IJMS – Indonesian Journal On Medical Science – Volume 5 No.

1 – Januari 2018

Efek dimethyl sulfoxide (DMSO) terhadap Karakteristik Sel Punca Limbal (SPL) Tikus
Effects of dimethyl sulfoxide (DMSO) at Limbal Stem Cells Characteristics (LSCs) of Rat
1 2 3
Ratih Rinendyaputri , Frans Dany , Uly Alfi Nikmah
1-3
Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan Balitbangkes, Kemenkes RI
ratihr79@yahoo.com

Abstact : The number of donor limbal stem cells (LSCs) is limited despite their large demand for
management of LSC deficiency-related corneal opacity, requiring propagation of these cells in vitro.
Production of LSCs can be done through isolation and culture of limbal tissue in vitro and
cryopreservation of LSCs is utilized to maintain the availability of LSCs. Upon cryopreservation,
cryoprotectants are required to protect cells from thermal injury. Dimethyl sulfoxide (DMSO) is a
commonly used cryoprotectant for cryopreservation but the effect of its use on LSCs are still seldomly
reported. This study aimed to determine the effect of the use of DMSO in cryopreservation of LSC.
The study was conducted at the Stem Cell Laboratory, Center for Biomedical and Basic Technology of
Health, NIHRD Ministry of Health. This research was performed by culturing and observation of LSCs
characteristic after cryopreservation. Meanwhile, level of LSC proliferation was determined by
calculating population doubling (PD) and population doubling time (PDT) besides analyzing their gene
expression using markers such as CD90 (Thy1) and Krt12. The results showed that PD and PDT in
LSC control and post-cryopreservation without DMSO and cryopreservation using DMSO accordingly
are 1.33 and 143.03, 150.65 and 1.15, and 1.31 and 155. Meanwhile, CD90 (Thy1) gene expression
and Krt12 expression in the cryopreserved group with and without DMSO compared with their
respective controls are 2.7 and 4.51, 2.55 and 1:44, respectively. In this study, DMSO for the
cryopreservation did not affect at the LSC characteristics of rat.
Key word : limbus stem cell, LSC, cryopreservation, dimethyl sulfoxide, DMSO

Abstrak : Jumlah donor sel punca limbal (SPL) sangat terbatas padahal kebutuhannya cukup besar
untuk penatalaksanaan kekeruhan kornea akibat defisiensi sel tersebut sehingga SPL perlu
diperbanyak secara in vitro. Produksi SPL secara in vitro dapat dilakukan dengan melakukan isolasi
dan kultur dari jaringan limbal, dan metode simpan beku atau kriopreservasi SPL digunakan untuk
menjaga ketersediaan SPL. Pada saat kriopreservasi, dibutuhkan krioprotektan yang dapat
melindungi sel dari kerusakan termal saat kriopreservasi. Dimethyl sulfoxide (DMSO) merupakan
salah satu krioprotektan yang umum digunakan untuk kriopreservasi namun efek penggunaan pada
SPL masih sangat jarang dilaporkan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek penggunaan
DMSO pada kriopreservasi SPL. Penelitian dilakukan di Laboratorium Stem Cell Pusat Biomedis dan
Teknologi Dasar Kesehatan Badan Litbangkes. Penelitian ini dilakukan dengan melakukan kultur SPL
tikus menggunakan metode eksplan secara in vitro pada cawan petri. Pengamatan terhadap
karakteristik SPL pasca kriopreservasi dilakukan dengan pengamatan terhadap morfologi SPL secara
mikroskopis dan mengetahui tingkat proliferasi SPL dengan menghitung population doubling (PD) dan
population doubling time (PDT) serta menganalisis ekspresi gen CD90 (Thy1) dan Krt12 sebagai
marker SPL. Hasil penelitian menunjukkan bahwa PD dan PDT pada SPL kontrol dan pasca
kriopreservasi tanpa DMSO dan kriopreservasi dengan DMSO secara berturut-turut adalah 1.33 dan
143.03, 1.15 dan 150.65 serta 1.31 dan 155. Sedangkan tingkat ekspresi gen CD90 (Thy1) dan Krt12
SPL pada penggunaan dan tanpa DMSO dibandingkan dengan kontrol masing-masing adalah 2,7 dan
4,51 serat 2,55 dan 1,44 kali. Pada penelitian ini, DMSO tidak mengubah karakteristik SPL tikus.
