Fermentų inhibitoriai

Fermentų inhibitoriais vadinamos medžiagos, kurios lėtina fermentinės reakcijos greitį. Šis reiškinys yra labai paplitęs gamtoje, kadangi
specifinės, nedidelės molekulinės masės medžiagos, metalų jonai, prisijungdami prie fermento gali keisti fermentinės reakcijos greitį,
reguliuoti įvairius metabolinius procesus. Dauguma toksinių medžiagų, vaistų slopina atitinkamus fermentus (ar receptorius), tuo pasireiškia jų
naudingas ar žalingas veikimas. Pavyzdžiui aspirinas (acetilsalicilo rūgštis) slopina ciklooksigenazę (ji dar vadinama PGH-sintazė 1), fermentą,
dalyvaujantį pradinėse prostaglandinų sintezės stadijose ir mažina žmogaus kūno temperatūrą, inhibuoja trombocitų agregaciją ir kraujo
krešėjimą. Ciklooksigenazės aktyvumas slopinamas acetilinant fermento aktyviame centre esantį seriną. Vaistas Pemetrexed, naudojamas
onkologijoje, inhibuoja keturis folio rūgšties ciklo fermentus ir stabdo navikinių ląstelių dauginimąsi. Gerai žinomas nuodas cianidas, blokuoja
mitochondrijų kvėpavimo grandinės fermentą citochromo c oksidazę ir mažina ATP sintezės greitį. Fermentų slopikliai plačiai panaudojami
fermento aktyvaus centro, jo veikimo mechanizmo tyrimams.
 E+S ES E+P
Fermentų inhibicijos principai E+I
k+i
EI
Fermentui, reaguojant su inhibitoriumi (I) susidaro fermento inhibitoriaus (EI) kompleksas. Priklausomai k-i
nuo EI komplekso tvirtumo (nuo slopinimo konstantos Ki ) slopinimas gali būti grįžtamas ir [E] [I]
Ki =
negrįžtamas. Jeigu k+i >> k-i, tai slopinimas negrįžtamas , jeigu k+i≤k -i, tai - grįžtamas. [EI]

Negrįžtamos inhibicijos atveju susidaręs EI kompleksas labai lėtai disocijuoja. Negrįžtami cholinesterazės inhibitoriai fosforo
rūgšties esteriai – vieni iš pavojingiausių cheminių ginklų, jie kovalentiškai prisijungia prie fermento acetilcholino esterazės
aktyviame centre esančios aminorūgšties serino hidroksigrupės ir negrįžtamai blokuoja fermentą. Acetilcholinas išskiriamas kaip
nervinės stimuliacijos atsakas ir jungiasi prie cholinerginių receptorių taip iššaukdamas raumenų susitraukimą ir įvairių liaukų sekreciją.
Šio neurotransmitoriaus veikimas staigiai nutraukiamas cholinesterazės, kuri suhidrolizuoja acetilcholiną – tokiu būdu vyksta šio signalo
reguliavimas. Jei cholinesterazė inhibuojama, nervinio signalo perdavimas tampa nebekontroliuojamas – prasideda traukuliai, sekrecija
iš visų liaukų ir gana greitai ištinka mirtis.
Grįžtamos inhibicijos atveju, sumažinus slopiklio
koncentraciją (arba konkurentinės inhibicijos atveju
padidinus substrato koncentraciją) fermento-
inhibitoriaus kompleksas lengvai disocijuoja į laisvą
fermentą ir inhibitorių, fermento aktyvumas atsistato.
Grįžtamas slopinimas skirstomas į konkurencinį,
nekonkurencinį, bekonkurencinį, mišrų ir kitus. Štai
tos pačios cholinesterazės grįžtamieji inhibitoriai, tokie
kaip Edrophonium, nėra cheminis ginklas ir naudojami
raumenų nepakankamumui gydyti.
Norint nustatyti slopinimo rūšį, matuojama
fermentinės reakcijos greičio priklausomybė nuo
substrato koncentracijos, esant ir nesant slopikliui.
Nubraižoma priklausomybė 1/V0 nuo 1/[S].
 Konkurencinė inhibicija
Esant konkurencinei inhibicijai inhibitorius ir substratas jungiasi prie tos pačios fermento vietos ir didelės
substrato koncentracijos susilpnina inhibitoriaus poveikį. Inhibitorius reaguoja tiktai su laisvo fermento
molekule.
Dažnai substratas ir inhibitorius turi panašias struktūras ir konkuruoja vienas su kitu dėl susirišimo su fermento
aktyviuoju centru. Klasikinis konkurencinio slopinimo pavyzdys yra fermento sukcinato dehidrogenazės
veikimo stabdymas. Šio fermento aktyvumą blokuoja malono rūgštis. Slopiklio struktūra yra labai panaši į
substrato, tačiau turi viena -CH2- mažiau, abu junginiai sąveikauja su ta pačia fermento aktyvaus centro vieta.
Padidinus gintaro rūgšties koncentraciją, sumažėja malono rūgšties poveikis ir atvirkščiai. Vmax [S]
V0 =
[S] + K M (1 + [I]/K i )

