4.

8 Mikromanipulácie s embryami

Rozvoj molekulárnej biológie umožnil pochopiť niektoré procesy v bunke na

molekulárnej úrovni. Základným objavom bolo objasnenie štruktúry DNA a proteínov aj
s mechanizmami génového riadenia ich vzniku. V minulosti sa biológovia snažili pochopiť
mechanizmy vývoja rôznymi experimentálnymi zásahmi, ako preskupovanie alebo odňatie
časti embrya. V súčasnosti sú známe rôzne biotechnológie, z ktorých niektoré sa používajú aj
v chovateľskej praxi. K týmto metódam patrí dozrievanie a oplodňovanie oocytov in vitro,
zmrazovanie gamét a skorých embryí, delenie embryí, tvorba klonov embryí, chimér a
transgénnych zvierat, génové embryonálne manipulácie a determinácia pohlavia u skorého
embrya.

4.8.1 Delenie embryí

Včasné embryá v štádiu moruly je možné experimentálne rozdeliť na 3 – 4 časti, ktoré

sú schopné samostatného vývoja. Po vyplavení oplodnených vajíčok v štádiu moruly
z vajcovodu sa odstráni zo včasného embrya zona pellucida. Potom sa špeciálnymi prístrojmi
(mikroskop s mikromanipulátorom) pomocou mikroskalpelu a mikroihly, rozdelí morula
mechanicky napr. na 2 časti, ktoré obsahujú ešte nediferencované bunky – blastoméry. Tieto
časti sa samostatne vložia do zona pellucida, ktoré sa získajú z iných embryí. Takto rozdelené
časti sa vpravia do maternice príjemkyne, hormonálne pripravenej tak, akoby u nej prebehla
ovulácia a oplodnenie. Maternica je preto pripravená prijať tieto dve embryá, ktoré sa v nej
zahniezdia. Embryá sa normálne vyvíjajú a dorastajú z nich dvaja identickí jedinci.
Podobne je možné rozdeliť vyplavené embryá v štádiu blastocysty. Blastocysty však
už obsahujú bunky diferencované na trofoblast a embryoblast. Pri delení blastocysty je teda
potrebné rozdeliť ju tak, aby obe časti obsahovali bunky trofoblastu aj embryoblastu. Ak by
sa embryo rozdelilo tak, že jedna časť by neobsahovala bunky embryoblastu, nemohol by
z nej vzniknúť nový jedinec. Každá časť sa potom zase vloží do samostatnej zony pellucida a
takto upravené časti sa vpravia do maternice príjemkyne, kde prebehne ich embryonálny
vývoj.

4.8.2 Tvorba chimér

 Slovo chiméra pochádza z gréckeho chimaeras (monštrum, ktoré má časti rôznych
zvierat). V embryológii znamená chiméra organizmus, ktorý vznikol spojením embryí
s odlišným genotypom. Chimerizácia sa však nevyskytuje iba v rámci druhu, ale je možné
vytvárať chiméry aj medzi druhmi.
Pri tvorbe chimér agregáciou sa používajú embryá v štádiu moruly, kým nie sú
diferencované bunky trofoblastu a embryoblastu. Príkladom tvorby chimér s fenotypovým
prejavom je napr. chimerizácia dvoch farebne odlišných línií myší (čierna a albino). Od oboch
myší sa vyplavia po oplodnení vajíčka. Z embryí v štádiu moruly sa odstráni zona pellucida a
z „čierneho“ i „bieleho“ embrya sa odoberie niekoľko blastomér, ktoré sa k sebe priložia –
agregujú a vložia sa do jedného obalu – zona pellucida. Takto upravené a kultivované embryo
sa potom vloží do maternice príjemkyne. Narodí sa jedinec, ktorý bude mať znaky oboch línií
myší, z ktorých pochádzali pôvodné embryá a bude mať 4 rodičov. Výsledkom bude čierno-
bielo sfarbená myš s náhodne rozmiestnenou oblasťou bez pigmentu a čiernou. Týmto
spôsobom je možné spojiť dve embryá s odlišným pohlavím, pretože genetické pohlavie je
determinované v čase oplodnenia. Potom vznikne jedinec so samčími i samičími gonádami.

