroforezi yapıldı.
- Kapiler jel elektroforezi Page’in kapiler ile yapılanıdır.
- Cihaz kapilerini plate’e daldırır ve sadece DNA’yı alır. Bunun sebebi ise DNA’nın eksi yüklü
olmasıdır.
- Daha sonra jel yürütüldü ve cihazda oluşan pikler analiz edildi.

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Staj Yapanın İmzası Adı, Soyadı, İmzası, Firma Kaşesi
YAPILAN İŞİN;
TARİHİ: 03.08.2018 KAPSAMI: HYBRID-R BLOOD RNA-TOTAL RNA
ISOLATION YAPILDI

Protokol:

 1.5’luk tüplere (hasta sayısı kadar) 750 µl Riboex LS konuldu.

 Lenfositler 250 µl PBS ile sulandırıldı. Dikkatlice vortexlendi.
 Örnekler Riboex üzerine eklendi ve dikkatlice vortexlendi. 2 dk oda sıcaklığında bekletildi.
 200 µl kloroform eklendi. 15 sn vortexlendi. 2 dk oda sıcaklığında bekletildi.
 12000g’de 15 dk +4 C’de santrifüj yapıldı.
 Üst faz toplandı (450 µl kadar) toplandı ve filtreye aktarıldı.
  10000g de 30 s santrifüj edildi.
 Altta toplanan sıvının üzerine 900 µl RBI buffer eklendi ve pipetaj yapıldı.
 Bu karışımların yaklaşık 700 µl’si kolona aktarıldı.
  10000g de 30 s santrifüj edildi.
 Bu aşama geriye kalan sıvıyla tekrar edildi.
 Kolona 500 µl buffer RBW eklendi.
  10000g de 30 s santrifüj edildi.
 Ayrıca  10000g de 1 dk santrifüj edildi.
 Kolon 1.5’lik tüpe yerleştirildi.
 50 µl nükleaz free water kolonun merkezine eklendi ve biraz bekletildi.
  10000g de 1 dk oda sıcaklığında santrifüj edildi.

Stajımı bu firmada yaptım. Staj Yeri Yetkilisinin

Staj Yapanın İmzası Adı, Soyadı, İmzası, Firma Kaşesi