k+1 kk+2
E+S ES E+P
+ k-1
I
Ki

EI

Substratų konkurencija dėl aktyvaus centro struktūros irgi yra fermentinės

reakcijos, pagal konkretų substratą, inhibicija. Alkoholio dehidrogenazė
katalizuoja etilo ir metilo alkoholių oksidaciją. Metanolis yra labai nuodingas, net
nedideli jo kiekiai sukelia apakimą ir mirtį. Metanolio oksidacijos produktas
formaldehidas yra labai toksiškas. Apsinuodijus metanoliu duodama gerti ar
leidžiamas į kraują etanolis. Etanolis ir metanolis konkuruoja tarpusavyje dėl
prisijungimo prie fermento aktyvaus centro, todėl dideli etilo alkoholio kiekiai
apsaugo organizmą nuo metanolio poveikio.
Nekonkurencinė inhibicija
Nekonkurencinio slopinimo atveju substratas ir slopiklis reaguoja ne su ta pačia fermento vieta ir
substrato perteklius nesumažina slopiklio poveikio. Slopiklis gali nepriklausomai prisijungti prie
laisvo fermento ir prie fermento substrato komplekso ir sudaryti EI ar EIS kompleksus.
Nekonkurencinis slopiklis sumažina laisvo fermento, galinčio susijungti su substratu, koncentraciją.
k+1 k+2
E+S ES E+P
Nekonkurencinio slopinimo metu substratas ir slopiklis + k-1 +
nekonkuruoja tarpusavyje. Citochromo P450 2C9 I I
fermento, atsakingo už įvairių ksenobiotikų oksidaciją,
Ki Ki
inhibicija flavanoidais gali būti tiek konkurentinė
(dauguma flavonų) tiek nekonkurentinė (6- EI + S EIS
hidroksiflavonas).

Vmax [S]
V0 =
[S](1 + [I]/K i ) + K M

Nekonkurentinė inhibicija
Bekonkurencinė inhibicija
Bekonkurencinio slopinimo metu inhibitorius reaguoja tik su ES, o nereaguoja su laisvu E. Bekonkurencinio
slopiklio prijungimas iššaukia fermento aktyvaus centro konformacinius pakitimus ir fermentinės reakcijos
greičio sumažėjimą.
Keletas pesticidų yra bekonkurenciniai inhibitoriai, geriausiai žinomas inhibitorius N- E+S ES E+P
+
(fosfonometil)glicinas, geriau žinomas Roundup vardu. Jis yra 3-fosfošikimato 1-
I
karboksiviniltransferazės (EPSP sintazės) inhibitorius. EPSP yra prekursorius
aromatinėms aminorūgštims gauti. Ki

EIS
 Mišri inhibicija
Mišraus slopinimo atveju slopiklis jungiasi ne prie aktyvaus centro, bet prie kitos
srities. Jis gali prisijungti arba prie E arba prie ES. Mišraus slopiklio poveikyje kinta
tiek KM, tiek ir Vmax. Nekonkurentinis inhibitorius gali dalyvauti visuose virsmuose Ks,
Ks’, Ki, Ki’ – iš tiesų klasikinis nekonkurentinis inhibitorius yra atskiras Mišrios
inhibicijos atvejas kai Ks=Ks‘ ir Ki=Ki‘.