štádium spojenie blastomér a kultivácia pri 37°C blastocysta

brázdovania
in vitro

in vivo

vloženie embryí do mláďatá so zmiešaným

maternice príjemkyne sfarbením v podobe pásov

Obr. 4-27 Schématické znázornenie tvorby chimerických jedincov z farebne odlišných línií myší
(podľa Balinsky, 1975).
 Ďalšou metódou je mikroinjektáž buniek embryoblastu jedného embrya do dutiny
druhej blastocysty. V tomto štádiu sú síce bunky diferencované, ale bunky embryoblastu
nestratili schopnosť agregácie a môžu sa vyvíjať rôznymi smermi.

4.8.3 Klonovanie embryí

Vytváranie väčšieho počtu identických jedincov bez pohlavného rozmnoženia sa

nazýva klonovanie. Metóda klonovania spočíva v prenose jadier buniek jedného organizmu
do oocytu získaného z iného organizmu. Najprv sa oddelia blastoméry 4 – 16 bunkového
embrya, ktoré slúžia na získanie jadier (darca). Z ovulovaného vajíčka, ktoré slúži ako
príjemca, sa odstráni sada chromozómov a do perivitelinného priestoru sa prenesú jadrá
darcovských blastomér. Po kultivácii sa v štádiu blastoméry prenesie embryo do maternice
príjemkyne. Výsledkom je identické potomstvo. Presvedčiť sa o tom môžeme transplantáciou
akéhokoľvek tkaniva jedného jedinca tohto potomstva do druhého jedinca. Tieto transplantáty
nie sú odvrhnuté, pretože všetci jedinci sú geneticky identickí.
Klonovanie má niekoľko nesporných významov. Je to napríklad vytvorenie dostatku
optimálnych foriem rastlín a živočíchov na zabezpečenie výživy človeka, produkcia liečív, pri

odobraté vajíčko kravy odobratá ľudská bunka

splynutie vajíčka s bunkou

delenie buniek

odber kmeňových buniek z embrya

rast buniek v kultúre

pridanie rastových hormónov

neuróny bunky srdcovej svaloviny

orgány

Obr. 4-28 Možnosti využitia klonov na produkciu buniek a tkanív pre človeka.
výskume ochorení človeka (napr. rakoviny), regenerácia a vytvorenie tkanív a orgánov pri liečbe
vážnych traumatických stavoch (popáleniny, poškodenie miechy), pri transplantáciách.
Klonovanie miniatúrnych ošípaných, ktorým chýbajú gény zodpovedné za odvrhnutie
transplantátov má význam pre produkovanie orgánov vhodných pre človeka. V USA sa narodila takáto
ošípaná „Goldie“, u ktorej sa tieto gény nenachádzajú v žiadnej bunke. Klonované kravy, ktoré
produkujú ľudské protilátky sa čoskoro budú využívať v boji proti širokému spektru
mikroorganizmov, ktoré zahŕňajú aj mikroorganizmy zaujímavé pre teroristické akcie ohrozujúce život
človeka (napr. spôsobujúce anthrax).
Význam klonovania spočíva aj v záchrane ohrozených druhov alebo línií zvierat.
V USA sa takýmto spôsobom zachránila existencia jednej krvnej línie ošípaných klonovaním
poslednej žijúcej samice tejto línie „Princess“. V roku 2001 sa začali pokusy o záchranu
vzácneho divého druhu tura žijúceho v Indii - gaura. Darcovské bunky pochádzali z kože
gaura, podarilo sa priviesť na svet jedno zdravé mláďa menom „Noah“ geneticky identické
s býkom, od ktorého sa získali bunky kože, toto však o dva dni uhynulo na črevnú infekciu
bežnú u kráv.
Podarilo sa klonovanie aj z buniek mŕtvych zvierat. Napr. v roku 2002 v USA
vyklonovali kravu z bunky obličky, ktorá pochádzala z dobytka z bitúnka. Materiál z bunky
obličky sa vpravil do vajíčka a to sa potom implantovalo do maternice kravy. Výskumní
pracovníci však upozorňujú, že zatiaľ nie je jasné, čo sa s narodenými jedincami bude diať
počas ich života. Mnoho klonovaných embryí napríklad uhynulo ešte v maternici. Narodené
zvieratá mali fyzické abnormality, ako napríklad náchylnosť k obezite alebo dýchacie
ťažkosti. Klonované zvieratá by teda zatiaľ nemali slúžiť ako zdroj potravín pre človeka.
V súčasnosti prebiehajú intenzívne výskumy týkajúce sa klonovania človeka, ktoré je
vo svete všeobecne zakázané v zmysle vytvorenia a narodenia úplne kompletného jedinca. Aj
keď sa vyskytli snahy niektorých spoločností informovať o úspešnom narodení prvého
klonovaného človeka, tieto neboli zatiaľ preukázané hodnovernými dôkazmi. Vedci
upozorňujú okrem etických problémov súvisiacich s klonovaním človeka aj na ďalšie
nebezpečenstvo. Aj keď sa narodí zdravé dieťa, riziko hrozí matke. Jedná sa o riziko vzniku
ojedinelej formy rakoviny maternice – choriokarcinómu. Rakovina sa vyvíja z trofoblastu,
ktorý vrastá do steny maternici pri zahniezdení embrya a vyvíja sa placenta.
Ovca „Dolly“, prvé klonované zviera, bola vytvorená fúziou jadra bunky mliečnej
žľazy dospelého zvieraťa a vajíčka ovce v roku 1996. Treba však podotknúť, že z 277
použitých buniek bola iba jedna enukleácia úspešná v podobe živonarodenej ovce.
Neúspešnosť klonovania je však skôr technická záležitosť. V USA sa podarilo klonovanie
z fibroblastov embryí kráv, kedy sa narodili tri zdravé a geneticky identické kravy. Zdrojom
jadier boli v tomto prípade fibroblasty z 55 dňového embrya býka.

darkyňa darkyňa
vajíčka
bunky

bunka mliečnej žľazy sa mikropipetou sa

umiestnila na niekoľko z vajíčka odstránilo
dní do roztoku bez živín jadro

bunky sa spojili fúziou

pomocou elektrického
výsledná bunka

bunka sa rozmnožila a vzniklo embryo,

ktoré sa implantovalo do príjemkyne

príjemkyňa Dolly

Obr. 4-29 Priebeh klonovania ovce Dolly.

V súčasnosti sa však zisťujú aj negatívne dôsledky klonovania, napr. v prípade ovce

„Dolly“. Chromozómy tejto ovce sú staršie, ako by mali byť s ohľadom na jej vek. Ešte nie je
úplne jasné, ako ovplyvňuje mitochondriálna DNA vývoj klonu. Začiatkom roku 2003 musela
byť ovca "Dolly" predčasne utratená kvôli ochoreniu dýchacích ciest, ktoré sa bežne
vyskytujú u oviec až v staršom veku. Nie je isté, či niektoré vlastnosti jedinca neovplyvňuje aj
mitochondriálna DNA, ktorá samozrejme pri klonovaní chýba, keďže sa prenáša iba jadro
bunky. Význam uváženého používania klonovania je aj v nebezpečenstve zníženia
biodiverzity na Zemi.

4.8.4 Tvorba transgénnych zvierat.

 Transgénne zvieratá sú tie, ktoré majú svoju genetickú výbavu pozmenenú pridaním
cudzieho génu. Ako prvý sa v experimentálnych prácach použil gén rastového hormónu so
zámerom zvýšiť využitie krmiva a rast hospodárskych zvierat. V súčasnosti sa pozornosť
zameriava na zvýšenie odolnosti voči chorobám pridaním génu tvorby špecifických
protilátok. Pri tvorbe transgénnych zvierat sa prenáša DNA do prvojadra zygoty pomocou
mikroihiel. Asi 1/3 transgénnych zvierat prenáša pozmenenú chromozomálnu DNA na
potomstvo. V roku 1997 sa podarilo preniesť gény človeka pre určitý proteín zrážanlivosti
krvi do buniek ovce. Narodili sa tri a prežili dve jahňatá, „Polly“ a „Molly“ s týmto ľudským
génom. Proteín je vylučovaný do mlieka zvierat a takto sa ľahko extrahuje a použije na
výrobu liekov na liečbu hemofílie ľudí.

4.8.5 Determinácia pohlavia včasných embryí

V súčasnosti sa používajú metódy, ktoré určia pohlavie embrya s takmer 100 %

spoľahlivosťou. Z embrya sa biopsiou získa niekoľko buniek, z ktorých sa biochemicky
extrahuje DNA a pomocou špecifickej Y-chromozómovej sondy sa PCR metódou (metóda
polymerázovej reťazovej reakcie) zisťuje pohlavie. Táto metóda je založená na rozdieloch
v amplifikácii sekvencií DNA medzi samčím a samičím pohlavím pri polymerázovej
reťazovej reakcii.