Mahfudz, Jurnal PROTEIN

Sistem Kultur Sel Embrio Ayam untuk Pengujian Aktivitas Faktor

Pertumbuhan Limbah Distilasi Shochu

Muscle Cell Culture System of Chick Embryo For Examine Growth Factor
Activity From Shochu Distillery By-Product
L.D. Mahfudz1 dan K. Hayashi2
Faculty of Animal Science Diponegoro University, Semarang
Faculty of Agriculture, Kagoshima University, Japan
Email: ludfimahfudz@yahoo.com

Abstract
Background: Shochu is a common name for alcohol beverage from Japan. Shochu distilllery by-product
(SDBP) containt an unidentified growth promoting factor (UGF) for chicken. This experiment was
conducted to study in vitro activity of growth factor from SDBP due to its difficulty to examine in vivo,
related by very small amount of UGF.
Methods: The material of this experiment is chicks embryo muscle cell culture and UGF from SDBP. The
parameters for examined UGF from SDBP were creatine-kinase activity, protein and DNA content from
chick embryo muscle cells culture. The growth factor was separated by Sephadex LH-20 with 60 x 750mm
column, used solvent system of water, methanol and ethylene dichloride (10 : 90 : 20). The fraction 1, there
are contain UGF than added to chick embryo muscle cells culture. Rosalki (1967), protein content by
modification of Lowry method, examined the creatine kinase activity and Erwin, et al. (1981) method,
examined DNA content.
Result: The protein content and creatine kinase activity was increase by SDBP addition, but not the DNA. The
increaseing of protein content and creatine kinase activity showed that UGF from SDBP stimulated the
growth and maturity of myotubes. Eventhough, proliferation of myotubes has not existed, with signed by
same amount of DNA content. It could be concluded that chick embryo muscle cell culture can be used for
evaluate UGF activity from SDBP.

Key word: chick embryo, muscle cell, cell culture, growth factor, shochu.

Abstrak
Latar Belakang: Shochu adalah nama umum yang dipakai untuk minuman beralkohol khas Jepang. Limbah
Distilasi Shochu (LDS) mengandung “unidentified growth promoting factor” (UGF) untuk ayam. Penelitian
dilakukan untuk mencari cara menguji aktivitas faktor pertumbuhan dari limbah distilasi shochu secara in vitro,
karena sangat sulit untuk menguji secara in vivo berkenaan dengan jumlah growth factor yang sangat sedikit.
Metode: Materi dari penelitian ini adalah kultur jaringan sel dari embrio anak ayam, growth factor dari LDS.
Adapun parameter untuk menguji growth factor dari LDS adalah aktivitas kreatin kinase, kandungan protein dan
DNA dari kultur jaringan embrio anak ayam. Faktor pertumbuhan dipisahkan dengan menggunakan Sephadex
LH-20 dengan kolom 60 x 750 mm menggunakan pelarut air, methanol dan ethylene dikloride (10 : 90 : 20).
Fraksi 1 yang diketahui mengandung UGF kemudian ditambahkan pada kultur jaringan sel embrio ayam.
Aktivitas keratin kinase di ukur menurut metode Rosalki (1967), kandungan protein dengan modifikasi metode
Lowry, sedang DNA ditentukan menurut Erwin., et al (1981).
Hasil: Kandungan protein dan aktivitas kreatin kinase meningkat dengan pemberian UGF dari LDS, namun
konsentrasi DNA tidak dipengaruhi oleh UGF dari LDS. Peningkatan konsentrasi protein dan aktivitas keratin
kinase menunjukan bahwa UGF menstimulasi perkembangan dan pemasakan myotub-myotub. Walaupun belum
terjadi proses proliferasi ditandai dengan kandungan DNA yang sama. Disimpulkan bahwa sistem kultur sel
jaringan embrio ayam dapat digunakan untuk mengecek aktivitas UGF dari LDS.

