KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA PH MÔI TRƯỜNG LÊN

ĐỘNG HỌC SINH TRƯỞNG CỦA NẤM MEN

TRONG QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY MẺ

N.H. Minh, Đ.D. Tùng, N.N.M. Giao, N.V.T. Nguyên, N.T.T. Ngọc

Khoa Công nghệ Hóa Học và Thực Phẩm

Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật thành phố Hồ Chí Minh

Số 1, đường Võ Văn Ngân, quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh

TÓM TẮT

Mu ̣c đích của cuô ̣c thí nghiê ̣m này là nghiên cứu sự ảnh hưởng của pH nhân giố ng đế n sự
sinh trưởng và phát triể n của nấ m men Saccharomyces cerevisiae. Tiế n hành khảo sát ảnh
hưởng của pH nhân giố ng lên đô ̣ng ho ̣c sinh trưởng của nấ m men bằ ng phương pháp nuôi
cấ y mẻ trong thời gian 12 tiế ng với viê ̣c thay đổ i pH của môi trường nhân giố ng lầ n lươ ̣t
là 5.0, 6.0, 7.0, 8.0. Dựa trên các thông số đô ̣ng ho ̣c thu đươ ̣c ta thấ y số lươ ̣ng và chấ t
lươ ̣ng của nấ m men giố ng quyế t đinh ̣ đế n mâ ̣t đô ̣ sinh trưởng của nấ m men, khi số lươ ̣ng
nấ m men giố ng áp đảo thì tố c đô ̣ lên men sẽ nhanh hơn, đây là yế u tố quan tro ̣ng trong
viê ̣c chố ng nhiễm đố i với các vi sinh vâ ̣t có ha ̣i trong quá trin
̀ h lên men.

GIỚI THIỆU

Saccharomyces cerevisiae là một loài nấm men được biết đến nhiều nhất có trong bánh
mì nên thường gọi là men bánh mì là một loại vi sinh vật thuộc chi Saccharomyces lớp
Ascomycetes ngành nấm. Loài này có thể xem là loài nấm hữu dụng nhất trong đời sống
con người từ hàng ngàn năm trước đến nay. Nó được dùng rộng rãi trong quá trình lên
men làm bánh mì, rượu, và bia (Feldmann, Horst. 2010). Saccharomyces cerevisiae là vi
sinh vâ ̣t chủ yế u đươ ̣c dùng trong quá trình lên men. Hầ u hế t các loa ̣i chủng
Saccharomyces cerevisiae phát triể n ở pH từ 2.5 đế n 8.5 nhưng những loa ̣i ưa acid phát
triể n tố t ở điề u kiê ̣n pH thấ p (Carmelo, et al. 1996). Khoảng pH tố i thić h để nấ m men
phát triể n là từ 4.0 đế n 6.0 phu ̣ thuô ̣c vào nhiê ̣t đô ̣ sự hiê ̣n diê ̣n của oxy trong môi trường
và loa ̣i nấ m men (Narendranath and Power. 2005). Viê ̣c nghiên cứu các yế u tố ảnh hưởng
đế n quá trình sinh trưởng của nấ m men là cầ n thiế t để đảm bảo mu ̣c đić h chính của quá
trình nhân giố ng nhằ m ta ̣o ra quầ n thể nấ m men có chấ t lươ ̣ng tố t, số lươ ̣ng lớn, thời gian
nhân giố ng nhanh.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vi sinh vật

S. cerevisiae (nấm men bánh mì, MauriPan), được sử dụng trong suốt quá trình nghiên
cứu này, dạng instant dry yeast, men khô bảo quản ở nhiệt độ thường. Quá trình nhân
giống ở điều kiện nhiệt độ phòng trong 24 giờ.

Chuẩn bị môi trường nhân giống

Chuẩn bị 1 lit môi trường M1d chứa dịch chiết cà chua từ 100g cà chua, 200g saccharose,
1g peptone. Môi trường được điều chỉnh giá trị pH lần lượt là 5, 6, 7, 8 bằng dung dịch
NaOH 0.1 N, được phân phối vào bình nhân giống và được tiệt trùng ở 121oC. Vi sinh
vật được nhân giống trong bình tam giác 250 mL, chứa 100 mL môi trường nhân giống
trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng trên thiết bị có khuấy từ với tốc độ 120 rmp.

Chuẩn bị môi trường lên men

Môi trường lên men là môi trường được chuẩn bị như môi trường nhân giống và được
điều chỉnh đến giá trị pH = 5. Sau đó, rót 190 ml môi trường lên men đã chuẩn bị vào
bình tam giác 250 mL và đem đi tiệt trùng ở 121oC.

Điều kiện lên men

Quá trình nuôi cấy mẻ được tiến hành trong bình tam giác 250ml. Sau quá trình nhân
giống, dịch nấm men (10ml) được bổ sung vào 190 ml môi trường lên men đã được
chuẩn bị. Tiến hành lên men trong điều kiện nhiệt độ phòng trên thiết bị có khuấy từ với
tốc độ 120 rmp. Trong suốt quá trình nuôi cấy, bắt đầu từ giờ thứ 0, cứ mỗi một giờ thì
lấy mẫu và đo các chỉ tiêu: (a) mật độ tế bào/ml, (b) tỷ lệ tế bào sống, (c) tỷ lệ tế bào nảy
chồi, (d) hàm lượng đường tổng sẽ được kiểm tra, ghi nhận và biểu diễn thành bảng và đồ
thị. Các thông số động học sinh trưởng của nấm men sẽ được tính toán để rút ra kết luận.