Praktikoje mišrus ir bekonkuretinis slopinimas dažniausiai stebimas, kai fermentas

raeguoja su dviem ar daugiau substratų.
1. Visada įmanomas
2. Neįmanomas su bekonkurentiniais
inhibitoriais
Savižudžiai slopikliai 3. Neįmanomas su konkurentiniais
inhibitoriais
Yra cheminių medžiagų, kurios pačios neveikia kaip inhibitoriai,
tačiau patekusios į organizmą jos metabolizuojamos ir susidarę 4. Neįmanomas su konkurentiniais ir su
produktai jau tampa tų pačių ar kitų fermentų inhibitoriais. bekonkurentiniais inhibitoriais.
Fluoracto rūgštis organizme susijungia su CoASH, susidaręs
fluoracetil-CoA virsta fluorcitratu, kuris inhibuoja fermentą
akonitazę.
KoA-SH H
O - Sintetinant naujus vaistus yra labai svarbu
F C COO
-
F C COO F C C~ S KoA
HO C COO-
nustatyti ne tiktai naujų cheminių medžiagų,
H2 H2
C COO
- bet ir ląstelėje susidariusių metabolitų poveikį
H2 gyvybinėms organizmo funkcijoms.
Fluoracetatas Fluoracetil-KoA Fluorcitratas
Fermentų kofaktoriai
Dažnai į fermentų sudėtį be baltyminės dalies įeina nedidelės molekulinės masės organinės medžiagos ar jonai, kurie yra būtini fermento
veikimui ir vadinami kofaktoriais. Fermentų kofaktorius galima suskirstyti į dvi grupes:
1.Kofermentai
2.Neorganiniai kofaktoriai (dažniausiai metalų jonai)
Kofermentais vadinamos nedidelės molekulinės masės organinės
medžiagos, kurios būdamos fermento aktyviame centre dalyvauja katalizėje.
Vienas iš plačiausiai sutinkamų kofermentų yra NAD.
Geležies sulfidinis klasteris, sutinkamas Feredoksinų
Veikiant glicerolio aldehido 3-fosfato dehidrogenazei (GAPDH), glicerolio šeimos proteinuose
aldehido 3-fosfatas oksiduojasi redukuodamas NAD+. Susidaręs NADH
GAPDH LDH
disocijuoja nuo fermento, susijungia su laktato dehidrogenaze (LDH) ir glicerolio aldehido
NAD+ pieno rūgštis
redukuoja piruvo rūgštį. Tokiu būdu NAD pagalba elektronai ir protonai nuo 3-fosfatas
glicerolio aldehido 3-fosfato yra pernešami ant piruvo rūgšties. 1,3-bisfosfoglicerolio
NADH + H+ piruvo rūgštis
rūgštis
Jei kofermentai yra silpnai susirišę su fermentu – jie gali būti pašalinami nuo baltymo jį dializuojant. Baltyminė fermento dalis yra
vadinama apofermentu, o kofermento ir apofermento junginys, t.y. pilnas fermentas - holofermentu. Holofermentas = apofermentas +
kofermentas
Tiriant kofermentų cheminę struktūrą buvo parodyta, kad labai dažnai į kofermentų sudėtį įeina vitaminai ar jų dariniai. Žmogaus organizmas
nesugeba sintetinti vitaminų, todėl jų negaunant su maistu, nesusidaro kofermentai, sutrinka atitinkamų fermentų veikla, pakinta medžiagų
apykaita. Fermentinių reakcijų metu kofermentai chemiškai pakinta (oksiduojami, redukuojami, prijungiamos įvairios funkcinės grupės),
tačiau veikiant tam pačiam ar kitiems fermentams yra regeneruojami.
Jei kofermentas prisijungęs prie apofermento stipriu, dažniausiai kovalentiniu ryšiu - dializuojant fermentą jis nėra pašalinamas, tokie
kofermentai dar vadinami prostetinėmis grupėmis.
Dažnai sutinkamas biochemijoje terminas kosubstratas yra klaidinantis – kai kurie kofermentai gali būti laikomi kosubstratais dėl silpnos
sąveikos su fermentu, tačiau labiau šis terminas tinka tokioms molekulėms kaip ATP ir pan.
 Kai kurie fermentų kofaktoriai
Kofermentas Katalizuojamos reakcijos tipas Reakcijos metu Kofermento
pernešama sudėtyje esantis
vitaminas
NAD, NADP oksidacijos - redukcijos protonai ir niacinas(PP)
reakcija elektronai B3
FAD, FMN oksidacijos - redukcijos protonai ir riboflavinas (B2)
reakcija elektronai
Kofermentas Q oksidacijos - redukcijos protonai ir
(CoQ) reakcija elektronai
Kofermentas A acilo grupės aktyvacija ir R-CO- pantoteno
(CoA) pernaša rūgštis(B5)
Lipo rūgštis acilo grupės pernaša, R-CO- lipo rūgštis
oksidacija-redukcija
Tiamindifosfatas Oksidacinis dekarboksilinimas Atskyla CO2 tiaminas (B1)