Kata kunci: sel punca limbal, SPL, kriopreservasi, dimethyl sulfoxide, DMSO

I. PENDAHULUAN kimiawi (basa/asam nukleat) atau trauma kronis

Kemampuan sel punca untuk berdiferensiasi
menjadi berbagai tipe sel (plasticity) dan
berproliferasi dalam jangka waktu yang lama
(self-renewal) sangat berpotensi untuk
meregenerasi kerusakan jaringan maupun organ.
(Burman S and Sangwan V, 2008) Jika terjadi
kerusakan pada jaringan kornea, maka sel punca
limbal (SPL) akan berdiferensiasi menjadi sel
epitel kornea sehingga jaringan kornea kembali
)
normal. (Albert R et al, 2009 Kerusakan kornea
dapat terjadi akibat beberapa penyakit genetik
seperti Stevens-Johnson Syndrome (SJS),
diferensisi SPL parsial/total maupu trauma
akibat penggunaan lensa kontak. (Lekhanont K
et al, 2009) Untuk mengatasi permasalahn
tersebut transplantasi SPL dapat dilakukan,
namun ketersediaan donor SPL masih sangat
terbatas. Untuk itu, keberhasilan dalam
memperbanyak SPL secara in vitro serta
kriopreservasi dalam menjamin ketersediaan
SPL sangat dibutuhkan.
Produksi SPL secara in vitro pada manusia
maupun hewan coba dan kriopreservasi SPL
telah berhasil dilakukan. (Loureiro et al, 2013.,
Sancak et al, 2014, Meyer-Blazejewska et al,
2010., Yeh et al, 2008) Pada saat melakukan

ISSN 2443-1249 (Print) 2355-1313 (On Line) - ijmsbm.org 1

 IJMS – Indonesian Journal On Medical Science – Volume 5 No. 1 – Januari 2018
kriopreservasi, dibutuhkan krioprotektan dengan
konsentrasi tinggi untuk menarik sebagian
molekul air keluar dari dalam sel. Krioprotektan
akan masuk ke dalam sel dan mengurangi ikatan
hidrogen air sehingga terbentuknya kristal es
yang dapat merusak membran sel dapat dicegah.
,
(El-Danasaouri I. and Selaman H 2007,
Meryman, 2007) Namun krioprotektan juga
memiliki sifat toksik terhadap sel, sehingga jenis,
konsentrasi dan sifat krioprotektan yang akan
digunakan untuk kriopreservasi sel perlu
diperhatikan. (Bagis et al, 2009)
Terdapat berbagai jenis krioprotektan
intraseluler seperti DMSO, gliserol, propilen glikol
dan etilen glikol yang memiliki berat molekul
kecil. Krioprotektan intrasel merupakan molekul
kecil yang mudah keluar masuk melalui membran
sel. (Meryman, 2007) Penggunaan DMSO untuk
kriopreservasi berbagai tipe sel dengan
konsentrasi rendah telah berhasil dilakukan pada
SPL, haematopoetic stem cell (HSC) dan
embryonic stem cell (ESC). (Kito et al. 2005,
Desai et al. 2010, Djuwantono et al, 2011)
DMSO merupakan krioprotektan intrasel
dengan berat molekul 78,13 g/mol sehingga
secara cepat mampu melewati membran sel dan
mencegah terbentuknya kristal es. (Aye et al.
2010) Konsentrasi DMSO yang tinggi pada
kriopreservasi dapat secara maksimal mencegah
terjadinya kristal es sehingga kerusakan sel tidak
terjadi dan viabilitas sel meningkat. (Bakhach,
2009) Namun pada konsentrasi yang tinggi,
DMSO meliliki sifat toksik terhadap berapa tipe
sel tertentu. Pada sel kanker kolon pemberian
10% DMSO tidak menunjukkan adanya
kerusakan pada struktur membran sehingga
fungsi permeabilitas membran sel tidak
terganggu. (Violante et al. 2002)
Meskipun menurut Food & Drug
Administration DMSO masih dapat digunakan
untuk kriopreservasi sel, perlu dikaji lebih lanjut
pengaruh penggunaan DMSO dengan
konsentrasi tinggi terhadap karakteristik fenotipe
maupun genotipe SPL. Penggunaan
krioprotektan seperti DMSO dalam konsentrasi
10% pada kriopreservasi SPL telah dilaporkan
dengan hasil viabilitas bervariasi. (Yeh et al,
2008. , Kito et al. 2005) Namun informasi efek
tingginya konsentrasi DMSO dalam
kriopreservasi terhadap karakteristik SPL masih
sangat terbatas. Penelitian ini bertujuan untuk
mengetahui efek penggunaan DMSO pada
kriopreservasi SPL.
