ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑΣ ΡΟΗΣ

Αλεξάνδρα Φλέβα
PhD Βιολόγος
Εργαστήριο Ανοσολογίας-Ιστοσυμβατότητας
Γ.Ν.Θ. Παπαγεωργίου

ΓΕΝΙΚΑ

Η κυτταρομετρία ροής αποτελεί μια αυτοματοποιημένη μέθοδο ανάλυσης των

φυσικοχημικών χαρακτηριστικών κυττάρων και σωματιδίων, με βάση τη σκέδαση και
το φθορισμό και με την προϋπόθεση το υπό έλεγχο δείγμα να βρίσκεται σε μορφή
εναιωρήματος. Επιπλέον της ανάλυσης, η κυτταρομετρία ροής επιτρέπει την
απομόνωση κυττάρων χωρίς σχετική απώλεια της βιωσιμότητας τους και την
κάθαρση των σωματιδίων χωρίς απώλεια της δομής τους.

ΑΡΧΕΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΕΝΟΣ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΗΤΗ ΡΟΗΣ

Ο κυτταρομετρητής ροής αποτελείται από 3 βασικά συστήματα 1) το υδροδυναμικό

σύστημα ροής 2) το οπτικό σύστημα και 3) το ηλεκτρονικό σύστημα ανάλυσης
δεδομένων (σχήμα 1).
 Σχήμα 1 : γραφική αναπαράσταση των συστημάτων ενός
κυτταρομετρητή ροής

Υδροδυναμικό σύστημα ροής (FLUIDICS): Αποτελείται από την κεντρική

κυψελίδα ροής (flow cell – σχήμα 2) η οποία δρα ως κανάλι μέσω της οποίας
περνάει το κυτταρικό εναιώρημα περιβαλλόμενο από το αδρανές ρυθμιστικό διάλυμα
(sheath fluid). Χαρακτηριστικό του συστήματος είναι η εφαρμογή της θεωρίας της
υδροδυναμικής εστίασης που επιτυγχάνει τη ροή των κυττάρων σε μονήρη διάταξη.
Η σωστή ρύθμιση των ταχυτήτων και των πιέσεων μεταξύ του ρυθμιστικού
διαλύματος και του κυτταρικού εναιωρήματος επιτρέπει στα κύτταρα να διέρχονται
ένα προς ένα από το ρύγχος της κυψελίδας, σημείο στο οποίο προσπίπτει κάθετα η
ακτίνα laser του κυτταρομετρητή.

Σχήμα 2 : γραφική αναπαράσταση του υδροδυναμικού συστήματος ροής

Οπτικό σύστημα:Για τους περισσότερους κυτταρομετρητές η ακτίνα laser που
χρησιμοποιείται είναι αυτή του Αργού στα 488 nm. Τα τελευταία χρόνια υπάρχει η
επιλογή της ακτίνας Ζαφειρείου η οποία επίσης εκπέμπει στα 488 nm έχοντας το
πλεονέκτημα του μεγαλύτερου χρόνου ζωής. Οι κυτταρομετρητές τελευταίας
τεχνολογίας εφαρμόζουν πλέον και δεύτερη πηγή ακτίνας laser στα 635 nm όπως
επίσης προβλέπεται και η χρήση ως και τρίτης πηγής. Καθώς λοιπόν η ακτίνα laser
προσπίπτει στη μονήρη κυτταρική διάταξη προκαλείται σκεδασμός του φωτός
ανάλογα με το μέγεθος των κυττάρων (πρόσθιος σκεδασμός – forward scatter) και
με την κοκκίωσή τους (πλάγιος σκεδασμός – side scatter). Με αυτόν τον τρόπο
επιτυγχάνεται ο αρχικός διαχωρισμός του εναιωρήματος στους κυτταρικούς
πληθυσμούς που εμπεριέχει. Επιπλέον, στο προς ανάλυση δείγμα, προηγείται
επεξεργασία με αντισώματα σημασμένα με φθορίζουσες ουσίες. Η προσπίπτουσα
δέσμη της ακτίνας laser προκαλεί διέγερση των φθοριζουσών ουσιών και εκπομπή
σήματος σε συγκεκριμένο μήκος κύματος για κάθε φθορίζουσα ουσία. Η χρήση
περισσοτέρων της μιας πηγής ακτίνας laser εξυπηρετεί τη σύγχρονη επιλογή
πολλών διαφορετικών φθοριζουσών ουσιών οι οποίες θα μπορούν να διεγείρονται
και να εκπέμπουν σήματα σε διαφορετικές συχνότητες (Πίνακας 1 και 2). Οι
σύγχρονες ανάγκες της πολυπαραμετρικής και πολυχρωματικής κυτταρικής
ανάλυσης οδήγησε στη χρήση των σύνθετων φθοριζουσών ουσιών γνωστών ως
tandem χρωστικές. Οι συγκεκριμένες φθορίζουσες ουσίες είναι αποτέλεσμα ένωσης
δύο χρωστικών. Η διέγερση της πρώτης χρωστικής προκαλεί εκπομπή ενέργειας
που διεγείρει τη δεύτερη χρωστική. Το τελικό αποτέλεσμα είναι εκπομπή ενέργειας
και φθορισμού σε μήκος κύματος μεγαλύτερο από ότι θα μπορούσε να επιτύχει η
πηγή laser των 488nm με ένα φθοριόχρωμα.