Biotinas karboksilinimas Bikarbonatas biotinas (H)

Piridoksalfosfatas peramininimas -NH2 piridoksinas (B6)
dekarboksilinimas Atskyla CO2
racemizacija
Tetrahidrofolio vieno anglies atomo -CH 3 folio rūgštis (Bc)
rūgštis fragmento pernešimas -CHO
-CH2-
SAM metilgrupės pernešimas -CH3

piridoksalfosfatas Piridoks-4-karboksirūgštis Ciankobalaminas vidumolekuliniai B12

deoksiadenozil- persitvarkymai ribonukleotidų
kobalaminas redukcija

metilkobalaminas metilgrupės pernešimas -CH3 B12

 -
2H+, 2e
Nikotinamidiniai kofermentai SH2 + NAD + S + NADH + H
+

Nikotinamidadenindinukleotidas (oksiduotas, redukuotas, fosforilintas oksiduotas ir fosforilintas redukuotas) šios formos atitinkamai žymimos
NAD+, NADH, NADP+, NADPH. NAD dalyvauja daugelyje oksidacinių redukcinių reakcijų, kuriose nuo substrato (S) yra paimami ir
pernešami elektronai ir protonai. Žinoma daugiau nei 200 fermentų, kurie katalizuoja vandenilio atomo (protono ir elektrono) pernešimą nuo
substrato ant NAD+ ar NADP+. Šie fermentai priklauso oksidoreduktazių klasei, tačiau paprastai jie vadinami dehidrogenazėmis.

Kaip matome iš cheminės formulės į NAD‘o sudėtį įeina du nukleotidai -

nikotinamido ir adenino, kurie sujungti fosfoanhidridiniu ryšiu. NADP molekulėje
fosforo rūgštis prijungta prie adeninnukleotido ribozės 2/ anglies atomo.
Nežiūrint į tai, kad NAD molekulė yra didelė, reakcija vyksta tiktai su nikotinamido
žiedu. Likusi molekulės dalis reikalinga kofermento prijungimui prie apofermento
ir jo orientavimui aktyviame centre.
Į nikotinamidinių kofermentų sudėtį įeina vitaminas PP arba
niacinas. Esant jo trūkumui susergama pelagra.
COOH
CONH2 N S
N CH3
N N
Nikotino rūgštis Nikotinamidas Nikotinas
Niacinas
Vitaminas PP

Nikotinamidiniai kofermentai (žinomi kaip piridininiai nukleotidai) yra elektronų ir protono nešikliai. Oksiduojantis substratui NAD+ prisijungia
du elektronus ir vieną protoną (hidrido H- joną), o vienas protonas išeina į terpę. Tiriant NADH ir NADPH struktūras buvo parodyta, kad
nikotininiame žiede pozicija prie C-4 yra prochiralinė. Pakeitus kitoje žiedo plokštumos pusėje esantį vandenilį deuteriu gausime S-
konfigūraciją. Fermentai, kurie naudoja nikotinamidinius kofermentus dažniausiai yra stereospecifiški jie paima vandenilį arba nuo pro-R arba
pro-S padėties.
NAD+ dalyvauja katabolinėje oksidacijoje, susidaręs NADH oksiduojamas mitochondrijose ir išsiskyrusi energija panaudojama ATP sintezei.
NADPH pagrindinai susidaro pentozių fosfatinio ciklo metu ir jis dalyvauja anaboliniuose procesuose - riebalų rūgščių, steroidų sintezėje.
Fermentai specifiškai prisijungia NAD ar NADP ir katalizuoja atitinkamas reakcijas.
 Flavininiai kofermentai
Į flavininių kofermentų FAD (flavinadenindinukleotidas) ir FMN (flavinmononukleotidas) sudėtį įeina vitaminas B2 arba riboflavinas (7,8-
dimetil-10-(1/-D-ribitil)izoaloksazinas). Prie izoaloksazino žiedo yra prijungtas D-ribitolis. Ryšys tarp šių dviejų medžiagų nėra glikozidinis, ir
molekulė nėra “tikras” nukleotidas, tačiau istoriškai jis taip yra vadinamas.
Flavinai yra geltonos spalvos, iš to kilęs jų pavadinimas (lotyniškai flavus - geltonos spalvos).
Oksiduotas izoaloksazino žiedas sugeria šviesą 450nm (matoma šviesa). Kada žiedas
redukuojamas flavinas blykšta. Flavininiai kofermentai gali būti trijuose oksidaciniuose-
redukciniuose būviuose. Pilnai oksiduotas flavinas prisijungia (chinoninė forma) vieną
elektroną ir protoną tampa semichinonu. Esant fiziologiniam pH mėlynos spalvos (λmax =
570nm) semichinonas yra neutralus radikalas. Prisijungus antram elektronui jis pilnai
redukuojamas (iki hidrochinoninės formos). Flavininiai kofermentai dalyvauja vieno ar dviejų
elektronų pernešimo reakcijose.

