Protokol
Sljedeći protokol opisuje izolaciju mRNA koristeći 75 μg ukupne RNA kao početni materijal. Ovaj se
Dynabeads ™ Komplet za pročišćavanje mRNA
Kataloški broj 61006
Publikacija br. MAN0015808
Sadržaj kompleta
Sadržaj kompleta
Dynabeads ™ Oligo (dT) 25
Pufer za povezivanje
Pufer za pranje B
10 mM Tris-HCl
Dynabeads ™ Oligo (dT) 25 sadrži 5 mg / ml
kuglica u fosfatu
puferirana fiziološka otopina (PBS), pH 7,4, sa
0,05% Tween ™ i 0,02% natrijevog azida
kao konzervansa.
Oprez: Natrijev azid može reagirati s olovnim i
bakrenim vodovodom stvarajući vrlo
eksplozivne metalne azide. Pogledajte "Opis
materijala" za sadržaj pufera.
Opis proizvoda
Ovaj je proizvod dizajniran za brzu
izolaciju visoko pročišćene i netaknute
mRNA od ukupne RNA.
Izolacijski protokol oslanja se na
uparivanje baze između ostataka poli A
na kraju 3 'većine
mRNA i oligo (dT) 25 ostaci kovalentno
povezani na površinu
Dynabeads-a ™ magnetske kuglice. Ostale
vrste RNA kojima nedostaje poli A rep neće se
hibridizirati s kuglicama i lako se ispiru.
1 mg kuglica (~ 200 μL) izolirat će do 2 μg
mRNA, ovisno o uzorku. Tipična stanica
sisavaca sadrži oko 10–30 pg ukupne RNA, od
čega je 1–5% mRNA.
Samo za istraživanje. Nije za uporabu u dijagnostičkim postupcima.
Čuvati na temperaturi od 2̊C do 8̊C
Datum vlč. 18. ožujka 2016. (Rev. A.0)
Potrebni materijali
• DynaMag ™ Magnet
Volumen
(Vidjeti thermofisher.com/magnets za
2 ml
preporuke)
5 ml
• Miješalica za uzorke koja omogućava
5 ml naginjanje i okretanje cijevi (npr
5 ml HulaMixer ™ Uzorak mikser)
• Bez sterilnih RNaza cijevi za mikrocentrifugu
• Sterilni vrhovi pipete bez RNaze
Opće smjernice
• Radite bez RNAse i nosite rukavice.
• Zadržite Dynabeads ™ Oligo (dT) 25 u
tekućoj suspenziji tijekom skladištenja i
rukovanja stepenice. Prije uporabe dobro otopite.
• Svi uobičajeni puferi za pročišćavanje i
izolaciju mRNA mogu se koristiti s
Dynabeads ™ Oligo
(dT) 25.
protokol može povećati ili smanjiti povećanjem ili smanjenjem volumena reagensa proporcionalno
bilo kojim promjenama u količini ukupnog polaznog materijala RNA. Možda će biti potrebna
optimizacija.
Pripremite RNA
1. Podesite volumen ukupnog uzorka RNA (75 μg) na 100 μL destiliranom vodom tretiranom DEPC-om ili s 10 mM Tris-
HCl, pH 7,5. Izostavite ovaj korak ako je potrebno samo malo prilagođavanje (pogledajte korak 3 u „Priprema Dynabeads-
a ™ magnetske kuglice ”).
2. Zagrijte uzorak na 65 ° C tijekom 2 minute da se poremete sekundarne strukture.
3. Stavite uzorak na led.
Pripremite Dynabeads ™ magnetske kuglice
1. Prenesite 200 μL (1 mg) resuspendiranih Dynabeads-a ™ magnetske kuglice u cijev za
mikrocentrifugu. Stavite epruvetu na magnet na 30 sekundi ili dok ne dođu sve Dynabeads ™ magnetske
kuglice prilijepile su se za stijenku cijevi.
2. Bacite supernatant, izvadite epruvetu iz magneta i dodajte 100 μL veziva za punjenje kako biste
uravnotežili zrnca. Stavite epruvetu na magnet i uklonite supernatant. Izvadite cijev iz magneta.
3. Dodajte 100 μL veziva u pufer Dynabeads ™ magnetske kuglice. Optimalni uvjeti hibridizacije
zahtijevaju omjer vezivnog pufera 1: 1 i volumena uzorka. Ako je ukupna RNA razrijeđenija od 75 μg /
100 μL, tada Dynabeads-u dodajte volumen vezivnog pufera jednak volumenu uzorka ™ magnetske
kuglice.
Izolirajte mRNA
1. Dodajte ukupnu RNA na Dynabeads ™ / Suspenzija veznog pufera. Temeljito promiješajte i rotirajte
na valjku ili miješalici 3-5 minuta u sobi
temperatura koja omogućuje da mRNA zagrije na oligo (dT) 25 na perlicama.
2. Stavite epruvetu na magnet dok otopina ne postane bistra. Uklonite supernatant.
3. Izvadite epruvetu iz magneta i dvaput operite kompleks mRNA-zrnaca s 200 μL pufera za pranje B.
Upotrijebite magnet da biste uklonili sve tragove supernatanta između svakog koraka pranja (to je važno
kod rada s malim količinama).
4. ( Neobvezno) Dodajte 10–20 μL (ili do 5 μL) 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, da se eluira mRNA.
5. Zagrijte uzorak na 65 ° C do 80 ° C tijekom 2 minute i stavite epruvetu odmah na magnet.
6. Prenesite eluiranu mRNA u novu epruvetu bez RNaze.
Opis materijala
Dynabeads ™ Oligo (dT) 25 kuglice su jednolike, superparamagnetski polisteren
kuglice (promjera 2,8 µm) kovalentno povezane s Oligom (dT) 25 sekvence. Pufer za
vezanje sadrži 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1,0 M LiCl i 2 mM
EDTA. Pufer za pranje B sadrži 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,15 M LiCl i 1 mM EDTA. 10
mM otopina Tris-HCl ima pH 7,5.