II. METODE PENELITIAN
Isolasi Sel Punca limbal
Sel punca limba (SPL) yang digunakan
dalam penelitian ini merupakan SPL tikus strain
Wistar jantan atau betina dengan umur 3-4 bulan.
Tikus dipelihara dalam kandang akawat dengan
ISSN 2443-1249 (Print) 2355-1313 (On Line) - ijmsbm.org
pemberian pakan dan minum secara ad libitum.
Tikus yang diambil organ mata diterminasi
dengan melakukan anestesi dengan
menggunakan Xylasine dosis 0,05mg/kg BB dan
ketamin dengan dosis 11mg/kg BB kemudian
dilakukan dislocatio cervicalis. Organ mata
dibawa ke laboratorium menggunakan medium
transport (phosphate buffer saline/PBS yang
mengandung 1% Penisilin-Streptomisin atau
Penstrep). Organ mata dimasukkan ke dalam
Povidone Iodine 1% selama 2 menit kemudian
dilakukan isolasi SPL dengan memotong jaringan
di perbatasan antara konjungtiva dan kornea. Sel
punca limbal (SPL) yang diperoleh dicacah
dalam medium kultur. Sel punca limbal yang
telah dipotong kecil dikultur dengan metode
tempel eksplan pada plate dengan 4 well
menggunakan medium kultur.
Kultur Sel Punca Limbal
Kultur sel punca limbal dilakukan dengan metode
18
yang dikerjakan oleh Krishnan et al (2010)
dengan sedikit modifikasi. Medium kultur yang
digunakan medium α-MEM/F12 dengan 10%
FBS, dan suplementasi Penstrep 1%, ITS (insulin
0,1 mg, transferin 55µg/ml, selenium 5 ng/l),
EGF/epidermal growth factor (0,01 mg/l), dan
0
hidrokortison 0,1 mg/ml pada suhu 37 C, 5%
CO2. Penggantian medium kultur dilakukan
setiap 2-3 hari kultur, setelah 13-15 hari kultur
dilakukan pasase. Pada saat pasase,
penghitungan sel dengan uji Trypan blue
dilakukan sebelum penanaman kembali sel di
cawan petri yang baru.
Kriopreservasi Sel Punca Limbal
Sel punca limbal (SPL) yang digunakan
untuk penelitian ini merupakan SPL pasca
pasase 2. Jenis metode simpan beku atau
kriopreservasi yang dilakukan adalah vitrifikasi
dengan menggunakan SPL pasase 2 pasca
5
kultur (n=8) berjumlah ~5 x 10 sel. Sel
disentrifus pada 1000 rpm selama 5 menit, dan
supernatan lalu dibuang. Pelet dikriopreservasi
menggunakan 2 macam medium yaitu medium
vitrifikasi tanpa dan mengandung 15% DMSO
(A=medium tanpa DMSO, B= medium dengan
DMSO).
Pada medium A, komposisi terdiri dari 50 µl
medium ekuilibrasi (20% etilen glikol/EG) selama
5 menit dan 500µl vitrification solution (40% EG,
18% Ficoll 70 dan 0.3M Sucrose dalam PBS 20%
FBS) selama 40 detik. Pada medium B, pelet
diresuspensi dengan 200 µl medium vitrifikasi
(vitrification solution) komposisi medium kultur
dengan 20% FBS, 15% DMSO dan 15% EG
kemudian dipindahkan ke dalam tabung cryovial
dan segera dimasukkan langsung ke dalam
nitrogen (N2) cair kurang dari 15 detik.
2
 IJMS – Indonesian Journal On Medical Science – Volume 5 No. 1 – Januari 2018

Thawing dilakukan setelah 1 jam dalam maupun kemurniannya. Pengujian kemurnian

nitrogen cair dengan langsung menambahkan RNA total dilakukan dengan membandingkan
medium kultur (suhu 37ᵒC) pada cryovial yang nilai A260 dan A280. Rasio A260/A280 yang baik
diambil dari nitrogen cair. Suspensi sel adalah 1.88-2.00 artinya RNA hasil isolasi bebas
dimasukkan ke dalam conical tube yang berisi 10 dari kontaminasi protein. Hasil spektrofotometri
ml medium kultur. Sentrifugasi sel dilakukan yang positif dilanjutkan dengan proses
pada 1300 rpm selama 5 menit untuk amplifikasi.
