CHƢƠNG 5: PHỤ LỤC

5.1. Cách pha một số hóa chất

5.1.1. Cách pha dung dịch đệm [4,6]
* Dung dịch đệm acid citric - Na2HPO4 (pH 3, 4, 5)
- Dung dịch acid citric 0,1M: Hòa tan 10,504g acid citric (C6H8O7) trong
500ml nước cất (dung dịch a)
- Dung dịch Na2HPO4 0,2M: Hòa tan 71,7g Na2HPO4. 12H2O trong 500ml
nước cất (dung dịch b)
Dung dịch đệm acid citric - Na2HPO4 có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml
dung dịch a và số ml dung dịch b với tổng thể tích 100ml
Acid citric 0,1M Na2HPO4 0,2M
pH
(dd a, ml) (dd b, ml)
79,45 20,55 3,0
61,45 38,55 4,0
48,50 51,50 5,0

* Dung dịch đệm phosphate (pH 6, 7, 8)

- Dung dịch NaH2PO4 0,2M: Hòa tan 27,8g NaH2PO4 trong 500ml nước cất
(dung dịch a)
- Dung dịch Na2HPO4 0,2M: Hòa tan 71,7g Na2HPO4. 12H2O trong 500ml
nước cất (dung dịch b)
Dung dịch đệm phosphat có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch a
và số ml dung dịch b với tổng thể tích 200ml
NaH2PO4 0,2M Na2HPO4 0,2M
Nước (ml) pH
(dd a, ml) (dd b, ml)
87,7 12,3 100 6,0
39,0 61,0 100 7,0
5,3 94,7 100 8,0

82
5.1.2. Cách pha một số hóa chất khác [4,6]
- Thuốc nhuộm Bradford: Hòa tan 10mg Coomassive Brilliant Blue vào
50ml etanol 96o, thêm 100ml H3PO4 85%, định mức với nước cất đến 1000ml.
- Dung dịch Albumin 100 µg/ml: cân 10mg Albumin pha với nước cất thành
100ml
- Dung dịch Na2HPO4 1/15M: hoà tan 5,96g Na2HPO4.12H2O trong nước
thành 250 ml
- Dung dịch KH2PO4 1/15M: hoà tan 0,9072g KH2PO4 trong nước thành
100ml
- Dung dịch đệm Sorensen 1/15M, pH 7.6: trộn 177ml dung dịch Na2HPO4
1/15M và 23 ml dung dịch KH2PO4 đo và chỉnh lại pH cho đúng.
- Dung dịch Casein 1%: đun sôi cách thuỷ 1g Casein trong đệm Sorensen
đến tan hoàn toàn rồi sau đó định mức bằng đệm Sorensen cho đủ 100ml.
- Dung dịch TCA (tricloro acid) 10%: hoà tan 10g TCA trong nước cho đủ
100ml
- Dung dịch NaOH 0,5N: hoà tan 10g NaOH trong nước cho đủ 500 ml
- Dung dịch HCl 0,2N: trộn 4,25ml HCl đậm đặc với nước cho đủ 250 ml
- Dung dịch tyrosin 20mM: khuấy nghiền 0,118 g tyrosin trong dung dịch
HCl 0,2N vừa đủ 50ml
- Dung dịch tyrosin chuẩn 1mM: pha loãng 5 ml tyrosin 20mM trong HCl
0,2N thành 100 ml.
5.2. Xây dựng đƣờng chuẩn Bradford

Bảng 5.1. Tương quan giữa giá trị ∆OD với nồng độ albumin
Ống nghiệm số 1 2 3 4 5 6
Nồng độ protein
0 10 20 30 40 50
(μg/ml)
OD595nm 0,051 0,070 0,084 0,099 0,110 0,125
ΔOD 0 0,019 0,033 0,048 0,059 0,074

83
 0,08 y = 0,0015x
R2 = 0,9907
0,07

0,06

0,05
∆OD

0,04

0,03

0,02

0,01

0
0 10 20 30 40 50 60
Nồng độ protein (µg/ml)