Šie kofermentai sutinkami sukcinato dehidrogenazės,

riebalų rūgščių acil-CoA dehidrogenazės, mitochondrijų
kvėpavimo grandinės NADH dehidrogenazės ir kitų
fermentų katalizuojamose reakcijose.

Daugumoje flavoproteinų flavino nukleotidai prie baltymo prijungti silpnais nekovalentiniais ryšiais,
kai kuriuose fermentuose pavyzdžiui sukcinato dehidrogenazėje, ryšys yra kovalentinis. Šių
kofermentų standartinis oks-red potencialas keičiasi jungiantis jam su baltymu ir labai priklauso nuo
hidrofobinio ar hidrofilinio apsupimo. Pavyzdžiui sukcinato dehidrogenazėje, surišto FAD‘o E0/
artimas 0, tuo tarpu laisvo FAD‘o E0/ = -0.219V.
Kofermentas Q
Kofermentas Q (CoQ) dar vadinamas ubichinonu, dalyvauja elektronų ir protonų pernešime nuo vieno fermento ant kito oksidacinio
fosforilinimo ir fotosintezės procesų metu. Jis prisijungia vieną elektroną ir protoną, susidarant semichinonui arba prijungus 2 elektronus
ir du protonus virsta pilnai redukuota forma ubichinoliu CoQH2. Redukuota kofermento Q forma Ubichinolis veikia kaip aktyvių
deguonies formų gaudyklė.

Sukcinato dehidrogenazė, dalyvaujant kofaktoriui -

geležies-sieros klasteriui, kofermentą Q redukuoja iki
ubichinolio.
 Kofermentas A
Pantoteno rūgštis dar vadinama vitaminu B5 įeina į kofermento A (CoA) sudėtį.
Pantoteno rūgštis sujungta su 3/-fosfoadenozino difosfatu ir β−
merkaptoetilaminu. Kofermentas aktyvuoja ir perneša acilo grupę, kuri
prisijungia prie β−merkaptoetilamino -SH grupės, susidarant tioesteriams. Šio
tioesterio hidrolizės energija aukšta (∆G0/ -31,4 kJ/mol) todėl acilo pernešimo
potencialas yra didelis ir aktyvuota grupė lengvai prijungiama prie įvairių
akceptorių.
Norint pažymėti svarbų –SH grupės vaidmenį, kofermentas A dažnai žymimas CoASH. Aktyvuota
acilo grupė dalyvauja acetoacetato, citrato, riebalų rūgščių sintezėse, vaidina svarbų vaidmenį piruvato,
α-ketoglutarato dehidrogenazinėse reakcijose. Riebalų rūgščių sintazėje, acilą pernešančio baltymo
(ACP) sudėtyje taip pat yra pantoteno rūgšties fragmentas.

CoA atlieka dvi pagrindines funkcijas:

1. aktyvuoja karbonilinę acilgrupę,
α vandenilio
2. aktyvuoja acilgrupės Cα
atomą, palengvindamas jo kaip
protono disocijaciją.

Kaip ir nikotinamidiniuose bei flavininiuose kofermentuose, CoA Pantoteno rūgštis - vitaminas B5

kofermente apofermentas atpažįsta adeninnukleotidinę dalį.
Lipo rūgštis
Kofermentas - Lipo rūgštis yra dviejose formose: atviros
grandinės redukuota ir uždaro ciklo oksiduota forma. Redukuota
turi dvi –SH grupes, kurios gali grįžtamai oksiduotis iki -S-S-.
Lipo rūgštis kovalentiškai prijungta prie baltymo molekulės lizino
ε−aminogrupės.
Lipo rūgštis gali būti tik kaip prostetinė fermento grupė. Kodėl?