Kata kunci: embrio ayam, kultur sel, aktivitas growth faktor, limbah shochu

PENDAHULUAN Penelitian kami terdahulu telah

menunjukan bahwa Limbah Distilasi Shochu
(LDS) mengandung “unidentified growth

60
Mahfudz,
promoting factor” (UGF) untuk ayam. Shochu
adalah nama umum yang dipakai untuk
minuman beralkohol khas Jepang. UGF dapat
dipisahkan dengan kromatografi kolom (60 x
750 mm) menggunkan Sephadex LH-20,
dengan pelarut air, methanol dan ethylene
dikloride (10 : 90 : 20), menghasilkan 4 fraksi,
dimana hanya fraksi 1 yang mengandung UGF.
Namun sangat sulit untuk meneliti efek promosi
pertumbuhan yang didapat pada fraksi 1 diatas
secara in vivo, maka kami mencoba secara in
vitro menggunakan system kultur sel.
Sistem kultur sel akhir-akhir ini banyak
digunakan untuk meneliti aktivitas zat biologi
seperti hormone, enzym dan sebagainya. Gulve
dan Dice (1989) memperlihatkan bahwa
Insulin-like growth factors (IGF) –1 dan –2
menstimulasi pertumbuhan dengan
meningkatkan sintesis protein dan menghambat
degradasi protein pada kultur sel jaringan. Juga
diperlihatkan bahwa IGFs memperpanjang
setengah kehidupan dari protein myotubes yang
berusia lama (Tsujinaka, et al., 1995). IGF-1
telah diketahui mempunyai efek anabolisme
pada jaringan skeleton, hal ini dipercaya dapat
meningkatkan keberadaan konsentarsi asam
amino yang meningkat (Zdanpwicz, et al.,
1995). Kemudian Stewart dan Rotwein (1996)
melaporkan bahwa IGF-2 adalah faktor yang
mengatur kehidupan untuk deferensiasi
myoblast. IGF berperan menekan pada sel yang
mati secara nyata, mengindikasikan bahwa
sinyal “transduction pathways” merupakan
mediasi dari daya hidup myoblast secara in
vitro. Florini, et al. (1991) juga menyatakan
bahwa IGF –1 dan IGF-2 mengatur diferensiasi
myoblast in vitro. Meningkatkan pertumbuhan
dan regenerasi jaringan otot in vivo (Coleman
et al., 1995) dan meningkatkan masa jaringan
selama perkembangan embrio (Liu, et al.,
1993).
61
Jurnal PROTEIN
Tujuan penelitian ini untuk mengetahui
efek UGF terhadap stimulasi pertumbuhan pada
kultur jaringan sel embrio ayam, menggunakan
aktivitas Creatin Kinase (CK), kandungan
protein dan DNA sebagai Indeks dari
pertumbuhan sel.
MATERI DAN METODE
Pemisahan UGF fraksi (1) telah
dilakukan dengan prosedur sebagai berikut:
100mg ekstrak ether dari limbah distilasi
shochu (LDS) dilarutkan dalam 5 ml pelarut,
setelah diambil eternya di aplikasikan pada
Sephadex LH-20 dengan kolom (60 x 750mm).
Pelarut air : methanol : ethilin diklorid (10 : 90 :
20) digunakan untuk mengelusi pada kecepatan
elusi 1,5ml/min, dan dimonitor menggunakan
spektrofotometer (UV-150-02 Shimadzu) pada
absorben 292nm.
Ekstrak ether dari LDS terpisahkan
menjadi 4 fraksi, seperti terlihat pada gambar 1.
dan fraksi 1 yang memiliki aktivitas mensuport
pertumbuhan ayam broiler, akan diaplikasikan
pada kultur sel, untuk mengetahui aktivitasnya.
Kultur sel jaringan embrio diambil dari
embrio hasil penetasan telur ayam broiler. Sel
jaringan diisolasi dengan medium m-PBS dari
jaringan paha embrio berumur 13 hari
pengeraman, menggunakan prosedur
Konigsberg (1994). Jaringan paha di direndam
dan di autolisis dalam m-PBS selama 1 jam
pada temperatur 40ºC dan disayat dengan
silet. Pemisahan sel jaringan menggunakan
pipet yang dihubungkan dengan aspirator.
Larutan sel kemudian disaring dan dilarutkan
dalam medium kultur.
Volume 15 No. 2 Tahun.2007 Chciks Embryo Muscle Cell Culture System for Examine Growth Factor Activity

Gambar 1. Pemisahan UGF dari LDS menggunakan Sephadex LH-20 dengan pelarut
terdiri dari : air : methanol : 1,2-dichloroethane (10 : 90 : 20) pada kecepatan
aliran 1,5 ml/min. menggunakan kolom (60 x 750 mm) dimonitor pada
absorben 292 nm

Persiapan penanaman dilakukan Sel-sel diinkubasikan pada 5% CO2 dengan

untuk mengisolasi myoblas. Sel-sel jaringan temperatur 37ºC dengan medium basal seperti
ditanam pada cawan kultur jaringan yang berisi tertera pada Tabel 1
6 lobang gelatin, dengan kerapatan 2,5 x 10 5.