Đồ thị 5.1. Sự tương quan giữa giá trị ∆OD và nồng độ albumin

Bảng 5.2 . Giá trị OD tương ứng khi xác định hàm lượng protein trong lá trà
nguyên liệu
Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3
OD595nm 0,119 0,119 0,120
ΔOD 0,068 0,068 0,069
Hàm lượng protein trong
45,33 x 50 = 45,33 x 50 = 46 x 50 =
nguyên liệu suy ra từ đường
2266,5 2266,5 2300
chuẩn (µg/ml)
Hàm lượng protein trong
nguyên liệu suy ra từ đường 2,27 2,27 2,30
chuẩn (mg/ml)

5.3. Các số liệu thực nghiệm

Bảng 5.3. Giá trị OD tương ứng khi xác định hoạt độ PPO trong nguyên liệu

OD420nm KC OD420nm TN ∆OD

Mẫu 1 0,016 0,321 0,305
Mẫu 2 0,018 0,327 0,309
Mẫu 3 0,019 0,349 0,330

84
 Bảng 5.4. Giá trị OD tương ứng khi xác định pH tối ưu cho hoạt động của PPO
pH OD420nm KC OD420nm TN ∆OD ∆OD TB
0,008 0,166 0,158 0,158
3 0,007 0,164 0,157 ± 0,002
0,010 0,170 0,160
0,011 0,250 0,239 0,238
4 0,010 0,245 0,235 ± 0,002
0,012 0,251 0,239
0,010 0,330 0,320 0,322
5 0,010 0,327 0,317 ± 0,006
0,011 0,340 0,329
0,015 0,232 0,217 0,218
6 0,015 0,232 0,217 ± 0,001
0,016 0,235 0,219
0,017 0,164 0,140 0,151
7 0,019 0,172 0,153 ± 0,003
0,017 0,170 0,160
0,018 0,099 0,081 0,090
8 0,017 0,112 0,095 ± 0,005
0,017 0,110 0,093

Anova: Single Factor

SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance se
3 3 3356,8905 1118,9635 116,5370 10,80
4 3 5038,8693 1679,6231 266,3703 16,32
5 3 6826,8551 2275,6184 1947,8330 44,13
6 3 4614,8410 1538,2803 66,5926 8,16
7 3 3201,4134 1067,1378 599,3332 24,48
8 3 1901,0601 633,6867 1664,8146 40,80

ANOVA
Source of Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 4919341,122 5 983868,2244 1266,3807 6,70064E-16 3,105875
Within Groups 9322,961539 12 776,9134616
Total 4928664,083 17

85
 Bảng 5.5. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của pH đến độ bền
của PPO
pH OD420nm KC OD420nm TN ∆OD ∆OD TB
0,008 0,054 0,046 0,045
3 0,010 0,052 0,042 ± 0,003
0,008 0,055 0,047
0,010 0,159 0,149
0,154
4 0,012 0,172 0,160
±0,006
0,010 0,163 0,153
0,011 0,331 0,320
0,322
5 0,011 0,332 0,321
±0,002
0,012 0,336 0,324
0,015 0,236 0,221
0,219
6 0,017 0,240 0,223
±0,005
0,018 0,231 0,213
0,019 0,172 0,153
0,155
7 0,020 0,170 0,150
±0,007
0,020 0,183 0,163
0,019 0,118 0,099
0,100
8 0,018 0,116 0,098
±0,002
0,019 0,121 0,102

Anova: Single Factor

SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance se
3 3 954,0636042 318,0212014 349,61106 18,70
4 3 3265,017668 1088,339223 1548,2775 39,35
5 3 6819,787986 2273,262662 216,42589 14,71
6 3 4643,109541 1547,70318 1398,4442 37,40
7 3 3293,286219 1097,762073 2314,0922 48,11
8 3 2113,074205 704,3580683 216,42589 14,71

ANOVA
Source of Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 6943231,211 5 1388646,242 1378,7019 4,02872E-16 3,105875
Within Groups 12086,55371 12 1007,212809
Total 6955317,765 17