Povezani proizvodi
Proizvod Mačka. Ne.

DynaMag ™ - Spin 12320D

DynaMag ™ - 2 12321D
DynaMag ™ - 5 12303D
HulaMixer ™ Uzorak mikser 15920D
Dynabeads ™ Oligo (dT) 25 61002

REF na naljepnicama je simbol za kataloški broj.

Važne informacije o licenciranju

Ovi proizvodi mogu biti pokriveni jednom ili više dozvola za oznaku s ograničenom uporabom. Korištenjem ovih
proizvoda prihvaćate uvjete i odredbe svih primjenjivih licenci za oznaku s ograničenom uporabom.

Proizvedeno u tvrtki Thermo Fisher Scientific Baltics UAB, VA Graiciuno 8, LT-02241 Vilnius, Litva.
Thermo Fisher Scientific Baltics UAB udovoljava standardima sustava kvalitete ISO 9001 i ISO: 13485.

Ograničeno jamstvo za proizvod

Korporacija Life Technologies i / ili njezina podružnica (e) jamče za svoje proizvode kako je navedeno u
Općim uvjetima prodaje Life Technologies koji se nalaze na web mjestu Life Technologies na www.lifetechnologies.com/termsandconditions
. Ako imate pitanja, obratite se tvrtki Life Technologies na www.lifetechnologies.com/ podrška .

Poslovni subjekt: Life Technologies | Carlsbad, CA 92008USA | Besplatni u SAD 1.800.955.6288

© 2016 Thermo Fisher Scientific Inc. Sva prava pridržana. Svi zaštitni znaci vlasništvo su tvrtke Thermo Fisher Scientific i njezinih podružnica, ako nije drugačije

naznačeno. Između njih je registrirani zaštitni znak Croda Americas, PLC

ODRICANJE: DO DOZVOLJENOG ZAKONA, ŽIVOTNE TEHNOLOGIJE I / ILI NJIHOVI POMOĆNICI NEĆE ODGOVARATI POSEBNO, SLUČAJNO, INDIREKTNO,
KAŽNJIVO, VIŠEPOLOŠKE SEKCENCIJALNE ŠTETE KOJE SE PRIKLJUČUJU, VISE DO ISPORUČUJUĆI DO ISPLATA.

Za posjet posjetite thermofisher.com/support ili e-poštom na adresu

techsupport@lifetech.com

thermofisher.com