Ji perneša acilo liekaną ir randama tokiuose stambiuose

fermentiniuose kompleksuose kaip piruvato ir α−ketoglutarato
dehidrogenazė. Lipo rūgštis perneša acilgrupę, dalyvauja oks-
red reakcijose.
Tiamindifosfatas (TPP)
Į kofermento tiamindinfosfato (tiaminpirofosfato) sudėtį įeina vitaminas B1 (tiaminas). Jis yra oksidacinio
dekarboksilinimo ir kitų fermentinių reakcijų kofermentas. Tiamindifosfatas dalyvauja reakcijose, kuriose
cheminis ryšys, esantis šalia karbonilgrupės (keto ar aldehido) skaidomas arba sintetinamas. α−ketorūgščių
(piruvo ar α−ketoglutaro) dekarboksilinimo reakcijose susidaro CO2 ir aldehidas. Cheminės reakcijos vyksta
prisijungiant atitinkamoms grupėms prie tiazolo žiede esančio C2 atomo. Protonas prie C2 yra rūgštinis, jis
lengvai disocijuoja ir susidaręs karbanijonas yra labai reaktyvus. Prie tiazolo žiedo prisijungus karbonilgrupei,
pagreitėja dekarboksilinimo reakcija.
Tiamindifosfatas yra kofaktorius tokių fermentų kaip piruvato dekarboksilazė, piruvato dehidrogenazė, α−
ketoglutarato dehidrogenazė, transketolazė ir kitų.
Biotinas
Biotinas dalyvauja daugelyje fermentinių karboksilinimo reakcijų, kaip
karboksigrupių nešiklis. Biotinas yra kovalentiškai prisijungęs prie baltymo
lizino ε−aminogrupės ir šis ε-N-biotinil-L-lizinas yra vadinamas biocitinu.
Biotino žiedo sistema yra prijungta prie baltymo 1.6nm ilgio judria “ranka”,
todėl karboksigrupę galima pernešti nuo vieno substrato ant kito. Biotinas
sutinkamas įvairiuose fermentuose – acetil-CoA karboksilazėje, propionil-
CoA karboksilazėje, piruvato karboksilazėje ir kituose.

Biotinas labai tvirtai susiriša su Streptomyces avidinii bakterijose

randamu baltymu streptavidinu, todėl streptavidinas ir biotinas plačiai
naudojami biotechnologiniuose procesuose.
Piridoksalfosfatas (PLP)
Vitamino B6 (piridoksolis) biologiškai aktyvi forma yra kofermentas piridoksalfosfatas. Piridoksalfosfatas dalyvauja daugelyje aminorūgščių
apykaitos reakcijų – peramininimo, α− ir β−dekarboksilinimo, β− ir γ−eliminacijos, racemizacijos ir aldolinės kondensacijos reakcijose. Šio
kofermento cheminės savybės susijusios su jo sugebėjimu sudaryti stabilias Šifo bazes su aminorūgščių α−amino grupėmis bei stabilizuoti
reakcijos tarpines daleles. Piridoksalfosfatas su fermentu jungiasi kovalentiškai per lizino ε−aminogrupę.
Tetrahidrofolio rūgštis (THF)
Folio rūgšties dariniai (folatai) dalyvauja įvairiuose medžiagų apykaitos procesuose pernešant vieno anglies
atomo funkcines grupes. THF yra 6-metilpterino junginys su p-aminobenzenkarboksirūgštimi ir glutamatu. Prie p-
aminobenzenkarboksirūgšties gali prisijungti iki 7 glutamato molekulių.
Metotrexate