Kỹ thuật phân tích

Phương pháp xác định mật độ tế bào vi sinh vật, tỷ lệ tế bào sống, tỷ lệ tê bào nảy chồi
bằng phương pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu. Kết quả đếm được là tổng số
tế bào có trong mẫu, không phân biệt được tế bào còn sống hay đã chết (chỉ phân biệt tế
bào nấm nem sống/chết khi tiến hành nhuộm xanh bởi methylene blue).

Tiến hành pha loãng huyền phù nấm men theo tỷ lệ đã chọn với nước cất cùng với 50µl
methylene blue 30% rồi để trên máy lắc đều trong 30 giây. Hút huyền phù sau khi lắc để
đưa vào buồng đếm. Nhẹ nhàng dùng đầu pipette đặt một giọt huyền phù nấm men vào
cạnh buồng đếm tiếp giáp với hamelle. Dịch huyền phù sẽ đi vào buồng đếm nhờ cơ chế
mao dẫn. Buồng đếm được chuẩn bị đúng khi chỉ có vùng không gian nằm giữa buồng
đếm và hamelle được trám đầy bởi huyền phù nấm men, còn các rãnh xung quanh thì
không bị dính ướt. Dùng vật kính ×40 để quan sát, điều chỉnh cường độ ánh sáng bằng
cửa trập để có thể quan sát rõ tế bào và các đường kẻ.

Đặt buồng kính lên kính hiển vi, điều chỉnh cường độ sáng bằng cửa trập và sử dụng vật
kính ×40 để quan sát cả tế bào lẫn đường kẻ. Tiến hành đếm ô chứa nấm mem theo hai
đường chéo. Bắt đầu đếm tế bào và kết quả đếm mật độ tế bào chỉ có giá trị trong vòng 3
– 5 phút sau khi nhỏ giọt dịch vào buồng đếm, phải đếm các tế bào nằm trên 2 đường kẻ
kề nhau được chọn của từng ô.

Ở mỗi độ pha loãng, sau khi đếm ta được số tế bào trên 5 ô lớn là a, số tế bào nấm men b
(N) trên 1,0 ml mẫu:

Trong đó:

N: số tế bào trên 1.0 ml mẫu cho vào buồng đếm

a: số tế bào trên 5 ô vuông lớn

b: số ô vuông nhỏ trên 5 ô vuông lớn (16×5=80)

400: tổng số ô vuông nhỏ trong 25 ô vuông lớn

0.1: thể tích (mm2) mẫu chứa trên ô trung tâm

103: số chuyển mm2 thành ml (103 mm2 = 1 ml)

10n: độ pha loãng mẫu (lưu ý khi tính độ pha loãng phải bao gồm lượng methylene blue
cho vào mẫu).

Phương trình hồi quy của pha log dựa vào công thức:

lnNt = μt + lnNo

(phương trình có dạng: y = ax + b)

Trong đó: Nt: số tế bào ở thời điểm thứ t

No: số tế bào ở thời điểm bắt đầu.

μ: hằng số tốc độ sinh trưởng đặc trưng.

Các thông số động học

Tốc độ phân chia tế bào (µ, h-1) đặc trưng thể hiện sự thay đổi của mật độ tế bào trong
một đơn vị thời gian.

Hiệu suất tạo thành tế bào trên một đơn vị cơ chất YN/S (cell. g-1 sucrose)

Tốc độ đặc trưng tạo thành tế bào QN (cell. g-1 sucrose.h-1).

Thời gian thế hệ td (phút)

Trong đó:

No và Nt là số tế bào ở thời điểm bắt đầu và thời điểm thứ t (cell/ml).

So và St là nồng độ cơ chất ở thời điểm bắt đầu và thời điểm thứ t (g/ml).

KẾT LUẬN

Từ các kết quả nghiên cứu trên cho thấy, khi sử dụng môi trường lên men Md1 thay giá
đỗ bằng cà chua để nuôi cấy nấm men Saccharomyces cerevisiae ở các điều kiện pH
nhân giống khác nhau (5.0, 6.0, 7.0, 8.0) trong cùng một nhiệt độ phòng, thì sau 12 giờ
nuôi cấy (kể từ khi tiếp giống), ở các mẫu pH 5.0 và 6.0 số lượng tế bào đạt cực đại
nhanh hơn so vởi các mẫu pH 7.0 và 8.0. Do đó, thời gian sinh trưởng của nấm men càng
dài, đồng thời lượng sinh khối thu được cũng nhiều hơn ở các mẫu có pH nhân giống
càng cao.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Feldmann, Horst. 2010. Yeast. Molecular and Cell Biology. Wiley-Blackwell

Carmelo V, Bogaerts P, Sa Correia I. 1996. Activity of plasma membrane H ´ +-ATPase
and expression of PMA1 and PMA2 genes in Saccharomyces cerevisiae cells grown at
optimal and low pH. Arch Microbiol 166(5):315–20.

Narendranath NV, Power R. 2005. Relationship between pH and medium dissolved solids
in terms of growth and metabolism of lactobacilli and Saccharomyces cerevisiae during
ethanol production. Appl Environ Microbiol 71(5):2239–43.

Nwaka, Solomon, and Helmut Holzer.1997. Molecular biology of trehalose and the
trehalases in the yeast Saccharomyces cerevisiae. In: Progress in nucleic acid research
and molecular biology, vol. 58, pp. 197-237.