mendapatkan pelet. Resuspensi pelet dengan Amplifikasi material genetik RNA dilakukan
medium kultur dan dilakukan kultur di dalam 2 tahap yaitu 1) pengubahan RNA menjadi cDNA
cawan petri. Setalah mengalami 2 pasase, atau RT-PCR (Reverse Transcriptase
dilakukan penghitungan PD dan PDT pada hari Polymerase Chain Reaction) menggunakan kit
ke 7 kultur menggunakan uji Trypan blue. (Invitrogen, 12574-026) dan 2) amplifikasi cDNA
menggunakan realtime PCR dengan SYBR
Menghitung Population Doubling (PD) dan Green PCR Master Mix (AB, #4385610). Tahap
Population Doubling Time (PDT) SPL pertama dilakukan denaturasi RNA pada suhu
0
Penghitungan dilakukan sebanyak 6 kali 70 C selama 5 menit, kemudian tahap kedua
pengulangan (3 rangkap). PD merupakan siklus adalah sintesis komplementari DNA (cDNA)
0
penggandaan jumlah sel dalam suatu periode dengan inkubasi pada suhu 25 C selama 5
0 0
yang dihitung dengan rumus (log10 (jumlah sel menit, 42 C selama 60 menit dan 80 C selama 5
panen) - log 10(jumlah sel ditanam) / log 10 (2). menit. Tahap terakhir tambahkan 50µl nuclease-
Sedangkan PDT merupakan t/PD yaitu, waktu free water (NFW).
yang diperlukan sel untuk menggandakan Amplifikasi cDNA menggunakan mesin
jumlahnya, dengan t menggambarkan periode Applied Biosystem 7500 fast Realtime PCR
kultur penghitungan tersebut sesuai dengan system (AB 7500 realtime PCR) dengan tahapan
12
metode yang dilakukan Roy S et al (2014). aktivasi enzim 95ᵒC selama 3 menit, denaturasi
Dalam penelitian ini ∆t= 6 hari (104 jam). 95ᵒC selama 1-3 detik dan annealing/ekstensi
60ᵒC selama 20 detik (40 cycle). PCR dilakukan
Induksi Diferensiasi menjadi Osteosit dengan primer spesifik gen CD90 (Thy1) dan
Induksi dilakukan pada populasi SPL kontrol dan Krt/12. Primer yang digunakan primer spesfik
pasca kriopreservasi. Induksi dilakukan dengan yang didesain dan telah dicek dengan program
medium induksi osteosit (Gibco). Sel yang telah desain primer BLAST (Basic Local Alignment
mengalami konfluensi 60% diinduksi dengan Search Tool) pada situs gene bank database,
medium induksi tersebut selama 14 hari dengan yakni www.ncbi.nlm.nih.gov (Tabel I1). Metode
penggantian medium 2-3 hari sekali. Livak digunakan untuk menganalisa tingkat
Pewarnaan diawali dengan fiksasi ekspresi gen dibandingkan kelompok kontrol.
menggunakan 4% paraformaldehide selama 30 Selain itu, sistem mesin telah dilengkapi dengan
menit pada suhu ruang. Larutan fiksasi dibuang kalibrator ROX pada setiap reaksi serta 18sRNA
dan cuci dengan PBS 2 kali, dilanjutkan dengan sebagai housekeeping gene sebagai kontrol
penambahan larutan pewarnaan Alizarin untuk internal.
osteosit selama 30 menit. Larutan pewarna lalu
dibuang dan dibilas dengan air 2 kali. Tabel I. Urutan Basa (Sekuen) Primer Krt12,
Pengamatan dilakukan dibawah mikroskop CD90(Thy1) dan 18sRNA
inverted.