Pemetrexed

Viduje ląstelių folatas yra paverčiamas aktyvia forma - tetrahidrofolatu, redukuojant pteridino žiedą. Redukcija
vyksta dviem etapais, katalizuojant NADPH atrankiai dihidrofolato reduktazei. Pirmoje redukcijos reakcijoje
susidaro 7,8-dihidrofolatas, kuris redukuojamas iki tetrahidrofolato (5,6,7,8-tetrahidrofolatas). Folatinio ciklo
metu susidaro ir daugiau folio rūgšties formų – 5,10-CH2-THF ir 10-CHO-THF. Sulfamethoxazole
Antibakteriniai vaistai sulfonamidai tokie kaip sulfanilamidas yra p-aminobenzenkarboksirūgšties
struktūriniai analogai. Jie pakeičia p-aminobenzenkarboksirūgštį folato molekulėje ir inhibuojama
THF sintezė. Kadangi žinduoliai nesintetina THF tai sulfonamidai neveikia jų organizmų ir
slopina tiktai mikroorganizmų dauginimąsi.
Dihidrofolatreduktazė (DHFR), Serinohidroksimetiltransferazė (SHMT), Timidilatosintazė (TS), Glicinamido ribonukleotidformiltransferazė (GARFT), 5-aminoimidazolo-4-karboksamido
ribonukleotidformiltransferazė (AICARFT), timidilatosintazė turinti flavino kofermentą (ThyX).
S-Adenozilmetioninas (SAM)
S-adenozilmetioninas dažnai sutinkamas kofaktorius metilgrupės pernašos reakcijose, o fermentai dalyvaujantys šiose reakcijose - įvairios
metiltransferazės (pvz. DNR citozino 5-metiltransferazė). Kaip kofaktorius SAM dalyvauja nukleorūgščių, baltymų, lipidų, o taip pat ir
įvairių metabolitų nukleofilinių centrų metilinime.
S-adenozilmetioninas susideda iš adenozino fragmento ir metionino, o
sintetinamas organizme metionino adenoziltransferazės iš ATP ir metionino.

DNR ir RNR žymėjimas pasitelkiant modifikuotą S-adenozilmetionino

(AdoMet) kofaktorių yra jau įprastas įrankis biotechnologijoje.
Pastaruoju metu nauji AdoMet analogai, vietoje metilgrupės turintys
ilgesnės grandinės fragmentą su reaktyvia funkcine grupe, sėkmingai
naudojami nukleorūgščių dvipakopiam žymėjimui. Tam tikrais atvejais
yra galimybė taikyti netgi vienpakopį žymėjimą.
 Vitamino B12 kofermentai
Vitaminas B12 arba kobalaminas, yra grupė kobaltą turinčių medžiagų žinomų kaip korinoidai. Vitaminą B12 sintetina tiktai mikroorganizmai,
gyvūnuose šį vitaminą sintetina mikroflora arba jie gauna su maistu valgydami kepenis, kiaušinius, kiaulieną, vištieną ar gerdami pieną. Vaistinė
kobalamino forma yra ciankobalaminas, kuris susidaro kofermento išskyrimo metu iš gamtinių šaltinių. Organizme sutinkamos kelios
kobalamino formos: neaktyvi - hidroksikobalaminas, kuris paverčiamas į aktyvius kofermentus, ir aktyvios formos - 5/-
deoksiadenozilkobalaminas ir metilkobalaminas. Kofermento pagrindą sudaro korino žiedas su centre esančiu kobalto jonu. Korino žiedas yra
panašus į hemo porfirino žiedą, išskyrus, tai kad du pirolo žiedai korine sujungti tiesiogiai, o ne per -CH - fragmetą. Kobaltas koordinaciniais
ryšiais susijungęs su keturiais pirolo azotais. Vienas aksialinis kobalto ligandas yra dimetilbenzimidazolo azoto atomas. Kitas aksialinis kobalto
ligandas gali būti –CN (ciankobalaminas), -CH3 (metilkobalaminas), -OH (hidroksikobalaminas) arba 5/-deoksiadenozil-5/-anglies atomas
(5/-deoksiadenozilkobalaminas).

Metilkobalamino funkcijos: Adenozilbalamino funkcijos:

Metionino sintezė iš homocisteino Krebso ciklo elementas (ATP gavimas)
Metilgrupės donoras DNR, RNR ir baltymų metilinime Būtinas energijos gavimui iš lipidų ir baltymų
siekiant išvengti pakitimų genų ekspresijoje Būtinas hemoglobino sintezei
 Metalų jonų vaidmuo fermentų veikloje
Šiuo metu per 30% žinomų fermentų veiklai būtini metalų jonai. Dažniausiai fermentų veikimui reikalingi Fe2+, Zn2+, Mg2+, Cu2+, Co2+,
Mo2+, Ca2+, K+, Na+ sutinkami ir kiti jonai. Vieniems fermentams metalų jonai yra būtini fermento aktyvumui, kitais atvejais katalizinė
reakcija tiktai reguliuojama. Metalų jonai:
Metalų jonų įtaka Amazonės rhizobia bakterijos proteazių veiklai:
1. stabilizuoja baltymo struktūrą
2. dalyvauja substrato surišime su fermentu
3. dalyvauja kofermento prijungime prie baltymo
4. tiesiogiai dalyvauja fermentinėse reakcijose
5. veikia kaip Lewis rūgštys
6. dalyvauja oksidacinėse redukcinėse reakcijose