86
 Bảng 5.6. Giá trị OD tương ứng khi xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động
của PPO
o
Nhiệt độ ( C) OD420nm KC OD420nm TN ∆OD ∆OD TB
0,014 0,331 0,317
0,317
20 0,014 0,328 0,314
± 0,003
0,015 0,334 0,319
0,014 0,378 0,364
0,359
30 0,014 0,372 0,358
± 0,004
0,014 0,369 0,355
0,017 0,225 0,208
0,206
40 0,018 0,225 0,207
± 0,003
0,017 0,220 0,203
0,024 0,198 0,174
0,173
50 0,024 0,194 0,170
± 0,003
0,023 0,198 0,175
0,023 0,164 0,141
0,139
60 0,029 0,162 0,133
± 0,005
0,024 0,167 0,143
0,030 0,141 0,111
0,109
70 0,030 0,136 0,106
± 0,003
0,029 0,139 0,110
0,030 0,098 0,068
0,070
80 0,029 0,097 0,068
± 0,003
0,028 0,102 0,074

Anova: Single Factor

SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance se
20 3 6713,780919 2237,926973 316,3147665 17,79
30 3 7611,30742 2537,102473 1048,833173 32,39
40 3 4367,491166 1455,830389 349,6110577 18,70
50 3 3667,844523 1222,614841 349,6110577 18,70
60 3 2946,996466 982,3321555 1398,444231 37,40
70 3 2310,954064 770,3180212 349,6110577 18,70
80 3 1484,09894 494,6996466 599,3332418 24,48
ANOVA
Source of Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 10256446,85 6 1709407,808 2712,264151 1,24609E-20 2,84773
Within Groups 8823,51717 14 630,2512265
Total 10265270,36 20

87
Bảng 5.7. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền
của PPO
o
Nhiệt độ ( C) OD420nm KC OD420nm TN ∆OD ∆OD TB
0,014 0,345 0,331
0,328
30 0,015 0,340 0,325
± 0,003
0,014 0,343 0,329
0,015 0,323 0,308
0,307
40 0,016 0,321 0,305
± 0,002
0,018 0,325 0,307
0,016 0,256 0,240
0,234
50 0,019 0,254 0,235
± 0,007
0,017 0,243 0,226
0,015 0,112 0,097
0,095
60 0,017 0,114 0,097
± 0,003
0,018 0,110 0,092
0,016 0,061 0,045
0,048
70 0,016 0,062 0,046
± 0,004
0,019 0,071 0,052
0,018 0,045 0,027
0,030
80 0,017 0,047 0,030
± 0,003
0,018 0,050 0,032

Anova: Single Factor

SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance se
30 3 6961,130742 2320,376914 466,1480769 21,59
40 3 6501,766784 2167,255595 116,5370192 10,80
50 3 4954,063604 1651,354535 2513,869986 50,14
60 3 2021,201413 673,7338045 416,2036401 20,40
70 3 1010,600707 336,8669022 715,870261 26,76
80 3 628,975265 209,6584217 316,3147665 17,79

ANOVA
Source of Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 13179160,4 5 2635832,081 3479,689377 1,5706E-18 3,10587524
Within Groups 9089,8875 12 757,490625
Total 13188250,3 17

88
Bảng 5.8. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền
của PPO theo thời gian

Nhiệt độ Thời gian

OD420nm KC OD420nm TN ∆OD ∆OD TB
(oC) (phút)
0,014 0,378 0,364
0 0,014 0,372 0,358 0,359±0,005
0,014 0,369 0,355
0,014 0,354 0,340
5 0,015 0,352 0,337 0,337±0,003
0,014 0,348 0,334
0,017 0,291 0,274
10 0,015 0,282 0,267 0,272±0,004
0,015 0,289 0,274
0,019 0,228 0,209
15 0,017 0,221 0,204 0,205±0,004
0,019 0,220 0,201
60
0,018 0,202 0,184
20 0,017 0,212 0,195 0,187±0,007
0,021 0,202 0,181
0,018 0,137 0,119
25 0,017 0,137 0,120 0,120±0,001
0,022 0,142 0,120
0,015 0,112 0,097
30 0,017 0,114 0,097 0,095±0,003
0,018 0,110 0,092
0,018 0,097 0,079
35 0,017 0,090 0,073 0,074±0,005
0,02 0,090 0,070
40 0,018 0,082 0,064 0,065±0,001

89
 0,018 0,083 0,065
0,019 0,084 0,065
0,014 0,378 0,364
0 0,014 0,372 0,358 0,359 ± 0,005
0,014 0,369 0,355
0,017 0,183 0,166
5 0,017 0,186 0,169 0,166 ± 0,003
0,019 0,182 0,163
0,016 0,104 0,088
10 0,019 0,107 0,088 0,087 ± 0,001
0,018 0,104 0,086
0,018 0,085 0,067
15 0,018 0,088 0,070 0,067 ± 0,003
0,017 0,082 0,065
0,018 0,084 0,066
70
20 0,018 0,080 0,062 0,065 ± 0,003
0,016 0,083 0,067
0,015 0,076 0,061
25 0,016 0,076 0,060 0,060 ± 0,002
0,017 0,075 0,058
0,018 0,062 0,044
30 0,016 0,070 0,054 0,049 ± 0,005
0,016 0,065 0,049
0,018 0,052 0,034
35 0,018 0,057 0,039 0,037 ± 0,003
0,018 0,055 0,037
0,018 0,042 0,024
40 0,017 0,047 0,030 0,028 ± 0,003
0,016 0,045 0,029

90
 0,014 0,378 0,364
0 0,014 0,372 0,358 0,359 ± 0,005
0,014 0,369 0,355
0,017 0,128 0,111
5 0,017 0,138 0,121 0,118 ± 0,006
0,015 0,138 0,123
0,018 0,048 0,030
10 0,016 0,045 0,029 0,030 ± 0,001
0,015 0,046 0,031
0,016 0,042 0,026
15 0,017 0,040 0,023 0,026 ± 0,004
0,016 0,046 0,030
0,019 0,040 0,021
80
20 0,017 0,041 0,024 0,025 ± 0,005
0,015 0,045 0,030
0,016 0,035 0,019
25 0,016 0,039 0,023 0,020 ± 0,003
0,018 0,036 0,018
0,017 0,028 0,011
30 0,019 0,024 0,005 0,008 ± 0,003
0,019 0,026 0,007
0,017 0,022 0,005
35 0,016 0,022 0,006 0,005 ± 0,001
0,015 0,020 0,005
0,016 0,020 0,004
40 0,017 0,023 0,006 0,005 ± 0,001
0,016 0,020 0,004

91
 Bảng 5.9. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến
hoạt độ của PPO
Nồng độ
OD420nm KC OD420nm TN ∆OD ∆OD TB
cơ chất (mM)
0,009 0,102 0,093
0,093
10 0,009 0,095 0,086
± 0,008
0,008 0,109 0,101
0,012 0,125 0,113
0,115
20 0,010 0,129 0,119
± 0,003
0,010 0,124 0,114
0,011 0,171 0,160
0,161
30 0,014 0,176 0,162
± 0,001
0,014 0,176 0,162
0,013 0,260 0,247
0,243
40 0,015 0,253 0,238
± 0,005
0,015 0,260 0,245
0,020 0,348 0,328
0,330
50 0,018 0,347 0,329
± 0,002
0,017 0,349 0,332
0,019 0,343 0,324
0,328
60 0,017 0,354 0,337
± 0,008
0,020 0,343 0,323
0,023 0,352 0,329
0,331
70 0,020 0,351 0,331
± 0,002
0,025 0,358 0,333
0,025 0,347 0,322
0,326
80 0,027 0,362 0,335
± 0,008
0,024 0,345 0,321
0,027 0,368 0,341
0,335
90 0,028 0,355 0,327
± 0,007
0,027 0,363 0,336
0,030 0,354 0,324
0,326
100 0,028 0,351 0,323
± 0,005
0,027 0,359 0,332

92
Anova: Single Factor
SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance se
10 3 1978,7986 659,5995 2813,5366 53,04
20 3 2445,2297 815,0766 516,0925 22,72
30 3 3420,4947 1140,1649 66,5926 8,16
40 3 5159,0106 1719,6702 1115,4258 33,40
50 3 6989,3993 2329,7998 216,4259 14,71
60 3 6954,0636 2318,0212 3046,6106 55,20
70 3 7017,6678 2339,2226 199,7777 14,13
80 3 6911,6608 2303,8869 3046,6106 55,20
90 3 7095,4064 2365,1355 2513,8700 50,14
100 3 6918,7279 2306,2426 1215,3146 34,86