Panjang
Karakterisasi Sel Punca Limbal Primer Sekuen (Urutan Basa) target
PCR (bp)
Analisis genotipe SPL dilakukan Krt12
menggunakan metode quantitative real-time Forward CTA CCC GCT GAT TGA 367
polymerase chain reaction (qRT-PCR). Tahap ini Reverse GGA CC
diawali dengan tahapan isolasi material genetik TCT GAG CTC TCC GCT
CTT GG
berupa RNA (Ribonucleid Acid), hal ini bertujuan CD90/Thy-
untuk melihat ekspresi gen CD90 (Thy1) dan 1 AGA CCC AGG ACG GAG 416
Krt/12 pada sampel. Sampel yang dilakukan Forward CTA TT
isolasi RNA adalah sel punca limbal kontrol dan Reverse ACA CTT GAC CAG CTT
GTC TCT
pasca kriopreservasi yang telah dikultur selama 7 18sRNA
hari. Proses isolasi RNA dilakukan dengan Forward CAT TCG AAC GTC TGC 109
menggunakan kit mnual (Qiagen, #52906). Hasil Reverse CCT AT GTT TCT CAG
isolasi RNA dilanjutkan dengan uji kualitas GCT CCC TCT CC
menggunakan spektrofotometri yaitu
TM Pengolahan dan Analisis Data
menggunakan Nanodrop , hal ini bertujuan
untuk evaluasi hasil isolasi baik konsentrasi Data dari ekspresi gen Krt12 dan CD90 (Thy1)
akan dianalisis secara deskriptif dan data
ISSN 2443-1249 (Print) 2355-1313 (On Line) - ijmsbm.org 3
 IJMS – Indonesian Journal On Medical Science – Volume 5 No. 1 – Januari 2018
kuantitatif PD, PDT dan PD/hari dianalisis
dengan uji one way ANOVA menggunakan SPSS
16.
III. HASIL
Populasi SPL masih dapat menempel pada
cawan dan memiliki morfologi fibroblast-like cell
pascavitrifikasi dengan DMSO maupun tanpa
DMSO. Sementara tingkat kepadatan SPL pada
kelompok kontrol dan pascavitrifikasi telah
mencapai konfluen pada kultur hari ke-7
(Gambar 1).
A B
C 3). Demikian pula ekspresi gen CD90 atau Thy1
Gambar 1. Kultur sel punca limbal (SPL). SPL pada hari
ke 5 kultur pada kelompok kontrol (A), pasca vitrifikasi
tanpa DMSO (B) dan dengan DMSO (C).
Populasi SPL yang telah divitrifikasi dengan
dan tanpa DMSO masih dapat mengalami
diferensiasi menjadi osteosit. Setelah 14 hari
diinduksi dengan medium diferensiasi ostesoit,
sel diwarnai menggunakan Alizarin (Gambar 2).
A B
C ABCG2, p63 dan CD90/Thy1). (Sancak et al.
Gambar 2. Kemamuan sel punca limbal (SPL) tikus
diferensiasimenjadi osteosit dengan pewarnaan Alizarin.
Kelompok kontrol (A), pasca simpan beku (vitrifikasi) tanpa
DMSO (B) dan menggunakan DMSO (C) .
Tabel II . Tabel population doubling (PD) dan
population doubling time (PDT) SPL tikus
kontrol dan pascavitrifikasi.
PD PDT
(jam)
Koy tntrol 1,33±0,68 143,03±96,5
Vitrifikasi 1,15±0,70 150,65±68,62
(-DMSO)
Vitrifikasi 1,31±0,73 155,45±117,8
(+DMSO)
ISSN 2443-1249 (Print) 2355-1313 (On Line) - ijmsbm.org
Tingkat proliferasi sel punca limbal tikus
secara in vitro pasase ke-2 pada SPL grup
kontrol dan pascavitrifikasi menunjukkan
population doubling (PD) dan population doubling
time (PDT) yang sama (Tabel 2). Pada hari ke-6,
kultur SPL grup kontrol maupun pascavitrifikasi
telah mengalami konfluensi.
Tabel III. Ekspresi relatif gen Krt12 dan CD90
2-ΔΔCt
Kelompok
Krt12 CD90
Kontrol 1 1
Vitrifikasi
(-DMSO) 4,51 2,7
Vitrifikasi
(+DMSO) 1,44 2,55
Ekspresi gen Krt12 yang merupakan penanda sel
epitel kornea pada populasi SPL pascavitrifikasi
tampak lebih tinggi dibandingkan kontrol (Tabel
yang merupakan penanda progenitor epitel/SPL
yang meningkat dua kali lipat pascavitrifikasi.
IV. PEMBAHASAN
Kultur sel punca limbal (SPL) tikus
Pada penelitian ini populasi SPL merupakan
populasi sel yang diperoleh dari eksplan jaringan
limbus pasca pasase 3. Populasi SPL yang
digunakan dalam penelitian ini tidak dilakukan
tahap pemisahan sel sehingga populasi SPL
yang digunakan dalam penelitian ini tidak hanya
mengekspresikan gen ABCG2 dan p63 (data
tidak ditampilkan) tetapi juga mengekspresikan
gen CD90 (Thy1) dan gen Krt12 (Tabel 3).