Metalų jonai palaiko baltymo antrinę, tretinę ar ketvirtinę struktūras.

Tokie fermentai katalizuoja chemines reakcijas, tačiau jie nestabilūs. Jų
aktyvumas sumažėja nežymiai pakeitus tirpalo pH ar temperatūrą.
Metalų jonai stabilizuoja baltymo molekulės optimalią konformaciją.
Ca2+ stabilizuoja fermento amilazės struktūrą, fermentas tampa
atsparesnis temperatūros poveikiui. Alkoholio dehidrogenazė sudaryta
iš keturių subvienetų ir įeina keturi Zn2+ jonai. Pašalinus Zn2+,
fermentas disocijuoja į subvienetus ir praranda katalizinį aktyvumą.
Kinazinių reakcijų substratas yra ne laisva ATP4- molekulė, o ATP4--Mg2+ kompleksas. Mg2+ tiesiogiai nereaguoja su fermentu, bet dalyvauja
ATP molekulės stabilizacijoje ir substrato molekulės neigiamo krūvio neutralizacijoje, tuo palengvindamas substrato susijungimą su fermento
aktyviuoju centru.
Metalų jonai aktyviai dalyvauja elektrofilinėje katalizėje. Pereinamieji metalai Fe2+, Zn2+, Mn2+, Cu2+, turi laisvą d elektronų orbitalę ir jie
gali veikti kaip elektronų gaudyklės. Į fermento karboanhidrazės sudėtį įeina Zn2+ jonai, kurie dalyvauja H+ ir OH- jonų susidaryme iš
vandens. Fe2+ jonai įeina į citochromų, Fe-S baltymų sudėtį ir tiesiogiai dalyvauja oksidacijos redukcijos reakcijose, pernešant elektronus.
Fermento aktyvus centras
1894m. Fišeris (E.Fisher) savo fermento veikimo mechanizmo rakto ir spynos hipotezėje aiškino, kad substratas yra raktas, o fermento
aktyvus centras yra spyna. Substratas turi atitikti fermento aktyvų centrą kaip raktas spyną, jis turi būti specifiškas fermentui, tada fermentinė
reakcija vyksta efektyviai. Tačiau baltymai yra lanksčios, dinaminės struktūros, baltymo konformacija kinta vykstant cheminiams virsmams.
Košlandas (D.Koshland) pastebėjo, kad reaguojant substratui su fermentu aktyvaus centro konformacija pasikeičia, substratas indukuoja
katalizinių aminorūgščių šoninių radikalų persitvarkymą erdvėje. Jo hipotezėje fermento aktyvus centras yra kaip pirštinė, o substratas - ranka.
Pirštinė įgauna rankos formą. Ši hipotezė vadinama indukuoto atitikimo hipoteze.

Fermento aktyvus centras yra ta fermento molekulės dalis, prie

kurios prisijungia substratas ir vyksta katalizinė reakcija.
Aktyvus centras dažniausiai susidaro susiformuojant tretinei
baltymo struktūrai, rečiau ketvirtinės struktūros suvienetai
formuoja aktyvų centrą. Aminorūgščių šoniniai radikalai, esantys
įvairiose polipeptidinės grandinės vietose suartėja, baltymo
globulėje susidaro plyšys ar įdubimas, prie kurio prisijungia
substratas. Į fermento aktyvų centrą taip pat gali įeiti
kofermentas (tame tarpe ir prostetinės grupės) bei metalų jonai.

Aminorūgščių esančių aktyviame centre šoniniai radikalai atlieka dvi pagrindines funkcijas:
1) prijungia ir erdvėje orientuoja substrato molekules. Tokios aminorūgštys dar vadinamos kontaktinėmis ir jų išsidėstymas sąlygoja
fermento specifiškumą. