МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

ДНІПРОДЗЕРЖИНСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ ТЕХНІЧНИЙ

УНІВЕРСИТЕТ

О.Ю.Філімоненко

КОНСПЕКТ ЛЕКЦІЙ
з дисципліни «Загальна біотехнологія»
для студентів денної та заочної форм навчання
напряму 6.051401 «Біотехнологія»

Затверджено редакційно-видавничою
секцією науково-методичної ради ДДТУ
____16.06 __2016 р. протокол № _7_

Дніпродзержинськ
2016
 2

Розповсюдження і тиражування без офіційного дозволу

Дніпродзержинського державного технічного університету заборонено

Конспект лекцій з дисципліни „Загальна біотехнологія‖ для

студентів напряму 6.051401 „Біотехнологія‖/ Укл.: старший викладач
Філімоненко О.Ю. – Дніпродзержинськ, ДДТУ, 2016. – 157 с.

Укладачі: ст. викладач Філімоненко О.Ю.

Відповідальний за випуск: к.т.н., доцент Корнієнко І.М.
Рецензент: к.т.н., доцент кафедри ПБЗХ Анацький А.С.
Затверджено на засіданні кафедри
промислової біотехнології та загальної хімії,
протокол № 11 від 28.04.2016 р.

Коротка анотація видання. Конспект лекцій складений з

урахуванням робочої програми з дисципліни «Загальна біотехнологія», в
якому наведені теми, які викладаються на лекційних заняттях.
 3

Зміст
Вступ ………………………………………………………………….. 4
Тема Т1. Предмет та значення біотехнологічної галузі. …………… 5
Тема Т4. Основні закономірності культивування мікроорганізмів 9
та отримання продуктів мікробного синтезу ………………………..
Тема Т5. Біологічні агенти біотехнології ……………………………. 16
Тема Т6. Поживні середовища в біотехнології ……………………… 19
Тема Т8. Значення асептики в біотехнологічних процесах ………… 38
Тема Т9. Теоретичні основи стерилізації …………………………… 46
Тема Т10. Стерилізація поживних середовищ …………………. 53
Тема Т11. Стерилізація апаратури й комунікацій ………………. 61
Тема Т12. Очищення та стерилізація повітря ………………………. 63
Тема Т13. Виробниче культивування мікроорганізмів. 77
Поверхневе та глибинне культивування ………………………………
Тема Т14. Одержання посівного матеріалу …………………………. 94
Тема Т15. Технологічні схеми одержання культур мікроорганізмів … 105
Тема Т17. Екстрагування БАР із поверхневих культур …………….. 112
Тема Т18. Концентрування БАР методом вакуум-випарювання ….. 116
Тема Т19. Мембранні методи очищення розчинів БАР …………... 119
Тема Т20. Процес ферментації ……………………………………… 134
Тема Т21. Основні технологічні прийоми регуляції 142
процесів мікробіологічного синтезу ………………………………..
Перелік посилань …………………………………………………….. 157
 4

Вступ

Дисципліна ―Загальна біотехнологія‖ є дисципліною бакалаврської

підготовки фахівців-біотехнологів, належить до циклу професійної та
практичної підготовки, що призначена надати базові знання з
технологічного втілення процесів біосинтезу та отримання цінних
речовин з використанням мікроорганізмів та інших біологічних об'єктів.
Дана дисципліна є одною з найбільш визначальних у підготовці
майбутнього біотехнолога, що допомагає інтегрувати знання, отримані
при вивченні таких дисциплін як «Загальна мікробіологія та
вірусологія», «Біологія клітини», «Загальна біохімія», «Процеси і
апарати біотехнологічних виробництв» та втілити їх у практичній
діяльності.
Предметом дисципліни є вивчення технологій виробництва
біологічно активних речовин або мікробних мас за допомогою
біологічних агентів із застосуванням наукових та інженерних методів,
опанування основ кінетики фізіологічних перетворень, вивчення
методів моделювання клітинних популяцій. В рамках дисципліни
розглядаються базові технологiї, якi застосовуються у різноманiтних
напрямках біотехнології та медицини.
Метою дисципліни є вивчення умов і особливостей
культивування біологічних агентів (БА) - продуцентів біологічно-
активних речовин (БАР), процесів біосинтезу цільового продукту,
методів керування процесами біосинтезу, способів та прийомів
промислової реалізації біотехнологічного процесу, а також
ознайомлення студентів із принципами розробки біотехнологій.
 5

Тема Т1. Предмет та значення біотехнологічної галузі

Біотехнологія (від грецької. bios - життя, techne - мистецтво,

майстерність і logos - слово, навчання), використання живих організмів і
біологічних процесів у виробництві. Біотехнологія - міждисциплінарна
галузь, що виникнла на стику біологічних, хімічних і технічних наук. С
розвитком біотехнології пов'язують вирішення глобальних проблем
людства - ліквідацію недостачі продовольства, енергії, мінеральних
ресурсів, поліпшення стана охорони здоров'я і якості навколишнього
середовища.
Біотехнологія - це комплекс фундаментальних і прикладних наук,
технічних засобів, спрямованих на одержання і використання
клітин мікроорганізмів, тварин і рослин, а також продуктів їх
життєдіяльності: ферментів, амінокислот, вітамінів, антибіотиків та ін.
Біотехнологія, яка включає промислову мікробіологію, базується
на використанні знань і методів біохімії, мікробіології,
генетики і хімічної технології, що дає змогу діставати користь
у технологічних процесах із властивостей мікроорганізмів та клітинних
культур. Що стосується більш сучасних біотехнологічних процесів, то
вони базуються на методахрекомбінантних ДНК, а також на
використанні іммобілізованих ферментів, клітин і клітинних органел.
Основні напрямки досліджень:
 Розроблення наукових основ створення нових біотехнологій за
допомогою методів молекулярної біології, генетичної та клітинної
інженерії.
 Одержання й використання біомаси мікроорганізмів і продуктів
мікробіологічного синтезу.
 Вивчення фізико-хімічних та біохімічних основ біотехнологічних
процесів.
 6

 Використання вірусів для створення нових біотехнологій.

Біотехнологія застосовується навколо нас у багатьох предметах
щоденного вжитку - від одягу, який ми носимо, до сиру, який ми
споживаємо.
Протягом століть фермери,пекарі та пивовари використовували
традиційні технології для зміни та модифікації рослин та продуктів
харчування - пшениця може слугувати давнім прикладом, а нектарин -
одним з останніх прикладів цього. Сьогодні біотехнологія використовує
сучасні наукові методи, які дозволяють покращити чи модифікувати
рослини, тварини, мікроорганізми з більшою точністю та
передбачуваністю.
Споживачі повинні мати можливість вибору з якомога ширшого
переліку безпечних продуктів. Біотехнологія може надати споживачам
можливість такого вибору - не лише в сільському господарстві, але
також в медицині та паливних ресурсах. Біотехнологія пропонує
величезні потенційні переваги. Розвинуті країни та країни, що
розвиваються, повинні бути прямо зацікавлені у підтримці подальших
досліджень, спрямованих на те, щоб біотехнологія могла повністю
реалізувати свій потенціал. Біотехнологія допомагає довкіллю.
Дозволяючи фермерам зменшити кількість пестицидів та гербіцидів,
біотехнологічні продукти першого покоління призвели до зменшення їх
використання в сільськогосподарській практиці, а майбутні продукти
біотехнологій повинні принести ще більше переваг. Зменшення
пестицидного і гербіцидного навантаження означає менший ризик
токсичного забруднення ґрунтів та ґрунтових вод. Окрім того,
гербіциди, які застосовуються в поєднанні з генетично модифікованими
рослинами, часто є більш безпечними для довкілля, аніж гербіциди
попереднього покоління, на зміну яким вони приходять. Культури,
виведені методами біоінженерії, також ведуть до ширшого застосування
 7

безвідвальної обробки ґрунту, що в кінцевому рахунку призводить до

зменшення втрат родючості ґрунту.
Величезний потенціал біотехнологія має і в боротьбі з голодом.
Розвиток біотехнологій пропонує значні потенційні переваги для країн,
що розвиваються, де понад мільярд жителів планети живуть в бідності
та страждають від хронічного голоду. Через зростання врожайності та
виведення культур, стійких до хвороб та посухи, біотехнологія може
зменшити брак їжі для населення планети, яке станом на 2025 рік
складатиме понад 8 мільярдів чоловік, що на 30% більше ніж сьогодні.
Вчені створюють сільськогосподарські культури з новими
властивостями, які допомагають їм виживати у несприятливих
умовах посух та повеней.
Біотехнологія допомагає боротися з хворобами. Розвиваючи та
покращуючи медицину, вона дає нові інструменти у боротьбі з ними.
Саме біотехнологія дала нам медичні методи лікування кардіологічних
хвороб: склерозу, гемофілії, гепатиту, та СНІДу. Сьогодні створюються
біотехнологічні продукти харчування, які зроблять дешевими та
доступними для найбіднішої частини населення планети життєво
необхідні вітаміни та вакцини.
Внесок біотехнології в сільськогосподарське виробництво полягає
в полегшенні традиційних методів селекції рослин і тварин і розробці
нових технологій, що дозволяють підвищити ефективність сільського
господарства. У багатьох країнах методами генетичної і клітинної
інженерії створені високопродуктивні і стійкі до шкідників, хворобам,
гербіцидам сорту сільськогосподарських рослин. Розроблена техніка
оздоровлення рослин від накопичених інфекцій, що особливо важливо
для вегетативно що розмножуються культур (картопля й 7ез.). Як одна з
найважливіших проблем біотехнології у усьому світі широко
досліджується можливість керування процесом азотфіксації, у тому
 8

числі можливість уведення генів азотфіксації в геном корисних рослин,

а також процесом фотосинтезу. Ведуться дослідження з поліпшення
амінокислотного складу рослинних білків. Розробляються нові
регулятори росту рослин, мікробіологічні засоби захисту рослин від
хвороб і шкідників, бактеріальні добрива. Геноінженерні вакцини,
сироватки, моноклональні антитіла використовують для профілактики,
діагностики і терапії основних хвороб сільськогосподарських тварин. У
створенні більш ефективних технологій племінної справи застосовують
геноінженерний гормон росту, а також техніку трансплантації і
мікроманіпуляцій на ембріонах домашніх тварин. Для підвищення
продуктивності тварин використовують кормовий білок, отриманий
мікробіологічним синтезом.
Біотехнологічні процеси з використанням мікроорганізмів і
ферментів уже на сучасному технічному рівні широко застосовуються у
харчовій промисловості. Промислове вирощування мікроорганізмів,
рослинних і тваринних клітин використовують для одержання багатьох
цінних сполук – ферментів, гормонів, амінокислот, вітамінів,
антибіотиків,метанолу, органічних кислот (оцтової, лимонної, молочної)
і т. д. За допомогою мікроорганізмів проводять біотрансформацію одних
органічних сполук в інші (наприклад, сорбітау фруктозу). Широке
застосування в різноманітних виробництвах одержали іммобілізовані
ферменти. Для виділення біологічно активних речовин зі складних
сумішей використовують моноклональні антитіла. А. С. Спіріним
у 1985—1988 розроблені принципи 8ез клітинного синтезу білка, коли
замість клітин застосовуються спеціальні біореактори, що містять
необхідний набір очищених клітинних компонентів. Цей метод дозволяє
одержувати різні типи білків і може бути ефективним у виробництві.
Багато промислових технологій заміняються технологіями, що
використовують ферменти і мікроорганізми. Такі біотехнологічні
 9

методи переробки сільськогосподарських, промислових і побутових

відходів, очищення і використання стічних вод для
одержання біогазу і добрив. У ряді країн за допомогою мікроорганізмів
одержують етиловий спирт, що використовують
як пальне для автомобілів (у Бразилії, де паливний спирт широко
застосовується, його одержують із цукрового очерету й інших рослин).
На спроможності різноманітних бактерій перекладати метали в розчинні
сполуки або накопичувати їх у собі заснований витяг багатьох металів із
бідних руд або стічних вод.
Контрольні питання до теми Т1:
1. Що вивчає біотехнологія?
2. Основні напрями досліджень біотехнології.
3. Сфери використання продуктів біотехнології.

Тема Т4. Основні закономірності культивування

мікроорганізмів та отримання продуктів мікробного синтезу

Найважливішим завданням будь-якого біотехнологічного процесу

є розробка й оптимізація науково-обгрунтованої технології й апаратури
для нього. При організації біотехнологічних виробництв частково був
запозичений досвід развитой на той час хімічної технології.
Однак біотехнологічні процеси мають істотні відмінністі від
хімічних у силу того, що в біотехнології використають більше складну
організацію матерії - біологічну. Кожен біологічний об'єкт (клітина,
фермент і т.д. ) - це автономна саморегулююча система.
Природа біологічних процесів складна й далеко не з'ясована
детально. Для мікробних популяцій, наприклад, характерна істотна
гетерогенність по ряду ознак - вік, фізіологічна активність, стійкість до
впливу несприятливих факторів середовища. Вони також підлягають
 10

впливу випадковим мутаціям, частота яких становить від 10 -4 до 10-8.

Гетерогенність також може бути обумовлена наявністю поверхні
розподілу фаз і неоднорідністю умов середовища.
Принципова схема реалізації біотехнологічних процесів у
загальному виді може бути представлена блок-схемою, у якій зроблена
спроба охопити всі варіанти ферментаційних процесів (рис. 4.1).

1 - реактор для готування середовищ, 2 - вихровий насос, 3 - апарат для

готування твердих середовищ, 4 - парова колона для підігріву середовищ до
температури стерилізації, 5 - витримувач середовищ при температурі стерилізації, 6 -
теплообмінник для охолодження середовищ, 7 - мірник - збірник поживного
середовища 8 - дозатор, 9 - анаеробний ферментер, 10 - глибинний аеробний
ферментер, 11 – біокаталітичний реактор, 12 - ферментер для поверхневої
твердофазной ферментації, 13 - те ж для поверхневої рідинної ферментації, 14 -
екстрактор, 15 - сепаратор для відділення біомаси, 16 - система локальної
автоматики, 17 - плазмолізатор біомаси, 18 - дезінтегратор біомаси, 19 - випарна
установка, 20 - фракціонування дезінтегратів, 21 - сушарка й інші апарати для
зневоднювання, 22 - апаратури для розфасовки продукту, 23 - іонообмінні колони,
апарати для хімічних і мембранних методів виділення, центрифуги, фільтри,
кристаллизаторы й ін. пристрою. Умовні позначки: рН - розчин для корекції рН, П -
компоненти й середовища для підживлення, Пос - посівний матеріал, В - стиснене
повітря, ПАР - піногасник, Ср - стерильне поживне середовище БА - біологічний
агент.
Рисунок 4.1 - Принципова схема реалізації біотехнологічних
процесів
 11

У загальному виді будь-який біотехнологічний процес включає

три основні стадії: предферментаційну, ферментаційну й
постферментаційну.
На предферментаційній стадії здійснюють зберігання й підготовку
культури продуцента (інокулята), одержання й підготовку поживних
субстратів і середовищ, ферментаційних апаратур, технологічної й
рециркулюємої води й повітря. Підтримка й підготовка чистої культури
є дуже важливим моментом предферментаційної стадії, тому що
продуцент, його фізіолого-біохімічні характеристики й властивості
визначають ефективність усього БТ процесу. У відділенні чистої
культури здійснюють зберігання виробничих штамів і забезпечують їх
реактивацію й накопичення інокулята в кількостях, необхідних для
початку процесу. При вирощуванні посівних доз інокулята застосовують
принцип масштабування, тобто проводять послідовне нарощування
біомаси продуцента в колбах, суліях (бутилях), далі в серії послідовних
ферментерів. Кожен наступний етап даного процесу відрізняється за
обсягом від попереднього звичайно на порядок. Отриманий інокулят по
стерильній посівній лінії направляється далі в апарат, у якому
реалізується ферментаційна стадія. Готування поживних середовищ
здійснюється у спеціальних реакторах, обладнаних мішалками. Залежно
від розчинності й сумісності компонентів середовищ можуть бути
застосовані окремі реактори. Технологія готування середовищ значно
ускладнюється, якщо в їх склад входять нерозчинні компоненти. У
різних БТ процесах застосовуються різні по походженню й кількостям
субстрати, тому процес їх готування варіює. Тому дозування поживних
компонентів підбирається й здійснюється індивідуально на кожнім
виробництві відповідно до технологічного регламенту конкретного
процесу.
 12

Стадія ферментації є основною стадією в БТ процесі, тому що в її

ході відбувається взаємодія продуцента із субстратом й утворення
цільових продуктів (біомас, ендо- і екзопродуктів). Ця стадія
здійснюється в біохімічному реакторі (ферментері) і може бути
організована залежно від особливостей використовуваного продуцента
й вимог до типу і якості кінцевого продукту різними способами.
Ферментація може проходити в строго асептичних умовах і без
дотримання правил стерильності (так називана "незахищена"
ферментація); на рідкі й на твердих середовищах; анаеробно й аеробно.
Аеробна ферментація, у свою чергу, може протікати поверхово або
глубинно (у всій товщі поживного ) середовища.
Культивування біологічних об'єктів може здійснюватися в
періодичному й проточному режимах, напівбезперервно з підживленням
субстратом. При періодичному способі культивування ферментер
заповнюється вихідним поживним субстратом та мікроорганізмами із
інокуляту.

Рисунок 4.2 – Схема біореактора періодичної дії

Протягом певного часу в апараті відбувається взаємодія
мікроорганізмів із субстратом, яке супроводжується утворенням
продукту (Х + S → P) (рис.4.2).
 13

Біохімічні перетворення в цьому апараті тривають від десятків

годин до декількох доби. Регуляція умов усередині ферментера -
найважливіше завдання періодичного культивування мікроорганізмів. У
ході періодичної ферментації культура проходить ряд послідовних
стадій: лаг-фазу, експонентну, уповільнення росту, стаціонарну й
відмирання. При цьому відбуваються істотні зміни фізіологічного стану
біооб’єкту, а також ряду параметрів середовища. Цільові продукти
утворяться в експонентній (первинні метаболіти - ферменти,
амінокислоти, вітаміни) і стаціонарної (вторинні метаболіти -
антибіотики) фазах, тому залежно від цілей БТ процесу в сучасних
промислових процесах застосовують принцип диференційованих
режимів культивування. У результаті цього створюються умови для
максимальної продукції того або іншого цільового продукту.
Періодично ферментер спорожняють, роблять виділення й очищення
продукту, і починається новий цикл.
Безперервний процес культивування мікроорганізмів має істотні
переваги перед періодичним. Безперервна ферментація здійснюється в
умовах сталого режиму, коли мікробна популяція і її продукти найбільш
однорідні. Застосування безперервних процесів ферментації створює
умови для ефективного регулювання й керування процесами біосинтезу.
Системи безперервної ферментації можуть бути організовані за
принципом повного витиснення або повного змішання. Перший приклад
- так називана тубулярна культура (рис.4.3).

Рисунок 4.3 – Схема турбулярного біореактора повного витіснення

 14

Процес ферментації здійснюється в довгій трубі, у якій з одного

кінця безупинно надходять поживні компоненти й інокулят, а з іншої з
тією же швидкістю випливає культуральная рідина. Дана система
проточної ферментації є гетерогенною.
При безперервній ферментації у ферментах повного змішання
(гомогенно-проточний спосіб) у всій масі ферментаційного апарата
створюються однакові умови. Застосування таких систем ферментації
дозволяє ефективно управляти окремими стадіями, а також всім
біотехнологічним процесом і стабілізувати продуцент у практично будь-
якому, необхідному експериментаторові або біотехнологу стані.
Керування подібними установками здійснюється двома способами
(рис.4.4)

А-хемостат, Б –турбідостат з автоиатичною регуляцією оптичної щільності.

1 – надходження середовища; 2 – мішалка; 3 – сток культури; 4- насос; 5 –
фотоелемент; 6 – джерело світла
Рисунок 4.4 – Схема біореакторів для проточного культивування
мікроорганізмів

Турбидостатний спосіб базується на вимірі мутності потоку, що

виходить. Вимір мутності мікробної суспензії, викликане ростом клітин,
є мірою швидкості росту, з якої мікроорганізми виходять із біореактора.
 15

Це дозволяє регулювати швидкість надходження у ферментер свіжого

поживного середовища. Другий метод контролю, - хемостатний,
простіше. Керування процесом у хемостаті здійснюється виміром не
вихідного, а вхідного потоку. При цьому концентрацію одного з
компонентів поживного середовища (вуглець,кисень, азот), що поступає
у ферментер, установлюють на такому рівні, при якому інші поживні
компоненти перебувають у надлишку, тобто концентрація, що лімітує,
обмежує швидкість розмноження клітин у культурі.
Постферментаційна стадія забезпечує одержання готової товарної
продукції й також, що не менш важливо, знешкодження відходів і
побічних продуктів. Залежно від локалізації кінцевого продукту
(клітина або культуральная рідина) і його природи на
постферментаційної стадії застосовують різні апаратури й методи
виділення й очищення. Найбільш трудомістке виділення продукту, що
накопичується в клітинах. Першим етапом постферментаційної стадії є
фракціонування культуральної рідини й відділення зваженої фази -
біомаси. Найпоширеніший для цих цілей метод - сепарації, який
здійснюється в спеціальних апаратах - сепараторах, які працюють по
різних схемах залежно від властивостей оброблюваної культуральнї
рідини. Основні проблеми, виникають при необхідності виділення
дрібнозважених часток з розміром 0.5-1.0 мкм і менш (бактеріальні
клітини) і необхідністю переробки більших обсягів рідини (виробництво
кормового білка, ряду амінокислот). Для підвищення ефективності
процесу сепарації застосовують попередню спеціальну обробку
культури - зміна рН, нагрівання, додавання хімічних агентів. Для
збільшення строків придатності біотехнологічних продуктів роблять
їхнє зневоднювання й стабілізацію. В залежності від властивостей
продукту застосовують різні методи висушування. Сушіння
термостабільних препаратів здійснюються на стрічковому конвеєрі, а
 16

також у киплячому шарі. Особливо чутливі до нагрівання препарати

висушують у вакуум-сушильних шафах при зниженому тиску й
температурі й у розпилюючих сушарках. До стабілізації властивостей
біотехнологічних продуктів веде додавання в якості наповнювачів
різних речовин. Для стабілізації кормового білка застосовують пшеничні
висівки, кукурудзяне борошно, що володіють додатковою поживною
цінністю. Для стабілізації ферментних препаратів використовують
гліцерин і вуглеводи, які перешкоджають денатурації ферментів, а також
неорганічні іони кобальту, магнію, натрію, антибіотики й ін.
Контрольні питання до теми Т4:
1. Природа біологічних процесів
2. Принципова схема реалізації біотехнологічних процесів.
3. Основні стадії біотехнологічного процесу.

Тема Т5. Біологічні агенти біотехнології

Біологічний агент є активним початком у біотехнологічних

процесах й одним з найбільш важливих її елементів. Номенклатура
біологічних агентів бурхливо розширюється, але дотепер
найважливіше місце займає традиційний об'єкт - мікробна клітина (табл.
5.1).
Мікробні клітини з різними хіміко-технологічними властивостями
можуть бути виділені із природних джерел і далі за допомогою
традиційних (селекція, відбір) і новітніх методів (клітинна й гене-
тическая інженерія) істотно модифіковані й поліпшені. При виборі
біологічного агента й постановці його на виробництво насамперед слід
дотримуватися принципу технологічності штамів. Це значить, що
мікробна клітина, популяція або співтовариство особин повинні
зберігати свої основні фізіолого-біохімічні властивості в процесі
тривалого ведення ферментації. Промислові продуценти також повинні
 17

мати стійкість до мутаційних впливів, фагам, зараженню сторонньою

мікрофлорою (контамінації); характеризуватися безшкідливістю для
людей і навколишнього середовища, не мати при вирощуванні побічних
токсичних продуктів обміну й відходів, мати високі виходи продукту й
прийнятні техніко-економічні показники.
У цей час багато промислових мікробних технологій базуються на
використанні гетеротрофних організмів, а в майбутньому вирішуюче
місце серед продуцентів займуть автотрофні мікроорганізми, що не
потребують для росту дефіцитні органічні середовища, а також
екстремофіли - організми, що розвиваються в екстремальних умовах
середовища (термофільні, гало- і ацидофільні).
Особлива група біологічних агентів у біотехнології - ферменти,
так названі каталізатори біологічного походження. Ферменти знаходять
все більше застосування в різних біотехнологічних процессах і галузях
господарювання, але до 60-х років цей напрямок стримувався
труднощами їхнього одержання, нестійкістю, високої вартістю. Як
окрему галузь у створенні й використанні нових біологічних агентів
варто виділити іммобілізовані ферменти, які являють собою гармонійно
функціонуючу систему, дію якої визначається правильним вибором
ферменту, носія й способу іммобілізації. Перевага мобілізованих
ферментів у порівнянні з розчинними полягає в наступному:
стабільність і підвищена активність, утримання в обсязі реактора,
можливість повного й швидкого відділення цільових продуктів й
організації безперервних процесів ферментації з багаторазовим
використанням біологічного агента. Іммобілізовані ферменти
відкривають нові можливості в созданиибиологических мікропристроїв
для використання в аналітику, перетворенні енергії й
биоэлектрокатализе.
 18

Таблиця 5.1 – Мікроорганізми - продуценти, які

використовуються в біотехнології для одержання цільових продуктів
Організм Тип Продукт
Saccharomyces cerevіsіae Дріжджі Пекарські дріжджі, вино, ель,
саке
Streptococcus thermophіlus Бактерії Йогурт
Propіonіbacterіum shermanіі Бактерії Швейцарський сир
Gluconobacterіum suboxіdans Бактерії Оцет
Penіcіllіum roquefortіі Цвіль Сири типу рокфору
Aspergіllus oryzae Цвіль Саке
Saccharomyces cerevіsіae Дріжджі Етанол
Clostrіdіum acetobutylіcum Бактерії Ацетон
Xanthomonas campestrіs Бактерії Полісахариди
Corynebacterіum glutamіcum Бактерії L-Лізин
Candіda utіlіs Дріжджі Мікробний білок
Propіonіbacterіum Бактерії Вітамін В12
Aspergіlus oryzae Цвіль Амілаза
Kluyveromyces fragіlіs Дріжджі Лактаза
Saccharomycopsіs lіpolytіca Дріжджі Ліпаза
Bacіllus Бактерії Протеази
Endothіa parasіtіca Цвіль Сичуговий фермент
Leocanostoc mesenteroіdes Бактерії Декстран
Xanthomonas campestrіs Бактерії Ксантан
Penіcіllіum chrysogenum Цвіль Пеніциліни
Chehalosporіum acremonіum Цвіль Цефалоспирини
Rhіzopus nіgrіcans Цвіль Трансформація стероїдів
E. colі (рекомбінантні штами) Бактерії Інсулін, гормон росту,
інтерферон
Blakeslea trіspora Цвіль β-Каратин
Phaffіa rhodozyma Дріжджі Астаксантин
Bacіllus thurіngіensіs Бактерії Біоінсектециди
Bacіllus popіllіae Бактерії Біоінсектециди
До нетрадиційних біологічних агентів на даному етапі розвитку
біотехнології відносять рослинні й тваринні тканини, у тому числі
гібридоми, трансплантанти. Велика увага в цей час приділяється
одержанню новітніх біологічних агентів - трансгенних клітин
мікроорганізмів, рослин, тварин генноінженерними методами. Розвинені
також нові методи, що дозволяють одержувати штучні клітини з
використанням різних синтетичних і біологічних матеріалів (мембрани
із заданими властивостями, ізотопи, магнітні матеріали, антитіла).
Розробляються підходи до конструювання ферментів із заданими
 19

властивостями, що мають підвищену реакційну активність і

стабільність. У цей час реалізований синтез поліпептидів бажаної
стереоконфігурації й ін.
Таким чином, у біотехнологічних процесах можливо використання
різних біологічних агентів з різним рівнем організації, - від клітинної до
молекулярної.
Контрольні питання до теми Т5
1. Назвіть продуценти наступних продуктів: Пекарські дріжджі,
Швейцарський сир, Оцет, L-Лізин, Вітамін В12.
2. Як проводиться підбір продуценту для певного виробництва?
3. Як проводиться селекція штамів продуцентів?

Тема Т6. Поживні середовища в біотехнології

Субстрати й середовища які використовуються в біотехнології,

досить різноманітні, і їхній спектр безупинно розширюється (табл. 6.1).
З розвитком промислових процесів відбувається нагромадження нових
видів відходів, які можуть бути знешкоджені й конвертовані в корисні
продукти методами біотехнології. З одного боку Біотехнологічні
промислові напрямки, що розвиваються бурхливими темпами
зіштовхуються із проблемою вичерпання традиційних видів сировини,
тому виникає необхідність у розширенні сировинної бази, з іншого, -
збільшення обсягів відходів, що накопичуються, робить необхідним
розробку нетрадиційних, у тому числі біотехнологічних способів їхньої
переробки.
У цей час спостерігається ріст інтересу біотехнологів до
природних поновлюваних ресурсів - продуктам фотосинтезу,
біоресурсам світового океану. До складу середовищ для
біотехнологічних процесів входять джерела вуглецю й енергії, а також
 20

мінеральні елементи й ростові фактори. Як джерела вуглецю й енергії в

біотехнологічних процесах використають головним чином природні
комплексні середовища невизначеного складу (відходи різних
виробництв, продукти переробки рослинної сировини, компоненти
стічних вод й ін.), у яких крім вуглецевих з'єднань утримуються також
мінеральні елементи й ростові фактори. Досить широко включені в
розряд біотехнологічних субстратів целюлоза, гідролізати полісахаридів
і деревини. Останні роки використають для одержання білка
одноклітинні організми.
Таблиця 6.1 - Найважливіші групи субстратів, біологічних агентів
й продуктів, які утворюються у біотехнологічних процесах
Субстрати Біологічні агенти Продукти
Меляса, сік цукрового Мікроорганізми, рослинні Біодобрива й
тростнику, гідролізати й тварини клітини, біоінсектециди,
рослинних полімерів. у тому числі генетичної мікробні біомаси,
інженерії. діагностикуми, вакцини.
Сахара, спирти, Віруси. Біогаз.
органічні кислоти. Компоненти клітин: Чисті продукти,
Парафіни нафти. мембрани, протопласти, медикаменти,
Напівпродукти, мітохондрії, ферменти. диагностикумы.
попередники Позаклітинні продукти: Гормони й ін. продукти
Біотрансформації. ферменти, коферменти. біотрансформації
Природний газ, Іммобілізовані клітини Органічні кислоти.
водень. мікроорганізмів, рослин і Полісахариди. Білок
Відходи с/г і лісової тварин, їхні компоненти й одноклітинних. Харчові
промисловості. позаклітинні продукти. продукти.
Відходи промисловості, Екстракти, гидролизаты.
у тому числі переробки Спирти,
фруктів й овочів. органічні розчинники.
Побутові відходи, Антибіотики
стічні води. Амінокислоти.
Молочна сироватка. Ферменти, вітаміни.
Картопля, зерно. Метали, неметали.
Зелена біомаса рослин. Моноклональні антитіла.