Penanda tersebut sesuai dengan populasi SPL
yang dilaporkan oleh Krishnan et al (2010)
bahwa pada kultur sel epitel kornea dari jaringan
limbus, terdapat beberapa tipe sel yang akan
tumbuh, yaitu sel epitel kornea (penanda gen
Krt12), SPL (penanda gen ABCG2 dan p63) dan
populasi sel progenitor epitel/SPL (penanda gen
2014, Krishnan et al. 2010, Li et al. 2012)
Secara mikroskopis morfologi SPL
berbentuk kuboid dengan membentuk klon dan
menunjukkan adanya migrasi menjadi sel epitel
kornea. (Meyer-Blazejewska et al. 2010, Loureiro
et al. 2013) Namun ada populasi progenitor SPL
yang memiliki morfologi fibroblast-like cell dan
pada kondisi kultur tertentu akan berdiferensiasi
menjadi sel epitel kornea. (Sancak et al. 2014, Li
et al. 2012, Polisetty et al. 2012) Populasi
progenitor epitel/SPL merupakan mesenchymal
stem cell (MSC) yang berada pada jaringan
limbus sehingga dalam lingkungan kultur dapat
berproloferasi dan berdiferensiasi menjadi SPL.
(Li et al. 2012, Polisetty et al. 2012)
Pada penelitian ini populasi progenitor
epitel/SPL ditunjukkan dengan morfologi
fibroblast-like cell, kemampuan sel tersebut
4
 IJMS – Indonesian Journal On Medical Science – Volume 5 No. 1 – Januari 2018
berdiferensiasi menjadi osteosit serta positif
terhadap penanda CD90 atau Thy1 (Gambar 1, 2
dan Tabel 3). Selain itu kemampuan proliferasi
yang tinggi dengan PDT ± 6 hari (Tabel 2)
menunjukkan bahwa sel progenitor epitel/SPL
pada penelitian ini sangat tinggi dibandingkan
dengan kemampuan proliferasi SPL yang
dilaporkan oleh Loureiro et al. (2013). Hal ini
dapat disebabkan karena populasi SPL yang
digunakan dalam penelitian ini telah mengalami
beberapa pasase sehingga SPL telah
berdiferensiasi spontan menjadi sel epitel kornea.
Sedangkan proliferasi progenitor SPL yang tinggi
akan mendominasi populasi sel yang dikultur.
Karakteristik sel punca limbal (SPL) tikus
pasca kriopreservasi dengan dan tanpa
DMSO
Pascavitrifikasi dengan medium tanpa dan
dengan DMSO, populasi SPL tetap memiliki
morfologi fibroblast-like cell. Hal ini menunjukkan
bahwa penggunaan DMSO dengan konsentrasi
tinggi tidak mempengaruhi fenotipe dan tingkat
proliferasi populasi SPL (Gambar 1 dan Tabel 2).
Metode simpan beku pada penelitian ini
menggunakan DMSO dengan konsentrasi 15%,
namun keterpaparan SPL dengan DMSO pada
suhu ruang sangat cepat (< 15 detik) sehingga
efek toksik tidak mempengaruhi kualitas SPL.
Menurut Bagis et al. (2009) metode
kriopreservasi akan mempengaruhi sifat
toksisitas krioprotektan karena pada suhu ruang
DMSO bersifat toksik namun tidak toksik pada
suhu yang sangat rendah (-196ᵒC).
Pada penelitian ini, metode kriopreservasi
yang digunakan adalah metode vitrifikasi.
Meskipun konsentrasi krioprotektan yang
digunkan cukup tinggi, pelet sel segera
dimasukkan dalam nitrogen cair (-196ᵒC)
sehingga tidak terjadi proses dehidrasi pada sel
(El-Danasaouri I. and Selaman H. 2007)
Krioprotektan intasel seperti DMSO akan
membentuk ikatan hidrogen dengan molekul air
di dalam sel sehingga pengumpulan molekul air
yang membentuk kristal es saat penurunan suhu
tidak terjadi. (Jain J K and Paulson RJ. 2006)
Populasi progenitor SPL dari jaringan limbal
tikus pasca kriopreservasi dengan konsentrasi
15% DMSO pada penelitian ini masih memiliki
sifat multipoten secara fenotipe (Gambar 2 dan
Tabel 3). Secara fenotipe dapat ditunjukkan
dengan kemampuan diferensiasi menjadi osteosit
pasca induksi dan positif terhadap pewarnaan
Alizarin yang menunjukkan proses kalsifikasi sel.
Selain itu ekspresi imunofenotipe seperti
penanda CD90 atau Thy1 merupakan salah satu
ciri multipotensi progenitor SPL. (Li et al. 2012.,
Polisetty et al. 2008., Naaldijk etal. 2012)
Secara genotipe, populasi progenitor SPL
ditunjukkan dengan tingginya ekspresi CD90
ISSN 2443-1249 (Print) 2355-1313 (On Line) - ijmsbm.org
atau Thy1 pada pemeriksaan qRT-PCR, bahkan
lebih tinggi dua kali lipat dibandingkan kontrol
pada penelitian ini. Hal ini senada dengan
populasi progenitor SPL yang diisolasi dari
jaringan limbus pada penelitian lain. (Sancak et
al. 2014, Polisetty et al. 2008) Sehingga
penggunaan 15% DMSO pada kriopreservasi
dengan metode vitrifikasi untuk progenitor SPL
masih aman. Namun, pada 20% DMSO sangat
toksik untuk sel progenitor SPL hewan pada
kriopreservasi dengan metode konvensional
kriopreservasi. (Ock S and Rho G, 2011)
Pada kultur progenitor SPL pascavitrifikasi,
ekspresi gen Krt12 pada medium kriopreservasi
tanpa DMSO menunjukkan 4 kali lebih tinggi
dibandingkan kontrol dan menggunakan DMSO.
Data ini menunjukkan bahwa DMSO tidak
mengurangi potensi diferensiasi progenitor SPL
menjadi epitel kornea. Pada studi ini, proses
pembuangan DMSO saat thawing dapat
mengurangi konsentrasi DMSO ketika dilakukan
kultur sel. Terjadinya diferensiasi progenitor SPL
menjadi sel epitel kornea dapat dipicu oleh
kondisi lingkungan seperti medium kultur.
(Loureiro et al. 2013, Sancak et al. 2014)
V. SIMPULAN
Penggunaan DMSO pada kriopreservasi
populasi SPL tidak mempengaruhi karakteristik
sel tersebut.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis menyampaikan terima kasih kepada
Kepala Badan Litbangkes dan Kepala Pusat
Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan
(PBTDK) atas pemberian dana penelitian,
masukan dan nasehat selama melakukan
penelitian dengan dana DIPA 2014. Teman-
teman tim di Laboratorium Stem Cell PBTDK
Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan,
Badan Litbankes yang telah membantu dalam
proses penelitian, menyediakan bahan untuk
penelitian serta berdiskusi selama menjalankan
penelitian, penulis mengucapkan terima kasih.
DAFTAR PUSTAKA
Burman S and Sangwan V, H 2008, ‘Cultivated
limbal stem cell transplantation for ocular
surface reconstruction’, Clin Opthal, vol.
2, no. 3,hh. 489-502.
Albert R, Vereb Z, Csomos K, Moe MC, Johnsen
EO, Oldstad OK, et al., H 2011, ‘Cultivation
and characterization of corneal limbal
ephitelial stem cell on lens capsule in
animal material-free medium’, PLoS ONE,
vol. 7, no. 10, hh. 1-11.
Lekhanont K, Choubtum L, Chuck RS, Sa-
ngiampornpanit T, Chuckpaiwong V and
Vongthongsri A. H 2009. ‘A Serum-and
feeder-free technique of culturing human
5
 IJMS – Indonesian Journal On Medical Science – Volume 5 No. 1 – Januari 2018
corneal epitheliual stem cells on amniotic
membrane’, Mol Vis, 2009, vol. 15, no. 1,
hh. 294-302.
Loureiro RR, Cristovam PC, Martins CM, Covre
JL, Sobrinho JA, Ricardo JRS,
Hazarbassanov RM, et al, H 2013, ‘
Comparison of culture media for ex vivo
cultivation of limbal epithelial progenitor
cells’, Mol Vis, vol. 19, hh. 69-77.
Sancak İG, Ozen A, Pinarli FA, Tiryaki M,
Ceylan A, Acar U and Delibasi T, H 2014,
‘Limbal stem cells in dogs and cats. Their
identification, culture and differentiation
into keratinocytes’, Kafkas Univ Vet Fak
Derg,, vol. 6, hh. 909-914.
Meyer-Blazejewska E.A, Kruse F.E, Bitterer K,
Meyer C, Hofmann-Rummelt C, Peter H, H
2010, ‘Preservation of the limbal stem cell
phenotype by appropriate culture
techniques’, IOVS, vol. 51, no. 2, hh. 765-
774.