Tabel 1. Komposisi Medium Basal untuk Kultur Sel dan Kondisi Inkubasi
Komposisi / Kondisi Level
Medium m-199 (%) 82,5
Serum Anak Sapi (%) 15,0
Ekstrak Embrio Ayam (%) 2,5
Streptomycin (mg/l) 100,0
Penicillin (U/l) 105
Kelembaban Udara (%) 95,0
CO2 (%) 5,0
Temperatur (ºC) 37,0

Setelah 24 jam medium diganti dengan
medium yang mengandung UGF dari LDS
fraksi 1, dan medium diganti setiap hari
berturut-turut selama 6 hari. Frakksi 1 yang
ditambahkan kedalam medium pada level 0;
0,001; 0,01 dan 0,1%. Pada hari ke 6 medium
dikumpulkan, dan lapisan sel dicuci dengan
PBS dingin sebanyak 3 kali dan sel-sel
dikumpulkan dengan disekrap dan dilarutkan
dalam buffer Tris-HCl (Ph 6).
Medium dan sel-sel yang terkumpul
disimpan pada temperatur –80ºC, sampai
dianalisis. Sel-sel kemudian dihomogenkan
dengan Polytron homogeniser dan disentrifuse
pada kecepatan 2.500 rpm selama 10 min, pada
temperatur 4ºC. Aktivitas Creatin Kinse (CK),
kandungan protein dan DNA, dicari pada
supernatan yang dihasilkan.
Analisis Aktivitas Creatin Kinase ,
Kandungan Protein dan DNA
Aktivitas Creatin kinase (CK) ditentukan
menggunakan modifikasi metode Rosalki
(1967). Campuran subtrat sebanyak 2,9ml yang
mengandung adenosin phosphate (ADP),
creatin phosphat (CP), glukosa, magnesium

62
Mahfudz,
klorid, hexokinase, glucose 6-phosphat (G6P)
dan nicotinamid adenine dinucleotide
phosphate (NADP) pada konsentrasi terpilih
untuk mengoptimalkan kondisi reaksi.
Kemudian ditambahkan adenosine mono
phosphate (AMP) dan cystine hydroclorid
untuk menghambat aktvitas myokinase. Semua
reagen dilarutkan dalam buffer Tris pada pH
6,8 dan temperatur 25ºC. Ambil 2,5ml larutan
tersebut dan tambahkan 0,1 ml sample dan
inkubasikan pada 30±1ºC selama 6 min.
Aktivitas CK di tentukan dengan melihat
kenaikan optical density per menit pada 340nm,
akibat konsumsi NADP.
Konsentrasi protein ditentukan dengan
modifikasi metode Lowry menggunakan
standar bovine serum albumin (BSA).
Kandungan DNA ditentukan
menggunkan modifikasi metode Erwin et al.
(1981). Suspensi sel-sel di sentrifuse dengan
kecepatan 3.000 rpm pada 4ºC selama 15 min.,
dan endapannya di suspensikan kembali dengan
memvortex pada 500μl TCA 5%. Suspensi sel-
sel kemudian dihodrolisa pada 90ºC selama
30min. Sampel kemudian didinginkan pada 4ºC
dan disentrifus dengan kecepatan 3.000 rpm
pada 4ºC selama 15min. Sebanyak 500μl
supernatan ditambah 200μl diaminobenzoic
acid dihydrocloride (DABA) dan dijaga pada
temperatur 60ºC selama 1 jam, kemudian
ditambahkan 1N HCl untuk menghentikan
reaksi. DNA dihitung dengan Spektrofotometer
Tabel 2. Pengaruh UGF yang Dipisahkan dengan Spadhex LH-20 Terhadap Kandungan Protein,
Aktivitas CK dan Kandungan DNA pada Kultur Sel Jaingan Embrio Ayam.
Parameter Yang Diamati
0 0,001
Konsentrasi Protein (mg/plet) 1,11±0,5a
Aktivtas CK (IU/plet) 25,8±1,5a
Kandungan DNA (μg/plet) 17,8±4,8
Keterangan : Superskrip dengan huruf yang berbeda pada baris yang sama menunjukan
perbedaan yang nyata (P<0,05)
Penambahan UGF fraksi 1 dari LDS
nyata meningkatkan aktivtas CK pada kultur sel
jaringan embrio ayam. Penambahan 0,001%
fraksi 1, meningkatkan 15,12% aktivitas CK,
namun peningkatan penambahan fraksi 1 lebih
dari 0,1 tidak meningkatkan aktivitas CK.
Aktivitas CK adalah parameter yang baik untuk
mengetahui kematangan myotub pada kultur sel
63
Jurnal PROTEIN
Fluorescensi (Hitachi F-2000), pada eksitasi
panjang gelombang 314nm dan emisi panjang
gelombang 520nm.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini untuk mengevaluasi respon
kultur jaringan terhadap UGF dari limbah
distilasi shochu (LDS) yag dipisahkan
menggunakan Sephadex LH-20 kolom ukuran
60 x 750mm, untuk mengkonfirmasi bahwa
system kultur sel dapat dipakai untuk mengecek
aktivitas UGF. Tabel 2 memperlihatkan
konsentrasi protein, aktivitas CK dan
kandungan DNA dari kultur sel jaringan embrio
ayam.
Penanaman myoblas pada kultur telah
berkembang menjadi multi nucleated myotub,
yang merupakan akumulasi dari protein
jaringan yang spesifik. Sehingga konsentrasi
protein dari kultur sel adalah indek yang baik
untuk pertumbuhan sel-sel jaringan (Erwin, et
al., 1981; Florini dan Magri, 1989 dan Gulve
dan Dice, 1989).
Konsentrasi protein dari kultur sel
jaringan embrio ayam nyata (P<0,05)
meningkat jika fraksi 1 UGF ditambahkan
kedalam medium. Hasil ini memperlihatkan
bahwa farksi 1 mengandung UGF untuk
pertumbuhan myotube dari sel jaringan embrio
ayam.
UGF dari LDS (fraksi 1)
0,01 0,1
3,01±0,5 b
1,54±0,3 ab
2,73±0,1b
29,7±0,9b 27,5±0,6ab 24,7±0,7a
16,7±3,6 14,6±2,9 15,9±3,2
(Florini, et al., 1991; Jacobs, et al., 1992 dan
Silverman, et al., 1995). Peningkatan aktivitas
CK pada penelitian ini menunjukan bahwa
fraksi 1 telah mensuport pemasakan myotub.
Pemasakan myotub adalah tahapan untuk
proliferasi dari pertumbuhan sel (Jacobs, et al.,
1992 dan Silverman, et al., 1995).
Volume 15 No. 2 Tahun.2007 Chciks Embryo Muscle Cell Culture System for Examine Growth Factor Activity
Kandungan DNA tidak dipengaruhi oleh
fraksi 1. Kandungan DNA ditujukan sebagai
indek untuk proliferasi kultur sel jaringan
(Cottin, et al., 1994; Gulve dan Dice, 1989;
Hong dan Forsberg, 1994 dan Vyboh, et al.,
1994). Hasil ini menunjukan bahwa proliferasi
sel tidak dipacu oleh fraksi 1 hasil pemisahan
UGF dari LDS. Hasil ini sejalan dengan hasil
dari IGFs 1,6 yang menstimulasi diferensiasi
sel, baik morpologi (fusi) dan biokimia
(aktivitas CK) seperti yang dilaporkan oleh
(Florini, et al., 1991 dan Stewert dan Rotwein,
1996). Silverman, et al. (1995) juga
memperlihatkan bahwa IGF-1 menstimulasi
myogenesis pada sel-sel tikus L6E9.
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil diatas dapat
disimpulkan bahwa sistem kultur sel jaringan
embrio ayam dapat digunakan untuk mengecek
aktivitas UGF dari LDS.
DAFTAR PUSTAKA
Coleman,M.E., F. DeFayo, K.C. Yin., H.M.
Lee, R. Geske, C. Montgomery and
R.j. Schawartz. 1995. Growth of cell.
J. Biolgy Chem. 270: 12109 – 12116.
Cottin, P., J.J. Brustis., S. Poussard, N.
Elamrani, S. Broncard dan A.
Ducasting. 1994. Ca- Dependent
Proteinases (Calpains) and Muscle
Cell Differentiation. Biochem. Et
Biophys. Acta. 1223: 170 – 178.
Erwin, B.G., C.M. Stoscheck and J.R. Florini.
1981. A Rapid Flourometric Method
for The Estimation of DNA in Cultue
Cells. Anal. Biochem. 110: 291 – 294.
Florini, J.R. and K.A. Magri. 1989. Effects of
Growth Factor in Myogenic
Differentiation. Am. J. Physiol. 256:
C701 –C711.
Florini, J.R., D.E. Ewton and K.A. Magri.
1991. Hormons, Growth Factors and
Myogenic Differentiation. Am. J.
Physiol. 53: 201 – 216.
Gulve, E.A. and J.F. Dice. 1989. Regulation of
Protein Synthesis and Degradation
in L8 Myotubes. Effects of Serum,
Insulin and Insulin Like Growth
Factors. Biochem. J. 260: 377 – 387.
Hong, D.H. and N.E. Konisberg. 1994. Effects
of Serum and Insulin Like Growth
Factor I on Protein Degradation and
Protease Gene Expression in Rat L8
Myotubes. J. An. Sci., 72: 2279 –
2288.
Jacobs, A.E., A.A.G.M. Benders, A. Oosterhof
and J.H. Veerkamp. 1992. Effects of
Growth Medium, Electrical
Stimulation and Paralysis on
Various Enzyme Activities in
Cultured Rat Muscle Cells.
Comparation with Activities in Rat
Muscles. Int. J. Biochem. 24 (5): 751 –
758.
Konisberg, I.R. 1994. Skeletal Muscle in
Culture. In Methods in Enzymology.
Vol. 58. Ed. By Jakoby, W.B. and I.H.
Pastan. Academic Press, New York, pp:
511 – 527.
Liu, J.P., J. Backe, A.S. Perkins, E.J. Robertson
and A. Edstratiadis. 1993. Growth of
Myotubes. J. Cell. 75: 59 – 72.
Rosalki, S.B. 1967. An Improve Procedure
for Serum Creatine Phosphokinase
Determination. J. Lb. And Clin. Med.
69 (4): 696 – 705.
Silverman, L.A., A.Q. Cheng, D. Hsiao and.
S.M. Rosenthal. 1995. Skeletal Muscle
Cells Derived Insulin-Like Growth
Factor (IGF) Biding Proteins Inhibit
IGF-I-Induced Myogenesis in Rat
L6E9 Cccells. Endrocrin. 136: 720 –
726.
Stewart, C.E.H. and P. Rotwein. 1996. Insulin-
Like Growth Factor-II. An Autocrine
Survival Factor for Differentiating
Myoblast. J. of Biol. Chem. 271:
11330 –11338.
Tsujinaka, T., C. Ebisui, J. Fujita, T. Morimoto,
A. Ogawa, K. Ishidoh, E. Kominami,
M. Yano, H. Shiozaki and M. Monden.
64
Mahfudz, Jurnal PROTEIN

1995. IGF on Myotubes

Differentiation of Culture Cells. Zdanowicz, M.M., J. Moyse, M.A.
Biochem and Biophys. Res. Comm. Wingertzahn, M. O’connor, S.
208(1): 353 –359. Teichberg and A.E. Slonim. 1995.
Insulin-Like Growth Factor in
Vyboh, P., D. Lamosova, M. Vanekova and M. Differentiation of Myotubes Rat
Jurani. 1994. Effects of Thyroid Muscle Cells. Endocrine. 136: 4880 –
Hormones on Chicks Embryo 4886.
Muscle Cell Culture. Comp. Biochem.
Physiol. 109C: 269 – 276.

65