ANOVA
Source of Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 13118907 9 1457656,32 988,22 1,756E-24 2,392814
Within Groups 29500,514 20 1475,03
Total 13148407 29

Bảng 5.10. Giá trị OD tương ứng khi xác định động học phản ứng của PPO theo
thời gian
Thời gian OD420nm
OD420nm TB
(phút) Lần 1 Lần 2 Lần 3
0 0,012 0,016 0,014 0,014±0,002
5 0,351 0,353 0,349 0,351±0,002
10 0,428 0,431 0,426 0,428±0,003
15 0,435 0,436 0,431 0,434±0,003
20 0,434 0,431 0,429 0,431±0,003
25 0,429 0,429 0,426 0,428±0,002
30 0,418 0,422 0,418 0,419±0,002
35 0,406 0,410 0,401 0,406±0,005
40 0,396 0,393 0,384 0,391±0,006
45 0,382 0,386 0,379 0,382±0,004
50 0,379 0,380 0,376 0,378±0,002
55 0,377 0,380 0,376 0,378±0,002
60 0,369 0,372 0,372 0,371±0,002

93
Bảng 5.11. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của acid ascorbic đến hoạt
độ của PPO
Nồng độ
OD420nm OD420nm HđC
acid ascorbic ∆OD ∆OD TB
KC TN (UI/gNL)
(mM)
0,016 0,215 0,199
0,197 1392,23
0 0,018 0,211 0,193
± 0,003 ± 24,48
0,017 0,216 0,199
0014 0,188 0,174
0,173 1222,61
1 0,014 0,185 0,171
± 0,002 ± 12,24
0,015 0,189 0,174
0,014 0,029 0,015
0,017 117,79
5 0,013 0,030 0,017
± 0,002 ± 10,80
0,014 0,032 0,018
0,013 0,016 0,003
0,003 23,56
10 0,014 0,018 0,004
± 0,001 ± 4,08
0,013 0,016 0,003
0,015 0,015 0,000
0,001 4,71
50 0,014 0,015 0,001
± 0,001 ± 4,08
0,013 0,014 0,001
0,014 0,014 0,000
0,000 0,00
100 0,014 0,014 0,000
± 0,000 ± 0,00
0,014 0,014 0,000

Anova: Single Factor

SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance se
0 3 4176,678 1392,226 599,3332 24,48
1 3 3667,845 1222,615 149,8333 12,24
5 3 353,3569 117,7856 116,537 10,80
10 3 70,67138 23,55713 16,64815 4,08
50 3 14,13428 4,711425 16,64815 4,08
100 3 0 0 0 0,00

ANOVA
Source of Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 6531323 5 1306265 8718,119 6,36921E-21 3,105875
Within Groups 1798 12 149,8333
Total 6533121 17

94
 Bảng 5.12. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của acid citric đến hoạt
độ của PPO
Nồng độ HđC
OD420nm OD420nm
NaCl ∆OD ∆OD TB (UI/mlddE)
KC TN
(mM)
0,016 0,215 0,199 0,197
1392,23
0 0,018 0,211 0,193 ± 0,003
± 24,48
0,017 0,216 0,199
0,014 0,194 0,180
0,180 1274,44
1 0,014 0,192 0,178
± 0,003 ± 17,79
0,014 0,197 0,183
0,014 0,166 0,152
0,156 1100,12
5 0,015 0,174 0,159
± 0,004 ± 24,82
0,014 0,170 0,156
0,014 0,145 0,131
0,130 921,08
10 0,015 0,144 0,129
± 0,001 ± 8,16
0,015 0,146 0,131
0,015 0,110 0,095
0,098 694,94
50 0,014 0,112 0,098
± 0,004 ± 24,82
0,015 0,117 0,102
0,014 0,108 0,094
0,092 650,18
100 0,014 0,103 0,089
± 0,003 ± 18,7
0,015 0,108 0,093

Anova: Single Factor

SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance se
0 3 4176,678 1392,2261 599,33324 24,48
1 3 3823,322 1274,4405 316,31477 17,79
5 3 3300,353 1100,1178 615,98139 24,82
10 3 2763,251 921,08363 66,592582 8,16
50 3 2084,806 694,93522 615,98139 24,82
100 3 1950,53 650,17668 349,61106 18,70

ANOVA
Source of Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 1382010 5 276401,95 646,85325 3,72341E-14 3,105875
Within Groups 5127,629 12 427,3024
Total 1387137 17

95
 Bảng 5.13. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của NaCl đến hoạt độ
của PPO
Nồng độ
OD420nm OD420nm HđC
acid citric ∆OD ∆OD TB
KC TN (UI/gNL)
(mM)
0,016 0,215 0,199
0,197 1392,23
0 0,018 0,211 0,193
± 0,003 ± 24,48
0,017 0,216 0,199
0,015 0,199 0,184
0,182 1286,22
1 0,016 0,194 0,178
± 0,003 ± 24,48
0,014 0,198 0,184
0,017 0,198 0,181
0,180 1274,44
5 0,016 0,194 0,178
± 0,002 ± 14,71
0,016 0,198 0,182
0,015 0,182 0,167
0,166 1170,79
10 0,014 0,179 0,165
± 0,001 ± 8,16
0,014 0,179 0,165
0,015 0,152 0,137
0,134 949,35
50 0,016 0,150 0,134
± 0,003 ± 17,79
0,014 0,146 0,132
0,015 0,143 0,128
0,129 911,66
100 0,015 0,143 0,128
± 0,002 ± 12,24
0,015 0,146 0,131

Anova: Single Factor

SUMMARY
Groups Count Sum Average Variance se
0 3 4176,678 1392,2261 599,33324 24,48
1 3 3858,657 1286,2191 599,33324 24,48
5 3 3823,322 1274,4405 216,42589 14,71
10 3 3512,367 1170,7892 66,592582 8,16
50 3 2848,057 949,35218 316,31477 17,79
100 3 2734,982 911,66078 149,83331 12,24

ANOVA
Source of Variation SS df MS F P-value F crit
Between Groups 567049,7 5 113409,94 349,34188 1,46665E-12 3,105875
Within Groups 3895,666 12 324,63884
Total 570945,4 17

96
Bảng 5.14. Sự thay đổi OD420nm theo thời gian trong chế biến trà đen (mẫu TN)
Thời gian (phút) Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3
0 0,300 0,297 0,311
5 0,315 0,314 0,330
10 0,340 0,337 0,340
15 0,365 0,360 0,369
20 0,388 0,384 0,385
25 0,412 0,398 0,401
30 0,436 0,430 0,434
35 0,464 0,461 0,466
40 0,484 0,483 0,481
45 0,507 0,498 0,500
50 0,522 0,516 0,52
55 0,538 0,532 0,538
60 0,555 0,549 0,557

Bảng 5.15. Sự thay đổi OD420nm theo thời gian trong chế biến trà xanh (mẫu TN)
Thời gian (phút) Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3
0 0,373 0,369 0,372
5 0,374 0,367 0,373
10 0,373 0,369 0,375
15 0,372 0,368 0,374
20 0,372 0,368 0,375
25 0,373 0,369 0,373
30 0,373 0,369 0,373
35 0,373 0,367 0,375
40 0,374 0,369 0,374
45 0,372 0,368 0,375
50 0,372 0,368 0,375
55 0,374 0,368 0,373
60 0,374 0,369 0,373

97
 Bảng 5.16. Giá trị OD tương ứng khi xác định hoạt độ của chế phẩm PPO thô từ lá
trà nguyên liệu
Hoạt độ Thể tích Khối lượng
OD420nm OD420nm chung dung dịch PPO thô (g)
Mẫu ∆OD
KC TN
(UI/ml ddE) enzyme (ml)

1 0,013 0,032 0,019 38 10 0,1661

2 0,012 0,032 0,02 40 10 0,1763
3 0,015 0,035 0,020 40 10 0,1756

Bảng 5.17 . Giá trị OD tương ứng khi xác định hàm lượng protein trong chế phẩm
PPO thô từ lá trà
Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3
OD595nm 0,08 0,084 0,082
ΔOD 0,029 0,033 0,031
Hàm lượng protein trong CPE 19,33 x 20= 22 x 20 = 20,67 x 20 =
suy ra từ đường chuẩn (µg/ml) 386,60 440 413,40
Hàm lượng protein trong CPE
0,387 0,440 0,413
suy ra từ đường chuẩn (mg/ml)

5.4. Xác định sự tƣơng quan giữa nồng độ và độ hấp thu cực đại của
benzoquinon ở bƣớc sóng 420nm [2]

Bảng 5.18. Sự tương quan giữa nồng độ và độ hấp thu cực đại của benzoquinon ở bước
sóng 420nm
Nồng độ
benzoquinon 9 18 27 36 45 54 63 72 81 90
(mM)
OD420nm 0,045 0,096 0,138 0,183 0,226 0,272 0,321 0,356 0,408 0,454

98
 0,50 y = 0,005x
0,45 R2 = 0,9994
0,40
0,35
OD420mm

0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
9 18 27 36 45 54 63 72 81 90 99
Nồng độ benzoquinon (mM)

Đồ thị 5.2. Sự tương quan giữa giá trị OD và nồng độ benzoquinon

5.5. Phƣơng pháp tách chiết dung dịch enzyme ficin từ sung và bromelin từ
dứa [4,7]
- Tách chiết enzyme ficin từ quả sung: cân khoảng 20g quả sung, cắt nhỏ,
nghiền với 20ml nước cất, lọc qua vải thường, dịch lọc đem ly tâm với tốc độ
12000 vòng/5 phút, thu dịch nổi chứa enzyme ficin
- Tách chiết enzyme bromelin: cân khoảng 20g quả thơm đã gọt bỏ vỏ,
nghiền trong cối với 20ml nước cất, lọc qua vải thường, dịch lọc đem ly tâm với tốc
độ 12000 vòng/5 phút, thu dịch nổi chứa enzyme bromelin
5.6. Phƣơng pháp xác định hoạt độ protease của enzyme ficin và bromelin theo
Anson [4,6]
- Nguyên tắc:
Cho protease tác dụng với cơ chất là casein (hoặc hemoglobin), sản phẩm tạo
thành là các peptid ngắn hay acid amin, trong các loại acid amin, tyrosin chiếm đa
số. Xác định tyrosin bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin, từ đó xác định hoạt độ
protease theo định nghĩa:

99
 Hoạt độ của protease được biểu thị là số micromole tyrosin sinh ra do thuỷ
phân Casein bởi 1ml dung dịch hay 1 mg chế phẩm protease trong thời gian 1 phút
ở điều kiện chuẩn (35,50C, pH 7.6)
- Tiến hành thí nghiệm
Bảng 5.19. Phương pháp xây dựng đường chuẩn tyrosin
Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5
Dung dịch tyrosin chuẩn 1mM (ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Dung dịch HCl 0,2N (ml) 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0
Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 2 2 2 2 2 2
Thuốc thử Folin (ml) 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6
Lượng tyrosin (mol) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Lắc và để yên 10 phút đem đo mật độ quang ở bước sóng 660 nm
Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên mật độ quang (OD) theo lượng tyrosin ở các ống.
Bảng 5.20. Phương pháp xác định lượng tyrosin trong dung dịch nghiên
cứu
Ống nghiệm
Dung dịch hoá chất
Thử thật (3 ống) Thử không (3 ống)
Casein 1% (ml) 5 5
TCA 10% (ml) 0 5
Dịch enzyme mẫu (ml) 1 0
Lắc đều và giữ ở 35,5oC, trong 30 phút
TCA 10% (ml) 5 0
Dịch enzyme mẫu (ml) 0 1
Lọc, lấy 1ml dịch lọc thực hiện phản ứng màu
Dịch lọc (ml) 1 1
Dung dịch NaOH 0.5N (ml) 2 2
Thuốc thử Folin (ml) 0.6 0.6
Lắc đều, để yên 10 phút, đo OD ở bước sóng 660 nm

100
 - Cách tính: Hoạt độ protease:
x.V .K
Hoạt độ protease (UI/ml) =
t.v
x: số mol tyrosin suy ra từ đường chuẩn
V: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng enzyme (11 ml)
v: thể tích dịch lọc đem phân tích (1ml)
K: độ pha loãng mẫu
t: thời gian phản ứng (30 phút)
1 UI (Anson) = 1 mol Tyrosin/ml/phút ;
hoặc = 1 mol/mg/phút
* Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn tyrosin
Bảng 5.21. Tương quan giữa giá trị ∆OD với nồng độ tyrosin
Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5
Lƣợng tyrosin (μmol) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

OD660nm 0,027 0,319 0,610 0,860 1,110 1,310

ΔOD 0,000 0,292 0,583 0,833 1,083 1,283

y = 1,3367x
1,4
R2 = 0,994
1,2
1
0,8
∆OD

0,6
0,4
0,2
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Nồng độ tyrosin (µmol)
Đồ thị 5.3. Sự tương quan giữa giá trị ∆OD và nồng độ tyrosin

101
 * Kết quả xác định hoạt độ chung của enzyme bromelin và ficin
Bảng 5.22. Kết quả đo OD khi xác định hoạt độ chung của enzyme bromelin
và ficin
Độ pha Lượng tyrosin
Mẫu OD660nm
loãng suy ra từ
Thử đường chuẩn
Thử thật
không (µmol)
Lần 1 0,413 0,218

Lần 2 0,405 0,216

Bromelin 10
Lần 3 0,416 0,218 0,145

OD660nm TB 0,411 0,217

ΔOD 0,194

Lần 1 0,605 0,438

Lần 2 0,602 0,431

Ficin 1 Lần 3 0,606 0,435 0,139

OD660nm TB 0,604 0,435

ΔOD 0,186

Bảng 5.23. Kết quả xác định hoạt độ chung của enzyme bromelin và ficin

V v Hoạt độ chung
Mẫu x (μmol) t (phút) K
(ml) (ml) (UI/gNL)

Bromelin 0,145 11 30 10 1 4,25

Ficin 0.139 11 30 0 1 0,37

102
5.4. Một số hình ảnh minh họa

Hình 5.1. Phản ứng xúc tác bởi PPO trên cơ chất catechol
1. Dung dịch trước phản ứng
2. Dung dịch sau phản ứng

Hình 5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sẫm màu của khoai tây
1. Mẫu đặt ở nhiệt độ phòng
2. Mẫu xử lí ở nhiệt độ 100oC
3. Mẫu xử lí ở nhiệt độ 4oC

103
Hình 5.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sẫm màu của táo tây
1. Mẫu đặt ở nhiệt độ phòng
2. Mẫu xử lí ở nhiệt độ 100oC
3. Mẫu xử lí ở nhiệt độ 4oC

Hình 5.4. Ảnh hưởng của pH đến sự sẫm màu của khoai tây
1. Mẫu không xử lí
2. Mẫu xử lí ở pH 2
3. Mẫu xử lí ở pH 3
4. Mẫu xử lí ở pH 4

104
Hình 5.5. Ảnh hưởng của pH đến sự sẫm màu của táo tây
1. Mẫu không xử lí
2. Mẫu xử lí ở pH 2
3. Mẫu xử lí ở pH 3
4. Mẫu xử lí ở pH 4

Hình 5.6. Ảnh hưởng của hóa chất đến sự sẫm màu của khoai tây
1. Mẫu không xử lí
2. Mẫu xử lí với acid ascorbic
3. Mẫu xử lí với acid citric
4. Mẫu xử lí với NaCl

105
Hình 5.7. Ảnh hưởng của hóa chất đến sự sẫm màu của táo tây
1. Mẫu không xử lí
2. Mẫu xử lí với acid ascorbic
3. Mẫu xử lí với acid citric
4. Mẫu xử lí với NaCl

Hình 5.8. Ảnh hưởng của enzyme đến sự sẫm màu của khoai tây
1. Mẫu không xử lí
2. Mẫu xử lí với bromelin
3. Mẫu xử lí với ficin

106
 1 2 3

Hình 5.9. Ảnh hưởng của enzyme đến sự sẫm màu của táo tây
1. Mẫu không xử lí
2. Mẫu xử lí với bromelin
3. Mẫu xử lí với ficin

Hình 5.10. Chế phẩm PPO thô từ lá trà

107