Кислотний гідроліз деревини при 175-190°С забезпечує вихід у

середовище до 45-50 % редукуючи речовин; при більше твердих
режимах гідролізу ця величина зростає до 55-68 %. З більшим успіхом в
останні роки стали застосовувати гідролізати торфу, це дозволяє знизити
 21

вартість, наприклад, препаратів амінокислот в 4-5 разів. Мінеральні

елементи, необхідні для росту біологічних агентів, які входять до
складу поживних середовищ підрозділяються на макро- і мікроелементи.
Серед макроелементів на першому місці знаходиться азот, тому що
потреби в ньому в біологічних об'єктів на порядок перевищують
потреби в інших елементах (фосфорі, сірці, калії й магнії). Азот зазвичай
використовується мікроорганізмами у відновленій формі (сечовина,
амоній або їх солі). Часто азот уводиться в комплексі з іншими
макроелементами - фосфором, сіркою. Для цього в якості їхніх джерел
використовують солі (сульфати або фосфати амонію). Для ряду окремих
продуцентів, однак, кращими є нітрати або органічні сполуки азоту.
Істотне значення при забезпеченні азотного харчування продуцента має
не тільки вид, але концентрація азоту в середовищі, тому що зміна
співвідношення C:N, впливаючи на швидкість росту продуцента,
метаболізм, викликає сверхсинтез ряду цільових продуктів
(амінокислот, полисахаридів й ін.). Мінеральні елементи необхідні для
росту будь-якого біологічного агента, але їхня концентрація в
середовищі залежно від біології біообєкта, що використовуєтьмс й
завдань біотехнологічного процесу різна. Так, концентрація
макроелементів у середовищі (K, Mg, P, S) звичайно становить близько
10-3-10-4 г. Потреби в мікроелементах невеликі, і їхня концентрація в
середовищах істотно нижче - 10-6 - 10-8 г. Тому мікроелементи часто
спеціально не вносять у середовищі, тому що їхньої домішки в основних
солях і воді забезпечують потреби продуцентів. Окремі продуценти в
силу специфіки метаболізму або поживних потреб потребують для росту
наявність у середовищі ростових факторів (окремих амінокислот,
вітамінів й ін.). Крім чистих індивідуальних речовин такої природи, на
практиці часто використають у якості ростових добавок кукурудзяний
або дріжджовий екстракт, картопляний сік, екстракт проростків ячменя,
 22

зернових відходів і відходів молочної промисловості. Стимулююча дія

даних ростових факторів багато в чому залежить від індивідуальних
властивостей продуцента, що застосовується, складу основного
середовища, умов ферментації й ін. Додавання ростових факторів здатно
збільшити вихід цільового продукту, наприклад ферментів, у десятки
разів.
Традиційно склад поживного середовища оптимальний для
біотехнологічного процесу, визначається методом тривалого
емпіричного підбора, у ході якого на перших етапах визначається
якісний і кількісний склад середовища. Було зроблено багато спроб
обґрунтування складу середовищ із позицій фізіології й біохімії
продуцента, але тому що потреби в поживних речовинах видо- і навіть
штаммоспецифічні, у кожному конкретному випадку доводиться
підбирати оптимальний для конкретного продуцента склад середовища.
В останні 20-25 років усе ширше використовують математичний метод
планування експериментів, математичне моделювання біотехнологічних
процесів; це дозволяє обґрунтовано підходити до конструюванню
поживних середовищ зробити їх економічними.
Основною вимогою, яка висувається до складу поживного
середовища, є її повноцінність для росту продуцента й забезпечення
синтезу цільового продукту. Мікроорганізмам потрібні з'єднання, що
містять вуглець, азотисті речовини, водень, кисень. До складу
середовища повинні входити такі мінеральні речовини, як магній,
кальцій, фосфор, сірка, залізо, калій і деякі інші. Склад середовища для
того або іншого мікроорганізму різний, однак всі продуценти засвоюють
вуглець переважно у вигляді органічних сполук, водень - у вигляді води
й у складі органічних сполук, кисень - з основного складу середовища й
у молекулярному виді. Поживні речовини середовища витрачаються
 23

мікроорганізмами не тільки на побудову зростаючої клітки, але й на

забезпечення енергією основних життєвих процесів.
Мікроорганізми дуже чутливі до складу середовища, на якому
ростуть, причому одні сполуки вони споживають інтенсивно, а інші
залишаються майже невикористаними. Варто пам'ятати, що не завжди
інтенсивне зростання мікроорганізму сприяє максимальному
нагромадженню продукту.
Оскільки переважна більшість мікроорганізмів-продуцентів
являються аеробами, майже всі вуглеводи споживаються ними шляхом
окислювання й основними продуктами метаболізму являються двоокис
вуглецю й вода. Проміжні продукти окислювання, що накопичуються в
процесі росту культури, такі, як кетокислоти, ди- і трикарбонові
кислоти, альдегіди, слугують в міру споживання вуглеводів основним
джерелом вуглецю в середовищі. Якщо склад середовища підібраний
вірно й процес ведеться правильно, то надлишкового нагромадження
проміжних продуктів не відбувається. Гарним джерелом вуглецю в
середовищі можуть бути жири й масла. Це варто пам'ятати при
використанні жирових піногасників. Споживанню жирів передує їх
розщеплення на гліцерин і жирні кислоти. Мікроорганізми споживають
також органічні кислоти й спирти.
Джерелом азоту для мікроорганізмів-продуцентів можуть
слугувати складні органічні речовини, їх гідролізати й мінеральні солі.
Багаті азотними речовинами кукурудзяний екстракт, соєве й пшеничне
борошно, гідролізат казеїну й т.п. Мінеральний азот у середовищі
звичайно представлене амонійними солями й нітратами. Органічні
сполуки й амонійні солі містять азот у відновленій формі, тому він
легко й швидко споживається. Азот же нітратів повинен бути спочатку
відновлений і потім уже засвоєний мікроорганізмами. Цим
пояснюється більша швидкість споживання амонійного азоту, чим
 24

нітратного, при їхній спільній присутності в складі середовища.

Введення амонійних солей приводить до підкислення середовища, тому
що в розчині залишається аніон кислоти; при введенні нітратів
середовище підлужнюється за рахунок катіона, що залишається в
розчині, солі. Для кожного продуцента джерело азоту варто підбирати
індивідуально з урахуванням умов біосинтезу необхідного продукту.
Великий вплив на синтез ферментів має присутність у середовищі
мінеральних елементів, які необхідні мікроорганізму в макро- і
мікрокількостях. Для мікроорганізмів необхідні фосфор і сірка, що
входять до складу найважливіших речовин клітин - нуклеотидів, білків,
ліпідів, вітамінів. Фосфор бере участь у багатьох реакціях обміну
речовин у клітині. Такі елементи, як залізо, цинк, мідь, кобальт і деякі
інші, потрібні для синтезу ряду ферментів і білків у мізерно малих
кількостях. Підвищений зміст мікроелементів часто приводить до
гальмування нормального росту й життєвих процесів клітини. Більша
частина мікроелементів вноситься в середовище з водою й органічними
добавками - з борошном, кукурудзяним екстрактом, макухою й т.п.
Макрокількості мінеральних елементів можуть бути уведені до складу
середовища у вигляді мінеральних солей, але при цьому треба
враховувати, що всі вони містяться в природних продуктах, що входять
до складу середовищ.
Дуже часто при складанні рецептури в середовища вносять
крейду, роль якої зводиться до зв'язування кислот, що утворюються, і
регулюванню кислотності середовища. Крім того, вона може служити
додатковим джерелом мікроелементів, які звичайно присутні в ній у
значних кількостях.
Оптимальний склад середовища для кожного продуцента може
бути визначений двома способами: методом емпіричного підбору й з
використанням математичних методів планування експериментів.
 25

Перший спосіб був донедавна широко розповсюджений у всіх галузях

промисловості, що використовують мікроорганізми. Знання
фізіологічних особливостей мікроорганізмів дозволяло біологам
методом підбору й зміни якого-небудь із факторів на незмінному тлі
інших компонентів підібрати гарне й продуктивне поживне
середовище, бо такий спосіб дуже тривалий. Більш прогресивним у
біологічних дослідженнях є використання математичних методів
планування експериментів, які дозволяють значно швидше знайти й
обґрунтувати оптимальний склад поживного середовища.
Більшість математичних методів планування експериментів має на
меті одержання математичної моделі процесу. Обробка
експериментальних даних ведеться в чіткій послідовності
обчислювальних операцій і може бути виконана вручну. Статистичний
аналіз значимості коефіцієнтів отриманого рівняння і його адекватності
досліджуваному процесу в досліджуваному діапазоні зміни параметрів
процесу дозволяє з достатньою впевненістю знаходити оптимальний
склад середовища й оптимальні умови культивування по отриманій
математичній моделі процесу.
Середовища залежно від складу діляться на синтетичні й
комплексні. Синтетичними є середовища, що складаються із цілком
певних по кількісному складі індивідуальних речовин. Джерелами
вуглецю в таких середовищах можуть бути вуглеводи, спирти, органічні
кислоти; джерелами азоту - солі, що містять із, амінокислоти, пептиди
певного складу, сечовина й т.д..
У комплексні середовища звичайно входять різні природні
продукти, багаті органічними сполуками, і відходи ряду виробництв.
Комплексні середовища значно дешевше, більше доступні й тому
частіше використовуються в промисловості. Їхніми компонентами
можуть бути дерть, борошно різних злаків, меляса, гідрол, кукурудзяний
 26

екстракт, вижимки плодів і овочів, різні макухи, замкові води, барда

спиртових заводів, картопляна мезга та інші відходи картоплі і
кукурудзокрохмального виробництва, а також інших харчових
виробництв.
Так, для поверхневого культивування, використовують пшеничну
дерть; вона повинна бути крупнолопастною, без гіркого або
кислуватого присмаку. Дерть містить від 16 до 20% крохмалю, 10-12%
білка, у тому числі найважливіші амінокислоти (в %): метіонін - 0,19;
цистеїн - 0,30; аргінін - 1,0; лізин - 0,60; триптофан - 0,30; жир - 3,0-4,0;
клітковина - 10- 30; зольні елементи (Na - 0,09, К - 1,00, Са - 0,16, Р -
0,94); мікроелементи й деякі інші речовини. Пшенична дерть - сировина
дорога, тому їх можна частково заміняти іншими компонентами.
Додатковий компонент, що вводиться, може відігравати роль
розрихлювача середовища або ж збагачувати його відсутніми ростовими
й поживними речовинами. Такими компонентами являються солодові
паростки, лушпайка круп'яних культур, бурякові вижимки, тирса ,
вижимки плодів, овочів і ягід.
При обробці кукурудзяного зерна в крохмале-патоковому
виробництві в замкові води переходить до 8% сухої речовини.
Кукурудзяний екстракт - це замкові води, упарені у двох-,
трьохкорпусних вакуум-випарних апаратах до вмісту сухої речовини 48-
50%. Він не має постійного складу, що являється його недоліком.
Кукурудзяний екстракт містить велику кількість меланоїдинів і тому має
темно-коричневий колір. Він стабільний при зберіганні й широко
застосовується у ферментній промисловості. Кукурудзяний екстракт є
джерелом азотистих речовин, які становлять 40-50 % загального змісту
сухої речовини в екстракті. Вуглеводи є нестабільним компонентом
екстракту й можуть під дією молочнокислих бактерій повністю
перетворюватися в молочну кислоту, зміст якої при цьому зростає до
 27

25%. В екстракті в більших кількостях утримуються фосфор, калій і

магній. Зміст зольних елементів становить 15-20% сухої речовини
екстракту, а зміст фосфору може досягати 5%. Екстракт містить всі
необхідні для мікроорганізмів мікроелементи, вітаміни групи В, ростові
речовини й біостимулятори.
Крохмаль картопляний і кукурудзяний випускається чотирьох
сортів (вищий, І, ІІ й ІІІ). Основна сортова відмінність крохмалів полягає
в вмісті зольних елементів, що підвищується від вищого сорту до ІІІ з
0,35 до 1,20%. Підвищується також кислотність на суху речовину (у мл
0,1 н. розчину НС1) з 18 до 30, збільшується число зруйнованих
крохмальних зерен. Кукурудзяний крохмаль у своєму складі має (в %):
крохмаль - 98,5-98,8; білок - 0,60-0,35; жир - 0,62-0,70; зола - 0,17- 0,12;
розчинні речовини - 0,01-0,05; інші сухі речовини - 0,10-0,13.
Гідрол є відходом виробництва глюкози із крохмалю. Він являє
собою густий темний сироп, що містить від 67 до 72 % цукрів, що
редукують. Гідрол не стандартний по складу. Основним цукром гідролу
є глюкоза, зміст якої досягає до 80 % загальної суми цукрів, що
редукують. Гідрол містить деяка кількість органічних кислот, рН
гідролу близько 4,0, зольність близько 7%. У мінеральний склад гідролу
входять фосфор, магній, натрій, залізо.
Соєве борошно випускається трьох видів: незнежирена,
напівзнежирена й знежирена. Соєве борошно є багатим джерелом
азотистих речовин, особливо білків. У ній утримується близько 25 %
вуглеводів; крохмалю й глюкози майже немає (0,5- 1,0 %), але є сахароза
(5-10 %), пентозани, мальтоза, раффіноза, геміцелюлози, декстрини.
Мінеральний склад соєвого борошна багатий і різноманітний, зольні
елементи становлять 4,5-6,5 %o У їхнє число входять калій, магній,
кальцій, натрій, залізо, кремній, сірка, хлор, мідь, марганець, цинк,
нікель, фосфор. У соєвому борошні втримуються вітаміни групи В, D і
 28

А. Склад кукурудзяного борошна залежить від сорту переробляємої

кукурудзи. Кукурудзяне борошно містить 67-70 % крохмалю й близько
10 % інших вуглеводів (цукру, клітковина, пентозани й т.п. ). Білка в
кукурудзяному борошні порівняно мало - 10-12 %, зольні елементи
становлять тільки 0,3-1,0 %, а жир - близько 4 %.
Солодові ростки виходять у процесі обробки від сушеного солоду
в пивоварстві. Вони містять значну кількість вільних амінокислот,
азотистих речовин (до 24%), зольних елементів (близько 8%),
клітковини (14%), екстрактивні безазотисті речовини становлять 42 %. У
їхній склад може входити також до 5-6 % зернових домішок, що
представляють собою рештки зерен солоду. Солодові ростки можна
вносити в середовища безпосередньо або у вигляді їхніх екстрактів.
Пивна дробина є відходом пивоварства. Її вихід становить 22 %
сухої маси сировини, що надходить у варильне відділення. Вона може
використовуватися безпосередньо у вологому стані (вологість 83 %),
якщо виробництво біопрепаратів організовано при пивоварному заводі,
або ж у сухому виді. Дробина має жовто-коричневий колір, приємний
свіжий запах. Вона містить значну кількість білкових речовин (26-27%),
жир (7-8%), клітковину (17-18%), зольні елементи (4-5%), безазотисті
екстрактивні речовини (близько 44 %)o
Інший відхід пивоварства - осадові пивні дріжджі. Їхній вихід при
вологості 85 % становить 1,5-2 л на 10 дал пива. Відвар дріжджів або їх
автолізат може служити прекрасним збагачувачем поживних середовищ,
джерелом біологічно активних і легкозасвоюваних речовин. Пивні
дріжджі багаті білковими речовинами (45-55%) і вуглеводами (30-40
%)., вони містять значну кількість мінеральних солей (зольність 7-9%).
При використанні пивних дріжджів як компонента середовищ для
ферментної промисловості потрібно їхнє обов'язкове очищення від
хмелевих гірких речовин.
 29

В якості сировини також можна використовувати біомасу інших

мікроорганізмів, наприклад плазмолізовані кормові дріжджі, пропіонові
бактерії (відхід виробництва вітаміну В12), екстракти з міцеліальних мас
і т.п. Склад цих компонентів досить близький, але різниться змістом і
набором ростових речовин і стимуляторів. Намітилася тенденція
використовувати гідролізати біомас мікроорганізмів, які одержують
різними способами. Для готування поживних середовищ можна
використовувати відхід спиртового виробництва - фільтрат барди. Для
цього фільтрат збагачують борошном або заторною масою й додають
крейда для нейтралізації зайвої кислотності; фільтрат барди є
нестандартним продуктом.
Для готування поживних середовищ може використовуватися
здрібнена картопля або її відвар. Картопля містить велику кількість
вологи (до 75 %), а основна частина сухої речовини доводиться на
крохмаль. Залежно від року, сорту й умов вирощування картоплі вміст
крохмалю може бути від 8 до 27%, у середньому 18-19%. У картоплі
азотистих речовин порівняно мало, не більше 2 %, клітковини
втримується 1 -1,5%; зольні елементи становлять 0,8-1 % (К, Na, Mg,
Ca, Fe, Sі й ін.) У малих кількостях знайдені мікроелементи -
марганець, мідь, кобальт, нікель, йод і т.п. Картопля містить вітаміни
С, Аu цілий ряд інших речовин у сумі 2,2- 2,5%.
Бурякові вижимки являють собою здрібнений цукровий буряк
після витягу з нього сахарози й деяких інших речовин на дифузійних
установках цукрових заводів. Склад вижимок багатокомпонентний,
основну його масу становлять безазотисті екстрактивні речовини
(66%), у які входять пектинові речовини, геміцелюлози. У вижимках
міститься білок (близько 8%), клітковина (22%), зольні елементи (4%).
 30

До числа рідко використовуваних компонентів поживних

середовищ можна віднести казеїн і його гідролізат, рибне борошно,
рисову дерть, картопляну мезгу, вижимки плодів, ягід і овочів і т.д..
Для піногасіння використовують жири й масла, які також
можуть бути джерелом харчування для мікроорганізмів. Найчастіше
використовують тваринні жири, олеїнову кислоту, соняшникове,
соєве, бавовняне, кукурудзяне масла. Із всіх перерахованих
піногасників раціональніше всього вводити при вирощуванні олеїнову
кислоту, тому що інші масла мають харчову цінність і
використовуються в харчовій промисловості. Поступово вони
заміняються синтетичними піногасниками.
Джерела вуглецю. Вуглець украй необхідний мікроорганізмам,
тому що він визначає основні метаболічні шляхи будь-якого організму.
Джерелами вуглецю можуть бути всілякі органічні сполуки, вони
можуть бути використані як кістяковий матеріал при побудові клітинної
речовини і як джерело енергії.
Пектинвмісна сировина (відходи переробки плодів і овочів,
яблучний і буряковий пектини, а також гідролізати цих відходів) є
прекрасними джерелами вуглецю при вирощуванні продуцентів
пектолітичних і геміцелюлазних ферментів. При цьому, варіюючи
складом середовища й концентрацією пектинвмісної сировини, можна
досягати певного співвідношення окремих ферментів пектиназного й
геміцелюлазного комплексу. Сприятливий вплив на біосинтетичну
здатність мікроорганізмів робить лактоза, що вводиться в середовище в
кількості 1,5-3 %. Наприклад, за даними А. Г. Лобанка (1978), лактоза,
уведена у вигляді молочної сироватки, стимулює біосинтез
целюлолітичних ферментів. У присутності лактози зростає також
біосинтез пектиназ культурою A. awamorі 16 і біосинтез р-галактозидаз
будь-якими продуцентами. Вибір джерела вуглецю залежить від
 31

фізіології продуцента й виду утвореного продукту, тому оптимальне

дозування джерела вуглецю вибирається індивідуально для кожного
мікроорганізму.
Джерелами азоту в поживному середовищі при глибинному
культивуванні можуть бути мінеральні солі й азот органічних сполук. У
процесі біосинтезу протеїназ джерело азоту відіграє роль не тільки
необхідного компонента харчування, але й активатора процесу
біосинтезу. Найкращий стимулюючий ефект виходить при введенні до
складу середовища білків або продуктів їхнього гідролізу. До органічних
джерел азоту ставляться різні тваринні білки (пептон, казеїн, гемоглобін,
желатин, яєчний альбумін), білки рослинної сировини (знежирена соя,
кукурудзяний екстракт), біомаси мікроорганізмів, а також гідролізати
білків (кислотні, лужні й ферментативні), окремі амінокислоти і деякі
інші з'єднання.
Як неорганічні джерела азоту використовуються різні солі азотної
кислоти й амонійні солі. При виборі джерела неорганічного азоту треба
насамперед обертати увагу на фізіологічний вплив аніона або катіона
при виборчому споживанні азоту. Зміна рН середовища, тобто її
підлужування у випадку споживання аніона або підкислення при
утилізації катіона може викликати значні зміни в біосинтетичній
діяльності мікроорганізму.
За даними багатьох дослідників, додавання органічних джерел
азоту в багатьох випадках є більше ефективним, чим тільки
неорганічних, а спільне введення в середовище азоту солей і органічних
сполук може привести до їх синергетичної дії. Однак єдиної
рекомендації зі складання середовищ дати неможливо й необхідно
експериментальне визначення складу середовища для кожного
продуцента.
 32

Співвідношення вуглецю й азоту в середовищі. Велике

значення для біосинтезу продуктів має співвідношення вуглецю й азоту
в середовищі, тобто збалансованість поживного середовища по вуглецю
й азоту. Дефіцит одного із цих компонентів у середовищі не може бути
компенсований надлишком іншого.
Варто пам'ятати, що встановлення кращого відношення С : N при
деякому незмінному рівні одного з них може не привести до досягнення
оптимальної ефективності процесу й тому встановлювати оптимальне
відношення С: N треба при одночасному варіюванні рівнів С и N у
середовищі.
Фосфор вноситься в середовище у вигляді солей фосфорної
кислоти, рідше - у вигляді органічних сполук, наприклад фітину.
Фосфор може бути уведений у середовище з різними природними
субстратами: відварами рослинних тканин, борошном, кукурудзяним
екстрактом і т.п. Фосфор є дуже важливим елементом поживного
середовища: він входить до складу АТФ, АДФ, АМФ, які забезпечують
енергетичний обмін у клітині, а також здійснення найголовніших
біосинтетичних процесів (синтез білків, нуклеїнових кислот, гліколіз і
інші біохімічні перетворення). Фосфор інтенсивно споживається із
середовища в логарифмічній фазі росту культури, що відповідає
найбільш інтенсивному плину біосинтетичних процесів і утворенню
клітинної речовини. Звичайно в цей період росту в біомасу із
середовища переходить до 83-91 % фосфору. Потреба культури у
фосфорі можна приблизно визначити шляхом аналізу золи мікробної
маси продуцента.
Фосфор стимулює біосинтез протеаз, амілаз, пектолітичних
ферментів. Найкращі результати виходять, якщо фосфор додатково
вноситься у вигляді солей фосфорної кислоти (одно- і двохзаміщених
 33

солей натрію, калію й амонію) у середовища, що містять природні

рослинні відвари, що містять фосфор.
Без вітамінів, ростових речовин, іонів металів обмін речовин у
мікробній клітині малоймовірний. Але не всі мікроорганізми вимагають
введення цих сполук у середовище й залежно від цього мікроорганізми
діляться на два типи: ауксоавтотрофи, не потребуючі введення в
середовище вітамінів і синтезуючі їх самостійно, і ауксогетеротрофи,
нездатні синтезувати ряд вітамінів і потребуючі їхній обов'язкового
введення до складу середовища.
Якщо продуцентом є ауксоавтотрофний мікроорганізм, введення
до складу середовища ростових речовин і вітамінів не впливає на їхній
ріст і розвиток. Якщо ж продуцент - ауксогетеротроф, то введення навіть
невеликих кількостей ростових речовин помітно прискорює його ріст і
розвиток. На жаль, багато продуцентів є ауксогетеротрофними й для них
потрібне наявність у середовищі комплексу вітамінів групи В (B1, B3, В5,
В6, В8), тобто біотину, інозиту, пантотенової кислоти, тіаміну,
піридоксину й інших, що беруть участь у процесах біосинтезу
ферментів.
Біотин бере участь у реакціях перетворення амінокислот, входить
в активний центр ряду ферментів, каталізуючих процес
карбоксилювання й декарбоксилування жирних кислот. Інозит,
з'єднуючись із шістьма молекулами фосфорної кислоти, утворить
інозитфосфорну кислоту, що сприяє росту дріжджів. Пантотенова
кислота входить до складу КоА, при участі якого відбуваються
найважливіші перетворення в клітці.
Джерелом вітамінів і ростових речовин у поживних середовищах
звичайно являються мікробні маси й різні рослинні відходи, що входять
до складу середовищ. Найбільш багатими джерелами цих сполук
являються автолізати мікробних мас, у цей час для цих цілей часто
 34

використовують кормові дріжджі, плазмолізовані або піддані

кислотному або ферментативному гідролізу. Багаті вітамінами й
ростовими речовинами кукурудзяний екстракт, спиртова барда, відвари
борошна, вижимки плодів і овочів. Але тому що ці компоненти
середовища служать одночасно джерелами вуглецю, азоту, фосфору і
їхня кількість у середовищі найчастіше визначається саме цими
елементами, зміст вітамінів і ростових речовин у середовищах буває
достатнім і не потрібно їхнього додаткового введення. Якщо ж
середовище для культивування використовується синтетична, то
виникає необхідність спеціального дослідження з виявлення потреби
продуцента в цих з'єднаннях.
Макро- і мікроелементи являються невід'ємною частиною складу
поживних середовищ. Багато іонів металів входять в активний центр
ферментів або беруть участь у підтримці просторової структури
ферментів й забезпечують - ензиматичну діяльність організму, обмін
речовин у ньому. Більше чверті відомих у наш час ферментів
відносяться до металоферментів. Вони активують процеси дихання,
окислювально-відновні реакції, синтез амінокислот, жирних кислот,
Цукрів, нуклеотидів, пирамідинових основ, регулюють утворення
біополярних молекул білків, глікогену, нуклеїнових кислот, їхню
трансформацію й розпад.
В окислювально-відновних процесах беруть участь ферменти, що
вимагають присутності заліза, міді, марганцю, цинку, бору й молібдену.
Активність дихання й інтенсивність розщеплення органічних субстратів
залежать від специфічної активації ферментів тим або іншим металом.
Таким чином, метали і їхні комплексні з'єднання є не випадковими
домішками, а біологічно важливими компонентами. Мікроелементи
можуть регулювати обмінні процеси в організмі й змінювати напрямок
ферментативних реакцій. Синтез амінокислот каталізують ферменти, на
 35

які впливають марганець, молібден, залізо, кобальт; білки синтезуються

при участі молібдену, цинку, міді, бору; на синтез ліпідів впливає
наявність бору, міді, марганцю, кобальту.
Залежність потреби в мікроелементах від швидкості росту
мікроорганізмів і від утворення ними ферментів встановити важко, тому
що кількості мікроелементів, у яких потребують мікроорганізми, дуже
малі. Про потребу в мікроелементах для біосинтезу клітинної речовини
судять на підставі аналізу складу з біомаси мікроорганізму.
Потреба мікроорганізмів у макроелементах звичайно
компенсується введенням відповідних солей, а мікроелементи вносяться
в необхідній кількості з водопровідною водою, реактивами й
рослинними відварами.
Відомо, що ріст і розвиток мікроорганізмів пов'язані зі
здійсненням численних ферментативних реакцій, що протікають за
законами конкурентного й неконкурентного інгібування. У поживних
середовищах неминуче є присутньою деяка кількість металів, що
гальмує швидкість ферментативних реакцій. При цьому залежно від
концентрації ті самі метали можуть виступати як стимулятори і як
інгібітори процесу. Додавання до синтетичних середовищ білків і
екстрактів рослинної сировини помітно послаблює токсичну дію міді,
очевидно, у результаті здатності цих речовин утворювати з міддю
комплексні з'єднання.
Токсичний вплив на життєдіяльність багатьох мікроорганізмів
вчинює присутність у середовищі хлору, галогенів, формальдегіду,
фенолу, толуолу, бензолу й ряду інших речовин. Установлено, що для
повного придушення росту багатьох мікроорганізмів досить присутності
в природному поживному середовищі однієї з наступних сполук у
мільйонних частках у межах: ртуть - 40-50, хлор - 125-200, формальдегід
 36

- 225- 250, кадмій - 350-500, мідь - 400-500, двоокис сірки - 1250- 1500,
фенол - 2000-2500 і т.д..
Таким чином, для забезпечення процесу росту мікроорганізмів і
біосинтезу ними відповідної продукції необхідно, щоб у складі
поживного середовища були джерела вуглецю, азоту, фосфору,
вітамінів, ростових речовин, макро- і мікроелементів у певних
кількостях. Середовище повинне мати певне значення рН; для цього
необхідно передбачити, щоб у процесі культивування зміна рН не
позначалося негативно на життєдіяльності мікроорганізму.
Сухі компоненти для готування поживних середовищ зберігають в
основному виробничому будинку чи спеціальному складському
приміщенні. Поживне середовище для поверхневого культивування
готують у стерилізаторі або спеціальній ємності із пристроями, що
перемішують, куди дозують окремі компоненти й змішують їх з водою
або водяним розчином збагачувачів (розварена маса, солі, кислоти,
кукурудзяний екстракт). При глибинному способі культивування
готування середовища здійснюється в спеціальній ємності. Якщо
виробництво невелике, то готування середовища і її стерилізацію можна
здійснювати в одному приміщенні. Але з позиції ведення раціональної
технології, особливо на великих підприємствах, цех готування
поживного середовища потрібно ізолювати від інших виробничих
приміщень, щоб запобігти потраплянню нестерильної, забрудненої
мікроорганізмами сировини в основне виробництво. Стадії готування
поживного середовища й з її стерилізацією роз'єднані в різних цехах.
Методи готування різних поживних середовищ залежать від
складу вхідних у середовище компонентів. Для одних компонентів
потрібна попередня обробка: здрібнювання, дроблення, відварювання,
екстрагування й т.п. Ці підготовчі операції проводять у спеціальних
ємностях і в спеціальних апаратах. Підготовлені компоненти
 37

середовища (здрібнена макуха, глютен, картопля, розчинена в гарячій

воді, і частково розведений кукурудзяний екстракт) подають при
постійному перемішуванні через дозуючі пристрої в ємність для
готування середовища. Залежно від властивостей компонентів
середовище можна готовити шляхом їхнього розчинення або
суспендування в холодній або підігрітій воді.
Ємності для готування поживного середовища можуть бути
відкритими й закритими, циліндричної форми зі сферичним дном, з
мішалкою і барботажними пристроями для повітря та пари й дозуючих
пристроїв. Виготовляються апарати з нержавіючої сталі або з матеріалів
з антикорозійним покриттям.
Останнім часом з'явилася тенденція складання поживних
середовищ на основі різних гідролізатів (гідролізати рослинних відходів,
мікробних мас, крохмалю й т.п.). У цьому випадку необхідні спеціальні
ємності для проведення процесів гідролізу, апарати для відділення
твердої негідролізуємої фракції й насоси для перекачування гідролізатів
у ємність для змішування всіх компонентів. Розробляються лінії
безперервного гідролізу компонентів середовища, безперервного
змішування й передачі на стадію стерилізації.
Кожна партія сировини, що надійшла (дерть, макуха, паростки,
бурякові вижимки і ін.) піддається мікробіологічному контролю на
визначення обсім’яненності мікроорганізмами, аналізуються його
біохімічний склад, вологість і т.п..
У лабораторії проводиться контрольне вирощування продуцента
на новому виді сировини й уточнюється методика готування
середовища: порядок дозування компонентів, їхня обробка й режими
змішування.
 38

Контрольні питання до теми Т6:

1. Наведіть класифікацію поживних середовищ.
2. Як підібрати склад поживного середовища для виробництва певного
продукту?
3. Чим представлена сировинна база біотехнології?
4. Які речовини виступають в ролі ростових факторів?

Тема Т8. Значення асептики в біотехнологічних процесах

Біотехнологічні процеси, як правило, проводять в асептичних

умовах, хоча можуть бути виключення для деяких з них. Наприклад, при
культивуванні окремих еукаріот (дріжджі) у негерметизованих
ферментаторах (нестерильний процес) відбувається помітне зниження
рН середовища, де домінуюче положення дріжджів не змінюється при
потраплянні бактерій - контоменантів (від лат. contamіnatіo -
забруднення, зараження, змішання) - вони не можуть скласти
конкуренції основному виду.
Асептика (від греч. а-ні, sepsіs- гниття) - це комплекс заходів,
спрямованих на запобігання потрапляння в середовище (об'єкт)
сторонніх мікроорганізмів, включаючи хвороботворні. Отже, асептика в
біологічній технології й, наприклад, у хірургії - це не те саме поняття.
У першому випадку припускають використання якого-небудь біооб’єкту
(у тому числі - мікроба) і повне виключення потрапляння інших
мікроорганізмів, що є забруднювачами. У другому випадку прагнуть
виключити будь-яку можливість потрапляння патогенних мікробів і
мікробів - контамінантів на операційне поле або в рану.
Кожний з матеріальних потоків у біотехнологічних процесах -
потенційне джерело мікробів - контамінантів.
Асептика може включати вологе прибирання приміщень, обробку
їх ультрафіолетовими променями, антисептичними засобами,
 39

використання стерильних інструментів, середовищ, технологічного

одягу, подачу стерильного повітря і ін. Отже комплекс заходів, що
забезпечують асептику біотехнологічних процесів, включає: механічний,
фізичний й хімічний захист біооб’єкту й середовища його перебування,
а при необхідності - і кінцевий продукт. До механічного захисту
відносяться: видалення механічних домішок, герметизація устаткування,
ізоляція вузлів і з'єднань; до фізичного - обробка повітря й поверхонь
приладів й апаратів ультрафіолетовими променями, кип'ятіння,
стерилізація пором під тиском, обробка ультразвуком; до хімічного -
обробка поверхонь хімічними антисептиками.
У виробничих умовах джерелами микробів-контамінантів можуть
бути ґрунт, вода, повітря, люди. Із ґрунту в сферу біотехнологічних
процесів потрапляють спороутворюючі бацили, конідії грибів,
актиноміцети; ці ж мікроорганізми з пилом можуть потрапити в повітря,
за посередництвом якого вони здатні проникнути в середовище
вирощування біооб’єкту або в кінцевий продукт виробництва.
Якісний склад і розміри часток у повітряному пилу коливаються в
широких межах. У виробничих приміщеннях це залежить від
конструкційних особливостей будинку, троянди вітрів, географічної
зони розташування міста й підприємства, наявності або відсутності
потоків автомобільного й іншого транспорту, кількості безпосередньо
зайнятих у технологічному процесі людей, характеру й локалізації
складських приміщень і т.д..
Пил, що утворюється або/і крапельки вологи в повітрі, як правило,
містять на своїй поверхні шар адсорбованого повітря й більшу або
меншу кількість мікроорганізмів. Газова оболонка охороняє частки від
змочування. Такі частки являють собою дисперсну фазу аерозолю,
стійкість якої залежить від розмірів (величини) часток, їх електричного
заряду й поверхневої енергії. Необхідно пам'ятати, що у випадку
 40

знаходження на частках аерозолю мікробних клітин, те їх негативний

електричний заряд буде привносити свою частку в загальний заряд
частки. Спираючись лише на величину аерозолю, що містить
мікроорганізми, можна виділити три фази його: крупноядерну (діаметр
часток більше 100 мкм), дрібноядерну (діаметр часток менш 100 мкм) і
фазу бактеріального пилу (діаметр часток від 1 мкм до 100 мкм). Частки
крупноядерної фази протягом декількох секунд осідають із повітря, тоді
як частки двох інших фаз можуть довгостроково перебувати в повітрі,
утворюючи стійку колоїдну систему. У таблиці 8.1 представлені дані
про швидкості седиментації часток у повітрі й, для порівняння, у воді.
Бактеріальний пил може формуватися з перших двох фаз після їх
висихання й повторного потрапляння в повітря. У розряд часток з
діаметром від 0,001 мкм до 1 мкм підпадають віруси й деякі бактерії.
Аерозолі можуть бути шкідливими й для людини не тільки через
мікроби, що перебувають на частках пилу або крапельках рідини, але й
самі по собі внаслідок проникнення в альвеоли дихальної системи з
наступним розладом її функцій.

Таблиця 8.1 - Седиментаційна швидкість (мкм/с) для сферических

часток в повітрі при н.у. (18°с, 1,01·105Па) та у воді при 21°С
Діаметр часток, В повітрі У воді
мкм
0,1 1,0 0,001
1,0 42,0 0,11
5,0 960,0 2,8
10,0 3650,0 11.1

У такому розумінні шкідливими є наступні аерозольні частки:

азбесту, алебастру, абразивного порошку, графіту, гіпсу, діоксида
титану, дорожнього пилу, вапна, каоліну, корунду, карбіду кремнію,
 41

мармуру, оксиду олова, скловолокна й ін. В альвеоли проникають частки

розміром менш 3 мкм при швидкості потоку вдихуваного повітря вже
близько 1 см/с.
По ступені забруднення повітря мікробами й механічними
частками розраховуючи на 1м3 виробничі приміщення, у яких
асептично виготовляють лікарські засоби, класифікують по класності в
такий спосіб:
1-й клас чистоти з ламінарним потоком стерильного повітря - для
виготовлення стерильних ліків - не повинне бути мікробів, а механічних
часток розміром до 0,5 мкм - не більше 3500;
2- й клас чистоти - до 50 мікробних клітин, до 2500 часток
розміром 5 мкм і до 350000 часток розміром 0,5 мкм;
3- й клас чистоти - до 100 мікробних клітин (ЗА клас - до 200 і ЗБ
клас - до 500 кліток), до 25000 часток розміром 5 мкм і до 3500000
часток розміром 0,5 мкм;
4- й клас чистоти - за ГОСТ 12.1.005 - 86.
Для приміщень 2-го й 3-го класів чистоти, у яких виготовляють
нестерильні лікарські засоби, нормування повітря по змісту механічних
часток не передбачається.
Працюючі в приміщеннях різного ступеня чистоти повинні
одягати що рекомендує й придатну для таких цілей технологічний одяг
(відповідно до вимог системи GMP). Так, у приміщеннях першого
класу, де кратність обміну повітря в годину 600-200, одягають
стерильний костюм, головний убор повинен повністю закривати
волосся, включаючи бороду, і загортатися під комір костюма; на особу
одягається маска щоб уникнути влучення часток і краплі в навколишнє
середовище; на руки одягають стерилізовані без сипучих матеріалів
рукавички з каучуку або пластичних матеріалів, на ступні -
стерилізоване або продезінфіковане взуття, включаючи бахіли. Низ
 42

штанів підвертають у взуття (як і рукава костюма - у рукавички). Від

захисного одягу не повинні попадати в повітря частки й волокна, а сама
вона повинна затримувати частки, що виходять із тіла оператора.
Зазначений одяг повинен бути разового використання або використатися
протягом одного дня, якщо результати перевірки підтверджують таку
можливість. Рукавички рекомендується постійно дезінфікувати під час
операцій, маски й рукавички необхідно міняти перед кожною робочою
процедурою. Стерильну зону бажано проектувати таким чином, щоб всі
операції можна було спостерігати ззовні. У робочих зонах таких
приміщень всі відкриті поверхні повинні бути гладкими, непроникними,
нерозбитими, зручними для очищення й дезінфекції, де й коли це
необхідно, без важкодоступних виступів і поглиблень, полиць, шаф,
зайвого встаткування, розсувні двері тут небажані через можливість
скупчення пилу в пазах; стічні й каналізаційні труби не повинні
проходити в стерильних зонах. Кімнати для зміни одягу необхідно
проектувати й будувати з повітряними шлюзами, що забезпечуються
стерильним повітрям. Двері з повітряними шлюзами не повинні
відкриватися одночасно; між шлюзами повинна бути система для
візуального або аудиоконтроля. Миття рук і засобу для цього повинні
бути тільки в кімнаті для зміни одягу.
У робочі приміщення повинен подаватися стерильне повітря під
позитивним тиском.
У приміщеннях другого класу чистоти із кратністю обміну повітря
20-60 варто одягати гладкий (без складок) комбінезон, стягнутий на
поясі, з манжетами, що щільно облягають щиколотки ніг; на голову
необхідно одягати шолом-каптур, що повністю закриває волосся, ніс та
підборіддя; на обличча - маску; на руки - гумові (або з еластичних
полімерів) рукавички, на ноги - стерильне або продезінфіковане взуття,
поверх якої рекомендується одягати бахіли, повністю закриваюче
 43

ступню. Нижня частина штанів повинна заправлятися в бахіли, а рукава

комбінезона - у рукавички. Жодна частина тіла не повинна бути
відкрита.
У приміщеннях третього класу чистоти із кратністю обміну
повітря 1-15 рекомендується одягати комбінезон, або куртку із
зібраними рукавами на зап'ястях й коміром-стійкою, шапочку або
косинку, штани, бахіли й маску.
У приміщеннях четвертого класу чистоти рекомендується одягати
комбінезон, або куртку й штани, або халат, шапочку або косинку з
бавовняних або лляних тканин.
З водою в сферу технологічного процесу можуть потрапити
грамнегативні бактерії із груп ентеробактерій, псевдомонасов і деяких
інших. У природних відкритих водоймах виявляються
целлюлозоруйнуючі, нітрифікуючі та денітрифікуючі бактерії,
цианобактерії, аммоніфікатори, залізобактерії й багато інших. Лише
вода артезіанських колодязів, глибоких шарів (скважина) і джерел
відрізняється високою чистотою. Варто пам'ятати, що чим більше вода
забруднена органічними речовинами, тим більше в ній утримується
мікробів.
За ступенем забруднення відкритих водойм розрізняють 3 зони
сапробності (від лат. saprotes -гниття): полісапробна - сильно
забруднена, яка містить в 1 мл кілька мільйонів мікробних клітин,
включаючи гнильні й кишкові бактерії; мезосапробна - помірно
забруднена, яка містить в 1 мл до 100000 мікробних клітин з перевагою
аеробних видів; олігосапробна - зона чистої води, що містить в 1 мл не
більше 1000 мікробних клітин із представників залізо-, сіркобактерій й
деяких інших видів. Полісапробні зони характерні для річок, що
протікають по населених пунктах або поблизу їх, і де у воду
потрапляють рідкі відходи з великих свинарських ферм, каналізаційні
 44

стоки й стоки промислових підприємств. У такій воді можуть бути

санітарно-показові (Е. colі, Streptococcus faecalіs), умовно патогенні
псевдомонади, інші види, а також хвороботворні мікроорганізми із
групи ентеробактерій.
Седиментационная стійкість бактерій у воді досить виражена.
Варто також мати на увазі й мінімальні значення активної води (a w) для
різних мікроорганізмів, під якою розуміють відношення тиску пари
розчину (Vs) до тиску пар чистої води (Vpw):

В таблиці 8.1 наведені данні про мінімальне значення активної

води для різних груп мікроорганізмів.

Таблиця 8.1 – Мінімальне значення aw для мікроорганізмів

Группа микробов-сапрофитов Минимальные значения aw

Мезофільні бактерії 0,91

Галофільні бактерії 0,75
Психрофільні бактерії 0,75
Дріжджі 0,88
Нитчасті гриби 0,62 - 0,93
Осмофільні дріжджі 0,60
Нитчасті гриби - ксерофіти 0,65

Для сировини небезпечним рівнем вологості при тривалому

зберіганні є показник aw, що перевищує 0,6, рідше - 0,7.
З урахуванням всіх характеристик необхідно здійснювати
підготовку води для використання її в біологічній технології.
Люди, зайняті в біотехнологічному виробництві, також можуть
бути джерелом контамінуючої мікрофлори - грамегативних бактерій,
 45

коків, мікоплазм, вірусів й ін. Тільки на поверхні шкіри може

зосереджувати до 1010 мікробних клітин. Найбільш забрудненими є кисті
рук, ступні, лікті, шия, груди, промежина, пахові області. Різноманітна й
численна мікрофлора ротової порожнини: бактеріальні й коккові форми,
вібріони, спірилли й спірохети, нокардії, дифтероїди, протозойні
організми, аспорогенні дріжджі роду Candіda, мікоплазми, віруси й ін.
При розмові, кашлі, чиханні мікроби у великому числі попадають у
повітря. Установлено, що здорова людина за одне чихання виділяє до
20000 мікробних клітин, здатних поширюватися по горизонталі, у
середньому, до 1,5 м. Крапельки носового слизу, слини й мокротиння,
підсихаючи, утворять частки, покриті білкової або глікопротеїновою
оболонкою, що утримуютьі мікробні клітини. У таких частках
мікроорганізми довгостроково зберігаються й можуть бути причиною
нестерильності матеріалів (об'єктів) на яких-небудь технологічних
операціях.
Джерелом мікробів-забруднювачів можуть бути деякі компоненти
поживних середовищ наприклад, кукурудзяний екстракт (фаги, дріжджі
й ін.).
Рослинні віруси часто виявляються в культурах каллусних тканин;
високу заклопотаність у цьому змісті викликають також культури клітин
тваринних тканин і клітин людини, будучи винятково сприятливими
середовищами для контамінуючої мікрофлори.
Мікроби -контамінанти не тільки можуть придушити розвиток і
функції біооб’єкту в силу конкуренції й антибіоза, але й дезорганізувати
яку-небудь тканину - середовище вирощування; більше того, деякі з них
здатні продуціювати токсичні речовини, які можуть потрапити в
цільовий продукт (так само як і самі мікроби-забруднювачі).
 46

Контрольні питання до теми Т8

1. Визначте поняття асептика.
2. За якою формулою визначається мінімальні значення активної води (aw) для
різних мікроорганізмів?
3. Які показники aw длямезофільних бактерій, психрофільних бактерій,
дріжджів, нитчастих бактерій.
4. Назвіть джерело мікробів – контамінантів в біотехнологічному процесі.

Тема Т9. Теоретичні основи стерилізації

Метою стерилізації є знищення всієї мікрофлори, що перебуває в

поживному середовищі, різних рідких добавках (наприклад, у
піногаснику), а також на внутрішніх поверхнях устаткування, арматури,
що підводять і відводять комунікацій.
Необхідність стерилізації викликана тим, що культури –
мікроорганізмів продуцентів украй чутливі до присутності інших
мікроорганізмів.
Процес стерилізації можна розчленувати на три основні етапи:
нагрівання середовища або апарата до температури стерилізації,
витримування при цій температурі протягом часу, що забезпечує
загибель всіх мікроорганізмів і охолодження стерилізуємого об'єкта до
температур, доступних для засівання середовища чистою культурою
продуцента.
Досягти повної стерильності дуже важко, оскільки для цього треба
вбити всі мікроорганізми, а деякі з них, особливо спороносні,
витримують вплив високих температур дуже тривалий час. Властивості
стерилізуємих об'єктів мають велике значення, тому що деякі речовини
підсилюють стерилізаційний ефект, наприклад кислоти, а деякі, навпаки,
збільшують стійкість мікроорганізмів до температури й тиску. Так,
 47

мікроорганізми в 2-3 рази довше витримують термообробку в маслі, у

присутності крохмалю й т.п. Все це говорить про те, що ефективність
стерилізації залежить від дуже багатьох факторів: температури,
тривалості процесу, складу стерилізуємого середовища, конструкції
апарата, ступеня обсім’яненності стерилізуємого об'єкта, вимог
стерильності на наступних стадіях і т.п.
Характеристикою процесу стерилізації є питома швидкість
загибелі мікроорганізмів - кількість мікроорганізмів, що гинуть в
одиницю часу:

де N - число особин у популяції; τ - тривалість стерилізації, хв.

Після інтегрування, з огляду на, що при τ = 0, N = N 0, одержимо:

Питома швидкість загибелі k не залежить від концентрації

мікроорганізмів, а залежить від виду мікроорганізму, характеристики
стерилізуємого об'єкта, температури стерилізації й т.п.
Окремі особини мікроорганізмів однієї й тієї ж культури по-
різному реагують на вплив температури: одні гинуть швидше, інші
витримують високу температуру більш тривалий час. Тому
експериментально можна визначити лише середнє значення k.
Добуток N0τсер характеризує сумарну тривалість життя всієї
популяції, яке можна записати у вигляді наступного рівняння:
 48

звідки

Величина середнього k, що має розмірність хв-1, буде величиною,

оберненою середньому часу τсер:

Інтеграл для вираження питомої швидкості росту можна

записати в такий спосіб:

де N0 - кількість живих мікроорганізмів перед стерилізацією (при

τ =0). Ф. X. Дейндорфер і А. Е. Хемфрі запропонували ліву частину

цього рівняння позначити і назвати його критерієм стерилізації.

При постійній температурі критерій стерилізації буде дорівнювати:

Щоб розрахувати ефективність прийнятого режиму стерилізації,

варто взяти з табл. 1.6 значення k, що звичайно встановлюється за
експериментальним даними для найбільш термостійкого еталонного
мікроорганізму - В. stearothermophіlus 1518.
Для розрахунку й обґрунтування режиму стерилізації при
неізотермічних умовах реального виробництва використовують
наближений метод Т. Ричардса. Метод припускає враховувати критерії

стерилізації при нагріванні стерилізуємого об'єкта ( H),

 49

витримування його при температурі стерилізації ( B) і

охолодження ( ox).
Обробляючи численні експериментальні дані, Т. Ричардс
відзначає, що обробка при температурі нижче 100°С нерезультативна й
становить близько 2 % загального критерію стерилізації. Був зроблений
розрахунок критерію стерилізації в інтервалі від 100 до 125 °С при
підвищенні температури обробки на 1 °С у хвилину. Пізніше Д. Уеіга зі
співробітниками розрахували значення критерію стерилізації для
температури 143 °С, тобто для таких температур, які використовуються
в цей час при стерилізації.
Значення критеріїв стерилізації при різній температурі
представлені в табл. 9.1.
Якщо температура нагрівання або охолодження відрізняється від
прийнятого при складанні таблиці (1 ºС за 1 хв), то для розрахунку
дійсного критерію стерилізації можна використовувати співвідношення:

де T - табличне значення; τ - тривалість зміни

температури від 100°С до tст; tст- температура стерилізації, °С.
Ефект стерилізації визначається як сума критеріїв стерилізації:

Т. Річардс вважає, що повна стерильність досягається при =

40, однак у промисловості використовуються режими, де Σ =80÷100

і вище. Таке підвищення величини критерію стерилізації пов'язано,
очевидно, з тим, що вивчення процесу відмирання еталонної культури
 50

проводилося в нейтральному середовищі, де не могло бути речовин, що

збільшують термостійкість мікроорганізмів.

Таблиця 9.1 - Значення критеріїв стерилізації при різній

температурі

Метод Річардса може бути застосований для визначення ще однієї

характеристики процесу стерилізації - показника асептичної
ефективності (Sac), що дорівнює відношенню кількості забруднених
операцій (пз) до загального числа проведених операцій (п):

Якщо прийняти, що навіть одна особина, що вижила, викликає

інфікування об'єкта, то число "брудних" стерилізацій пз дорівнює числу
N, розрахованому для всіх п операцій:
 51

Звідки

Значення розраховується по методу Річардса з

використанням табл. 9.1. Величина Sac задається, виходячи з
економічних міркувань, тому що більш жорсткі режими стерилізації
пов'язані зі збільшенням енерговитрат, більш строгими вимогами до
герметизації й міцності устаткування, кваліфікації персоналу та ін.
В основі розглянутих методів визначення параметрів стерилізації
лежить гіпотеза про експонентну залежність числа клітин, що вижили,
від тривалості теплової обробки. Однак у багатьох випадках ця гіпотеза
не відповідає дійсності. Це пов'язано з наявністю захисних властивостей
деяких компонентів середовища (наявність грудок), різною швидкістю
нагрівання, нестабільністю температури стерилізації при витримуванні й
т.п. Для розрахунку режимів стерилізації такої складної системи
успішно використовуються імовірнісні методи, які полягають у
встановленні ймовірності виживання мікроорганізмів при даному
режимі стерилізації в даному встаткуванні або ймовірності одержання
чистих операцій.
Побудова імовірнісної моделі процесу стерилізації ґрунтується на
застосуванні розподілу Пуассона, що найбільш повно відображає
специфіку досліджуваного процесу. Імовірність виживання клітини Р
розраховується за формулою:

де m - число центрів, що реагують на здійснений вплив в одиниці

об'єму; V - деякий об’єм; d - умовне число якихось впливів (ударів) на
клітин, що не приводять до її загибелі.
Якщо для загибелі клітини досить одного удару, то виживають
тільки клітини, що не одержали цього впливу (d=0). Імовірність
виживання клітини в цьому випадку
 52

Якщо для відмирання клітин необхідно два удари, то виживають

клітини, що не одержали ударів або витримали їхню дію один раз (d1 =
0; d2= 1). Тоді ймовірність виживання:

Якщо потрібно багато ударів, то:

Число клітин, що вижили:

де N0 - початкова кількість клітин.

Для одноударних клітин залежність числа клітин, що вижили, від
впливу буде експонентною згідно теорії термічної загибелі

мікроорганізмів: N=N0ехр (- ), тоді = mV.

Для багатоударних популяцій можна записати:

причому ймовірність виживання клітин в оброблюваному об’ємі

Значення можна визначити по методу Річардса.

Імовірність появи брудних операцій може бути
розрахована по формулі:

У зв'язку з великою складністю процесу стерилізації й

неоднорідністю стерилізуємих середовищ отримані розрахунковим
 53

шляхом режими необхідно в кожному випадку перевіряти

експериментально.
Крім теплової обробки середовищ і апаратури парою, гарячим
повітрям існують інші способи стерилізації, які поки не знайшли
застосування у мікробіологічній промисловості. До них відноситься
обробка ультразвуком, ультрафіолетовими й інфрачервоними
променями, іонізуючим випромінюванням, обробка отрутами (фенол,
окис етилену) і т.п.
При поверхневому способі культивування стерилізують в
основному тверді сипучі середовища, при глибинному - рідкі. Тому
апаратурне оформлення цієї стадії залежить від способу культивування.

Контрольні питання до теми Т9:

1. Назвіть основні етапи процесу стерилізації.
2. Як визначається питома швидкість загибелі мікроорганізмів?
3. Значення критеріїв стерилізації при різній температурі.

Тема Т10. Стерилізація поживних середовищ

10.1 Стерилізація сипучих поживних середовищ.

При поверхневому способі вирощування різних

мікроорганізмів потрібен різний ступінь термічної обробки
середовища. Якщо середовище в процесі культивування не
перемішується й не переміщається, то її абсолютна стерильність
необов'язкова.
На цьому етапі здійснюється обробка середовища при різних
режимах. Наприклад, на механізованій установці Джеффриса
 54

(США) дерть зволожується 0,1 н. розчином соляної кислоти й

оброблюють дерть у тонкому шарі на стрічковому конвеєрі
протягом 15 хв при температурі близько 90 °С. В установці
Христенсена (США) ведеться обробка гострою парою в
герметизованному відсіку скребкового транспорту протягом 1 год
при 100°С. У Японії при поверхневому вирощуванні бактерій
(фірма "Нагазі") стерилізацію здійснюють у спеціальних автоклавах
безпосередньо в закритих кюветах при 150°С на протязі 40 хв, на
фірмі "Дайва Касай" стерилізують середовище у відкритих кюветах
при температурі 120°С на протязі 30 хв у спеціальних автоклавах
разом з етажерками. У Чехії проводять роздільну стерилізацію
гострою парою протягом 45-60 хв при 104-120°С у горизонтальній
ємності сухої сипучої фракції середовища, а вода або рідкий
компонент, що збагачує, стерилізуються окремо в спеціальнім
апараті. Фірма "Валерштейн" (США) використовує термічну
обробку гострою парою в циліндричних горизонтальних апаратах,
де стерилізуєма маса переміщається уздовж горизонтальної осі
апарата при температурі близько 120°С на протязі 45-60 хв.
В Росії найбільше поширення одержали горизонтальні
двоциліндрові стерилізатори, де обробка зволоженої дерті
здійснюється при температурі 104-110°С на протязі 1,5 – 2 год. При
цьому ефект стерилізації підсилюється додатковим введенням у
середовище антибіотика (фурациліну) з розрахунку 1,5 г на 100 кг
сухого середовища й 0,2 % розчину формаліну з концентрацією
40%. Тверде, зволожене до 35-40% середовище рухається в цьому
апарату у замкнутому контурі. Стерилізатор являє собою два
з'єднаних циліндри, які мають по одному валу із закріпленими на
них по гвинтовій лінії лопатками, що переміщаються. Оскільки
напрямок руху валів різний, то маса, пересуваючись по горизонталі,
 55

наприкінці циліндру перекидається в сусідній, підхоплюється

лопатками другого вала й направляється уздовж другого циліндра в
протилежному напрямку. Така конструкція дозволяє перемішувати,
рівномірно нагрівати й стерилізувати середовище будь-який
необхідний за регламентом час. Є також двоступінчасті
стерилізатори. У першого вертикального циліндроконічного щабля,
постаченого мішалкою, проводиться нагрівання середовища
гострою парою до 120 °С і її витримування протягом
установленого часу. Другий щабель - це горизонтальним циліндр,
де здійснюються охолодження стерильному маси, її дозволоження й
засівання чистою культурою продуцента.
При невеликому обсязі виробництва можлива стерилізація
твердого поживного середовища в спеціальних перфорованих
металевих ємностях - біксах в автоклавах при температурі 120°С на
протязі 1,5-2 год.
При режимах стерилізації, прийнятих для сипучих середовищ,
повна стерильність середовища й жорсткі умови стерилізації
необхідні у випадку, коли в процесі культивування середовище
переміщається або перемішується. Нестерильність середовища в
цьому випадку може викликати інфікування всієї маси, особливо,
якщо продуцент має низьку швидкість росту. Це обставину варто
враховувати при проектуванні великих виробництв із
автоматизованими лініями вирощування мікроорганізмів у
товстому шарі середовища.
Досить цікаві роботи з використання спеціальних установок
для стерилізації. Так, наприклад, італійська фірма "Бонопейч"
використовує холодну стерилізацію сипучих середовищ у
розрідженні шляхом введення окису етилену з розрахунку 10 г на
25 кг стерилізуємого середовища.
 56

Становлять інтерес роботи вчених по використанню в якості

джерела тепла струмів високої частоти й способів холодної
стерилізації в іонізованому потоці електронів. Експериментальні
дані показали, що при внесенні повітряно-сухої дерті в електричне
поле при відстані між обкладками конденсаторів 65-80 мм, напрузі
4-6,3 кВ, силі струму в мережі 0,1-0,2 А. частоті струму 12 МГЦ і
довжині хвилі 24 м за 90-540 с дерть у кюветах або скляній тарі
прогрівається до 130-172°С, причому швидкість нагрівання
лімітується підводимою питомою потужністю. Майже у всіх
зразках за цей період часу досягається повна стерильність. Подібні
досвіди були проведені в лабораторних умовах на лінійному
прискорювачі ЛУЭ-5 потужністю 5 Мзв. Встановлено, що,
починаючи із дози 700 кеВ, при тривалості стерилізації 5-10 с
досягається повна стерильність оброблюваних середовищ.
В СРСР серійно виготовлялися прискорювачі електронів
чотирьох типів (ЭЛТ-1,5 і ЭЛТ-2,5 потужністю 25- 40 кВт; ЭЛИТ-
1А и ЭЛИТ потужністю 10 і 10-30 кВт), з допомогою яких можна
здійснювати стерилізацію при 20 °С дозами до 2,5 млн. рад. Є дані
про створення перспективного високочастотного стерилізатора
безперервної дії для сипучих середовищ, де за 2 хв температура в
середовищі підвищується до 137- 155°С, що забезпечує повну
стерильність середовища. При цьому активність культури
підвищується на 12-20%.
Все це свідчить про те, що нові способи стерилізації
середовищ досить ефективні й перспективні для впровадження у
виробництво.
 57

10.1 Стерилізація рідких поживних середовищ

На вибір оптимального режиму стерилізації впливають

гетерогенність рідкого середовища, її фізико-хімічні властивості,
якісний і кількісний склад. Якщо середовище не містить твердих
часток і являє собою гомогенний розчин поживних речовин, то
тривалість стерилізації за інших рівних умов може бути менше, ніж
для середовищ, що містять тверді частки, тому що для їхнього
прогрівання потрібно більше часу. Більший час стерилізації
потрібно й у випадку, якщо в середовищі є ліпіди й вона має
високий вміст сухої речовини. При наявності в складі середовища
цукрів, що редукують, особливо глюкози й вільних амінокислот,
стерилізацію вуглеводної й амінокислотної фракцій варто вести
окремо, щоб уникнути втрати цукрів у результаті
меланоідиноутворення.
Стерилізацію поживних середовищ можна вести двома
способами: періодичним і безперервним. Періодичний спосіб
використовується при роботі з невеликими обсягами, наприклад у
лабораторних ферментаторах і при стерилізації середовища для
посівних апаратів. У цьому випадку процес ведуть у кілька етапів:
1) стерилізація ферментатора й всіх комунікацій гострою або
глухою парою; 2) затока прогрітого гомогенізованого середовища;
3) нагрівання середовища до температури стерилізації; 4)
витримування при цій температурі протягом часу, необхідного для
загибелі всіх мікроорганізмів; 5) охолодження стерильного
середовища в цій же ємності. Цей спосіб стерилізації досить
тривалий, і тому щоб уникнути істотних змін у складі середовища
процес ведуть при надлишковому тиску 0,05- 0,1 МПа, при
температурі 110-120°С на протязі 1 -1,5 год з моменту досягнення
 58

граничної температури. Але цей спосіб малоефективний, тому що

ферментатори використовуються нераціонально, і через тривалість
термічної обробки відбуваються розкладення й зміна ряду
компонентів середовища. Крім того, при періодичному способі
стерилізації високі енергетичні витрати й витрата води.
При безперервній стерилізації використовують більш високі
температури (140-145°С) і меншу тривалість витримування (1 -10
хв) при цій температурі. Запропоновано кілька конструкцій
безперервних стерилізаторів. Загальним для всіх апаратів цього
типу є розчленовування процесу на три етапи й проведення
кожного з них у потоці в окремому апараті.
Перший апарат, у якому середовище нагрівається до
температури стерилізації, називається стерилізатором,
нагрівальною колонкою або колонкою для стерилізації поживного
середовища (рис. 10.1а). Другий апарат, де стерилізуєму масу
витримують при певній температурі стерилізації, називається
витримувачем. Він призначений для продовження часу стерилізації
й досягнення максимальної загибелі мікрофлори. Апарат може бути
виконаний у вигляді циліндричної ємності, колони з полками або
тарілками, що забезпечують найбільш рівномірний прогрів всієї
маси середовища, або у вигляді спірального теплообмінника (рис.
10.1 б, в). Третій апарат - це теплообмінник, призначений для
охолодження стерильного поживного середовища до температури
оптимальної для засівання.
 59

а – тарілчасті нагрівальні колонки; б – витримувач колонного типу;

в – витримувач спірального типу
Рисунок 10.1 - Апарати безперервної стерилізації рідкого
поживного середовища

Широко застосовуються установки безперервної стерилізації

(УБС), у яких стерилізація ведеться при 140 °С на протязі декількох
хвилин. Вони мають продуктивність від 5 до 50м 3 стерильного
середовища в годину. Такі установки складаються з ємності для
нестерильного поживного середовища, насосів, нагрівача -
стерилізатора, витримувача, охолоджувача й системи
 60

автоматичного керування. На рис. 10.2 наведена принципова схема

установки для безперервної стерилізації продуктивністю 20 м 3 /год.
Стерилізація в цій установці ведеться при температурі 130 -135°С на
протязі 3-15 хв.