Πίνακας 1: Μονές φθορίζουσες ουσίες (single dyes)

ΦΘΟΡΙΖΟΥΣΑ ΜΗΚΟΣ ΚΥΜΑΤΟΣ ΜΗΚΟΣ ΚΥΜΑΤΟΣ

ΟΥΣΙΑ ΔΙΕΓΕΡΣΗΣ LASER ΕΚΠΟΜΠΗΣ (nm)
(nm)
FITC 488 nm 525 nm
PE 488 nm 578 nm
ECD 488 nm 613 nm
PerCP 488 nm 675 nm
Alexa Fluor 405 405, 407 421
Alexa Fluor 430 405, 407 541
Alexa Fluor 488 488 519
Alexa Fluor 633 633, 635, 647 647
Alexa Fluor 647 633, 635, 647 665
Alexa Fluor 660 633, 635, 647 690
Alexa Fluor 680 633, 635, 647 702
APC 633, 635, 647 661

Πίνακας 2: Φθορίζουσες ουσίες tandem

ΦΘΟΡΙΖΟΥΣΑ ΜΗΚΟΣ ΚΥΜΑΤΟΣ ΜΗΚΟΣ ΚΥΜΑΤΟΣ

ΟΥΣΙΑ ΔΙΕΓΕΡΣΗΣ LASER ΕΚΠΟΜΠΗΣ (nm)
(nm)
APC-Alexa Fluor 750 633, 635, 647 779
APC – Cy 5.5 633, 635, 647 695
APC – Cy7 633, 635, 647 785
PerCP – Cy5.5 488 695
PE-Alexa Fluor 610 488 627
PE-Alexa Fluor 647 488 667
PE-Alexa Fluor 680 488 702
PE-Alexa Fluor 700 488 723
PE-Alexa Fluor 750 488 779
PE – Cy5.5 488 695
PE – Cy5 488 667
PE – Cy7 488 785
PE – Texas Red 488 615
 Ένα ιδιαίτερα πολύπλοκο σύστημα φακών, φωτοανιχνευτών και
φωτοπολλαπλασιαστών συλλέγουν τα φωτεινά σήματα και τα διοχετεύουν στο
ηλεκτρονικό σύστημα του κυτταρομετρητή ροής. Όσο περισσότερες φθορίζουσες
ουσίες χρησιμοποιούνται για την κυτταρομετρική ανάλυση τόσο πιο πολύπλοκη
γίνεται και η διαδικασία διαχωρισμού και πιθανής επικάλυψης της εκπομπής
φθορισμού των χρωστικών. Η ρύθμιση αυτή είναι γνωστή ως compensation και έχει
σκοπό την αφαίρεση των κοινών τόπων μήκους κύματος μεταξύ των φθοριζουσών
ουσιών (Πίνακας 3).

Πίνακας 3: Σχηματική απεικόνιση των επικαλυμμένων τόπων εκπομπής φθορισμού

Πίνακας 2: Φθοριοχρώματα tandem

Ηλεκτρονικό σύστημα ανάλυσης δεδομένων

Η μετατροπή των φωτεινών σημάτων σε πληροφορίες και η ανάλυση των δεδομένων

γίνεται από τον ηλεκτρονικό υπολογιστή του κυτταρομετρητή. Υπάρχουν διάφοροι
τρόποι παρουσίασης των αποτελεσμάτων. Οι επικρατέστεροι και οι πιο εύχρηστοι
είναι 1) τα ιστογράμματα κατανομής συχνοτήτων (εικόνα Α) όπου στον x άξονα
παρουσιάζεται η ένταση του φθορισμού του σήματος και στον y άξονα ο αριθμός των
κυττάρων και 2) τα στικτογράμματα (dot plots- εικόνα Β) όπου είναι δυνατή η
ταυτόχρονη παρουσίαση και μελέτη δύο παραμέτρων. Κάθε παράμετρος
παρουσιάζεται στον ένα από τους δύο άξονες του διαγράμματος. Η σύγχρονη
παρουσίαση και ανάλυση περισσότερων παραμέτρων απαιτεί πολύπλοκα διαγράμματα
(εικόνες C και D)
Σχήμα 3 : διαγράμματα παρουσίασης αποτελεσμάτων ενός κυτταρομετρητή
Εργαστηριακή ανάλυση δείγματος
Όπως συμβαίνει και για οποιαδήποτε εργαστηριακή πράξη, ένα από τα πιο
σημαντικά στάδια είναι η ορθή εφαρμογή του πρωτοκόλλου δειγματοληψίας,
μεταφοράς, συντήρησης και επεξεργασίας του βιολογικού δείγματος : α) το δείγμα
θα πρέπει να μεταφέρεται στο κατάλληλο αιματολογικό φιαλίδιο το οποίο θα
εμπεριέχει κάποια αντιπηκτική ουσία κυρίως K3EDTA ή ηπαρίνη β) η συντήρηση
του θα πρέπει να γίνεται εντός του ανάλογου χρονικού περιθωρίου. Αν είναι
περιφερικό αίμα, θα πρέπει να αναλυθεί εντός 48 ωρών ενώ εάν είναι μυελός των
οστών εντός 24 ωρών γ) σε περίπτωση ανάλυσης συμπαγούς δείγματος θα πρέπει
να γίνει κατάλληλη επεξεργασία ώστε να καταλήξει σε μορφή εναιωρήματος δ) η
μέτρηση του δείγματος στον κυτταρομετρητή ροής μετά την απαραίτητη επεξεργασία
πρέπει να γίνει μέσα σε λίγες ώρες ε) κατά τη διάρκεια ανάλυσης του δείγματος, θα
πρέπει να αναλύονται ικανός αριθμός κυττάρων έτσι ώστε να αποφεύγονται
εσφαλμένα θετικά ή αρνητικά αποτελέσματα. Συνήθως η μέτρηση 5000 – 15000
κυττάρων μπορεί να καλύψει τις περισσότερες περιπτώσεις. ‘Όταν όμως
αναλύονται δείγματα στα οποία ο υπό έλεγχο κυτταρικός πληθυσμός βρίσκεται σε
πολύ χαμηλή συγκέντρωση ( Ελάχιστη Υπολειμματική Νόσος, CD34+) τότε ο
μετρούμενος αριθμός κυττάρων μπορεί να φτάσει και τις 100.000.
 Η επεξεργασία του δείγματος συμπεριλαμβάνει το στάδιο της επώασή του με τα
απαραίτητα μονοκλωνικά αντισώματα τα οποία είναι συνδεδεμένα με τις κατάλληλες
φθορίζουσες ουσίες. Ο αριθμός και το είδος των φθοριζουσών ουσιών επιλέγεται
ανάλογα με : α) το είδος του κυτταρικού πληθυσμού, β) το υπό διερεύνηση νόσημα
και γ) την ποσότητα του επιφανειακού ή ενδοκυττάριου αντιγόνου που διερευνάται.
Οι σύγχρονοι κυτταρομετρητές ροής έχουν τη δυνατότητα επεξεργασίας μέχρι και
>30 διαφορετικών φθοριζουσών ουσιών, σε ερευνητικό επίπεδο, ενώ στην κλινική
πράξη σήμερα χρησιμοποιούνται από 6-10 διαφορετικές φθορίζουσες ουσίες. Όσο
μεγαλύτερος είναι ο αριθμός των χρωστικών τόσο πολυπλοκότερη είναι η ρύθμιση
του compensation στον κυτταρομετρητή και τόσο μεγαλύτερη η πιθανότητα
απώλειας δεδομένων.
Σε περίπτωση που θέλουμε να μελετήσουμε ενδοκυττάρια αντιγόνα το δείγμα
επιδέχεται επιπλέον επεξεργασία ώστε να είναι διαπερατή η κυτταρική μεμβράνη.
Στη συνέχεια το δείγμα αιμολύεται και είναι έτοιμο για ανάλυση στον
κυτταρομετρητή ροής.
Όπως αναφέρθηκε και παραπάνω, η αρχική ανάλυση γίνεται με βάση τον πρόσθιο
και πλάγιο σκεδασμό και έτσι διαχωρίζονται οι κυτταρικοί πληθυσμοί. Αυτός όμως
είναι ένας αδρός διαχωρισμός. Στη συνέχεια, με τη βοήθεια συγκεκριμένων
μονοκλωνικών, ειδικών για τον πληθυσμό που θέλουμε να μελετήσουμε,
επιτυγχάνουμε την ακριβή αναγνώριση των προς μελέτη κυττάρων. Για παράδειγμα,
η χρήση του CD45/CD14 στο διπλό φθορισμό θα διαχωρίσει λεμφοκύτταρα
μονοπύρηνα και πολυμορφοπύρηνα. Η χρήση του CD45 σε τριπλό φθορισμό θα
διαχωρίσει το βλαστικό λεμφοκυτταρικό πληθυσμό (και όχι μόνο), το CD4 τα Τ
λεμφοκύτταρα και το CD19 τα Β λεμφοκύτταρα. Επιλέγουμε τον κυτταρικό πληθυσμό
που θα μελετήσουμε κάνοντας περιχάραξη γύρω από αυτόν τον πληθυσμό. Η
διαδικασία αυτή είναι γνωστή ως gating. Και ο πληθυσμός που ορίζεται ονομάζεται
πλέον gate.
Σχήμα 4 : διαγράμματα διαχωρισμού και gating των κυτταρικών πληθυσμών

Το πρώτο και πολύ σημαντικό στάδιο ανάλυσης οποιουδήποτε δείγματος στον

κυτταρομετρητή είναι ο ορισμός του αρνητικού φθορισμού στον συγκεκριμένο
πληθυσμό, με τη χρήση του ισοτυπικού control. Τα ισοτυπικά control είναι
μονοκλωνικά αντισώματα κυρίως IgG τάξης (IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b). Ανάλογα
με την τάξη στην οποία ανήκουν τα κυρίως μονοκλωνικά που θα μελετήσουμε,
χρησιμοποιούμε και τα αντίστοιχα ισοτυπικά control. Για παράδειγμα, αν έχουμε
CD3+ Fitc (IgG1) / CD4+ PE (IgG1) συνδυασμό, θα πρέπει να χρησιμοποιήσουμε
και το IgG1 Fitc / IgG1 PE ισοτυπικό control. Ο αρνητικός φθορισμός είναι ένα
είδος cut off για την κυτταρομετρία. Ορίζουμε τα όρια πάνω από τα οποία το
αποτέλεσμα μας θα είναι θετικό. Είναι μια αναγκαία συνθήκη λόγω της ύπαρξης
αυτοφθορισμού από τα ίδια τα κύτταρα, της πιθανής μη ειδικής σύνδεσης καθώς και
της ύπαρξης νεκρών κυττάρων. Όλοι οι παραπάνω παράγοντες θα πρέπει να
αποκλειστούν έτσι ώστε η μέτρηση του ποσοστού των κυττάρων που συνδέονται με
το αντίστοιχο μονοκλωνικό αντίσωμα που έχει χρησιμοποιηθεί να είναι αληθής και
ακριβής.
Μετά τον αποκλεισμό του αρνητικού ποσοστού η ανάλυση και αξιολόγηση των
αποτελεσμάτων γίνεται κυρίως με τη χρήση των ιστογραμμάτων και των
στικτογραμμάτων για κάθε μία ή συνδυασμό περισσοτέρων της μιας παραμέτρων.

Έλεγχος ποιότητας κυτταρομετρητή ροής και εργαστηρίου κυτταρομετρίας

Ο έλεγχος ποιότητας σε ένα εργαστήριο κυτταρομετρίας ροής συμπεριλαμβάνει τόσο

τον έλεγχο της ορθής λειτουργίας του οργάνου όσο και της απόδοσης των
αποτελεσμάτων.

Έλεγχος ποιότητας κυτταρομετρητή ροής :

Σφαιρίδια οπτικής ευθυγράμμισης: ευθυγράμμιση των οπτικών συστημάτων.
Σφαιρίδια αναφοράς καθορισμένου φθορισμού: ρύθμιση φίλτρων και
φωτοπολλαπλασιαστών
Σφαιρίδια βαθμονόμησης : ρύθμιση της ποσοτικοποίησης των σημάτων φθορισμού
Έλεγχος ποιότητας αποτελεσμάτων εργαστηρίου κυτταρομετρίας
Εσωτερικός: μονιμοποιημένο περιφερικό αίμα γνωστών συγκεντρώσεων
Εθνικός : δεν υπάρχει επίσημος φορέας
(η Ελληνική Εταιρία Κυτταρομετρίας έχει αναλάβει τα τελευταία χρόνια
πρωτοβουλία στέλνοντας δείγματα στα εργαστήρια 3-4 φορές το χρόνο και στη
συνέχεια γίνεται επεξεργασία των αποτελεσμάτων και ενημέρωση όλων των
ενδιαφερόντων εργαστηρίων)
Eξωτερικός: ευρωπαϊκά προγράμματα ελέγχου ποιότητας
Η κυτταρομετρία ροής αποτελεί μια ιδιαίτερα ευαίσθητη και αυτοματοποιημένη
μεθοδολογία ανάλυσης πολλαπλών παραμέτρων. Παρόλα αυτά, η αξιολόγηση των
αποτελεσμάτων απαιτεί την άρτια και εμπεριστατωμένη γνώση του αντικειμένου
καθώς η ανάλυση των ζητούμενων στοιχείων βασίζεται σε μεγάλο βαθμό στις
επιστημονικές και τεχνικές γνώσεις του χειριστή και αναλυτή ενός κυτταρόμετρου.
Δεδομένης αυτής της ιδιαιτερότητας η κυτταρομετρία ροής, αν και
αυτοματοποιημένη, επιδέχεται μεγάλο βαθμό υποκειμενικότητας γι αυτό και ο
κυτταρομετρητής ροής διαφοροποιείται από πολλούς αναλυτές στο σύγχρονο
εργαστήριο. Οι εφαρμογές της κυτταρομετρίας είναι πολλές, αυξάνονται συνεχώς
όσο εξελίσσονται οι τομείς της μοριακής βιολογίας, της βιοχημείας, της φυσικής και
της ηλεκτρονικής τεχνολογίας, η παρουσία όμως ενός καταρτισμένου επιστήμονα θα
παραμένει αναπόσπαστο κομμάτι ενός έγκυρου αποτελέσματος από έναν
κυτταρομετρητή ροής.

ΑΝΟΣΟΦΑΙΝΟΤΥΠΟΣ ΠΕΡΙΦΕΡΙΚΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ

Η ανοσοφαινοτυπική ανάλυση των υποπληθυσμών των λεμφοκυττάρων αποτελεί τη
πιο απλουστευμένη εφαρμογή της κυτταρομετρίας ροής. Με ένα πολύ απλό
συνδυασμό μονοκλωνικών αντισωμάτων επιτυγχάνεται ο πρώτος αδρός έλεγχος του
ανοσοποιητικού συστήματος.

*CD45 FITC / CD14 PE (ταυτοποίηση λεμφοκυττάρων για gating – τα

λεμφοκύτταρα είναι CD45+ CD14-)
*CD3 FITC / CD4 PE ( μέτρηση CD4 T λεμφοκυττάρων και όχι των
μονοκυττάρων τα οποία επίσης εκφράζουν το CD4)
*CD3 FITC / CD8 PE ( μέτρηση των CD8 T λεμφοκυττάρων και όχι των NK
τα οποία έχουν φαινότυπο CD3- /CD8+)
*CD3 FITC / CD19 PE ( μέτρηση T και B λεμφοκυττάρων)
*CD3 FITC / CD16/56 PE ( μέτρηση T και NK λεμφοκυττάρων)
CD3-/ CD16+, (υποπληθυσμός NK λεμφοκυττάρων με κυτταροτοξική δράση)
 CD3-/ 56+ (υποπληθυσμός NK λεμφοκυττάρων που εκκρίνει κυτταροκίνες)
CD3+/ CD16+56 (ΝΚ-like ή ΝΚΤ λεμφοκύτταρα)
CD4/CD8 (Λόγος Τ βοηθητικών /Τ κυτταροτοξικών λεμφοκυττάρων)

Περαιτέρω ανάλυση βασικών κυτταρικών υποπληθυσμών

Υποδοχείς Τ λεμφοκυττάρων
TCRαβ, TCRγδ
Οι τιμές των αβ και γδ κυττάρων υπολογίζονται επί του ποσοστού των CD3+
κυττάρων (TCRαβ+/CD3+ x100)/CD3+ και (TCRγδ+/ CD3+ x100)/CD3+

Δείκτες κυτταρικής ενεργοποίησης

HLA-DR, CD25, CD38 (π.χ CD3/DR, CD4/CD25, CD8/38)

Δείκτες διαφοροποίησης
CD45RA (παρθένα κύτταρα)
CD45RO (μνημονικά κύτταρα)

Υποτροπιάζουσες λοιμώξεις
Έλεγχος ανοσοφαινότυπου με ιδιαίτερη προσοχή στο λόγο CD4/CD8
Σε περίπτωση EBV λοίμωξης ο λόγος αναμένεται πολύ χαμηλός (<1)
Συγκριτικά, ο λόγος CD4/CD8 είναι χαμηλότερος σε περίπτωση EBV λοίμωξης σε
σχέση με τη CMV λοίμωξη (κλινικά παρουσιάζουν παρόμοια συμπτώματα και η
κυτταρομετρία ροής δείχνει μια γενική κατεύθυνση γιατί οι καλλιέργειες αργούν).
Γενικά μπορεί να παρατηρηθεί αύξηση τόσο των Β λεμφοκυττάρων όσο και των
CD3/8 κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων και των ΝΚ κυττάρων.
Σε παιδιατρικά περιστατικά γίνεται και έλεγχος των TCRαβ+/CD3+ και TCRγδ+/
CD3+. Παρακολουθείται η πιθανή αύξηση των γδ κυττάρων

Αλλεργίες
Επιπλέον του βασικού ανοσοφαινότυπου γίνεται μέτρηση των CD19+/CD23+
κυττάρων. Μελετάμε την αύξηση της έκφρασης του χαμηλής συγγένειας υποδοχέα
της IgE στα Β λεμφοκύτταρα. Για τον συγκεκριμένο υποπληθυσμό δεν υπάρχουν
φυσιολογικές τιμές. Εμπειρικά, τιμές >5% θεωρούνται αυξημένες.

Υπογονιμότητα

Γίνεται έλεγχος των ΝΚ κυττάρων (CD3-/16+56+) και των υποπληθυσμών

(CD3-/16+ και CD3-/56+). Εξαρτάται από τον παραπέμπων ιατρό εάν θα ζητήσει
πλήρη ανοσοφαινότυπο ή επιπλέον υποπληθυσμούς.
Γενικά ελέγχεται η αύξηση των ΝΚ κυττάρων, των γδ Τ λεμφοκυττάρων ( φ.τ <10%),
των Τ ρυθμιστικών (CD4/25) και του υποπληθυσμού των Β κυττάρων που
παράγουν αυτοαντισώματα (CD19/5). Για τους δύο τελευταίους υποπληθυσμούς δεν
υπάρχουν φυσιολογικές τιμές. Εμπειρικά, τιμές >5% θεωρούνται αυξημένες.

Σκλήρυνση κατά πλάκας

Γίνεται ο έλεγχος του λόγου CD4/CD8 και καταγράφεται ο απόλυτος αριθμός των
κυτταρικών πληθυσμών (λεμφοκύτταρα, πολυμορφοπύρηνα και μονοπύρηνα για την
εφαρμογή μονοκλωνικής θεραπείας)
Το εύρος της τιμής του λόγου εξαρτάται από την κλινική πορεία του ασθενούς και
την ανάλογη θεραπευτική αγωγή που εφαρμόζει ο κλινικός ιατρός.
Η βιβλιογραφία αναφέρει αναμενόμενη αύξηση των CD4 αυτοδραστικών Τ
λεμφοκυττάρων.

Μεταμοσχευμένοι ασθενείς ή νεφροπαθείς

Γίνεται ο έλεγχος του λόγου CD4/CD8
Το εύρος της τιμής του λόγου εξαρτάται από την κλινική πορεία του ασθενούς και
την ανάλογη θεραπευτική ανοσοκατασταλτική αγωγή που εφαρμόζει ο κλινικός
ιατρός. Εμπειρικά, ο λόγος κυμαίνεται από 0,8 –1,5 χωρίς να αποκλείονται και
σημαντικές αποκλίσεις.

Πρωτοπαθείς Ανοσοανεπάρκειες

Για την ταυτοποίηση των πρωτοπαθών ανεπαρκειών του ανοσοποιητικού

συστήματος πρέπει να έχουν αποκλειστεί οι περιπτώσεις των δευτερογενών
ανοσοανεπαρκειών ( λοιμώδη νοσήματα, νεοπλασματικά νοσήματα, αυτοάνοσα
νοσήματα κ.α.). Μελετάται ο αριθμός των κυτταρικών υποπληθυσμών του αίματος
και η ενεργοποίηση τους σε ιδιάζουσες περιπτώσεις. Η εφαρμογή της μελέτης των
πρωταπαθών ανοσοανεπαρκειών αναφέρεται κυρίως σε παιδιατρικές κλινικές.

Ταυτοποίηση Κυτταρικών Υποπληθυσμών

CD45 FITC / CD14 PE (gating λεμφοκυττάρων )

CD3 FITC / CD19 PE ( T λεμφοκύτταρα , Β λεμφοκύτταρα)
CD 10 FITC / CD20 PE ( άωρα Β λεμφοκύτταρα , ώριμα Β λεμφοκύτταρα )
CD 3 FITC / CD16+56 PE ( T λεμφοκύτταρα , ΝΚ λεμφοκύτταρα)
Σε ευρύτερο έλεγχο των παιδιατρικών περιστατικών, γίνεται πλήρη ανάλυση του
βασικού ανοσοφαινότυπου και επιπλέον:
TCRαβ+/CD3+ και TCRγδ+/ CD3+ (Παρακολουθείται η πιθανή αύξηση των γδ
κυττάρων)
Σε περίπτωση κοινής ποικίλης ανοσοανεπάρκειας (CVID) γίνεται περαιτέρω
έλεγχος των CD19+/CD21- και CD19+/27+ υποπληθυσμών για την κατάταξη των
ασθενών με βάση τα διεθνή κριτήρια. Η βασική κατάταξη συμπεριλαμβάνει 3 ομάδες
: ομάδα 1 ομάδα 2 και ομάδα3
CD19+/CD21-
CD19+/27+

Μελέτη Ενεργοποίησης Ανοσοποιητικού

DHR 123 για την ποσοτική μέτρηση ενδοκυττάριων οξειδωτικών ουσιών
(Χρόνια κοκιωματώδη νοσο-φαγοκυττάρωση)
Έκφραση κυτοχρώματος b στην μεμβράνη των πολυμορφοπύρηνων –
mAds 7D5 FITC , PE (Χρόνια κοκιωματώδη νόσος)
CD11a , CD11b , CD11c , CD18 FITC , PE , PerCP , APC για την έκφραση
των ιντεγκρινών στην μεμβράνη των λευκοκυττάρων ( LAD1 cyndrome)
CD15s ( sialyl-LewisX) FITC , PE , PerCP (LAD-2 syndrome)
CD40L FITC (Φυλοσύνδετο υπερ-IgM σύνδρομο. Μόριο συνδιέγερσης
στην επιφάνεια των Τα βοηθητικών λεμφοκυττάρων και συνδέεται με το CD40
των Β λεμφοκυτάρων. Είναι σημαντικό για τον πολλαπλασιασμό των Β
λεμφοκυττάρων και για την ισοτυπική μεταστροφή (switching) από την
ανοσοσφαιρίνη IgM σε IgG, IgA, ή IgE)
Μελέτη MHC ταξης Ι , MHC τάξης ΙΙ , HLA-DR αντιγόνων
( ανεπάρκεια στην έκφραση των αντιγόνων ιστοσυμβατότητας)
TCRα/β FITC , TCR γ/δ PE ( σύνδρομο Gi-George)
CD45RA FITC / CD45RO PE (άωρα και μνημονικά Τ λεμφοκύτταρα
αντίστοιχα για μελέτη της λειτουργίας του ανοσοποιητικού μετά από
ανοσοκαταστολή)
IN VITRO ειδική ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων και ανίχνευση CD
69 (πρώιμος δείκτης ενεργοποίησης), (TH1: IL-2 , IFN-γ , TH2: IL-4 , IL-10)
για μελέτη εξειδικευμένης ενεργοποίησης
ανίχνευση αρχέγονων προγονικών κυττάρων (cd34)
stem cells detection
Η εφαρμογή αναφέρεται σε:
Α.Μεταμοσχεύσεις μυελού των οστών.
Β.Τράπεζες αποθήκευσης και κρυοσυντήρησης ομφαλιοπλακουντικού αίματος.

CD45 FITC / CD34 PE (μέτρηση απόλυτου αριθμού των CD34)

CD45 FITC / CD34 PE / CD38 PerCP (Ανίχνευση βαθμού διαφοροποίησης
των CD34)
Η μέτρηση και ταυτοποίηση του βαθμού διαφοροποίησης των CD34 είναι απαραίτητη
διότι:
Α. Απαιτείται συγκεκριμένος αριθμός κυττάρων ανά κιλό σωματικού βάρους.
Β. Η ταυτοποίηση των CD38- Stem Cells έχει ιδιαίτερο ερευνητικό ενδιαφέρον διότι
ο συγκεκριμένος υποπληθυσμός είναι ο πλέον πολυδύναμος και αδιαφοροποίητος.

ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗ ΤΩΝ HIV+ ΑΣΘΕΝΩΝ

HIV MONITORING
Κατά την HIV λοίμωξη ελαττώνεται ο αριθμός των CD4 T λεμφοκυττάρων και
αυξάνεται αυτός των CD8 T λεμφοκυττάρων ενώ ο τελικός αριθμός των
λεμφοκυττάρων (CD3) παραμένει σχετικά σταθερός.

*CD45 FITC / CD14 PE (ταυτοποίηση λεμφοκυττάρων για gating – τα

λεμφοκύτταρα είναι CD45+ CD14-)
*CD3 FITC / CD4 PE ( μέτρηση CD4 T λεμφοκυττάρων και όχι των
μονοκυττάρων τα οποία επίσης εκφράζουν το CD4)
*CD3 FITC / CD8 PE ( μέτρηση των CD8 T λεμφοκυττάρων και όχι των NK
τα οποία έχουν φαινότυπο CD3- /CD8+)
*CD3 FITC / CD19 PE ( μέτρηση T και B λεμφοκυττάρων)
*CD3 FITC / CD16/56 PE ( μέτρηση T και NK λεμφοκυττάρων)

Η μέτρηση των Β και ΝΚ λεμφοκυττάρων είναι για κοντρόλ της μεθόδου (T+B+NK
cells = CD45+ cells), ενώ το gating με τα CD45+ κύτταρα είναι απαραίτητη
προϋπόθεση για την αποδοχή των αποτελεσμάτων ( NIAID DAIDS
κατευθυντήριες γραμμές). Η παραπάνω προσέγγιση μπορεί να γίνει και με την χρήση
διπλού, τριπλού ή τετραπλού φθορισμού, σε περιπτώσεις που διατίθεται αντίστοιχο
κυτταρόμετρο (5 ή 6 παραμέτρων).
ΣΗΨΗ – ΦΛΕΓΜΟΝΗ

Βασικό πρόβλημα στις Μονάδες Εντατικής Θεραπείας. Η κυτταρομετρία ροής με την

ταυτοποίηση των λευκών αιμοσφαιρίων έχει συμβάλει τόσο στην έρευνα όσο και
στην διάγνωση της νόσου. Η μελέτη της σήψης εστιάζεται στα πολυμορφοπύρηνα –
ουδετερόφιλα , στα μονοκύτταρα – μακροφάγα και στα λεμφοκύτταρα.

DHR123 για την ποσοτική μέτρηση ενδοκυττάριων οξειδωτικών ουσιών

( οξειδωτικό στρες)
CD16 , πρωτεϊνάση 3 (pr 3) , μυελοϋπεροξειδάση (MPO) , ελαστάση
(HLE) , CD11 , CD54 , CD66b , CD64 , CD63 , CD62L , CD10 , TNF-R55 , NF-
κβ επιφανειακή έκφραση σε πολυμορφοπύρηνα και μονοκύτταρα
Μελέτη παραγωγής κυτταροκινών (κυρίως IL-6)
Μελέτη sCD14 , HLA-DR , CD64 , CD71 , CD86 στα μονοκύτταρα
Κυκλοφορούντα μονοκύτταρα συνδεδεμένα με LPS
Απόπτωση

ΑΠΟΠΤΩΣΗ – ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΙΣΜΕΝΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΘΑΝΑΤΟΣ

APOPTOSIS PATHWAYS DETECTION – CELL DEATH

Η απόπτωση ή προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος αποτελεί βασική

κυτταρική απόκριση η οποία μελετάται σε πληθώρα κυτταρικών αποκρίσεων
 (σήψη, καρκίνος, χημειοθεραπεία). Η συγκεκριμένη εφαρμογή αναφέρεται στο
πλείστον των ερευνητικών εφαρμογών.

PI / ANNEXIN V FITC
BCECF or carboxy–SNARF ΓΙΑ ΕΝΔΟΠΛΑΣΜΑΤΙΚΟ PH
BCL2 FITC (δείκτης απόπτωσης)
KASPASES FITC / PE / PerCP (δείκτες απόπτωσης)
FAS FITC / FASL PE (ταυτοποίηση μονοπατιού υποδοχέων
θανάτου , ισορροπία κυτταρικών υποπληθυσμών aνοσοποιητικού)
Death Receptors (DR , ταυτοποίηση μονοπατιών απόπτωσης ,
υπερέκφραση σε πληθώρα όγκων-λευχαιμίων)
SMAC/Diablo FITC (δείκτης μιτοχονδριακού μονοπατιού
απόπτωσης)
JC1 , Rhodamine για ανάλυση μιτοχονδριακού δυναμικού

ΜΕΛΕΤΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΚΥΚΛΟΥ

CELL CYCLE AND DNA ANALYSIS

Η ανάλυση του κυτταρικού κύκλου αποτελεί σημαντική προσέγγιση στην πρόγνωση

διαφόρων μορφών καρκίνου, αναφέρεται σε ογκολογικές κλινικές και σε ερευνητικές
προσεγγίσεις.

PI / PHOSPHO HISTONE3 FITC (G1 , S , G2 , M PHASE

DETECTION)
BRDU-ANTIBRU (S PHASE DETECTION)
DAPI OR HOECT (UV EXCITATION BLUE EMMISSION)
PCNA FITC για ανάλυση S φάσης
PI/CYTOKERATIN FITC για ανάλυση κυτταρικού κύκλου/DNA
επιθηλιακών κυττάρων όγκων
Survivin FITC (δείκτης G2/M φάσης υπερέκφραση σε πληθώρα
όγκων-λευχαιμιών

ΜΕΛΕΤΗ ΑΙΜΟΠΕΤΑΛΙΩΝ
PLATELETS MEASUREMENT
Η μελέτη της ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων είναι ιδιαίτερα σημαντική για τις
αιμοδοσίες διότι μας ενδιαφέρει τα αιμοπετάλια να είναι μη ενεργά στις διάφορες
εφαρμογές τους.

Μορφολογία αιμοπεταλίων (Fsc/Ssc)

P-selectin FITC (CD 62P)
CD41 (σχηματισμός μικροσφαιριδίων)
CD61 (αύξηση)
CD42 (μείωση)
CD63 (έκφραση πρωτεϊνών λυσοσωματίων)
Annexin V FITC (ταυτοποίηση αρνητικά φορτισμένων μεμβρανών)

Εδώ πρέπει να τονιστεί ότι για την περίπτωση των αιμοδοσιών μια από τις
εφαρμογές της κυτταρομετρίας ροής είναι και η μέτρηση των υπολειπόμενων
λευκών στα λευκαφαιρεμένα αίματα

ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΚΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ

ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΡΑΓΜΑΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ ΜΕ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ

ΡΟΗΣ ΠΡΟΤΕΙΝΟΥΜΕ ΤΑ ΠΑΡΑΚΑΤΩ PANEL (Τ-Χρόνια λεμφογενή λευχαιμία,
Β-Χρόνια λεμφογενή αναιμία, Μυέλωμα, Λεμφοκυττάρωση, Mabthera,
Λεμφοκυτταρικός τύπος)

Α ΧΡΟΝΙΑ Τ ΛΕΜΦΟΓΕΝΗΣ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ

FITC PE
1 G1 G2α
2 CD45 CD14
3 CD3 CD19
4 CD3 CD16-56
5 CD3 CD4
6 CD3 CD8
7 CD3 CD25
8 CD57 CD8
9 CD7 CD4
10 CD2 HLA-DR
11 CD57 CD11b
12 TCRαβ TCRγδ

Β ΧΡΟΝΙΑ Β ΛΕΜΦΟΓΕΝΗΣ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ

FITC PE
1 G1 G2α
2 CD45 CD14
3 CD3 CD19
4 CD3 CD16-56
5 CD4 CD8
6 CD5 CD19
7 CD20 CD23
8 CD10 HLA-DR
9 CD25 CD79α
10 CD38 CD22
11 CD19 CD79b
12 FMC-7 CD11c
13 κ λ
14 CD103 CD22
15 CD38 CD138
Γ ΠΟΛΛΑΠΛΟΥΝ ΜΥΕΛΩΜΑ
FITC PE
1 G1 G2α
2 CD45 CD14
3 CD3 CD22
4 CD45 CD8
5 CD57 CD19
6 CD20 CD23
7 CD20 CD38
8 CD10 HLA-DR
9 CD38 CD56
10 CD2 CD79α
11 κ λ
12 CD38 CD138
Δ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ
FITC PE
1 G1 G2α
2 CD45 CD14
3 CD15 HLA-DR
4 CD34 CD13
5 CD7 CD33
6 CD14 CD2
7 CD3 CD19
8 CD4 CD8
9 CD10 CD22
10 CD5 CD20
11 CD34 CD117
12 G1 G2α
13 MPO CD34
14 Tdt CD33

Ε MABTHERA
FITC PE
1 G1 G2α
2 CD45 CD14
3 CD19 CD2
4 CD3 CD1656
5 CD4 CD8
6 CD5 CD19
7 CD20 CD23
8 CD7 HLA-DR
9 CD25 CD22
10 κ Λ
11 CD57 CD8
12 CD8 CD28
13 CD8 CD38
14 TCRαβ TCRγδ
ΣΤ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΣΗ
FITC PE
1 G1 G2α
2 CD45 CD14
3 CD19 CD2
4 CD3 CD1656
5 CD4 CD8
6 CD5 CD19
7 CD7 HLA-DR
8 CD3 CD25
9 CD57 CD8
10 κ λ