Yeh HJ, Yao CL, Chen HI, Cheng HC, Hwang
SM, H 2008, ‘Cryopreservation of human
limbal stem cell ex vivo expanded on
amniotic membrane’ Cornea, vol. 27, no. 3,
hh. 327-333.
El-Danasaouri I. and Selaman H. , H 2007,
‘Vitrification versus conventional
cryopreservation technique’, Middle East
Fertlity Society Journal, vol. 10, no. 3, hh.
205-206.
Meryman HT., H 2007, ‘Cryopreservation of
living cells: principles and practice’,
Transfusion ,vol. 47, hh. 935-945.
Bagis H, Akkoc T, Taskin C and Arat S, H 2009,
‘Comparison of different cryopreservation
techniques: Higher survival and
implantation rate of frozen-thawed mouse
pronuclear embryos in the presence of
beta-mercaptoethanol in post-thaw
culture’, Reprod Dom Anim, Doi:
10.1111/j.1439-0531.2009.01570.x
Kito K, Kagami H, Kobayashi C, Ueda M,
Terasaki H, H 2005, ’ Effect of
cryopreservation on histology and viability
of cultured corneal epithelial cell sheets in
rabbits’, Cornea, vol. 24, no. 6, hh. 735-
741.
Desai N, Xu J, Tsulata T, Lawson JS, Hafez AF,
Goldfarb J and Falcone T, H 2010,
‘Vitrification of mouse embryo-derived ICM
cells: a tool for presering embryonic stem
cell potential?’, J Assist reprod Genet , DOI
10.1007/s10815-010-9500-x.
ISSN 2443-1249 (Print) 2355-1313 (On Line) - ijmsbm.org
Djuwantono T, Wirakusumah F F, Achmad T H,
Sandra F, Halim D, Faried A., H 2011,
‘Comparison of cryopreservation methods:
slow-cooling vs. rapid-cooling based on
cell viability, oxidative stress, apoptosis,
and CD34+ enumeration of human
umbilical cord blood mononucleated cells,
BMC Research Notes, vol. 11, no. 4, hh.
371.
Aye M, Giorgio C D, Mo M D, Botta A, Perrin J,
Courbiere B., H 2010. ‘Assessment of
genotoxicity of three cryoprotectants used
for human oocyte vitrification: dimethyl
sulfoxide, ethylene glycol and propylene
glycol’ Food Chem Toxicol, vol. 48, hh.
1905-12.
Bakhach J., H 2009, ‘The cryopreservation of
composite tissues: principles and recent
advancement on cryopreservation of
different type of tissues’,
Organogenesis,vol. 5, no.3, hh. 119-126.
Violante GD, Zerrouk N, Richard I, Provot G,
Chaumeil JC and Arnaud P., H 2002,
‘Evaluation of the cytotoxicity effect of
dimethyl sulfoxide (DMSO) on Caco2/TC7
colon tumor cell cultures’, Biol Pharm
Bull,, vol. 25, no. 12, hh. 1600-3.
Krishnan S, Iyer GK and Krishnakumar S., H
2010, ‘Culture and characterisation of
limbal epithelial cells and oral mucosal
cells’, Indian J Med Res,vol.13, no.1, hh.
422-8.
Li G, Zhu Y, Xie H, Chen S, Tseng S., H 2012, ‘
‘Mesenchymal stem cells derived from
human limbal niche cells’, Cornea, vo. 12,
no. 53, hh. 5686-97.
Polisetty N, Fatima A, Madhira SL, Sangwan VS
and Vemuganti GK., H 2008,
‘Mesenchymal stem cell from limbal stroma
of human eye’, Mol Visvol. 14, hh. 431-42.
Jain J K and Paulson RJ. H 2006, ‘Oocytes
cryopreservation’, Fertility and Sterility,
vol.86, hh. 1037-46.
Naaldijk Y, Staude M, Fedorova V and Stolzing
A., H 2012, ‘Effect of different freezing rate
during cryopreservation of rat
mesenchymal stem cell using combination
of hydroxyethyl strach and
dimethylsulfoxide’, BMC Biotechnology,
vol. 12, no.49. DOI:10.1186/1472-6750-12-
49.
Ock S and Rho G., H 2011, ‘Effect of dimethyl
sulfoxide (DMSO) on cryopreservation of
porcine mesenchymal stem cell (pMSC)’,
Cell Transplantation, vol. 20, hh. 231-9.
6