1 – приймальна ємність; 2 – насос; 3 – стерилізатор-нагрівач; 4 –

витримувачі; 5 – пробовідбірник; 6 – теплообмінник-рекуператор;
7 – теплообмінник-охолоджувач; 8 – ферментатор.
Рисунок 10.1 - Установка безперервної стерилізації УБС-20

Використовуються також роторні стерилізатори безперервної

дії й ряд інших установок.

Контрольні питання до теми Т10

1. Яу відбувається стерилізація сипучих поживних середовищ?
2. Як відбувається стерилізація рідких поживних середовищ?
3. У чому полягає різниця в стерилізації поживних середовищ
періодичним і безперервним способом
 61

Тема Т11. Стерилізація апаратури й комунікацій

При поверхневому культивуванні стерилізують апаратуру для

приготування посівного матеріалу (ємності для засівання, кювети,
ємності для води, для готування посівної суспензії, посівні
комунікації), а також виробничі кювети. Стерилізація кювет і
скляного посуду у посівному відділенні проводиться сухою парою
при температурі 160°С не менше 60 хв. Апаратуру й комунікації
стерилізують гострою парою при температурі 105-120 °С і
надлишковому тиску 0,05-0,1 МПа.
Приміщення, особливо посівні бокси, стерилізують
опроміненням за допомогою спеціальних бактерицидних ламп.
Стерилізація апаратів і комунікацій має велике значення й при
глибинному способі культивування. Сама ретельна стерилізація
може не дати ефекту, якщо порушено герметичність устаткування.
Створено спеціальні прилади, наприклад галоїдні струмошукачі,
для виявлення навіть незначних порушень герметичності.
При стерилізації встаткування є небезпека навіть при високих
температурах не домогтися стерильності в результаті того , що в
процесі теплової обробки внутрішніх порожнин апаратів
відбувається конденсація пари біля стінок. Повітря, що виділяється
з парогазової суміші, покриває стінки апарата повітряною плівкою,
у результаті чого умови нагрівання стінки погіршуються. Погано
піддаються стерилізації різні патрубки і люки, тому що в них
утворюються повітряні пробки. Для поліпшення умов стерилізації
при конструюванні апаратури варто скорочувати число швів,
збільшувати діаметр і зменшувати висоту відводячих і підводячих
штуцерів.
 62

Всі вентилі перед установкою перевіряють гідравлічним

опресуванням при тиску 0,3 МПа. Для герметизації фланців і
вентилів використовують особливі прокладки з параніту,
обробленого графітом, для герметизації кришок апаратів
застосовують шнур із прогумованої тканини діаметром до 19 мм, а
для завантажувальних люків - гуму товщиною 14 мм.
Герметичність з'єднань перевіряють при надлишковому тиску пари
0,15- 0,2 МПа.
Перед поданням середовища ретельно перевіряють сальникове
ущільнення мішалки, тому що в процесі стерилізації щільність
насадки може змінитися.
Особлива увага приділяється стерилізації апаратури й
комунікації для подачі піногасника. Стерилізацію цих вузлів
проводять при 125-135°С на протязі 1,5-2 год.
На стадії стерилізації ведеться постійний мікробіологічний
контроль стерильності поживного середовища, подаваного у
ферментатор повітря, піногасника й т.п.
На мікробіологічну чистоту перевіряють відділення
стерилізації, його стіни і підлогу, апаратуру, комунікації, а також
руки працюючих.

Контрольні питання до теми Т11

1. Як відбувається стерилізація ферментаційної апаратури?
2. Як відбувається стерилізація кювет і скляного посуду?
3. Як відбувається вибір оптимальних технологічних параметрів термічної
стерилізації?
 63

Тема Т12. Очищення та стерилізація повітря

Переважна більшість продуцентів ферментів являються

аеробами, і для їх нормального розвитку в процесі культивування
необхідно подавати в достатній кількості стерильне повітря.
Повітря після аерації зростаючої культури може містити спори чи
клітини мікроорганізму - продуцента, тому перед викидом у
навколишнє середовище воно також вимагає очищення. Таким
чином, потрібне очищення як подаваного у виробничі апарати і
приміщення, так і видаляємого із них повітря. Особливо високі
вимоги до стерильності пред’являються при підготовці повітря для
аерації глибинної культури.
Існує кілька способів очищення й стерилізації повітря,
заснованих на двох принципах: умертвіння мікроорганізмів і їхнє
механічне відділення. Перший принцип лежить в основі методів
впливу високих температур, ультрафіолетового або іонізуючого
випромінювання, фенол- і ртутьмістких агентів, пропущення
повітря через 10%-ный розчин лугу або 15-20%-ный розчин кислоти
в спеціальних вежах. Використання хімічних агентів, що
стерилізують, неприпустимо, тому що сліди їх в апаратах і
середовищах можуть впливати негативно на розвиток
мікроорганізмів-продуцентів. Використання методу впливу сухого
тепла для стерилізації повітря при температурі до 300ºС ефективно
вбиває мікрофлору, але економічно не виправдано.
Найбільше поширення у мікробіологічній промисловості
одержала стерилізація повітря методом фільтрування через
волокнисті або зернисті фільтруючі матеріали. На ефект
стерилізації повітря методом фільтрування впливає ступінь
засміченості повітря, оскільки самі мікроорганізми мають розміри
 64

від 0,01 до 25 мкм, але вони осідають на частки пилу, і ступінь

уловлювання залежить від розмірів цих часток. Вміст бактеріальних
забруднень у повітрі в середньому становить 1000- 1500 клітин в 1
м 3 , але воно може підніматися до 10 4 . Крім мікроорганізмів у
повітрі є пил органічної й неорганічної природи, пари води, і
загальна кількість сторонніх часток може досягти 10 9 в 1 м 3 .
Мікроорганізми, що перебувають у повітрі, звичайно стійкі до
відсутності вологи й дії природних ультрафіолетових променів.
Кількість мікроорганізмів в атмосферному повітрі убуває зі
збільшенням висоти над рівнем землі; мікробна засміченість
повітря у вологих районах або районах із сильними вітрами й
ґрунтами, що порошать, значно вище. Кількість мікроорганізмів у
повітрі міняється залежно від пори року; найменша кількість
мікроорганізмів у повітрі спостерігається в зимовий час.
Вибір і розрахунок системи очищення повітря ведуться по
максимальній засміченості для даної місцевості з врахуванням того,
що розміри часток у повітрі, на яких адсорбуються мікроорганізми,
коливаються від 0,5-2,0 мкм по ширині до 2-15 мкм по довжині.
У приміщення й апарати повітря подається потужними
компресорами; проходячи через них, повітря засмічується
механічними включеннями від тертьових деталей і крапельками
мастил при використанні поршневих компресорів. При фільтрації
повітря відбувається також його очищення від цих механічних
домішок.
Апаратурне оформлення стадії підготовки й очищення повітря
залежить від способу культивування продуцента. При
поверхневому культивуванні вимоги до стерильності повітря менш
тверді, чим при глибинному, і навіть допускається рециркуляція
аеруємого повітря. Підготовка повітря для аерації при
 65

поверхневому культивуванні проводиться у відділенні

кондиціювання повітря, що звичайно розташовується над
ростовими камерами. Цей процес складається з наступних
послідовних операцій: очищення повітря від грубих механічних
суспензій; попереднє кондиціювання повітря до певної
температури; подача повітря в головний вентилятор; тонке
очищення повітря від мікроорганізмів і остаточне очищення в
індивідуальному фільтрі. При поверхневому способі
культивування 90 % повітря, що відходить із ростових камер,
надходить на рециркуляцію через індивідуальний кондиціонер, а 10
% після попереднього знепліднення повертається в атмосферу.
Принципові схеми очищення, кондиціювання й рециркуляції
повітря у виробництві при поверхневому й глибинному
культивуванні представлені на рис. 12.1 і 12.2.
Підготовка повітря для глибинного культивування має деякі
відмінності - замість головного вентилятора використовують
компресори. Потужність компресора підбирають із таким
розрахунком, щоб забезпечити подачу повітря через всю систему
очищення у ферментатори й щоб у процесі культив ування
підтримувався надлишковий тиск 0,01-0,03 МПа. На шляху
проходження від компресора до ферментатору повітря переборює
опір: у системі апаратів і комунікацій (близько 0,03 МПа); у
фільтруючому шарі (близько 0,02 МПа); опір стовпа рідини у
ферментаторі (0,04-0,06 МПа); при виході з барботажного пристрою
в результаті розширення (0,01-0,02 МПа).
Для стиснення й нагнітання повітря можна використовувати
поршневі компресори або турбокомпресори. Поршневі компресори
мають високий КПД, вони прості в роботі, але мають невелику
продуктивність і забруднюють повітря маслом. Щодо цього
 66

кращими технологічними характеристиками володіють

турбокомпресори, у яких стиснення повітря відбувається під дією
відцентрової сили. Вони більш складні в обслуговуванні, але мають
високу продуктивність (від 100 до 1000 м 3 /хв) і не забруднюють
повітря маслом. Недоліком цих компресорів є те, що вони можуть
ефективно працювати лише при певному протитиску системи й
високої продуктивності. При падінні тиску в системі й зниженні
продуктивності ККД різко падає.

1 – ростова камера; 2 – розподілювач повітря; 3 – стерилізуючі колонки; 4 –

бак для стерилізації води; 5 – ємність для формаліну; 6 – ємність для аміаку; 7
– насос для подачі рецуркуляційної води до форсунок зрошувальної камери; 8
– кондиціонер повітря; 9 – вентилятор; 10 – клапани з автоприводом; 11 –
кип’ятильник; 12 – бак з охолоджуючим зміївиком; 13 – осьові вентилятори;
14 – форсунки для зволоження; 15 – парові форсунки для дезінфекції; 16 –
перфорировані труби для підводу пари; 17 – калорифери.
Рисунок 12.1 - Схема очистки і стерилізації повітря для
поверхневої культивації продуцентів
 67

Стиснення повітря супроводжується його сильним

нагріванням, тому після компресорів повітря надходить у
холодильник. Щоб видалити з повітря зайву вологу, його необхідно
прохолоджувати до температури нижче крапки роси. Перед
фільтрами встановлюють одну більшу ємність (ресивер) або
систему невеликих посудин, які служать для вирівнювання тиску в
системі й забезпечення рівномірної подачі повітря на фільтри. Далі
повітря прямує на знепліднення спочатку в головний, а потім в
індивідуальні фільтри.

1 – вісцинові фільтри; 2 – масловідділювач; 3 – холодильник; 4 –

ресивер; 5 – поршневий компресор; 6 – турбокомпресор; 7 – головні фільтри;
8 – індивідуальний фільтр; 9 – фільтр для відпрацьованого повітря.
Рисунок 12.2 - Схема очистки і стерилізації повітря для
глибинної культивації продуцентів

Повітря, що відводиться з ферментатора після аерації

культури, що росте очищається в системі фільтрів і викидається в
атмосферу.
Відповідно до технологічної схеми одержання стерильного
стисненого повітря всі фільтруючі матеріали можна розділити на
три групи: матеріали для попереднього очищення повітря,
 68

матеріали для стадії грубого очищення (головні фільтри) і

матеріали для стерилізації повітря (індивідуальні фільтри). Для
нормальної роботи фільтруючих матеріалів необхідно підтримувати
в системі повітряпідготовки оптимальний термодинамічний режим.
Конденсація вологи з повітря і її можливе нагромадження в
трубопроводах можуть привести до розвитку в них мікроорганізмів
і контамінації процесу. Потрапляння вологи на фільтруючі
матеріали зменшує ефективність фільтрування й збільшує опір
матеріалу потоку повітря. Одним зі способів запоб ігання випадання
вологи у фільтрах є підтримка величини відносної вологості
повітря на всім шляху від компресорної установки до ферментатора
менше одиниці й температури повітря в системі значно вище
крапки роси.
Стадія попереднього очищення або знепилювання повітря.
На цій стадії з повітря віддаляється основна маса великих
часток пилу розміром 5-10 мкм. В якості фільтруючих матеріалів у
фільтрах попереднього очищення використовують багатошарові
дротяні сітки, набивання зі стружок металів, з полімерних
матеріалів, із грубих мінеральних і синтетичних волокон. До
фільтрів цього класу ставляться масляні або вісцинові із
промасленими металевими сітками. Масло сприяє осіданню часток
пилу на фільтрі і їхньому втриманні. Змочувальні засоби,
використовувані у вісцинових фільтрах, можуть бути
бактерицидними, і осаджувані разом з пилом мікроорганізми
втрачають здатність розмножуватися або гинуть.
В якості фільтрів попереднього очищення застосовуються
також губчаті фільтри з модифікованого пінополіуретану.
Ефективність уловлювання атмосферного пилу на пінополіуретані
 69

становить 50-85 %, його пилоємність - 0,2 кг/м 2 . Гранична робоча

температура використання пінополіуретану дорівнює 121 °С.
Стадія грубого очищення повітря. Ця стадія очищення
здійснюється в головних фільтрах. Ефективність очищення повітря
в головних фільтрах від часток діаметром 1 -1,5 мкм тобто
бактеріальних забруднень повітря, досягає 98 %.
Широке поширення у якості фільтруючого матеріалу головних
фільтрів одержали волокнисті матеріали. Волокнисті фільтри є
фільтрами об'ємної дії, тому що вони розраховані на вловлювання й
нагромадження часток не тільки на поверхні фільтруючого
матеріалу, але й і глибині шару. Для фільтруючого матеріалу з
певним діаметром волокна характеристики очищення можна
змінювати, збільшуючи щільність упакування волокна у фільтрі або
товщину шару матеріалу.
Найбільш оптимальним є застосування багатошарової
конструкції однорідної волокнистої насадки з різною щільністю
шарів, що дає значне збільшення пилоємності й терміну служби
фільтра при порівняно невеликому опорі потоку повітря, високої
ефективності фільтрування й невеликих габаритів фільтра. При
такій конструкції більш пухкі шари розташовуються першими по
ходу руху газів. Товщину першого шару вибирають у межах 50 -
60 % загальної товщини насадки. Останній шар насадки роблять
значно більш щільним і з невеликою товщиною, він лімітує
ефективність усього фільтра.
На підприємствах мікробіологічної промисловості в головних
фільтрах знайшов застосування фільтруючий матеріал з
базальтових волокон. Основним достоїнством базальтового волокна
є висока паростійкість (більша ніж скляного волокна). При
багаторазовому впливі гострої пари під тиском 0,2 МПа волокно не
 70

знижує своєї міцності протягом 1 року роботи фільтра. Властивості

базальтового волокна при нагріванні до 1100 °С не змінюються.
Базальтове волокно не піддається гниттю й горінню.
Експериментально показано, що оптимальний діаметр волокна для
фільтрів грубого очищення повітря становить 12-14 мкм. Недоліком
базальтового волокна є наявність у ньому кілких голок з
базальтових підплавів і інших механічних включень.
Для очищення більших обсягів повітря застосовуються
нетканинні фільтруючі матеріали з різних волокон: поліамідних,
поліефірних, віскозних, металевих, а також різних сумішей
волокон. Товщина нетканих фільтруючих матеріалів звичайно
становить 1-5 мм, а маса пластини площею 1 м 2 дорівнює від 0,4 до
1 кг.
Матеріали першого щабля очищення повітря досить дешеві й,
за винятком нетканинних, не регенеруються.
Стадія тонкого очищення повітря. До цієї стадії
пред'являються найбільш тверді вимоги. Для тонкого очищення
повітря використовуються індивідуальні фільтри, які
встановлюються перед кожним ферментатором і повинні
забезпечувати очищення повітря від часток діаметром 0,3 мкм на
99,999 %. Специфічною вимогою, пропонованою до фільтруючих
матеріалів, застосовуваних на даній стадії очищення, є необхідність
їхньої періодичної стерилізації гострою парою разом з усім
устаткуванням технологічної лінії.
Фільтруючі матеріали, використовувані на стадії тонкого
очищення, поділяються на кілька груп: тонковолокнисті матеріали
у вигляді матів, картону й паперу, зернисті тверді фільтру ючі
перегородки (керамічні, металокерамічні, з полімерних матеріалів)
і мембранні фільтри. У промислових фільтрах тонкого очищення
 71

повітря найбільш часто використовуються тонковолокнисті

фільтруючі матеріали.
Волокнисті матеріали звичайно формують у вигляді матів-
пластин з об'ємною часткою волокон близько 0,1. Волокна
втримуються або силами тертя, або за допомогою сполучного
матеріалу. До цього виду фільтруючих матеріалів можна віднести
базальтове волокно, скловату, синтетичні волокна (віскоза,
перхлорвініл). Волокнисті матеріали можуть бути оформлені також
у вигляді картону й паперу. Для таких матеріалів використовують
базальтове супертонке волокно (БСТВ), хлопкоасбест, скло,
сополімер вінілхлориду і акрилонітрилу. Картон і папір
використовуються для ущільнення матів при впакуванні їх у
фільтрі. Волокнисті матеріали дешеві, вони мають малий
гідравлічний опір (0,01-0,03 МПа) і велику пилоємність, тому вони
вважаються досить перспективними для мікробіологічної
промисловості. Для підвищення стійкості до впливу гострої пари
використовують латексні просочення. Додатково проводять
просочення волокон бактерицидними з'єднаннями, наприклад,
антибіотиками, гексахлорофеном і іншими речовинами.
Високоефективними фільтруючими матеріалами є азбестово-
целюлозні папери й картони. Волокна целюлози товщиною близько
15 мкм служать каркасом, на якому лежать волокна азбесту
товщиною в десяті частки мікрометра, які втримують частки.
Пористі матеріали виготовляють із полівінілового спирту,
металів, кераміки, ацетилцелюлози. Фільтруючі матеріали цього
типу використовуються у вигляді пластин або циліндричних
патронів, мають великий термін служби (1,5-2 роки), добре
стерилізуються парою. При русі повітря по звивистих порах
відбуваються інерційний, дифузійний і інший види оса джень.
 72

Пластина з пористих матеріалів товщиною 1 см досить міцна й

легко регенерується.
Особливою групою мікропористих матеріалів є фільтри
"Міліпор" (США). Розміри пор фільтрів варіюють від 0,005 до 10
мкм. Для стерилізації повітря найчастіше використовуються
фільтруючі матеріали з порами 0,45-0,80 мкм. Однак, незважаючи
на високі фільтруючі властивості цього матеріалу, він
використовується порівняно мало по економічних міркуваннях,
оскільки це пов'язано з необхідністю подачі стисненого повітря
більш високого тиску.
При порівнянні різних фільтруючих матеріалів доцільно
користуватися критерієм, запропонованим Г. Л. Мотиною і І.А.
Казаковою,

де Р р - опір матеріалу потоку повітря, при якому перестає

забезпечуватися регламентна подача повітря в апарат, Па; Р 0 -
початковий опір матеріалу потоку повітря, Па; К пр - коефіцієнт
проскакування часток аерозолю масляного туману; К ппр -
мінімальна величина коефіцієнта проскакування аерозолю
масляного туману, що може бути визначена; S - пилоємність, кг/м 2 ;
m - маса 1 м 2 фільтруючого матеріалу, кг; (S/m) б - питома
пилоємність базового матеріалу. Звичайно ця величина дорівнює 3;
С - кількість циклів стерилізації парою, що витримується
матеріалом без зміни властивостей; С зад - задана кількість циклів
паростерилізації. Звичайно задається 100.
 73

Для першого, грубого щабля очищення використовуються

матеріали з М ≤ 20, для другого, тонкого щабля очищення - з М >
20.
Конструктивне оформлення процесу фільтруючої
стерилізації повітря залежить від багатьох факторів і в першу чер гу
від виду матеріалу, яким наповнюють фільтр. Конструкція апарата
повинна забезпечувати дві головних вимоги до характеру потоку
газу: перпендикулярність напрямку газу до поверхні мата й рух
газу тільки через шар матеріалу. Перпендикулярність волокон
потоку газу - необхідна умова ефективного осадження. При
паралельному напрямку волокон ефективність зменшується на
порядок. Для того щоб газ, минаючи матеріал для очищення, не
проникав у зазор між матеріалом і корпусом або ущільненням,
величина зазору повинна бути близько 0,002-0.05 мм, тобто
порівнянна з відстанню між волокнами фільтра.
Для насадок з волокнистих матеріалів великої товщини або
неміцних при вигині використовуються фланцеві (касетні) апарати
Ф1 і Ф2; для тонка й гнучких - гільзова (патронна) конструкція (рис
12.3). Для запобігання руху повітря в пристінному шарі фланцевої
конструкції Ф1 кінці матеріалу зажимаються у фігурних фланцях,
які вільно переміщаються в корпусі й стягаються болтами. Однак
навіть при більших зусиллях стиску деяка кількість повітря
проникає через верхні диски матеріалу в зазори між фланцями,
корпусом і болтами. Ці недоліки усунуті в конструкції Ф2. де
фланці з текстоліту або металу монолітно установлені в корпусі
фільтра.
 74

а, б – фланцеві фільтри Ф1, Ф2; в – патронний фільтр П

Рисунок 12.3 - Схема аерозольних фільтрів, виготовлених із
волокнистих матеріалів

У кожній фільтруючій касеті з листового металу укладений

диск із волокнистого матеріалу, затиснутий між сітками й
відділений від фланців гумовими прокладками. Лобову сторону
першої касети покривають шаром скловолокна й склотканини для
захисту від ушкоджуючої дії великих часток окалини, що
утвориться в паропроводі. У цих фільтрах грубе віскозне волокно
(d B=l7 мкм) у матах з високооб’ємного нетканинного фільтруючого
матеріалу (ВНФМ) комбінується із трьома шарами ефективно
фільтруючої, але неміцного паперу "Біоцел", поміщеного в кожній
касеті між двома матами ВНФМ.
На підприємствах біотехнологічної промисловості в якості
індивідуальних фільтрів до ферментаторів використовують фільтри
тонкого очищення типу ФТО (табл. 12.1), усередині яких
укладається елемент із гофрованої тканини Петрянова.
 75

Таблиця 12.1 - Фільтри тонкого очищення типу ФТО

темпера-тура,ºС

Фільтру-ючий
Витриму-єма
Тип фільтру

Продуктив-

фільтрації,

повітря,Па

проскоку,
Коефіцієнт
поверхні

матеріал
потоку
Площа
м 3 /год
ність,

Опір
м2

%
ФТО-1000 1000 10 800 0,0010 140 ФПАН
ФТО-750 750 10 400 0,0001 60 ФПП-15
ФТО-500 500 5 800 0,0010 140 ФПАН
ФТО-60 60 1 470-600 0,0010 140 ФПАН

Фірма "Балстон" (Великобританія) випускає фільтри для

повітря у вигляді трубок товщиною 3 мм із мікроволокон
боросилікатного скла, зв'язаних епоксигумою і володіючих
високою пропускною здатністю. Фільтруючий матеріал стійкий до
дії багатьох кислот, аміаку, хлору, води, витримує температуру до
200°С и обробку гострою парою. При заміні фільтра міняються
тільки фільтруючі трубки.
У Японії для тонкого очищення повітря використовують
фільтри "Эко". Фільтруючий шар кожного аркуша має товщину 2,5
мм. Ці фільтри працюють у комплексі з підготовчими фільтрами з
волокнистих матеріалів або бавовняної вати. Фільтри "Эко" можуть
витримувати до 50 стерилізацій і забезпечують ступінь
уловлювання більше 99,9999%. Вони випускаються з більшим
діапазоном продуктивності - від 0,6 м 3 (фільтр 68-А) до 4 080 м 3
(фільтр 68- Н) повітря в годину.
Очищення відпрацьованого повітря. Система очищення
повітря, що відходить, впроваджена у виробництво порівняно
недавно. У цей час доведено, що з ферментаторів разом з повітрям,
в атмосферу викидається до 10 10 -10 11 клітин мікроорганізмів і спор
в 1 м 3 , що неприпустимо з погляду охорони навколишнього
 76

середовища. Засміченість повітря при поверхневому способі

культивації, особливо на стадії спороутворення, ще більше.
Очищення повітря, що відходить, ускладнюється тим, що він має
дуже високу відносну вологість (до 25 г вологи на 1 м 3 ), і звичайні
фільтри тонкого очищення швидко виходять із ладу.
Експериментально доведено, що якщо з повітря, що
відходить, конденсувати воду, то разом з нею віддаляється 99 %
мікроорганізмів.
Для очищення вихідного повітря можна використовувати
волого- і термостійкі фільтри. Доцільно використовувати для
очищення повітря, що відходить, парні фільтри, із яких один
регенерується, другий працює, а в цілому система працює
безупинно.
Підготовка повітря для аерації виробничих приміщень.
Стерильні виробничі приміщення аеруються стерильним повітрям,
кондиційованим за температурою й вологістю.
Якісно підготовка повітря в цих умовах нічим не відрізняється
від підготовки повітря для аерації зростаючої культури. Відмінність
може полягати лише в параметрах кондиціювання, але не в
зниженні вимог до стерильності повітря. Стерильні приміщення
повинні мати повітряні шлюзи, приміщення для зберігання
захисного стерильного спецодягу. Стіни, підлоги н стелі приміщень
повинні бути вологонепроникні й придатні для мийки і обробки
дезінфікуючими речовинами. Для забезпечення постійної
стерилізації повітря, наприклад, у боксах широко застосовується
ультрафіолетове опромінення, а також вентиляція їх стерильн им
повітрям.
Система аерації виробничих приміщень із метою створення
нормальних умов для роботи обслуговуючого персоналу менш
 77

складна в технічному відношенні, тому що вимоги до забрудненості

повітря тут менш жорсткі. Кратність обміну повітря рівняється 5-
12. Подаване у виробничі приміщення повітря повинне мати
вологість близько 60 % і кімнатну температуру. Сухе повітря
викликає подразнення слизуватих, збільшує сприйнятливість
організму до інфекції, але разом з тим має високу здатність
видаляти вологу, що виділяється. При розрахунку вентиляції
виробничих приміщень передбачається рециркуляція повітря.
Осушення повітря здійснюється шляхом пропущення його через
шар зернистого осушувача, колону з насадкою чи розпилювач із
рідиною, що володіє високою спорідненістю до води. До твердих
осушувачів ставляться силікагель із зернами величиною 1 -4 мм,
активований глинозем, безводний сульфат кальцію й деякі інші
матеріали. З рідин, що володіють високою спорідненістю до води,
можна відзначити гліколі (гліцерин, ди- і триетиленгліколь) і
концентровані розчини солей.

Контрольні питання до теми Т12

1. Назвіть способи очищення й стерилізації повітря.
2. Апаратурне оформлення стадії підготовки й очищення повітря.
3. Як відбувається очищення відпрацьованого повітря?
4. Конструктивне оформлення процесу фільтруючої стерилізації
повітря.

Тема Т13. Виробниче культивування мікроорганізмів.

Поверхневе та глибинне культивування.

Культивування мікроорганізмів-продуцентів біологічно-

активних речовин можна вести поверхневим і глибинним способами.
Поверхневим способом можна виростити тільки аеробну культуру
 78

мікроорганізмів в основному на твердому сипучому поживному

середовищі.
Глибинним методом вирощують мікроорганізми в рідкому
поживному середовищі, цим методом можна виростити як аеробні, так
й анаеробні мікроорганізми. Переважна більшість продуцентів
ферментів - аероби, тому при глибинному культивуванні, як і при
поверхневому, застосовують примусову аерацію зростаючої культури
мікроорганізму.

13.1 Поверхневе культивування мікроорганізмів

Процес культивування продуцента починається з моменту

засівання охолодженого стерильного поживного середовища
посівним матеріалом. Засівання середовища при періодичній
стерилізації звичайно проводиться безпосередньо в стерилізаторі в
охолоджене середовище при постійному перемішуванні. При
безперервній стерилізації середовище засівають у відсіку
стерилізатора, де воно охолоджується, а засіяне середовище передають
у цех вирощування.
Поверхневе культивування мікроорганізмів може проводитися
різними способами. Традиційним є кюветний спосіб, що вимагає
застосування ручної праці й величезних виробничих площ. Більш
новим методом є вирощування продуцентів у механізованих установках.
Кюветний спосіб вирощування. Елементарною ланкою для
вирощування є кювету — ємність чотирикутної форми площею 0,25-
0,50 м2 і висотою 20-50 мм. Вона виготовляється з листа металу з
перфорованим дном і рідше - із суцільного листа. Кювети бувають
відкриті й із кришками. Найбільше поширення одержали відкриті
кювети з оцинкованого заліза з перфорованим днищем. Перфорація
 79

виконується у вигляді довгастих вузьких щілин довжиною 20 мм і

шириною 1,5-2 мм, розташованих або в шаховому порядку, або підряд
із зазором між отворами 3-5 мм і відстанню між рядами 10 мм.
Кювети заповнюють зволоженим засіяним поживним
середовищем шаром 2-2,5 см і транспортують у ростові камери, де
кювети розташовуються на багатоярусних рухливих етажерках або
стаціонарних стелажах з відстанню між ярусами 10-11 см. Звичайно в
стелажах й етажерках улаштовано 18 ярусів при загальній висоті не
більше 2 м. Перша кювета встановлюється на висоті 20-25 см
від підлоги. Етажерки й стелажі повинні виконуватися з металу з
антикорозійним покриттям. Перед завантаженням кювет камеру
миють і дезінфікують формаліном, який потім видаляється з камери
при аерації й обробці аміаком. Камери бувають різного типу й форми.
Вони можуть використатися з максимальним заповненням простору й
мати висоту 2,2 м, або з більш вільним заповненням, коли висота стель
може бути 3 м і більше. Камера може заповнюватися кюветами
суцільно, наприклад, на пересувних стелажах-етажерках, або кювети
можуть розташовуватися на стаціонарних стелажах, коли між
стелажами передбачається вільний прохід. Найчастіше камера має
форму довгого вузького коридору із дверима в торцях. Безпосередньо
над камерою розташовується відділення кондиціонування й очищення
повітря.
Камери всіх типів працюють за графіком: завантаження;
культивування (звичайно становить від 20 до 72 г о д ) ; підсушування
культури на кюветах сухим, підігрітим до 40-45 °С (φ =25-30%)
повітрям протягом 3-4 год; вивантаження; збирання й мийка камери;
обробка формаліном, аміаком і парою (3 год) і провітрювання камери
(близько 3 год). Повний технологічний цикл у камері з урахуванням
 80

тривалості росту продуцента звичайно становить від 36 до 90 год і

залежить від виду продуцента.
Ростові камери розташовують так, щоб у них можна було вести
вирощування культури з дотриманням всіх правил асептики. Кожна
камера має два виходи. З однієї сторони камера з'єднана зі стерильним
коридором, з якого в камери завантажують кювети з тільки що засіяним
середовищем, а з іншої примикає до розвантажувального коридору, по
якому з камер транспортують кювети з готовою культурою.
Використання кювет у виробництві ферментів пов'язане з витратою
великої кількості ручної праці, тому що майже всі операції на стадії
культивування виконуються вручну. І хоча одержання культури
продуцента технологічно порівняно просто, її собівартість досить
висока.
Вирощування в механізованих установках. Основні труднощі при
створенні механізованих ліній полягають у тім, що шар поживного
середовища повинен добре аерируватися, не спресовуватися й не
підсушуватися. Механізована установка повинна бути влаштована так,
щоб можна було без зупинки лінії у випадку виникнення інфекції
провести стерилізацію й негайне вивантаження зараженого
середовища. До механізованих ростових установок відносяться лінії
Джеффриса, Христенсена, Андеркофлера, установки фірми
«Валерштейн», конструкції ВНДІФСа, ВНДІбіотехніки й ряд інших.
В установці Джеффриса здійснюється механізоване завантаження
засіяного середовища в кювети, які переміщаються по транспортері й за
допомогою спеціального пристрою передаються на підвісну етажерку.
Завантажена етажерка по монорейці входить у ростовий коридор, де
створюються необхідні умови, і зі швидкістю залежно від тривалості
культивування продуцента переміщається до іншого кінця коридору.
Готова культура при виході з ростового коридору автоматично
 81

розвантажується, і цикл повторюється. В установці Христенсена

процес вирощування здійснюється безупинно з допомогою скребкового
транспортера, культивація завершується в ростовій камері барабанного
типу. Але ці установки мають істотний недолік: у випадку інфікування
необхідна повна зупинка процесу й стерилізація всієї лінії.
Більш надійні механізована установка, напівмеханізована
установка Андеркофлера й установка фірми «Валерштейн», де
передбачається циклічна робота апаратів з обов'язковою
стерилізацією всього встаткування після кожного циклу
вирощування. Механізована установка для вирощування поверхневої
культури, володіє порівняно невеликою продуктивністю (0,4 т/добу),
являє собою камеру, у якій розміщений багатоярусний ланцюговий
транспортер з підвішеними до нього лотками. При русі транспортера
лотки заповнюються доти, поки перший заповнений лоток не дійде до
останньої позиції нижньої стрічки транспортера. Потім камера
підключається до кондиціонера, рух транспортера припиняється до
кінця культивування. Коли ріст закінчений, включають транспортер,
лотки по черзі перекидаються, культура потрапляє в бункер. Після
розвантаження камера й лотки миються, стерилізуються, і цикл
повторюється.
Механізована установка Андеркофлера має більшу
продуктивність - до 10 т/добу. Ростова камера являє собою вузький
довгий коридор, до стін якого від стелі до підлоги прикріплені
відкидні полки. Стіни камери із зовнішньої сторони безпосередньо
контактують із повітроводами кондиціонера. Повітря надходить
через перфорації уздовж коридору по всій висоті камери з однієї
сторони й забирається з іншої. Полки, починаючи знизу, по черзі
повертаються горизонтально й автоматично завантажуються. По
закінченні росту культури вона розвантажується з полиць при їхньому
 82

послідовному опусканні, починаючи з нижньої. Культура

накопичується на дні камери, звідки транспортується в сушарку. Після
закінчення циклу передбачаються мийка й стерилізація камери.
Інтерес представляє механізована ростильна установка фірми
«Валерштейн» (США) барабанного типу діаметром 2,1 м і довжиною
5,2 м. Усередині барабана розташована рама для розподілу середовища.
У барабан завантажується середовище (до 200 кг), і він обертається зі
швидкістю 100 хв-1. Повітря вводиться по осі барабана (до 20 000
м3/год) з високою відносною вологістю. Обертання барабана сприяє
перемішуванню, аерації середовища, покращенню тепло- і масообміну,
завдяки чому можливо культивувати продуцент у шарі середовища до
200 мм і більше.
Установка конструкції ВНДІФСа для вирощування культури у
вертикальних кюветах має продуктивність 1,5 т/добу.
Простерилізована засіяна дерть за допомогою спеціального
розподільного пристрою завантажується на вібраційному столі в
ростильну камеру й по рейковому шляху подаються в ростове
відділення. На спеціальних траверсних візках ростильні камери
підводять до повітряних дифузорів. Останні підключені до
кондиціонерів, які можуть подавати повітря до зростаючої культури
по різних режимах залежно від фази росту культури. Аерацію
культури здійснюють через вертикальні канали між кюветами, через
перфоровані стінки кювет. Повітря переміщається уздовж кювет.
Кондиціонери працюють із рециркуляцією повітря, підсмоктування
свіжого повітря становить 10%. Відпрацьоване повітря перед
видаленням очищається від мікрофлори й пилу. Культура в
ростильній камері практично не підсихає, навіть спостерігається її
додаткове зволоження вологою, виділюваної мікроорганізмом у
процесі росту. Схематично растильна камера являє собою ящик
 83

прямокутної форми з алюмінієвого сплаву. Перфоровані перегородки

із круглими отворами діаметром 3 мм і кроком 40 мм утворять
усередині ящика вертикальні кювети. Просвіти між кюветами
виконують роль повітряних щілинних каналів. Кювети можуть
відкриватися знизу й зверху. При росту культури міцелій найбільше
інтенсивно розвивається біля отворів у стінках кювет і вростає в
них. Корж готової культури при розвантаженні дуже важко
відокремлюється від кювети, тому вертикальну стінку кювети по
закінченні культивування відсувають, корж звільняється й легко
віддаляється з камери на вібраційному столі для розвантаження.
Коржі, що виходять із ростильної камери, розріжуться ножем, що
переміщається в горизонтальній площині під дном ростильної
камери. Частково здрібнена культура потрапляє в бункер, на дні якого
встановлені горизонтальні транспортуючі шнеки, що подають
культуру до поперечного шнека. Із приймача культура надходить по
похилому редлеру в сушарку, де висушується до вологості 10-12 %,
потім на фасування й у склад.
Звільнена від культури ростова камера по рейковому шляху
подається в мийну камеру, постачену форсунками, які подають
потужні струмені води. Ростильна камера миється й потім
стерилізується в спеціальної стерилізаційній камері. Чиста
простерилізована ростова камера подається в стерилізаційне
відділення на вібраційний завантажувальний стіл, і цикл
повторюється. Місткість кожної камери становить 500 кг по сухій
дерті.
Переваги цієї установки полягають у повній механізації процесу
вирощування, в ізолюванні ростових камер, що дозволяє якщо буде
потреба ізолювати вогнище інфекції й провести повну послідовну
 84

стерилізацію всіх камер, що не можна зробити в безперервно діючих

установках.
Механізована установка для вирощування культури
мікроорганізму в товстому шарі середовища конструкції
ВНДІбіотехніки. Складність вирощування в товстому шарі пов'язана з
тим, що відбувається перегрів внутрішніх шарів у результаті
інтенсивного тепловиділення й аерація культури сильно утруднена.
При вирощуванні культур у закритому герметичному апараті рух газу
відбувається не уздовж поверхні шару середовища, а поширюється на
весь об’єм. Виникає режим об'ємної аерації, здатний забезпечити
конвективний і дифузійний тепломасообмін по всій висоті шару
зростаючої культури, що дозволяє в 10 і більше раз збільшувати
висоту шару середовища (до 300 мм). Апарат являє собою
вертикальний циліндр, розділений на секції перфорованими
пластинами, укріпленими консольно на поворотних осях. Усередині
апарата розташовані пристрої, що перемішують, для періодичного
перемішування, що забезпечують рівномірність висоти шару й
виключають утворення застійних зон середовища усередині кожної
секції. Таким чином, у шарі підтримується задане повітророзділення.
Верхня частина апарата герметично з'єднана зі стерилізатором.
Стерильне повітря для аерації надходить у кожну секцію під
перфоровані пластини із заданими температурою й об’ємом і перед
виходом в атмосферу піддається бактеріальному очищенню.
Відвід біологічного тепла, виділюваного в процесі активного
росту, здійснюється повітрям. Для цієї ж мети встановлені сорочки.
Інтенсивність перемішування усередині кожної секції може бути
різної відповідно до заданого режиму, розробленим для кожної
культури. Переміщення середовища з вищележачої секції на
нижчележачу виробляється при автоматичному повороті пластини на
 85

90°. Вирощена культура надходить у нижню конічну частину

апарата й стерильно вивантажується в прийомний бункер сушарки
або екстрактора.

а – загальна схема: 1 – поворотне коло; 2 – вібраційний стіл для

завантаження; 3 – стерилізатор камер; 4 – штовхач; 5 – пристрій для миття
камер; 6 – стіл для розвантаження; 7 – коридор з кондиціонерами для вирощування;
8 – транспортер; 9 – ростова камера; 10 – рельсовий шлях; б – ростильна камера; в –
кювета.
Рисунок 13.1 – Установка з вертикальними кюветами
 86

1 – люк для вивантаження; 2 – валик секції; 3 – опора; 4 – колектор підводу

стерильного повітря; 5 – охолоджуючі змієвики; 6 – лопасть вала; 7 – колектор
відводу відпрацьованого повітря; 8 – кришка; 9 – бобика манометра; 10 – штуцер; 11
– повітряник; 12 – шестерня приводу вала; 13 – вал; 14 – люк для завантаження; 15 –
корпус.
Рисунок 13.2 – Апарат для механізованого вирощування
мікроорганізмів у шарі середовища
 87

13.2 Глибинне культивування мікроорганізмів

Цей спосіб має ряд очевидних переваг перед поверхневим, тому що

дозволяє значно скоротити виробничі площі, виключити важку
непродуктивну ручну працю, поліпшити гігієну праці, спрощує
механізацію й автоматизацію виробництва, уможливлює перехід на
безперервний спосіб культивування. При глибинному способі
культивування більш раціонально використаються живильні речовини
середовищ, що дає можливість значно скоротити відходи виробництва у
вигляді нерозчинних осадів твердого поживного середовища,
одержувати препарати з меншим вмістом домішок і більшою питомою
активністю.
Глибинне культивування проводять у вертикальних ємностях
різного розміру, називаних ферментаторами. Основна вимога до
ферментатору - можливість проведення процесу культивування
продуцента в асептичних умовах при інтенсивній аерації середовища. У
процесі культивування доводиться мати справу зі складною
трифазною системою рідина - тверда суспензія - газ. У такій системі
утруднені масообміні процеси, і тому ускладнюється апаратурне
оформлення всієї стадії вирощування.
Існуючі промислові ферментатори за способом підведення енергії
на аерацію й перемішування можна підрозділити на три групи:
апарати з механічним перемішуванням і барботажем (комбіновані); з
ежекційною системою аерації (підведення енергії до рідкої фази) і
барботажні (підведення енергії до газової фази). Для ферментної
промисловості найбільший інтерес представляє перша група апаратів,
призначена для асептичних процесів. Ці апарати в основному мають
циліндричну форму й відрізняються за об’ємом, конструкцією
відбійників, перемішуючих пристроїв, ущільнень обертового вала й
 88

теплообмінних пристроїв. Максимальний об’єм ферментаторів з

механічним перемішуванням і піногасінням становить 2 000 м3.
З вітчизняних апаратів найбільш широко використовуються
герметизовані ферментатори місткістю 50 м 3 і 100 м 3 з механічним
перемішуванням і барботажем повітря. Крім цих двох ферментаторів
на багатьох ферментних підприємствах працюють апарати
місткістю 63 м3 виробництва Німеччини.

1 – привод, 2 – корпус; 3 – муфта; 4 – барботер; 5 – крильчатка; 6 – змієвик; 7 –

турбіна; 8 – вал; 9 – труба для видалення рідини з ферментатора під надлишковим
тиском.
Рисунок 13.3 – Ферментатор барботажного типу з перемішуючим
пристроєм, об’ємом 100 м3
 89

1 – електродвигун; 2 – редуктор; 3,10 – муфти; 4 – підшипник; 5 – сальник; 6–

вал; 7 – корпус; 8 – турбінна мішалка; 9 – змієвик; 11 – труба для підводу повітря; 12
– лопастна мішалка; 13 – барботер; 14 – гвинтова мішалка; 15 – опорний підшипник;
16 – штуцер для спуску; 17 – рубашка; 18 – люк для завантаження; 19 – повітряний
патрубок.
Рисунок 13.4 – Ферментатор об’ємом 63 м3

Апарати розраховані для роботи під надлишковим тиском 0,25

МПа й стерилізації при температурі 130—140 °С. Щоб уникнути
інфікування культури передбачені торцеві ущільнення вала мішалки з
паровим захистом. Торцеві ущільнення дозволяють практично повністю
запобігти витоку середовища або влучення повітря в порожнину апарата
в місці виходу з нього вала, що дуже важливо для забезпечення
асептичних умов процесу.
Важливим фактором з погляду асептики процесу культивування
продуцента є правильна обв'язка ферментатора. Під обв'язкою мають
 90

на увазі підведення всіх комунікацій з урахуванням можливості

стерилізації гострою парою ділянок, які можуть виявитися
джерелом зараження.
Аналіз монтажних схем, скрупульозно проведений В. Є.
Матвєєвим, показує, що вони звичайно складаються з типових
елементів. Розглянемо одну з монтажних схем з нижнім спуском
середовища, застосовуваних у всіляких мікробіологічних виробництвах
(рис. 13.5). Її характерною рисою є встановлення термічних затворів 3 й
5 для попередження проникнення сторонньої мікрофлори в апарат по
комунікаціях через нещільності в ущільненнях «сідло - клапан»
запірних арматур. У матеріальні трубопроводи, безпосередньо з'єднані
із внутрішньою порожниною апарата, постійно подається пара, а
пароконденсатна суміш, що утвориться, видаляється в каналізацію або
спеціальний пристрій (при наявності відкритих трубних закінчень). Як
показує досвід мікробіологічних виробництв такі термічні затвори
забезпечують досить ефективний захист апаратів і комунікацій від
інфікування.
У монтажних схемах повинен передбачатися вільний доступ
пари в усі точки стерилізуємих внутрішніх порожнин апаратів,
трубопроводів і запірних арматур, що забезпечує досягнення й
підтримку необхідної температури стерилізації. Однак на практиці
часто те саме монтажне оформлення комунікацій і запірної арматур
різного діаметра не забезпечує рівного ефекту стерилізації. Наприклад,
у запірних арматурах і штуцерах малого діаметра необхідного
ступеня стерильності досягти сутужніше. Ще більші труднощі
виникають при термічній стерилізації відкритих трубних закінчень
(пробник 4, штуцер для введення посівного матеріалу 1, трубопровід
для видалення технологічного повітря 2 (рис. 13.5)).
 91

Рисунок 13.5 – Монтажна схема ферментатора з нижнім спуском

середовища
Відкриті трубні закінчення комунікацій і вузлів монтажних схем
не дозволяють створити в них тиск, необхідний для ефективної
стерилізації. Використання гумових шлангів для підключення сулій і
колб із посівним матеріалом, пробовідбірників й ємностей з рідкими
добавками ще більше утрудняє процес стерилізації.
До відкритих трубних закінчень відносяться й так названі штуцери
для продувки колекторного трубопроводу для стерильного поживного
середовища, з'єднуючі установку безперервної стерилізації поживного
середовища чи апарат періодичної дії з ферментаторами. Така схема
комунікації передбачає подачу гострої пари в лінію протягом часу, що
гарантує можливість стерилізації колекторів поживного середовища.
Варто також приділяти велику увагу процесу піноутворення при
культивуванні й пристроям для піногасіння. Всі існуючі і
використовувані у ферментній промисловості ферментатори постачені
спеціальними пристроями для введення піногасника й контролю
 92

висоти піни в апараті. Перекидання піни вкрай небажаний, тому що

при цьому може відбутися намокання повітроочисних фільтрів і
порушення умов герметизації й стерильності процесу.
Схема піногасіння, прийнята в стерильних виробництвах,
представлена иа рис. 13.6 У неї включені датчики 1, 2 й 3 різних
рівнів піни, що працюють або за принципом замикання ланцюга
«датчик — корпус апарата» або при зміні електропровідності піни, або
за принципом зміни електричної ємності між датчиком і корпусом
апарата в момент торкання піни й датчика. При торканні піною
першого датчика через підсилювач П1 включається електромагнітний
клапан СК1, установлений на лінії подачі піногасника з мірника, час
подачі піногасника регулюється реле часу РЧ1.

Рисунок 13.6 – Схема автоматизації піногасіння

По закінченні подачі піногасника включається реле часу РЧ2.

Якщо піна продовжує рости й стикається із другим датчиком, то
через підсилювач П2 виключиться електродвигун мішалки на час,
встановлений РЧ2. Коли мішалка знову починає працювати, РВ2
спрацьовує й повторно включається РВ1. Зв'язок між РВ1 і РВ2
 93

забезпечує подвійне послідовне піногасіння: за допомогою

піногасника й шляхом вимикання мішалки. Якщо піна не
опускається нижче першого датчика, то подача піногасника в
апарат і зупинка електродвигуна мішалки повторюються.
У випадку досягнення піни аварійного датчика 3 через
підсилювач П3 спрацьовує електромагнітний клапан СК2 і
закривається вихід повітря з апарата. Під дією тиску піна руйнується
й, як тільки вона сходить із датчика 3 у результаті стиснення газу
й припинення барботажа, клапан СК2 відкривається, і відновляється
аерація. Але при використанні такого способу варто враховувати
аерофільність продуцента й закладати в програму тільки припустиму
тривалість кисневого голодування.
В останнє десятиліття найбільше економічно вигідний метод
комбінованого хімічного й механічного піногасіння. Для його
автоматичної реалізації може бути використана та ж схема.
У процесі культивування також ведеться постійний контроль за
нагромадженням метаболітів, станом біомаси продуцента, рН
середовища, споживанням деяких складових середовища й т.п. По
закінченні ферментації культуральна рідина подається або
безпосередньо у виробництво, де вона використовується (спиртове,
пивоварне, виробництво глюкози й т.і.), або на відділення рідкої фази
від біомаси й твердих нерозчинних часток середовища з метою
використання фільтрату культуральної рідини. У деяких випадках
біомаса продуцента надходить на одержання ферментних препаратів
різного ступеня очищення.
Контрольні питання до теми Т13
1. Як відбувається поверхневе культивування мікроорганізмів?
2. Як відбувається вирощування мікроорганізмів в механізованих установках.
3. Конструкції ферментерів.
 94

Тема Т14. Одержання посівного матеріалу

Для виробництва посівного матеріалу використовують вихідний

штам продуцентів, одержуваний з лабораторії чистих культур. Для
готування необхідної кількості посівного матеріалу на заводі
організується цех чистої культури, що веде постадійне вирощування
посівного матеріалу в асептичних умовах, які гарантують розвиток
тільки продуцента й повну відсутність інших мікроорганізмів.
Технологія одержання виробничого посівного матеріалу залежить від
виду продуцента й способу його культивування.
Зберігання вихідних штамів продуцентів. Це відповідальне й
важке завдання. Особливі труднощі виникають у випадках, коли
вихідним штамом є мутант, тому що при його тривалому зберіганні не
виключена можливість прояву спонтанної мінливості культури. Для
запобігання цього необхідно періодично проводити розсів культури й
перевірку її однорідності як по морфологічним, так і по фізіологічним
ознакам. При розсіванні з колонії, що дає найкращі показники, роблять
новий розсів в 30-40 пробірок і потім перевіряють на 5-б пробірках
продуктивну здатність відібраної культури.
Жоден із численних способів зберігання живих культур
мікроорганізмів не дає повної гарантії стабільності штаму й збереження
його продуктивності. Найпоширенішим способом підтримки вихідної
культури продуцента є висів мікроорганізмів у пробірки на скошені
агаризовані середовища з оптимальним для кожного штаму складом і
вирощування його до певного віку в оптимальних умовах.
Готову культуру в пробірках поміщають у холодильник і
зберігають при температурі 3-4 °С. Пересівання культур проводять через
певні проміжки часу з таким розрахунком, щоб щонайкраще зберегти
фізіолого-біохімічні властивості штаму. При пересіваннях варто
 95

переносити тільки спори або невеликі шматочки міцелію без поживного

середовища, щоб у свіже живильне не середовище вносити продукти
метаболізму. Для тривалого зберігання деяких штамів доцільно
використовувати бідні цукрами крохмальні середовища.
Більше тривалий час можна зберігати культуру під шаром
вазелінового масла. Для цього доцільно використовувати вазелінове
масло медичного призначення. Воно не повинне містити токсинів і
окислених продуктів. Шар масла повинен бути тільки на 1 см вище
агарового зрізу, інакше можлива загибель культури через недостачу
кисню. Попереднє масло стерилізують при 0,15 МПа протягом 1,5 ч.
Культуру заливають стерильним маслом після того, як вона досягне
повної фізіологічної зрілості. Для цього способу зберігання найкращим
середовищем уважається картопляно-мальтозний агар.
Відомі способи зберігання культур при температурах від -11 до -
14°С. У цих умовах багато культур повністю зберігають активність
протягом 10-16 міс.
Грибні культури успішно зберігають у замороженому стані в
атмосфері рідкого азоту при температурах від -165 до -196 °С.
Мікроскопічні гриби заморожують в 10%-вому водному розчині
гліцерину в запаяних ампулах. Ампули із замороженими культурами
поміщають у контейнер з рідким азотом, де їх зберігають 5 і більше
років.
Перспективним варто визнати спосіб зберігання культур у
ліофілізованому стані. Культуру мікроорганізму вносять у захисне
середовище, у якості якого можна використовувати цукрожелатинове
середовище й ін., поміщають у стерильні ампули, закривають
стерильними ватними тампонами й швидко заморожують при
температурах від -35 до -78°С. Потім ампули переносять у вакуум-
сушильний апарат і висушують при залишковому тиску 13,33-1,33 Па
 96

протягом 25-30 ч. Ліофільно висушені культури можуть зберігатися до

5-6 років, не втрачаючи здатності синтезувати ферменти.
Вихідний штам може зберігатися на зерні або в ґрунті. Для цього
ґрунт стерилізують і вносять у неї культуру продуцента. Штам у таких
умовах може зберігатися довго. При поновленні культури змив із ґрунту
висівають на чашки Петрі. Якщо продуцент зберігають на пшоні, то для
цього пшоно, очищене від домішок, кип'ятять у мінімальній кількості
води (0,8 л на 1 кг пшона), розпарюють 30 хв, потім розбирають і
видаляють грудки, що утворилися, а остигле пшоно по 15-16 г
засипають у стерильні флакони місткістю 250 мл, які потім стерилізують
при 0,1 МПа протягом 40 хв. На стерильне розпарене пшоно засівають 2
мл густої суспензії конідій або 3 мл дводобових вегетативних міцеліїв,
вирощених в колбах на качалках. Культуру продуцента вирощують при
періодичному струшуванні при температурі 25-30° С. Зрілу культуру
висушують до вологості 7-8% у вакуумі при 25 °С на протязі 60-70 год і
в такому вигляді зберігають від 1 до 3-5 років.
Підготовка посівного матеріалу для поверхневого культивування.
Цей спосіб застосовують в основному для культивування
мікроскопічних грибів. Посівний матеріал у цьому випадку може бути
приготовлений двох видів: у вигляді культури, вирощеної на твердому
живильному , середовищі й міцеліальної маси продуцента, вирощеної на
рідкому середовищу глибинним способом. Незалежно від виду
посівного матеріалу послідовність операцій однакова: 1) готування
поживного середовища; 2) стерилізація поживного середовища й з
апаратури; 3) охолодження середовища з дотриманням правил асептики
до температури росту культури; 4) засівання середовища вихідним
штамом продуцента; 5) вирощування культури продуцента до певного
віку; 6) консервування посівного матеріалу.
 97

Готування поживного середовища зводиться до точного

дозування окремих компонентів середовища і їхньому змішуванню в
певній послідовності. Цей процес можна вести в спеціальній ємності -
змішувачі або ж в апарату, призначеному для стерилізації. Умови
стерилізації залежать від складу середовища і його стану. Всю апаратуру
й комунікації стерилізують гострою парою при надлишковому тиску
0,15-0,35 МПа. Прохолоджувати середовище можна стерильним
холодним повітрям або холодною водою через глухі поверхні
теплообміну. Засівання середовища ведуть водною суспензією
продуцента з дотриманням правил асептики.
Вирощування проводиться в спеціальному цеху. Готовий посівний
матеріал консервують або висушуванням, або зберіганням при низьких
температурах. Строки зберігання встановлюються для кожного
продуцента експериментально.
Посівну культуру на твердому живильному середовищі готують,
вирощуючи мікроорганізми в зростаючій кількості в три або чотири
етапи. Склад поживного середовища визначається властивостями
мікроорганізму - продуцента. Найчастіше для цієї мети використовують
зволожену пшеничну дерть. Іноді до середовища додають солодові
ростки, тирсу, буряковий жом. Залежно від продуцента вологість
середовища після стерилізації становить 45-56 %.
Вихідну музейну культуру продуцента на твердому агаризованому
середовищі пересівають для відновлення спочатку на 1 -1,5 г зволоженої
стерильної дерті у пробірку (рис. 14.1). Пробірку поміщують у термостат
і вирощують культуру при оптимальній температурі до рясного
конідієутворення. Вміст пробірки переносять в 3-4 колби місткістю 0,75-
1 л, що містять 40-100 г пухкого вологого стерильного середовища, і
вирощують продуцент за тих самих умов.
 98

Підготовлений у колбах у достатній кількості посівний матеріал

використовують для засіву поживного середовища, яке попередньо
стерилізують у біксах при 0,15 МПа протягом 60 хв. Засіяне середовище
розміщається на стерильних кюветах. Звичайно посівні кювети мають
прямокутну форму, виконуються з оцинкованого неперфорованого
заліза і постачені кришками, які мають одне чи два отвори, що
закриваються ватно-марлевими серветками. Трьох колб посівної
культури досить для засіву 20-25 кювет. Засіяне середовище
розкладають у посівні кювети шаром 0,8-1,2 см; між кюветою і кришкою
прокладають шар непроклеєного паперу для запобігання можливої
конденсації вологи на кришці й створення зон зайвого зволоження
зростаючої культури.
Закриті кювети із середовищем поміщають у спеціальні ростові
камери для посівної культури на стаціонарні стелажі або етажерки.
У камері підтримують певну вологість і температурний режим,
оптимальні для вирощуваного штаму й забезпечуючі рясне
конідієутворення. Камери заповнюють кюветами з розрахунку не більше
1-2 кг засіяного середовища (по сухій масі) на 1м 3 об’єму камери,
повітрообмін у такій камері повинен бути 2-3м3/(м3·год).
Готовий посівний матеріал знімають із кювет за допомогою
ручного маніпулятора й у вологому стані поміщають у стерильні пакети,
які поміщають на зберігання в камеру з температурою не вище 4°С до
закінчення його мікробіологічної й біохімічної перевірки. Тривалість
зберігання посівного матеріалу не повинна перевищувати 5-6 днів, тому
що волога культура навіть при низькій температурі поступово стає
малопридатною для одержання активної виробничої культури.
Приготовлена вищеописаним способом посівна культура повинна
містити не менше 0,7 млрд. спор в 1 гр. Схожість спор повинна бути 86-
90%. Посівний матеріал не повинен містити сторонньої мікрофлори.
 99

1 – вихідна культура продуцента в пробірках; 2 - культура в колбах на дерті;

3– культура на дерті в банці Протод’яконова; 4 – ємність для підігрівання води; 5 –
стерилізатор; 6 – ємність для зберігання дерті; 7 – дозатор; 8 – бікс з дертю; 9 –
автоклав; 10 – бікс зі стерильною дертю; 11 – ватно-марлева салфетка; 12 - кришка
для кювети; 13 – кювета на завантаженні; 14 – стіл; 15 – завантажена кювета; 16 –
ростова камера; 17 – стелажі; 18 – викид повітря із калорифера в атмосферу; 19 –
фільтри для повітря; 20 – вентилятор, 21 – калорифер; 22 – відбійники; 23 – ручний
маніпулятор для розвантаження кювет; 24 – готова посівна культура; 25 –
стерильний флакон; 26 – брудна кювета; 27 – ванна для миття кювет; 28 – сушка
кювет; 29 – шафа для стерилізації кювет; 30 – стерильна кювета; 31 – прохолодна
кімната; 32 – ємність для стерилізації і охолодження води; 33 – ємність для
поверхнево-активної речовини; 34 – дозатор; 35 – ємність для приготування посівної
суспензії; 36 – насос.
Рисунок 14.1- Технологічна схема отримання посівної культури
для поверхневого культивування

Якщо посівний матеріал задовольняє всім вимогам, його

передають із холодного приміщення у відділення готування посівної
суспензії. Посівний матеріал змішують у спеціальній посудині зі
стерильною водою й невеликою кількістю поверхнево-активної
речовини для підвищення змочуваності спор. Така суспензія і є готовим
посівним матеріалом.
 100

Використання міцеліальної маси мікроскопічних грибів в якості

посівного матеріалу при глибинному методі культивування відомо
давно, однак застосування його як посівного матеріалу при
поверхневому способі культивування стало поширюватися тільки в
останні 20 років.
Принципова технологічна схема одержання посівного матеріалу
глибинним способом у вигляді міцеліальної маси показана на рис. 14.2.

1 – вихідна культура продуцента в пробірках; 2 – культура в колбі на

твердому сусло-ростковому середовищі; 3 – культура на дерті в колбі; 4 – ємність
для одержання глибинної культури; 5 – качалка; 6 – прохолодна кімната; 7 –
інокулятор; 8 – фільтри для очистки повітря.
Рисунок 14.2 - Технологічна схема отримання міцеліальної маси
продуцента

Вихідна культура продуцента із пробірки пересівається в колбу

місткістю 0,5-0,75 л з 25-40 мл агаризованого середовища, культура
рівномірним тонким шаром розподіляється по внутрішній поверхні
колби обертовим рухом. Культивування продуцента ведуть поверхневим
 101

способом до рясного конідієутворення. З колби конідії продуцента разом

з міцелієм, не порушуючи цілісності агаризованого середовища,
змивають 100-150 мл стерильної води й засівають нею 15-20 колб
місткістю 0,5-0,75 л зі зволоженою дертю, на яких ведеться
вирощування до рясного конідієутворення. Одна колба з культурою на
дерті використовується для готування посівної суспензії й засіву двох
посудин місткістю 8-10 л (коефіцієнт заповнення 0,3-0,4). У якості
основного поживного середовища частіше всього використовується
сусло-росткове середовище, що складається з 3 частин солодкого
солодового сусла з концентрацією сухої речовини 8 % і 1 частини
витяжки із солодових ростків, отриманої при настоюванні паростків в 5
частинах води при 18-20 °С на протязі 1 год. Посудини з рідким
поживним середовищем поміщають на кругову качалку із частотою
обертання 200-220 хв-1. Температура й тривалість культивування
вибираються оптимальні для даного продуцента.
Цей спосіб зручний тільки при невеликій продуктивності заводу
або цеху - до 3-6 т готової культури в добу. При більшій продуктивності
підприємства доцільно одержувати посівний матеріал у вигляді
міцеліальних мас не на качалках, а в невеликих ферментаторах
(інокуляторах). Готовим посівним матеріалом звичайно служить молода,
що активно росте культура і перебуває в експонентній фазі розвитку.
Такий спосіб дозволяє в 2,5-3 рази скоротити тривалість готування
посівного матеріалу, значно (в 4-5 разів) зменшити необхідну площу
цеху чистої культури, поліпшити умови праці, а головне - знизити
конідієутворення в готовій виробничій культурі при її поверхневому
вирощуванні.
Підготовка посівного матеріалу для глибинного культивування.
Для засіву виробничого середовища при глибинному способі
культивування посівний матеріал готовлять також глибинним способом.
 102

Вид посівного матеріалу залежить від продуцента: для грибів і

актиноміцетів - це міцеліальна маса, а для бактерій - молода культура зі
спорами.
Етапи одержання посівної культури наступні: 1) відновлення
вихідної культури на агаризованому середовищі; 2) вирощування
культури на рідкому середовищі в колбах на качалці; 3) культивування
продуцента в малому, а потім, якщо потрібно, у великому інокуляторі.
Посівна доза при засіві глибинною культурою порівняно більша - від 1
до 15 %, тому число стадій і обсяг інокуляторів визначаються тільки
продуктивністю підприємства й оптимальною нормою витрати
посівного матеріалу для даного продуцента.
Технологічна схема готування посівного матеріалу для глибинного
культивування наведена на рис. 14.3. Вихідний продуцент із пробірки 1
пересівають на матраци 2 з більшою кількістю агаризованого
середовища. З матраців культуру змивають стерильною водою й у
вигляді суспензії використовують для засіву колб 3. Частіше засівши
ведуть відразу із пробірки в колби. Колби закріплюють на качалці 4, що
струшує рідину в колбах і сприяє розчиненню кисню в середовищі, що
забезпечує нормальні умови життєдіяльності мікроорганізмів. Готову
культуру з колб збирають в одну ємність при дотриманні правил
асептики н переносять у малий інокулятор 5 зі стерильним охолодженим
середовищем. Засів ведуть у полум'ї палаючого смолоскипа через
посівний патрубок інокулятора. У малий інокулятор через
індивідуальний фільтр 6 подається стерильне повітря. Підготовку,
стерилізацію й охолодження поживного середовища здійснюється в
малому інокуляторі. Піногасник стерилізують і прохолоджують у
спеціальній ємності й подають у малий інокулятор у міру потреби.
Для великого інокулятора 7 середовище готують, як правило, у
спеціальних апаратах і подають її в стерильний, охолоджений до 60-70
 103

°С інокулятор. Готову культуру з малого інокулятора передавлюють

стерильним повітрям у великий інокулятор на свіже поживне
середовище.

Рисунок 14. 3 - Технологічна схема отримання глибинної посівної

культури

Культивування на всіх стадіях ведеться при оптимальній

температурі й аерації. Звичайно готовий посівний матеріал відразу ж
передають у виробництво. Якщо ж виникають непередбачені затримки,
то посівний матеріал безпосередньо в інокуляторі прохолоджують до 8-
10 °С, але зберігають не більше 3-4 год, інакше його якість може різко
погіршитися. Посівний матеріал, отриманий будь-яким способом,
піддається мікробіологічному й біохімічному контролю.
Посівний матеріал уважається активним, якщо він забезпечує
нормальну тривалість культивування на виробничому середовищі й
 104

досягнення максимальної продуктивності за цей строк. Він не повинен

містити сторонньої мікрофлори.
Дозування й вік посівного матеріалу. Цей фактор впливає на хід
культивування й біосинтез ферментів. Внесення великої кількості
посівного матеріалу може, з одного боку, прискорити ріст культури, але,
з іншого боку, у результаті більше рясного спороутворення при
поверхневому способі культивування збільшуються втрати на дихання.
Занижені дози посівного матеріалу приводять до різкого вповільнення
процесу культивування.
У зв'язку із цим для кожного виробничого штаму встановлюється
оптимальне дозування посівного матеріалу. Для забезпечення
нормального розвитку мікроскопічних грибів при поверхневому з
культивування в умовах стерильного середовища й знеплідненого
повітря досить внести 0,02-0,05 % посівний спороутворюючої культури
з титром 106 спор на 1 г. У заводських умовах, де часто неможливо
домогтися повної стерильності виробничих середовищ, посівний
матеріал вносять із розрахунку 0,2-1,0 % до маси сировини, що
переробляється.
При використанні міцеліального посівного матеріалу його витрата
дорівнює 1,5-2,5%. Використання глибинного посівного матеріалу трохи
затягує процес росту виробничої поверхневої культури, але він більше
перспективний, тому що полегшується праця робітників, спрощується
процес одержання стандартної посівної культури й дозволяє скоротити
площі посівних цехів. Дозування глибинної посівної культури залежить
від виду використовуваних мікроорганізмів. Якщо це спорова культура,
то витрата посівного матеріалу залежить від титру посівного матеріалу:
звичайно він становить від 0,2 до 1,0%; для мікроскопічних грибів родів
Aspergіllus, Trіchoderma, Endomycopsіs він становить 1,0-2,5%. Для
 105

продуцентів з ослабленою вегетацією й актиноміцетів посівна доза

зростає до 5-6%, а в деяких випадках - до 15-20 %.
Вік глибинної посівної культури відповідає логарифмічній фазі
росту; звичайно це інтенсивно зростаюча культура у віці 18-24 год.
Оптимальний вік установлюється експериментально для кожної
культури.

Контрольні питання до теми Т14

1. Як зберігаються вихідні штами продуцентів?
2. Як відбувається підготовка посівного матеріалу для поверхневого
культивування?
3. Технологічна схема отримання посівної культури для поверхневого
культивування..
4. Технологічна схема отримання міцеліальної маси продуцента.

Тема Т15. Технологічні схеми одержання культур

мікроорганізмів

Послідовність процесу одержання культури мікроорганізму є

загальної як для поверхневого, так і для глибинного способу
культивування. Вона включає стадії готування посівного матеріалу,
готування поживного середовища її стерилізації, охолодження,
засівання посівним матеріалом і вирощування. Однак залежно від
способу культивування апаратурне оформлення технологічної схеми
істотно розрізняється.
Технологічна схема зображується так, щоб видно був хід
технологічного процесу, на неї наносяться всі матеріальні потоки
продуктів води, пари, повітря й т.д. Устаткування зображується
умовно, але так, щоб були ясні основний принцип роботи даного
апарата і його розмір.
 106

15.1 Технологічна схема поверхневого культивування

Особливостями процесу поверхневого культивування є велика

кількість сипучих компонентів середовища й передача їх по стадіях
виробництва. Тому при поверхневому культивуванні більші площі
виробничого будинку або поруч із ним виділяються цехи зберігання
сировини (висівки, буряковий гніт, солодові ростки, стружки й ін.).
Залежно від виду сировини його запас може бути різний, але не
менше місячного. Сипучі компоненти зберігаються в бункерах і
переміщуються за допомогою пневмотранспорту.
На рис. 15.1 наведена принципова технологічна схема
одержання культур мікроорганізмів при поверхневому культивуванні
кюветним способом. Висівки або інші сипучі компоненти з основного
складу по пневмотранспорту направляються в бункери 1, постачені
перемішувачами 2. Пневмотранспортуюча система подальшої подачі
сировини постачена циклонами 4 для очищення від грубого пилу,
вентилятором 5 і фільтром тонкого очищення повітря 20, що
викидається в атмосферу. З бункера сипучі компоненти по
розподільному шнеку 3 за допомогою пневмотранспорту надходять у
дозуючий пристрій 6, а потім у стерилізатор 7, постачений мішалкою,
паровою сорочкою й лініями підведення стерильного повітря й пари.
По закінченні стерилізації середовище зволожується водою,
стерилізуємої у стерилізаторі 8 й охолоджуваної в теплообміннику 9.
Вода дозується мірником 10. У стерилізатор через мірник 13 і
дозатор 11 подається 9%-вий розчин соляної кислоти й суспензія
посівного матеріалу з ємності 14. Нерозбавлений 37%-вий розчин
соляної кислоти перебуває в мірнику 12.
 107

Засіяне середовище надходить на розкладковий стіл 15 у чисті

стерильні кювети 16. Кювети із середовищем поміщаються на
пересувну етажерку 17 і транспортуються в ростильну камеру 18, де
за допомогою кондиціонерів 19 підтримуються строго певні
температура й відносна вологість повітря. Повітря, що надходить із
атмосфери, подається на фільтри 21 для очищення від грубої суспензії
мікроорганізмів. Очищення повітря, що відходить, від
мікроорганізмів проводяться на фільтрі 20. Готова культура в

Рисунок 15.1 – Принципова схема отримання культури мікроорганізмів поверхневим

способом на твердому середовищі
 108

кюветах 25 транспортується на етажерках-візках 22 до дробарки 30 і

подається по транспортеру в прийомний бункер. Із прийомного
бункера готова культура може бути спрямована на сушіння для
одержання технічного ферментного препарату у вигляді сухої
культури або на подальшу переробку для одержання очищених
ферментних препаратів.
Потім етажерка направляється в камери для мийки 23,
стерилізації 24, а брудна кювета 26 — на мийку 27. Чиста кювета 28
стерилізується в камері 29 і направляється на завантаження. Цикл
повторюється.
Представлена на мал. 15.1 схема може бути істотно видозмінена,
якщо вибрати інший тип стерилізатора, установити механізовану
установку для вирощування або прийняти іншу схему одержання
посівного матеріалу. Прикладом у цьому випадку може служити
технологічна уніфікована схема одержання поверхневої культури з
використанням апаратів з товстим шаром середовища конструкції
ВНДІБіотехніки (рис. 15.2), Однак послідовність і суть технологічного
процесу одержання поверхневої культури залишаються незмінними.

15. 2 Технологічна схема глибинного культивування.

Технологічні схеми глибинного культивування аеробних й

анаеробних мікроорганізмів майже не відрізняються одна від іншої, за
винятком того, що в схемах культивування анаеробних мікроорганізмів
виключається стадія підготовки повітря й використовуються
ферментатори без аеруючих пристроїв і мішалок.
На рис. 15.3 наведена технологічна схема культивування
мікроорганізмів глибинним методом. Сухі компоненти середовища
подаються в складське приміщення заводу по пневмотранспор ту. З
 109

циклона 1 за допомогою трубоконвейера 2 вони надходять у бункери

3, а з них по трубоконвейеру 4 – на автоматичні ваги 5. Якщо
потрібно ввести до складу середовища солі або інші компоненти в
невеликій кількості, то вони надходять у шнек 6, що транспортує
сипучі матеріали в норню 7. З норні компоненти середовища
надходять у змішувач 8 для готування виробничого поживного
середовища. Сюди ж надходять вода й рідкі компоненти через
відповідні дозуючі й мірні пристрої.

1 – прийомний бункер; 2 – дозатор; 3 – циклони; 4, 18 – стерилізатори води; 5

– стерилізатор сировини; 6 – механізована установка для вирощування посівного
матеріалу; 7, 15 – фільтри тонкої очистки; 8 – шлюзові підживлювачі; 9 –
автомат для стерильного фасування посівного матеріалу; 10 – гомогенізатор; 11 –
стерилізатор середовища; 12 – механізована ростильна установка; 13 – газодувки; 14
– фільтри грубої очистки; 16 – калорифери; 17 – зволожувачі повітря; 19 – апарат
для приготування розчинів поживних солей; 20 – збірник культури; 21 –
транспортуючий пристрій; 22 – апарат для сушки і подрібнення; 23 – фільтр
рукавний; 24 – вакуум-насос; 25 – бункер для сухої культури; 26 – бункер
накопичувач; 27 – змішувач-подрібнювач; 28 – бункер для стандартизованого
препарату; 29 – фасовочний автомат.
Рисунок 15.2 - Принципова схема отримання культури
мікроорганізмів поверхневим способом культивації
 110

Для розчинення солей і клейстеризації крохмалю середовище

підігрівають. Підготовлене підігріте середовище за допомогою насоса 30
надходять у нагрівач 22 системи безперервної стерилізації поживного
середовища й потім подається в спіральний теплообмінник 23 для
витримування при температурі 140°С. Стерильне поживне середовище
охолоджується в теплообміннику 24 і направляється в чистий
стерильний ферментатор 25, який заповнюють на 65-75 %
залежно від ступеня піноутворення при рості культури.
Посівний матеріал одержують у посівному відділенні.
Середовище для нього готовлять у спеціальній невеликій ємності 9,
нагрівають, перемішують і насосом 10 направляють в інокулятори
першого 16 і другого 19 щаблів, де проводяться стерилізація,
охолодження й засів середовища. Суспензія вихідної культури
пересівається спочатку в колби на качалці, потім подається в
інокулятор першого щабля 16, вирощується в ньому й повністю
передавлюється в інокулятор другого щабля 19 зі стерильним
охолодженим середовищем. Вирощений посівний матеріал з
інокулятора 19 передається у ферментатор 25. У процесі
культивування проводиться піногасіння Піногасник стерилізують у
спеціальному апараті періодичної дії 12, потім охолоджується й
надходить через мірник 14 у ферментатор.
 111

Рис. 1.23 - Наведена технологічна схема культивування мікроорганізмів глибинним методом

 112

Контрольні питання до теми Т15

1. Технологічна схема поверхневого культивування
2. Технологічна схема глибинного культивування.

Тема Т17. Екстрагування БАР із поверхневих культур

Деякі БАР є водорозчинними, тому найкращим екстрагентом для

них є вода. Для витягу із дріжджів або бактерій необхідно піддати
механічному чи автолітичному руйнуванню їхні клітинні стінки, що
володіють високим дифузійним опором. Оболонки міцеліальних ниток
мають менший дифузійний опір, ніж оболонки бактеріальних і
дріжджових клітин, тому дезінтеграції культури грибів не потрібно.
Екстракцію проводять як з вологих, так і із сухих
поверхневих культур грибів. Суха культура може зберігатися
тривалий час без втрати активності необхідних речовин, і з неї
одержують більш концентровані екстракти. Технологічно це вигідніше,
але при підсушуванні культури мають місце втрати активності, і тому
екстрагування доцільно вести з вологої культури. При екстрагуванні
різні водорозчинні речовини витягаються з культури з неоднаковою
швидкістю, відбувається їхнє часткове фракціонування, питома
активність БАР в екстракті підвищується в 3,5- 4 рази в порівнянні з
вихідною культурою в результаті відділення великої частини речовин
(до 75%) з нерозчинним залишком - біошротом.
На повноту екстрагування з культур впливають багато факторів:
температура, рН, тривалість процесу, конструктивні особливості
екстракційних апаратів, природа речовини, що екстрагується, кількість
відібраного екстракту з одиниці маси завантаженої в апарат культури
й т.д.
 113

Одночасно з БАР екстрагуються багато інших з'єднань, і часто

швидкість витягу баластових речовин більше швидкості екстрагування з
культури цільової речовини. Тому раціональніше піти на деякі втрати
й закінчити екстрагування на оптимальному значенні відношення
активності речовини в екстракті до суми речовин, що витягають. Це
питання вирішується експериментально для кожного виду
продуцента.
Впливати на процес екстрагування за допомогою такого
фактора, як температура, практично неможливо, тому що БАР дуже
термолабільні й інактивуються навіть при 35–40 °С. Крім того,
підвищення температури до 35–40°С спричиняє збільшення змісту
сухої речовини в екстракті й зменшення питомої активності на 1 г
сухої речовини, підвищення небезпеки інфікування екстрактів. Тому
при проведенні екстракції в заводських умовах прагнуть придушити
розвиток мікрофлори шляхом максимального зниження температури
води до 22—25°С і застосуванням антисептиків (формалін, бензол,
толуол, хлороформ й ін.). У більшості випадків ферменти
найбільш повно витягаються при рН 5—7.
Для одержання концентрованих екстрактів при невеликих втратах
БАР з біошротом необхідно застосовувати спеціальні екстракційні
установки. Донедавна для цього широко використалися дифузійні
батареї (рис. 1.28). У них можна одержати екстракт зі вмістом сухої
речовини від 7 до 14 % залежно від виду культури, середовища й
величини відбору екстракту.
Але ці установки для екстрагування ферментів з поверхневої
культури мали порівняно невелику продуктивність, вимагали
більших витрат ручної праці, і в них спостерігалися порівняно
більші втрати активності. Тому зараз розробляються безперервнодіючі
екстракційні апарати. Певний інтерес представляє для ферментної
 114

промисловості екстрактор безперервної дії фірми «Ніро Атомайзер»

(Японія), що працює під надлишковим тиском (рис. 17.1). Екстрактор
являє собою похилу циліндричну ємність, постачену двома шнеками,
теплообмінними сорочками й насосами. Культура через дозуючий
пристрій 5 подається усередину циліндра, а із протилежної сторони
вводиться розчинник. Екстракт виходить із установки через
самоочисний фільтр, а біошрот видаляється із протилежного кінця.
Якщо буде потреба, БАР екстрагуються не повністю, можна
здійснювати двоступінчасте екстрагування, збільшуючи тривалість
процесу. Вторинний екстракт може бути використаний як розчинник
для першого щабля екстрагування. Загальна тривалість екстрагування
регулюється частотою обертання шнеків. Вторинний біошрот
використовується як компонент середовища або після знепліднення в
кормовиробництві.

Рисунок 17.1 – Дифузійна батарея для екстракції БАР з

поверхневої культури

У ферментній промисловості використовуються екстрактори

роторного типу фірми «Роунс Даунс», що складаються з нерухомого
корпуса, усередині якого перебуває ротор, розділений на 16-20
 115

секторних відсіків, які обертаються навколо вертикальної осі. Кожен

відсік має сітчасте дно, на яке подається здрібнена культура гриба.
Ротор повільно обертається й послідовно проходить чотири ділянки, у
кожній з яких культура змочується водою або екстрагентом з
попередніх відсіків, витяжка вакуум-насосом відфільтровується й
подається в наступну ділянку для зволоження свіжої культури, знову
відбирається витяжка й передається в 3-й відсік і т.д.

1 – похилий циліндр; 2 – насос-дозатор; 3,8 – теплообмінники; 4 –

шнек; 5 – дозатор; 6 – привод; 7 – насос; 9 – рубашка.
Рисунок 17.2 – Екстрактор безперервної дії фірми «Ніро
Атомайзер»

При завершенні одного обороту ротора біошрот вивантажується й

відсіки знову завантажуються свіжою культурою.
У цей час спостерігається тенденція повернення до процесу
прес-дифузії. Він полягає в тім, що культура після настоювання з
водою відпресовується, потім знову настоюється при меншій
концентрації ферментів в одержуваному екс-трагенті, знову пресується
 116

й т.д. Імовірно, цей спосіб екстрагування знайде свій подальший

розвиток.

Контрольні питання до теми Т17

1. Які фактори впливають на повноту екстрагування з культур?
2. Установки для екстрагування ферментів з поверхневої культури.
3. Дифузійна батарея для екстракції БАР з поверхневої культури

Тема Т18. Концентрування БАР методом вакуум-випарювання

Екстракти з поверхневих культур мікроорганізмів і

фільтрати глибинної культури є нестабільними при зберіганні. Для
одержання готових форм технічних препаратів їх необхідно
сконцентрувати. Найчастіше для цих цілей у технології
біопрепаратів використовуються методи вакуум-випарювання.
Вакуум-випарювання також застосовується як один з етапів
одержання сухих технічних або очищених препаратів. БАР дуже
чутливі до температури випарювання, тому основною умовою
концентрування їх розчинів є короткочасне ведення процесу при
низьких температурах кипіння, щоб не мала місце інактивація. Варто
враховувати, що чим чистіше розчин, чим менше він містить
супутніх речовин, тим БАР більш чутливі до впливу високих
температур. При концентруванні екстрактів з поверхневих культур
інактивація розчинів значно менше, тому що в екстракті втримується
дуже велика кількість захисних сполук, які перешкоджають інактивації
БАР. При концентруванні фільтратів культуральної рідини
спостерігаються трохи більші втрати, тому культуральну рідину
стабілізують різними сполуками. У процесі концентрування розчинів
БАР відбуваються зміна розчинності багатьох сполук і випадання
 117

їхніх опадів, сумарний вміст сухої речовини в концентраті знижується

на 11-20%, змінюється рН концентрату. В осад випадають мінеральні
солі, деякі органічні речовини й продукти їхнього розпаду,
спостерігається втрата азоту в результаті утворення аміаку.
Більшість БАР термолабільні й потребують м'яких режимів
концентрування. При низьких температурах кипіння (25-30°С)
відбувається помітна інактивація ферментів (до 1 2 % ) , якщо
температура гріючої пари дорівнює 120°С. При температурі теплоносія
90-100°С и температурі кипіння 35-40°С втрати активності не
перевищують 1 0 %. Залежно від виду продуцента культуральна
рідина має різний хімічний склад і містить різний комплекс БАР,
тому теплові режими вакуумвипарювання уточнюються
експериментальним шляхом.
Сумарні втрати активності при вакуум-випарюванні в значній мірі
залежать не тільки від режиму концентрування, але й від конструкції
апарата. Апарати для стадії вакуум-випарювання в останні роки значно
вдосконалені, у десятки разів скорочена тривалість процесу, що привело
до значного зменшення втрат активності ферментів, а також дозволило
трохи посилити температурні режими концентрування розчинів БАР.
Крім трубчастих вакуум-випарних установок з різним розташуванням
трубок (горизонтальним, вертикальним і похилим), з вбудованою й
виносною поверхнею нагріву, з використанням примусової циркуляції
створені нові конструкції плівкових випарних апаратів,
ультравідцентрових вакуум-випарних установок і пластинчастих
випарників. Особливий інтерес представляють ротаційні плівкові
випарні апарати, де випарювана рідина у вигляді плівки рухається по
внутрішній стінці апарата. Лопатки, змонтовані на обертовому роторі,
безупинно направляють рух її зверху вниз. Час проходження рідини
через апарат становить декілька секунд. Фірма «Альфа-Лаваль»
 118

виготовляє вакуум-випарні відцентрові апарати типу «Центритерм».

Вони дуже компактні, час контакту ферментного розчину з
обігрівальною поверхнею гранично скорочене (не більше 1 с), втрати не
перевищують 10%, продуктивність цих установок від 800 до 4800 л/ч.
Створено відцентрову вакуум-випарну установку плівкового
типу продуктивністю 800 л/год по випаруваній волозі. Час контакту
культуральної рідини з теплоносієм не більше 1 с, температура
граючої пари - 60-80ºС. Для збільшення продуктивності можна
змонтувати установку із трьох модулів, кожний з яких працює або
автономно, або послідовно, або перші два модулі працюють
паралельно й з'єднані із третім модулем послідовно. Становить
інтерес для промислової біотехнології відцентрова плівкового типу
вакуум-випарна установка «Єдність» (Югославія) продуктивністю до
200 л/год і з температурою розпарювання 30-40°С. Гарні
технологічні показники мають роторні випарні апарати фірми «Люва»
(Швейцарія), що мають продуктивність по випаруваній волозі від 50 до
200 л/(м2∙ч). Французька фірма APV виготовляє пластинчасті вакуум-
випарні установки продуктивністю до 20 000 л/год.
Не дивлячись на наявність високопродуктивних вакуум-
випарних апаратів повністю усунути недоліки методу вакуум-
випарювання не вдається (втрати активності, випадання опадів і т.д.), і
цей метод усе більше заміняється методом ультрафільтрації.

Контрольні питання до теми Т18

1. Режими концентрування продукту.
2. Сумарні втрати активності при вакуум-випарюванні.
3. Які апарати використовуються для стадії вакуум-випарювання?
 119

Тема Т19. Мембранні методи очищення розчинів БАР

До мембранних методів очищення відносяться діаліз,

електродіаліз, до баромембранних методів - зворотний осмос,
ультрафільтрація, мікрофільтрація й тонка фільтрація.

19.1 Діаліз й електродіаліз

Розділення розчинених речовин методом діалізу засновано на

селективній проникності мембран для сполук із різною
молекулярною масою. Необхідною умовою для проведення діалізу є
створення різниці концентрацій по обидві сторони напівпроникної
мембрани (рис. 19.1, а) Процес діалізу описується рівнянням

де Q — кількість речовини, перенесеного через мембрану за

одиницю часу D d — коефіцієнт діалізу, що залежить від властивостей
мембрани (Dm) i властивостей рідкої плівки, що утвориться на
границі розділу (Dь). Залежність між Dm й Dь можна записати у
вигляді рівняння

S - площа поверхні мембрани; ΔС - різниця концентрації

речовини по обидві сторони мембрани.
Діаліз може бути використаний для очищення розчинів БАР від
низькомолекулярних речовин, таких, як цукри, амінокислоти,
мінеральні солі, ступінь очищення розчинів від цих речовин досягає
60-100%. Діаліз досить ефективний при високому вмісті в розчинах
солей, наприклад після осадження БАР методом висалювання. У цьому
 120

випадку можна використати накладення постійного струму на розчин,

що діалізується, і тоді при двосторонньому електродіалізі аніони
будуть прагнути до аноду, а катіони - до катода. Схематично такий
процес представлений на рис. 19.1, б, коли діалізуємий розчин
поміщений у камеру, обмежену двома напівпроникними
мембранами. Однак електродіаліз не можна застосовувати при
виділенні ферментів, що мають, наприклад, четвертинну структуру,
яка формується за участю іонів металів, а також при виділенні
металоферментів, які, як правило, гублять активність при
електродіалізі.
Процес діалізу протікає дуже повільно, а для очистки від баласту
значних обсягів розчинів потрібна мембрана з великою поверхнею. У
цьому випадку доцільно не збільшувати розміри однієї мембрани, а
розчленувати її на кілька мембран меншого розміру, пропускаючи
розчин ферменту в безперервному потоці послідовно через діалізні
блоки (рис. 19.1, в).

а – проточний діалізатор; б – проточний електродіалізатор; в - безперервний

електродіалізатор.
Рисунок 19.1 – Схема роботи діалізаторів
 121

Для діалізу використовують найрізноманітніші напівпроникні

мембрани. Найбільш доступними є пергамент, армований целофан,
різні марки целофану, що відрізняються друг від друга величиною пор,
а також мембрани, застосовувані в ультрафільтрації і в інших видах
мембранної техніки. Діаліз дозволяє видалити основну масу супутніх
низькомолекулярних домішок і підвищити активність розчинів БАР
у перерахуванні на суху речовину в 5-10 разів.
Однак цей метод має ряд істотних недоліків. По-перше, при
діалізі можлива втрата активності в результаті вимивання іонів
металу чи нестабільності самої речовини. По-друге, при діалізі проти
звичайної водопровідної води може відбуватися втрата активності в
результаті потрапляння з води в розчин БАР іонів металів - інгібіторів
ферменту й т.д. Слід також зазначити, що в процесі діалізу одночасно з
очищенням відбувається сильне розведення розчину БАР через
проникнення води під дією сил прямого осмосу в діалізуємий
розчин, що складно і економічно нерентабельно використовувати у
виробництві. Тому зараз цей метод очистки розчинів від баластових
речовин у біологічній промисловості майже не використовується. Його
іноді застосовують у лабораторних дослідженнях і при одержанні
високоочищених препаратів. На зміну діалізу приходять
баромембранні методи.

19.2 Баромембранні методи очищення розчинів

Ці методи класифікуються по розмірах пор використовуваних

мембран: зворотний осмос (~3-10 -4 мкм); ультрафільтрація (15-10-5
мкм), мікрофільтрація (0,2 мкм) і тонка фільтрація (10 мкм).
Класифікація процесів мембранного поділу розчинів і колоїдних
систем по розмірах затримуваних часток наведена нижче (у см).
 122

Зворотний осмос Від 5∙10-8 до 8∙10-5

Ультрафільтрація Від 3∙10-7 до 1∙10-4
Мікрофільтрація Від 5∙10-6 до 2∙10-3
Фільтрація Більше 2,5∙10-3

Зворотний осмос й ультрафільтрація. Ці методи очищення і

концентрування одержали широке поширення в хімічній,
нафтопереробній, харчовій, фармацевтичній та ферментній
промисловості. Перспективність використання ультрафільтрації в
біотехнології очевидна, оскільки вона дешевше інших методів поділу
розчинів БАР. У табл. 19.1 наведені дані фірми «Амікон корпорейшн»
(США), які підтверджують це.
Таблиця 19.1 - Дані фірми «Амікон корпорейшн» (США) по
використанню ультрафільтрації
Метод розділення Концентрація сухої речовини, %
Вихідна В концентраті Витрати на видалення
1 м3 води, долл.
Центрифугування 1-2 10-15 0,15-0,9
Гель-фільтрація 3-5 Розбавлена 6-30
Сушка:
барабанна 30 100 7,5
розпилювальна 10-20 100 15
ліофільна 10 100 60-90
Осадження 1-2 Різна 1500
етанолом
чи солями
Ультрафільтрація 1-10 10-50 0,15-0,30

Перевагою ультрафільтрації є відсутність теплової інактивації

БАР і невеликі енерговитрати. Ультрафільтрація дозволяє провести
концентрування розчину без фазового перетворення при кімнатній
температурі, а головне, при одночасному звільненні від баластових
речовин (пігментів, азотистих й інших низькомолекулярних сполук).
 123

Процеси ультрафільтрації і зворотного осмосу мають один й той же

механізм, але відрізняються по ряду параметрів. Прямий осмос — це
дифузія молекул розчинника в розчин через напівпроникну мембрану
(рис. 19.2), коли мембрана не пропускає розчинену речовину.
Осмотичний тиск розчину (Р 0) залежить від молярної концентрації
розчиненої речовини і ступеня його дисоціації. Якщо осмотичний тиск
більше гідравлічного р г, то відбувається прямий осмос, якщо
дорівнює гідравлічному (робочому) тиску, то дифузія води через
мембрану припиняється. Якщо рг>Р0, то рівновага порушується й
молекули розчиненої речовини і води будуть проходити через мембрану
в розчинник. Цей механізм спостерігається й при зворотному осмосі, і
при ультрафільтрації. Отже, зворотний осмос і ультрафільтрація - це
перенос молекул через мембрану під тиском вище осмотичного, при
якому розчинник (вода) проходить через мембрану, а розчинена
речовина залежно від його молекулярної маси й величини пор
мембрани частково або повністю затримується. Швидкість
ультрафільтрації буде тим вище, чим більше різниця між робочим
тиском й осмотичним.

Рисунок 19.2 - Схема дифузії молекул при прямому осмосі

Між процесами зворотного осмосу й ультрафільтрації є

розходження. Так, при зворотному осмосі розділення
низькомолекулярних речовин відбувається при робочому тиску до
 124

0,7— 14 МПа, тому що осмотичний тиск Р0 у цих розчинах великий.

При зворотному осмосі використовуються мембрани з дуже
маленькими порами. При ультрафільтрації відбувається поділ високо- і
низькомолекулярних з'єднань, і метою цього процесу є одержання
концентрату високомолекулярних з'єднань (наприклад, ферментів).
Робочий тиск у цьому випадку низький (від 0,07 до 0,7 МПа), тому
що р0 невеликий. Величина пор мембран значно більше.
Однак названі розходження досить умовні. Механізм процесів
зворотного осмосу й ультрафільтрації поки залишається недостатньо
ясним.
Для математичного опису процесу мембранного поділу служить
модель руху грузлого потоку через пори і модель дифузійного
масопереносу. Прийнято вважати, що якщо розмір пор мембрани
менше 3-10 -3 мкм (зворотний осмос), те процес підкоряється закону,
якщо ж розмір пор більше 3-10 -3 мкм (ультрафільтрація), то процес
підкоряється рівнянню.
Мембрани. Робочим елементом ультрафільтраційних установок є
напівпроникна мембрана. Мембрани повинні мати високу проникність
і селективність, бути стійкими до впливу розділюваних розчинів,
механічно міцними, мембрана не повинна піддаватися усадці й
змінювати свої характеристики в процесі зберігання й експлуатації,
повинна мати низьку адсорбцію по відношенню до розділюваних
речовин і невисокою вартістю. За цими показниками кращими
вважаються полімерні мембрани. У процесах ультрафільтрації
використовуються мембрани із целофану, каучуку, поліетилену,
полістиролу, целюлози й різних її похідних (особливо з
ацетатцелюлози), поліфенолу, поліакрилової кислоти, металокераміки
з нанесеним на їй шаром графіту, пористого скла й т.д.
 125

Мембрани підрозділяють на одношарові - ізотропні, що мають

товщину 0,05-0,2 мкм, і двошарові - анізотропні. Перший шар,
звернений до фильтруємого розчину, визначає селективність
мембрани. Другий шар грубозернистий, він є нижнім, придає мембрані
міцність рис 19.3. Із двошарових мембран одержали поширення
ацетатцелюлозні. Вони мають високу проникність, селективність і
достатню міцність. Але вони піддаються гідролізу в сильнокислому і
сильнолужному середовищах, і тому їх можна використати тільки в
середовищах із рН від 3 до 7,5. Ці мембрани мають деяку усадку, тому
проникність і швидкість фільтрування змінюється в процесі
експлуатації мембран. Крім того, ці мембрани потрібно зберігати у
воді, є й інші менш істотні недоліки ацетатцелюлозних мембран.

1 – напівпроникний шар; 2 – дренажна підкладка

Рисунок 19.3 – Схема двошарової напівпроникної мембрани

З нових типів мембран одержали поширення мембрани у

вигляді найтонших трубок, так називані порожні волокна із
внутрішнім діаметром 20-100 мкм і товщиною стінки 10-50 мкм.
Інтерес представляють високоселективні «динамічні» мембрани. Вони
являють собою пористу нержавіючу сталь, на яку наносять
полімерне покриття, графітову пластинку, пресоване волокно й т.д.
і пропускають розчин полімеру (наприклад, полівінілпірролідонову
кислоту). Розчин полімеру застигає в порах й утворює армовану
 126

напівпроникну перегородку. Створено напівпроникні мембрани на

основі мікропористого скла.
У СРСР випускалися універсальні ацетатцелюлозні м е м б р а н и
« Вл а д и п о р » з р о зм ір а м и п о р від 0 , 2 ·1 0 - 2 д о 7 ·1 0 - 2 мкм, які
працюють у зонах рН від 3 до 8, при максимальній температурі 50
°С и робочому тиску 0,05—1 МПа. Використовуються також
полімерні мембрани фірм «Амікон» й «Міліпор» (США). Мембрани»
«Дяаффо» фірми «Амікон» діляться на кілька типів залежно від
молекулярної маси затримуваних речовин, матеріалу мембран і
стійкості їх у різних середовищах. Ця ж фірма випускає листові
мембрани, мембрани у вигляді порожніх волокон різних полімерів
(ацетатцелюлоза, нітроцелюлоза, полівінілхлорид, поліаміди й ін.).
Фірма «Міліпор» випускає мембрани з різноманітних полімерів для
ультрафільтрації й зворотного осмосу, як універсальні, так й
вузькоспецифічні. Наприклад, мембрани типу для фармацевтичної й
ферментної промисловості витримують вплив кислот н лугів, що
дозволяє проводити їхню регенерацію або фільтруючі матеріали на
основі азбесту, целюлози, кераміки, скловолокна й ін. для
попереднього очищення ферментного розчину перед
ультрафільтрацією.
Робота ультрафільтраційної установки й тривалість служби
мембран багато в чому залежать від якості дренажної підкладки.
Матеріал для її виготовлення повинен бути стійким до впливу
фільтруючих розчинів, хімічно й біологічно інертним, мати
пружну й стабільну пористу структуру, його фільтраційні й дренажні
характеристики не повинні залежати від робочого тиску. В якості
матеріалу для дренажної підкладки використовують минпласт, пористу
нержавіючу сталь, спінений поліетилен, капронові сітки, папір.
Найбільшою продуктивністю володіють капронові сітки товщиною
 127

0,2 мм із розміром комірки 0,1×0,1 мм 2 — до 0,5 мл/(см2·хв), а

найменшої — підкладки зі спіненого поліетилену — до 0,25
мл/(см2·хв).
Тривалість служби мембран і дренажних підкладок залежить
від виду й концентрації розчинених у фильтруємому розчині
речовин, якості попередньої обробки концентруємого розчину.
Тривалість роботи мембран може коливатися від декількох місяців до
декількох років.
Х а р а к т е р и с т и к и м е м б р а н . На процес ультрафільтрації
впливає ряд факторів: селективність мембран, їхня проникність і
протікаємість, рН концентруємого розчину, температура, тиск,
концентрація сухої речовини у вихідному розчині, концентраційна
поляризація. Розглянемо ці показники.
Головною характеристикою мембрани є її селективність, або
вибірковість до втримання певної речовини. Вона визначається за
формулою (в %)

де Сф—концентрація концентруємого речовини у

фільтраті; Ср-концентрація ферменту у вихідному розчині.
Селективність залежить від особливості мембрани й тривалості
її експлуатації (рис 19.4).
Питома продуктивність апаратів пов'язана із селективністю
мембран, що визначається величиною пор і молекулярною будовою
розділюваного середовища. Селективність і швидкість фільтрування
істотно залежать від процесу масопереносу на границі мембрана —
розчин; швидкість й якість поділу залежать від масопереносу всередині
мембрани й у прикордонному шарі. Проникність мембрани (G)
визначається по формулі [в л/(м 2 ·год)]
 128

Цей показник залежить від фізико-хімічних властивостей

мембран, а також від температури, рН, тиску й інших параметрів
концентруємого розчину.
Коефіцієнт протікаємості мембран (D) безпосередньо
пов'язаний із проникністю й залежить від різниці робочого й
осмотичного тисків Δр при ультрафільтрації [у л/(м 2/год·Па)]:

На величини R, G й D помітний вплив вчиняє рН фільтруємого

розчину. Максимальна селективність мембран проявляється при
ультрафільтрації поблизу ізоелектричної точки концентрує мого білка
(ферменти) , тому що відхилення в ту або іншу сторону приводить до
іонізації розчину й погіршенню умов концентрування (рис 19.5).
Коефіцієнт протікаємості мембран максимальний в ізоелектричній
крапці.
Підвищення температури позитивно впливає на основні
показники процесу ультрафільтрації, оскільки в'язкість розчину
зменшується й зростає швидкість фільтрування, підвищується
проникність мембран, росте коефіцієнт протікаємості (рис 19.6). Але
підвищення температури розчину БАР з метою інтенсифікації процесу
ультрафільтрації неприйнятно, тому що більшість БАР термолабільні.
Чутливі до температури й мембрани. Крім того, температурний ефект
згладжується зі зростанням ступеня концентрування, тому що росте
осмотичний тиск, величина зменшується й коефіцієнт протікаємості
мембран падає. Рушійної силою процесу фільтрування є робочий
тиск (рг ), але ця величина має оптимальну межу, оскільки її
 129

зростання приводить до ущільнення мембрани і зниженню її

проникності (рис 19.7).
Для багатьох білкових розчинів на рівні граничних оптимальних
значень спостерігається явище концентраційної поляризації, коли
порушується пряма залежність між швидкістю фільтрування.
Звичайно це спостерігається при р г, рівному 0,5—1,2 МПа. Це явище
пов'язане із утворенням на поверхні мембрани в результаті адсорбції
часток осаду в порах динамічного гелеподібного шару або в
результаті поганого первинного очищення розчинів від суспензії.
Відокремлювана речовина затримується на поверхні мембрани,
збільшується р0, падає проникність, знижується швидкість
фільтрування, змінюється селективність мембрани. Якщо вміст білка
в кон цен тр уємом у р озчин і не пе ревищ ує 0,3 — 0,4 мг/мл, то
гелеобразный шар не утвориться й між V й pv зберігається пряма
залежність, якщо концентрація вище 0,4 мг/мл, починається
концентраційна поляризація.
Для запобігання концентраційної поляризації використовують
різні прийоми: якісне попереднє очищення розчинів, установлення
мішалки й турбулізаторів, зменшення просвіту між мембранами,
різке збільшення швидкості протоку до переходу його в
турбулентний. Для усунення початкової адсорбції використаються
попереднє фільтрування концентруємого розчину через
металокерамічні фільтри, щільні фільтри, центрифугування,
сепарування й т.д. Із цього погляду ефективна хімічна обробка
розчину, при якої віддаляється частина баластових речовин
солями, бентонітом й ін., а також зміна рН до ізоелектричного
значення, при якому осаджуються баластові речовини. Після цього
попередньо оброблений фільтрат надходить на концентрування.
Використання флокулянтів дозволяє збільшити швидкість
 130

фільтрування й зменшити концентраційну поляризацію на 20—30%.

Для поліпшення умов ультрафільтраційного концентрування розчинів
БАР може використатися їх попередня діафільтрація. Для цього в
ультрафільтраційну комірку, куди поміщений концентрируемый
розчин, подається розчинник (наприклад, вода) зі швидкістю відводу
фільтрату, тобто обсяг концентрируемого розчину залишається якийсь
час постійним. Потім додавання розчинника припиняють і проводять
концентрування. Цей прийом дозволяє фактично усунути явище
концентраційної поляризації й одержати порівняно чисті концентрати
ферментів.
Ультрафільтраційні установки. Процес ультрафільтрації
здійснюється в спеціальних установках, які залежно від пристрою й
форми фільтруючої комірки можна підрозділити на чотири групи: із
плоскопараллельными фільтруючими елементами (типу фільтр-
преса) із трубчастими фільтруючими елементами, з рулонними
фільтруючими елементами й з фільтруючими елементами у вигляді
порожніх волокон. Мембранний апарат і пристрої для створення в
системі тиску - головні елементи ультрафільтраційної установки.
Крім них у схемі передбачаються апаратури для попереднього
очищення ферментного розчину (ємності для ферментного
розчину, коагулянтів, осаду, сепаратор або фільтр, насос), збірники
для фільтрату й концентрату, ємності й насос із дозуючим
пристроєм для проведення диафильтрации й т.д. У лабораторних
умовах для підбора типу мембран, робочого тиску, режимів
попередньої обробки й т.д. використають комірки з однією
мембраною.
До досвідченим і виробничим ультрафильтрациоиным
установок пред'являються наступні вимоги: компактність, простота
виготовлення й експлуатації, дотримання оптимальної гідродинаміки
 131

(мінімальна енергоємність процесу й мінімальна концентраційна

поляризація), коррозиестой-кость, низька металоємність, висока
міцність для роботи під тиском, простота зборки й надійність.
Ультрафільтраційні установки із трубчастими фільтруючими
елементами складаються із трубок, які становлять; дре-иажную
систему. Усередині або зовні трубки наноситься пйдлож-ка (опорний
шар) мембрани й потім мембрана. Залежно від того, де встановлена
мембрана, концентрируемый розчин подається або усередину, або
зовні труби. Апарати цього типу були розроблені фірмою «Хавенз»
(США), зараз вони випускаються фірмами «Абкор» (США),
«Рамикон» (Франція), «Филко-Форд» (США), «Дедремо» (Франція).
Каркасні дренажні труби для цих апаратів виготовляються з металу,
кераміки, пластмаси, склопластику, графіту й інших матеріалів
діаметром від 6 до 30 мм. У цих апаратах Можна створити високі
швидкості протоки, що дозволяє турбулизировать потік, і не потрібно
попереднього глибокого очищення від суспензії й колоїдних часток.
Крім того, вони мають просту конструкцію, низьку металоємність,
відрізняються рівномірністю розподілу концентрируемого розчину по
поверхні мембран. До недоліків цих установок ставляться: громіздкість
(фільтруюча поверхня до 100 м 2/м3 ), складність збору трубок у
колектор, тому що трубки мають малий діаметр. Ці установки
дорогі, і на них не можна концентрувати грузлі розчини.
Фильтрующие елементи рулонного типу являють собою навитий
на центральну перфоровану фильтратотводящую трубку пакет, що
складається із двох мембран, розділених одним або декількома
шарами гнучкого пористого дренажного матеріалу, і сітчастого
сепарационного листа між мембранами, що утворить канал для
протоки поділюваного розчину. Апарати з елементами рулонного типу
мають високу щільність упакування (300—800 м2/м3) і низкою
 132

металоємністю. Недоліками рулонних апаратів є: високий гідравлічний

опір потоку розчину, обумовлене наявністю сепарационной сітки з
досить дрібними комірками (1-2 мм).
Ультрафильтрациониые установки, що працюють за принципом
фільтр-преса були створені на початку 60-х років для опріснення води
методом зворотного осмосу. У цей час засновані на цьому принципі
ультрафильтрациоиные установки випускаються фірмами «Аэроджет
Дженерал Корпорейшн» (США), DDS (Данія), <Ронпоулен»
(Франція) і поруч інших. Кроком уперед у порівнянні з
перерахованими вище апаратами стали апарати з модулями
плоскопараллельного типу, розроблені фірмою «Дорр-Оливер»
(США) н на початку 70-х років у ВНИИпродуктов шумування. Остання
складається нз трьох циркуляційних контурів по нескольку
фільтруючих блокоЬ у кожному із плоскопараллельнымн
мембранними пакетами. Установка має загальну поверхню
фільтрування 24 м 2 . Кожен блок містить 40—45 фільтруючих
елементів загальною площею близько 2 м2. Тиск у контурі
підтримується насосом на рівні 0,3-0,6 Мпа. Установка має
продуктивність 100- 200 л/ч, швидкість потоку в каналах 0,67-0,70 м/с; у
міру забруднення мембран через 300- 350 ч вона падає в 2 рази. Конст-
руктивная особливість цієї установки полягає в тім, що
концентрируемый розчин подається одночасно в усі канали
плоскопараллельных фільтруючих елементів блоку. Фільтрат
виводиться нз блоку по дренажній системі. Всі блоки в кожному
контурі з'єднані послідовно. Розроблено установку з поверхнею
мембран 2 000 м 2, що працює під тиском до 1,5 МПа із
продуктивністю по ультраконцентраті 30— 35 м3/сут.
Становить інтерес установка такого ж типу УФ1-1-180
конструкції ВНИИбнотехннкн, схема якої показана на мал. 1.52.
 133

Вона складається нз 18 фільтраційних блоків із загальною площею

фільтруючої поверхні 180 м2 н має трн щабля концентрування, що
включають відповідно 9, 6 й 3 фільтраційних блоків. У першому щаблі
передбачається 3 паралельних потоки, у другий - 2 й у третьої - 1. Це
дозволяє підвищити швидкість протоки до 1,5-2,0 м/с і знизити
гідравлічний опір. Продуктивність цієї установки близько 1 800 л/ч.
Фірма «Дорр-Олнвер» випускає восьмимодульные ультра-
фильтрацнонные установки, що працюють під тиском 0,38 Мпа;
кратність концентрування в них 25-30.
Всі апарати, що працюють за принципом фнльтр-пресса досить
прості у виготовленні й монтажі, листові мембрани дозволяють
створити надійні ущільнення при зборці, але оии мають і недоліки:
вони громіздкі, що фільтрує поверхня мембран становить 100—200
м2/м3, ультрафнльтрацноиные модулі складно промити, важко
проводити їхню заміну, потрібні тур- зсув шарів під час експлуатації,
складне очищення й виготовлення фільтруючих елементів. Апарати
такого типу придатні для поділу розведених маловязких розчинів,
ретельно очищених від колоїдних і зважених речовин.
В апаратах з елементами з порожніх волокон використаються
мембрани у вигляді найтонших трубочок з напівпроникними стінками.
Діаметр волокон (50—250 мкм) і товщину стінки (15— 100 мкм)
підбирають таким чином, щоб вони витримували робочий тиск без
застосування підкладок і дренажних пристроїв. Порожні волокна
збирають у пучки довжиною до 3 м і поміщають у трубчастий корпус.
Кінці волокон закріплюють міцним водостійким клеєм у трубних
ґратах і виводять у камеру збору фільтрату. У промисловості
поширені апарати на основі порожніх волокон, де концентрируемый
розчин обмиває волокна зовні, а фільтрат приділяється усередині
волокна. Виробником таких апаратів є фірма «Дюпон» (США). Вони
 134

компактні, що фільтрує поверхня апаратів, що випускають нею, досягає

000
20 м2/м3. Вони прості в монтажі й експлуатації, високопродуктивні.
Але вони мають ті ж недоліки, що й установки рулонного типу.
В висновок варто сказати, що використання ультрафільтрації у
ферментній промисловості перспективно як на стадії концентрування
ферментних розчинів з метою одержання рідких концентратів, так й як
спосіб згущення й очищення ферментних розчинів на стадії одержання
препаратів різного ступеня чистоти.

Контрольні питання до теми Т19

1. Діаліз й електродіаліз.
2. Як і існують баромембранні методи очищення розчинів?
3. Зворотний осмос й ультрафільтрація

Тема Т20. Процес ферментації

Розрізняють два принципово різних процеси одержання мікробних

метаболітів. Перший - ферментація (культивування продуцента), при
якій окремі метаболіти утворюються безпосередньо при культивуванні
мікроорганізмів-продуцентів. Інший процес - ферментативний каталіз.
Його здійснюють виділені із природних об'єктів (частіше
мікроорганізмів) ферменти або клітини мікроорганізмів, що мають
необхідні ферментні системи. У промислових або напівпромислових
установках мікроорганізми часто використовуються у вигляді
іммобілізованих клітин, фіксованих на полімерних носіях у спеціально
підготовлених скляних кульках або включених у полімерні гелі. Серед
продуктів ферментації найбільш помітне місце за обсягами виробництва
займають вторинні метаболіти (ферменти, антибіотики, вітаміни тощо).
За біохімічною сутністю процес ферментації багато в чому імітує
передферментацію і тому названий термін є умовним.
 135

У процесі ферментації також необхідне використання

стерильних поживних середовищ, повітря і біореакторів, вибір яких
обумовлений особливостями мікроорганізмів, що культивуються.
Мікроорганізми у вигляді суспензії певної щільності подають з
інокулятора(-ів) у промисловий біореактор, чи ферментатор, у якому
міститься стерильне рідке живильне середовище. При цьому не
повинно відбутися попадання яких-небудь сторонніх мікробів у
живильне середовище разом з продуцентом — всі з'єднання системи
повинні бути герметично закритими.
Загальний об'єм ферментатора заповнюють інокулюваним
середовищем на 70-80%, 20-30% об'єму заповнюють газами (інертним –
для анаеробов, повітрям – для аеробов).
Аерація рідини сприяє піноутворенню, яке знижує якість
ферментації, тому використовують піногашення або механічне
(установка у верхній частині ферментатора спеціальної додаткової
мішалки), або фізико-хімічне (використання ПАР для зниження
поверхневого натягу на границі роздягнула фаз "газ-рідина").
Тривалість ферментації коливається в межах від 4-5 до 14 доби і
довше, що залежить від особливостей фізіологічної активності
біооб’єктів.
У процесі ферментації дозовані потоки поживних середовищ,
посівного матеріалу (засівної біомаси, інокуляту) подаються у
біореактор (ферментатор).
З ферментатора відводиться культурна рідина (культурна рідина –
багатофазна структура, яка складається із суспензії БА, що містить
залишки компонентів поживного середовища і продуктів метаболізму),
тепло, відпрацьоване повітря (гази).
 136

Вимірюються (та підтримуються, якщо потрібно) необхідні

параметри середовища (фізико-хімічні) для конкретного біологічного
агента.

20.1 Основні варіанти культивування

Розрізняють наступні види аеробної й анаеробної ферментації:

- періодичне, безперервне;
- глибинне та поверхневе (на рідинних та твердих
середовищах);
- стерильне та умовно-стерильне;
- з використанням біокаталітичних реакцій (реактор повного
перемішування);
- іммобілізовані системи (ферменти, біомаса та ін);
- культивування рослинних та тваринних тканинних клітин
(рис. 20.1.).
Генетично модифіковані мікроорганізми, клітини рослин, тварин
та людини є найбільш складними для біотехнологів. Для них
розробляються спеціальні конструкції біореакторів. Наприклад:
- біореактори з рухомими мікроносіями для БА на поверхнях
(отримання інтерферону);
- мембранні біореактори для вирощування клітинних культур та
іммобілізації бактерій та дріжджів (виробництво вірусних вакцин,
моноклональних антитіл, етанолу і т.д.);
- проточні колони з іммобілізованими БА (отримання етанолу,
моноклональних антитіл);
- біореактори киплячого шару (очищення стічних вод та інше).
 137

Аеробна Анаеробна

Періодична Твердофазн
а
Ферментаці
поверхнева
Безперервн я Глибинна
а

Клітини Ферменти

Суспендовані Ферменти в
клітини розчині
Іммобілізовані Іммобілізовані
клітини ферменти

Рисунок 20.1 - Методи ферментації.

20.2 Іммобілізація

Методи іммобілізації універсальні для всіх видів іммобілізованих

біокаталізаторів - індивідуальних ферментів, клітин, субклітинних структур,
комбінованих препаратів.
Поряд з іммобілізацією ферментів останнім часом все більша увага
приділяється іммобілізації клітин і субклітинних структур. Це пояснюється
тим, що при використанні іммобілізованих клітин відпадає необхідність
виділення й очищення ферментних препаратів, застосування кофакторів;
створюється можливість одержання поліферментних систем, що здійснюють
многостадийні безперервно діючі процеси.
У промислових процесах частіше використовують спочиваючі
клітини. Дійсно, багато господарсько-коштовних продуктів синтезуються
головним чином у стаціонарній фазі розвитку клітинних культур.
 138

Зростаючі клітини порушують структуру носія. Дочірні клітини, що

утворюються при розподілі, залишаючи носій, забруднюють цільовий
продукт. Для придушення росту іммобілізованих клітин рослин
використовують дефіцит фітогормонів, а ріст клітин бактерій гальмують
додаванням антибіотиків.
Іммобілізовані клітини мікроорганізмів застосовують для
біотрансформації органічних сполук, поділу рацемічних сумішей, гідролізу
ряду складних ефірів, інверсії сахарози, відновлення й гідроксилювання
стероїдів. Іммобілізовані хроматофори використовують у лабораторних
установках для синтезу АТФ, а пурпурні мембрани - для створення штучних
фотоелектричних перетворювачів - аналогів сонячних батарей.
Розробляється реактор на основі іммобілізованих клітин дріжджів для
одержання єтанола з меляси, у якому дріжджі зберігали б здатність до
спиртового бродіння протягом 1800 ч. З більш ніж 2000 відомих у цей час
ферментів іммобілізована й використовується для цілей інженерної
єнзимології приблизно десята частина (переважно оксидоредуктази,
гідролази й трансферази).
Для здійснення хімічних процесів за допомогою іммобілізованих
ферментів застосовують колончасті, трубчасті, пластинчасті й
танкерні реактори різного об'єму й продуктивності. Іммобілізовані
ферментні системи функціонують у біореакторіу вигляді нерухомої
фази, через яку протікає середовище із субстратом, що підлягає
хімічному перетворенню (гетерогенний каталіз). У таких реакторах
поряд з безперервним режимом використовується й періодичний. Для
ефективного перемішування й газообміну біореактор постачають
мішалкою. Дію мішалки, що ушкоджує біокатализатор, усувають,
закріплюючи певним чином його гранули. Наприклад, у биореакторе
«корзинового» типу мішалка обертається в порожньому циліндрі із
сітчастої структури (кошик), в осередках якої закріплений
 139

іммобілізований фермент. У внутрішньому об'ємі трубчастих реакторів

розташовані порожні волокна, заповнені біокатализатором. Ступінь
перетворення субстрату в продукт (наприклад, фумарата амонію в
аспартат) у таких реакторах досягає 90 %.

20.3 Піногасники

Процеси піноутворення і піногасіння відіграють важливу роль при

аеробному глибинному культивуванні мікроорганізмів. При збалансованих
пінних режимах збільшується міжфазна контактна поверхня і досягається
інтенсивний масобмін між середовищем і аеруючим повітрям. Спінювання
поживного середовища, стійкість піни і її реологічні властивості
(поверхневий натяг, поверхнева в'язкість) залежать від складу середовища
(вмісту цукрів, ліпідів, білків, структуроутворюючих солей), режимів
стерилізації й аерації середовища й ін.
Для створення стійких режимів піноутворення застосовують механічні
і хімічні піногасники і їхні комбінації. Хімічні піногасники (поверхнево-
активні речовини – ПАР) поділяються на жирові і синтетичні. Жири
виявляють піногасні властивості у відносно високих концентраціях 0,2-1,0%
від обсягу середовища і вище). Крім того, для багатьох мікробіологічних
процесів вони є необхідними чи додатковими поживними компонентами.
При асиміляції жири, розщеплюючи до жирних кислот, змінюють рН
середовища.
Дуже ефективні синтетичні піногасники (силікони, пропіноли,
контрамін, поліформаль і ін.), що випускаються для харчової промисловості.
У кожнім конкретному процесі мікробного синтезу
експериментальним шляхом підбирають оптимальний піногасник і
розраховують його максимально допустиме дозування.
 140

Для піногасіння використовують жири й олії, що також можуть

бути джерелом харчування для мікроорганізмів. Найчастіше
використовують тваринні жири, олеїнову кислоту, соняшникову,
соєву, бавовняну, кукурудзяну олії. З усіх перерахованих
піногасників найбільш раціонально вводити при вирощуванні
олеїнову кислоту, тому що інші олії мають харчову цінність і
використовуються в харчовій промисловості. Поступово вони
заміняються синтетичними піногасниками.

20.4 Флокулянти

У деяких мікробіологічних процесах доцільно стимулювати

флокуляцію (конгломеризацію) клітин продуцента, наприклад, для більш
ефективного фракціонування чи клітин з метою утримування клітин в умовах
неперервної ферментації. Застосовують хімічні флокулянти (хлорид кальцію,
солі фосфорної кислоти) чи синтетичні поліелектроліти, що можуть бути
аніон- або катіонактивні, чи неіоногени. На фосфаті кальцію, що випадає в
осад, наприклад, адсорбуються клітини продуцента. З аніонактивних
поліелектролітів використовують співполімер акриламіду і натрієвої солі
акрилової кислоти. Катіонактивні поліелектроліти (наприклад,
цетазолакриламід із співполімером - катіоногеним мономером) осаджують
білкові речовини ферментаційного середовища (до 20 мг на 1 мг
поліелектроліту), і на них адсорбуються клітини.

20.5 Оцінка процесу ферментації

Культивування мікроорганізмів (тобто клітин мікроорганізмів)

відбувається в трифазному середовищі - рідина, газ, тверда речовина.
Мікроорганізми в результаті секреції продуктів обміну речовин
 141

безупинно змінюють середовище культивування, а самі процеси

метаболізму, у свою чергу, швидко реагують на зміни в середовищі.
Треба враховувати здатність багатокомпонентного живильного
утворювати стійку піну, що викликає необхідність регулювання режимів
піноутворення. Крім того, у результаті інтенсивного обміну речовин у
мікроорганізмів частина хімічної енергії, зв'язаної під час ферментації,
виділяється у вигляді теплоти. Асимілюючи один кг цукру,
мікроорганізми виділяють 4-6 тис. кДж тепла. На біохімічних заводах
працюють десятки ферментерів, від яких відводять зайве тепло.
Для оцінки реального ферментаційного процесу використовують
ряд кінетичних показників, які перераховані в табл. Практично у
ферментаційному середовищі контролюють вміст основних субстратів S
(звичайно джерело вуглеводів), біомаси X і цільового продукту P. За
цими показниками обчислюють питому швидкість росту,
продуктивність системи по біомасі й продукту, а також, при
необхідності, економічні коефіцієнти.
Процес ферментації можна оцінювати за різними показниками,
використовуючи для цього відповідні розрахункові формули (табл.
20.1).
Таблиця 20.1 - Основні показники процесу ферментації

Символ Розрахункова
Показник Примітка
та од. вимір. формула
1 2 3 4
Концентрація
X, г/л
біомаси: Для логарифмічної
X1  X 0e (t1 t 0 )
субстрату S, г/л фази росту е=2,718
продукту Р, г/л
Питома X1  X 0
μ, 1/год  –
швидкість росту X 1 (t1  t0 )
Коефіцієнт D
Для безперервного
D, 1/год
розведення процесу
 142

1 2 3 4
Продуктивність X1  X 0 Для періодичного
Qx 
по біомасі t1  t0 процесу
Qx, г/(лгод)
Qx  DX
Для безперервного
процесу
Те ж по P1  P0 Для періодичного
Qp 
продукту t1  t0 процесу
Qp, г/(лгод)
Qp  DP Для безперервного
процесу
Питома
швидкість S1  S0
qs, г/(лгод) qs  –
споживання X 1 (t1  t0 )
субстрату
Вихід продукту q p P1  P0
Yp/s, г/г Yp / s   –
із субстрату qs S0  S1
Вихід біомаси із  X1  X 0
Yx / s  
субстрату Yx/s, г/г qs S0  S1 –

Питома
швидкість P1  P0
qp, г/(лгод) qp  –
утворення X 1 (t1  t0 )
продукту

Контрольні питання до теми Т20

1. Назвіть процеси одержання мікробних метаболітів.
2. Назвіть основні варіанти культивування.
3. Процеси одержання мікробних метаболітів.

Тема Т21. . Основні технологічні прийоми регуляції процесів

мікробіологічного синтезу

Основна проблема мікробіологічного синтеза - проблема

продуктивності, збільшення активності, проблема надсинтезу. Одним зі
шляхів рішення цих завдань може бути створення нового
високопродуктивного штаму-продуцента широко розповсюдженими
 143

методами генетики й селекції або шляхом конструювання нового генома

методами генної інженерії. При доборі або створенні нового штаму-
продуцента можуть бути сформульовані наступні основні завдання, що
характеризують продуцент:
 оптимальна швидкість росту у ферментерах;
 стабільність фізіологічних показників;
 максимальна утилізація джерел харчування із
середовища для культивування;
 зміни в структурі генома, що знімають необхідність
мати в середовищі індуктор (при біосинтезі індуцибельних
ферментів);
 мінімальний синтез інших метаболітів;
 відсутність серед продуктів метаболізму токсичних
метаболитів (алергени, онкогени, високотоксичні антибіотики);
 високий вихід цільового продукту;
 швидке нагромадження цільового продукту.
Максимум своїх можливостей культура може виявити, коли
технологічний процес ферментації відповідає фізіологічним
особливостям продуцента.
Регуляція технологічних процесів мікробіологічного синтезу
заснована на характерних для даного процесу біохімічних реакціях, які
здійснюються продуцентом у конкретних умовах культивування. До
числа таких реакцій можуть бути віднесені шляхи асиміляції основних
вуглець- і азотовмісних компонентів середовища, реакції синтезу
низькомолекулярних метаболітів і ін. Знання механізмів регуляції
синтезу ферментних білків необхідно як при одержанні ферментів, так і
при синтезі низькомолекулярних сполук, наприклад вторинних
метаболітів. Відомі труднощі в оцінці реальних факторів регуляції
 144

полягають у тому, що більшість метаболітів поряд з їхньою участю в

конструктивному й енергетичному метаболізмі виконують і
регуляторні функції.
У мікробних клітинах функціонують різні системи регуляції
обміну речовин (табл.21.1). Принципові відмінності між ними
полягають у наступному: одна регулює синтез ферментів, інша - їхню
активність. Посередниками в здійсненні регуляції є низькомолекулярні
сполуки, які або синтезуються клітиною, або надходять у клітину з
навколишнього середовища.
Основні дані про механізми регуляції були отримані на
мутантних штамах або в досвідах in vitro на моделях. Останні не
завжди в стані відтворити умови, близькі до in vivo.
Застосування терміна "індукція" не завжди коректно. У більшості
випадків мова може йти лише про первинний фізіологічний сигнал.
Істинний індуктор повинен бути локалізований у клітині, тобто
необхідна наявність транспортної системи для переносу даної речовини в
клітину.
Існує більша група конститутивних ферментів, синтез яких не
визначається наявністю індукторів. Це в першу чергу центральні
ферменти метаболізму вуглеводів, які є загальними для більшості
вуглеводів. У цих випадках введення індукторів не є необхідним.
При мікробіологічному синтезі ферментів як індуктори звичайно
використовують субстрат дії ферменту. Однак у ході обміну речовин і
синтезу відповідного ферменту відбувається деградація індуктора,
порушення його структури. Щоб уникнути подібної ситуації й зберегти
синтез ферменту більш тривалий час, запропоновано вводити в
середовища речовини, які мають стеричну подібність із індуктором,
тобто є структурними аналогами й можуть виконувати функції
 145

індуктора, але не асимілюватися клітиною (або асимілюватися, але дуже

повільно).
Таблиця 21.1 -Механізми регуляції метаболізму

Вид регуляції Коротка характеристика

Регуляція Активність ферментів і їхня кількість не змінюються.
метаболітами Інтенсивність метаболізму залежить від концентрацій
метаболітів
Ферментна регуляція
Регуляція Загальний механізм регуляції біосинтетичних шляхів у бактерій
кінцевим полягає в інгібуванні ферменту, що каталізує нову стадію
продуктом метаболічного шляху кінцевим продуктом цього шляху за
типом зворотного зв'язку
Регуляція в Обмежений протеоліз може індукувати фізіологічну
результаті функцію шляхом перетворення білка-попередника в його
обмеженого біологічно активну форму або забезпечує припинення якої-
протеоліза небудь біологічної активності
Регуляція Циклічний перехід ферментів, що каналізують ключові стадії
шляхом метаболізму, з фосфорильованих форм у дефосфорильовані
оборотного
фосфорилювання
Регуляція Здійснюється посттрансляційною модифікацією
шляхом амінокислот у складі білків. У бактерій здійснюється
ковалентної шляхом зворотного аденилювання, уридилювання й
модифікації ацетилювання
Аллостеричні Заснована на змінах конформації ферменту, ведучих до
регуляції зміни його активності
Генна регуляція
Позитивна Регулюючі фактори активують промотор. Промотор
регуляція лактозного оперона активується під дією цАМФ і білка
транскрипції БАК, якщо в клітині немає глюкози
Негативна Характерна для генів, об'єднаних в оперон. Інтенсивність
регуляція транскрипції регулюється в результаті взаємодії оператора з
транскрипції білком-репресором. При синтезі репресибельного ферменту
репресор блокує оператор, при синтезі індуцібельного фермента-
звільняє оператор
Посттранскрипці У єукариот тільки частина РНК, що утворюється в ядрі попадає в
йна регуляція цитоплазму. У процесингу цілком руйнується більша або менша
частина синтезованих молекул
 146

Регулювання Регуляція трансляції відбувається на етапі ініціації за

трансляції допомогою факторів ініціації
Для того щоб природні індуктори зробити менш доступними
ензиматичному розщепленню, вони можуть бути модифіковані за
рахунок приєднання до них полімерів або жирних кислот.
Неодмінною умовою прояву активності ферменту повинна бути
здатність індукторів проникати в клітини.

21.2 Катаболітна репресія

Мікробіологам добре відомий так званий глюкозний ефект,

коли високі концентрації глюкози гальмували ріст і утрудняли
асиміляцію джерел енергії, що повільно розщеплюються,. Сутність
цього процесу полягає в інгібуванні (катаболитному) транскрипції
генів, що детермінують синтез ферментів, необхідних для
катаболізму лактози або інших енергетичних субстратів, коли в
середовищі присутня глюкоза — більш ефективне джерело енергії.
Сама по собі глюкоза не робить безпосереднього інгібуючий дії.
Інгібітор, відповідальний за глюкозний ефект у клітинах Е. coli, є
продуктом розщеплення, тобто катаболитом глюкози, а саме
явище одержало назву катаболитної репресії. Який саме продукт
розщеплення глюкози обумовлює катаболитну репресію, дотепер
не встановлено. До числа вуглеводів, на асиміляцію яких впливає
катаболитна репресія, можуть бути віднесені не тільки лактоза, але
й галактоза, мальтоза й т.п. Такий регуляторний механізм
обумовлений біохімічними особливостями асиміляції вуглеводів,
відмінних від глюкози. Відомо, що кожний з названих вуглеводів,
перш ніж увімкнутися в метаболізм за гліколітичним шляхом,
повинен піддатися ензиматичним перетворенням до одного з
 147

початкових продуктів гліколізу, наприклад глюкозо-6-фосфата або

фруктозо-6-фосфата. Таке перетворення викликає необхідність
синтезу ферментів, що забезпечують утворення названих
продуктів.
Слід зазначити, що ефективність дії якого-небудь
джерела вуглецю в якості катаболитного репресора залежить не
від його хімічної структури, а винятково від його ефективності
як джерела харчування. Тому сполуки, що є найбільш
активними катаболитними репресорами в одному організмі,
можуть бути порівняно малоактивні в іншому. Класичним
прикладом середовища, де одночасно присутні лактоза й
глюкоза, є середовище для біосинтезу пеніциліну. Внаслідок
катаболитної репресії синтезу ферменту, що гідролізуює лактозу,
остання не асимілюється організмом, поки концентрація глюкози
не досягне рівня, коли катаболитна репресія вже не позначається.
При оптимальному співвідношенні лактози й глюкози
підтримується необхідний для біосинтезу пеніциліну інтервал
рн середовища, накопичуються необхідні для синтезу проміжні
метаболіти й т.п. У тих процесах, де аналогічне рішення або
неприйнятно, а катаболитну репресію росту або синтезу
цільового продукту необхідно зняти, рекомендується дробове
введення глюкози або якого-небудь іншого джерела вуглецю по
ходу ферментації.

21.3 Аллостерична регуляція ферментів

Аллостеричні регулятори виконують найважливіші функції в

регуляції каталітичної активності. Приставка алло означає "інший".
Вона показує, що на ферменті, крім ділянки зв'язування субстрату, є
 148

одна або кілька ділянок зв'язування іншої сполуки (або сполук).

Низькомолекулярні сполуки, що зв'язуються білком, прийнято називати
лигандами. Цей термін часто поширюють і на невеликі білки. Лиганди,
що зв'язуються з аллостеричними ділянками, називають аллостеричними
ефекторами або аллостеричними регуляторами. Вони звичайно не схожі
по своїй будові на субстрат, на який діє даний фермент. Тому
молекули субстрату й регулятора не можуть конкурувати за ту ж саму
ділянку молекули ферменту.
Дія еффекторів, як правило, спостерігається при певній концентрації
субстрату. Позитивні ефектори при зв'язуванні з аллостеричною ділянкою
ферменту збільшують його активність, негативні - знижують. Відбувається
зміна конфірмаційної структури ферменту. Однієї з істотних особливостей
аллостеричної регуляції є її миттєва дія. Аллостеричний лиганд практично
миттєво зв'язується з регуляторним центром за рахунок нековалентних
взаємодій. Регулятор диссоціює з комплексу з ферментом, коли його
концентрація в середовищі зменшується. При цьому фермент вертається у
вихідний стан. Аллостеричні ферменти, як правило, мають четвертинну
структуру.
Механізми регуляції активності ферментів за допомогою
аллостеричних єфекторів, очевидно, найпоширеніші в мікробних
клітинах. Одним із проявів аллостеричного механізму є активація
попередником. Це сполука, що повністю або зі незначними змінами
входить до молекули синтезованої речовини.
Більш розповсюдженим типом регуляції, чим активація
попередником, є інгібування за типомі негативного зворотного зв'язка,
коли нагромадження надлишку кінцевого продукту даного метаболічного
ланцюга приводить до "вимикання" необхідних для його синтезу
ферментів. Найчастіше придушується активність першого ферменту, що
займає ключове положення в даному ланцюзі біосинтезу.
 149

Порушення системи регуляції біосинтезу в мікробній клітині тих

або інших сполук, зокрема амінокислот, є основним прийомом
одержання промислових продуцентів.
Як правило, методами генної інженерії намагаються зняти ефект,
що блокує, тобто одержати новий продуцент зі зміненою системою
саморегуляції. До чисто технологічних прийомів, при збереженні
здатності культури до саморегулювання, можна віднести виведення
кінцевого продукту, що є ефектором, зі сфери реакції. Найбільш просте
рішення – переведення продукту в нерозчинний стан. Інший шлях -
використання мембранної технології.

21.4 Механізм регуляції біосинтезу продуктів, що

накопичуються в другій фазі

Багато промислово важливих продуктів біосинтезу накопичуються

в культурі продуцента після того, як основні компоненти середовища
витрачені, а швидкість росту біомаси вповільнена, тобто - у другу фазу.
Подання про двухфазність мікробіологічного синтезу були уперше
сформульовані на прикладі ацетонобутилового бродіння. Пізніше було
запропоновано ростову фазу називати трофофазой, а другу
(продуктивну) - ідіофазою.
Трофофаза відповідає періоду молодості культури, друга -
періоду зрілості. Протягом трофофази відбувається швидкий ріст і
розмноження міцелію або бактеріальних клітин. Культуральна рідина в
цей період багата вуглеводами, азотом і неорганічним фосфором.
Продукти обміну речовин мікроорганізмів відсутні або перебувають у
вкрай незначних кількостях. У культуральної рідини переважно
відбувається утворення більше окислених продуктів.
 150

Ідіофаза починається з моменту вповільнення росту культури.

Протікає вона в культуральної рідини, збагаченої продуктами
життєдіяльності організму, з невеликою кількістю або при відсутності
вуглеводів і неорганічного фосфору. На початку цієї фази клітини
мають максимальну здатність до синтезу цільового продукту. У
культурі переважають відбудовні біохімічні процеси. Після завершення
фази, коли кількість біомаси зберігається приблизно на одному рівні,
починається автоліз. При промисловій ферментації процес практично
закінчується на початку - середині ідіофази, тому що в ході автолізу
ферментативної деградації може піддаватися продукт ферментації, а
також відбувається розпад біомаси, що створює труднощі при її
відділенні при фільтрації або іншому способі видалення. Збільшення
тривалості першої фази й скорочення другої фази, якими б причинами це
не було обумовлено, веде до зниження кількості синтезованого продукту.
Сприятливим фактором переходу культури в другу фазу, є майже повне
використання культурою фосфору, що знаходиться в середовищі.
Найбільше добре двухфазність процесу і її закономірності вивчені
для деяких типів бродінь і при біосинтезі вторинних метаболітів,
наприклад антибіотиків. В основі закономірностей синтезу лежать
механізми регуляції, за допомогою яких ферменти синтезу антибіотиків
починають функціонувати в клітині тільки наприкінці трофофази. До
настання цього часу ділянки генів (оперони), що контролюють синтез
ферментів ідіофази перебувають у стані репресії, внаслідок чого не
відбувається зчитування необхідної інформації для синтезу, тобто не
відбувається транскрипції. Після того як відбудеться дерепресія,
наступить синтез ферментів метаболітів ідіофази.
Назвати який-небудь один механізм регуляції досить важко.
Можливо, що той самий процес регулюється за допомогою
декількох систем:
 151

 індуктор накопичується наприкінці (або після) трофофази

або уведений ззовні, щоб дерепресувати гени, що функціонують у
період ідіофази;
 якийсь продукт первинного метаболізму викликає
подавлення активності одного з ферментів на шляхах біогенезу
вторинних метаболітів. Зникнення цієї сполуки веде до
дерепрессии генів, активних у період ідіофази;
 ріст на джерелі вуглецю, що легко утилізується,
придушує гени ідіиофази шляхом катаболитної репресії. При
зникненні цих катаболитів відбувається дерепрессія генів ідіофази;
 активність ферментів ідіофазы придушується за рахунок
високого рівня АТФ у клітині;
 РНК-полимераза під час трофофази може ініціювати
транскрипцію тільки генів трофофази внаслідок того, що фер мент
не може реагувати із промоторною ділянкою оперона, котрий
працює на синтез ферментів, що беруть участь во вторинному
метаболізмі. Після завершення трофофази відбувається
конформациона зміна РНК-полимерази, що дає їй можливість
взаємодіяти із промоторною ділянкою, ініціюючи транскрипцію й
синтез ферментів ідіофази;
 оскільки формування молекул різних мікробних
метаболітів проходить через численні біогенетичні шляхи, має
місце одночасне функціонування декількох регуляторних систем
при синтезі того або іншого продукту.

21.5 Метаболічні попередники вторинних метаболітів

Розшифровка біохімічних механізмів біогенезу молекул

багатьох практично важливих мікробних метаболітів дозволила
 152

застосувати в ході ферментації технологічний прийом, що відомий

як введення попередників. При цьому в середовище вносять
попередники - сполуки, близькі за структурою яким-небудь
фрагментам молекули цільового продукту. Цей прийом можливо
використовувати на таких етапах біогенезу, які здійснюють
ферменти, що мають низьку специфічність. Найбільш
розроблений цей прийом у виробництві пеніциліну. Відом о, що
молекули пеніцилінів складаються з "ядра", що являє собою 6-
амінопеніціланову кислоту, і радикала, котрий визначає
терапевтичну цінність препарату й специфічність його дії на
патогенні мікроорганізми. Однією з визначальних умов
можливості включення попередника в молекулу синтезованої
речовини є можливість його переносу із середовища в клітину, де
відбувається синтез.
Іншим прикладом, де при біосинтезі використається
попередник, може служити одержання вітаміну В 12. Тут як
попередник уводять 5-6-диметил-бензимидазол. Відомо, що поряд із
істинним вітаміном культура може синтезувати псевдовітаміни, що
зокрема містять у нуклеотидної частині молекули аденина. Характерною
рисою цієї речовини є здатність витісняти й заміщати в молекулі вітаміну
аденин, якщо 5-6-диметилбензимидазол доданий до культури на 1-3 добу
росту. Для перетворення псевдовітамінів у істинний вітамін досить вести
ферментацію додатково 12-24 ч у присутності 5-6-диметилбензимидазола.
Більша група антибіотиків, відома під загальною назвою
актиноміцини, містить у своєму складі речовини, що відрізняються
складом амінокислот у пептидних ланцюжках. У цьому випадку, як і в
інших пептидах, заміна амінокислот можлива структурно близькими
сполуками. Найбільше часто спостерігаються заміни валин-лейцин-
изолейцин.
 153

Введення попередників дозволяє регулювати процес біосинтезу,

направляючи реакції синтезу на одержання необхідних продуктів. Однак
і без попередників у наведених вище прикладах мікроорганізми здатні
синтезувати перераховані сполуки.

21.6 Регуляція рН в процесі ферментації

Відомо, що в деяких процесах ферментації оптимальні умови

для нагромадження біомаси й синтезу цільових продуктів біосинтезу
не збігаються, що викликає необхідність підтримки певної програми
зміни рн у ході ферментації. Підбор середовища, що забезпечує
виконання такої оптимальної програми, ще більш складний, хоча
одним зі способів регулювання рн є підбор компонентів у
концентраціях, що створюють необхідний інтервал рн для росту
культури. Деякі мікроорганізми виявляються здатними самі
регулювати рн середовища. Так, бактерії, що утворять при
зброджуванні вуглеводів нейтральні продукти, можуть протягом
усього періоду росту культури підтримувати необхідне для неї
значення рн. При цьому спочатку може відбуватися перетворення
вуглеводів до утворення органічних кислот, коли ж кислотність
середовища досягне певної величини, у дію вступають ферментні
системи, що сприяють утворенню не кислоти, а нейтральних
продуктів, зокрема спиртів.
На практиці щоб уникнути закислення середовища застосовують
крейду. При цьому більшість органічних кислот, синтезованих
культурою й виділених у середовище, утворюють із іонами кальцію
нерозчинні або малорозчинні солі.
На величину рн середовища істотний вплив здійснюють мінеральні
солі, що є її компонентами. Якщо в середовищі присутня сульфат амонію,
 154

то можна чекати її закислення, внаслідок інтенсивного споживання іонів

амонію як необхідного джерела азоту. Потреба гетеротрофних
мікроорганізмів у сірці звичайно значно менша, чим в азоті. Стало бути,
надлишок вільних іонів сульфату амонію приведе до зниження рн.
Протилежний ефект виникає, коли в середовище уведений нітрат натрію
або калію. У цьому випадку нітрат після його відновлення буде
асимілюватися клітиною, а лужні іони калію або натрію викличуть
зрушення рн у лужну зону.
Від величини рН залежить ступінь дисоціації присутніх у
середовищі солей. Можна вважати, що в кислому середовищі слабкі
кислоти виявляються у вигляді цілих молекул, а в лужному - у вигляді
іонів, тому що солі слабких кислот сильно диссоційовані, а самі кислоти
- слабко. При цьому для кожної кислоти й солі є певна критична зона рН,
у якій кислота може переходити з диссоційованого стану в не
диссоційований.
Для підтримки необхідного рн найбільше часто використають луг,
переважно їдкий натр, і кислоти - сірчану й соляну. Найбільше зручно
застосовувати концентровані розчини лугів і кислот (близько 20%),
інакше об’єм середовища у ферментері може істотно змінитися. Як
правило, цей процес автоматизований, необхідні інгредієнти подаються
за сигналом датчика, пов'язаного із системою виміру рн.
У ряді випадків для регулювання рн застосовується подача у
ферментер розчину глюкози або інших подібних джерел харчування. Це
не завжди доцільно, тому що програма подачі глюкози як джерела
харчування може не збігатися з її використанням як титруючого агента.
Аналогічна ситуація може виникнути при використанні розчину
сечовини.
Існує також дробове введення газоподібних аміаку й вуглекислого
газу з балонів через редуктор безпосередньо через барботер разом з
 155

повітрям. Регулювання рн при цьому здійснюється досить м'яко при

невеликих межах зміни рн в процесі. При використанні вуглекислого газу
недоліком є зниження ефективності аерації за рахунок зменшення
парціального тиску кисню в подаваній газовій суміші. У деяких процесах
відзначається інгібуючий вплив розчиненого вуглекислого газу на подих
культури й біосинтез цільового продукту. У мікробіологічних процесах
регулювання рн звичайно здійснюється в області, близької до
нейтрального.

21.7 Регулююча функція фосфатів. Співвідношення

концентрацій джерел вуглецю й азоту в середовищі

При біосинтезі більшості продуктів обміну речовин

мікроорганізмів до складу середовищ входять неорганічні сполуки, що
містять фосфор у вигляді фосфат-іонів. Вони є необхідними для росту
мікроорганізмів, здійснення синтезу багатьох життєво важливих сполук.
Однак фосфат-іони за певних умов можуть впливати на активність
деяких ензиматичних систем. Стосовно до синтезу вторинних
метаболітів такий негативний вплив показаний при одержанні деяких
антибіотиків, амінокислот, ряду метаболітів, що містять циклічні
структури. При біосинтезі ферментів їхній вплив особливо позначається
на ферментах нуклеїнового обміну. Фосфат має різні шляхи впливу на
ферменти, що здійснюють ту або іншу реакцію.
Одним з фізіологічних шляхів регуляції біосинтезу є зміна
співвідношення вихідних концентрацій джерел вуглецю й азоту в
середовищі. Величина відносини визначається характером цільового
продукту біосинтезу. Прикладом може служити надлишковий синтез
клітиною жирових речовин, що спостерігається при високій
концентрації вуглеводів, у порівнянні з кількістю в середовищі джерела
 156

азоту. При одержанні лимонної кислоти повинен бути 50-70-кратний

надлишок вуглеводів у порівнянні з азотом. У цьому випадку гриб
Aspergillus niger спочатку використовує живильні речовини для
утворення міцелію, після чого не асимільовані культурою вуглеводи
піддаються так званому окисному бродінню, або "неповному
окислюванню".
Як було відзначено вище, при деяких процесах мікробіологічного
синтезу високі концентрації глюкози можуть привести до гальмування
деяких ферментативних реакцій за рахунок дії механізму катаболитної
репресії. Тому при рішенні конкретного нового завдання вихідні
концентрації джерел азот і вуглецю бажано підбирати досвідченим
шляхом. При цьому не слід забувати, що асиміляція більшості джерел
вуглецю корелює з концентрацією в середовищі фосфору й, по-друге,
необхідно переконатися, що культура здатна засвоювати дане джерело
вуглецю.
Контрольні питання до теми Т21
1. Як відбувається регуляція технологічних процесів мікробіологічного
синтезу?
2. Механізми регуляції метаболізму.
3. Назвіть метаболічні попередники вторинних метаболітів.
4. Як регулюється рН в процесі ферментації?
 157

Перелік посилань

1. Биотехнология/ Т. Г. Волова. – Новосибирск: Изд-во

Сибирского отделения Российской Академии наук, 1999. – 252 с.
2. Общая технология микробиологических производств./
М.С.Мосичев, А.А.Складнев, В.Б Котов. – М.: Легкая и пищевая пром-
сть, 1982 – 264 с.
3. Кантере В.М. Теоретические основы технологии
микробиологических производств. – М : Агропромиздат, 1990. – 227с.
4.Манаков М.Н., Победимский Д.Г. Теоретические основы
технологии микробиологических производств. – М.: Агропромиздат,
1990 – 227с..
5. Бекер М.Е. Введение в биотехнологию. Пер. с латыш. (Рига,
1974). – М.: «Пищевая пром-сть», 1978 – 237с.
 158

Навчальне видання
Конспект лекцій з дисципліни „Загальна біотехнологія‖ для
студентів напряму 6.051401 „Біотехнологія‖

Укладач: Філімоненко Ольга Юріївна

Підписано до друку____16.06________2016р.
Формат_____А4_________ Обсяг______6.08_________
Тираж____25________ екз. Заказ______139________
51918, м. Дніпродзержинськ, вул. Дніпробудівська,2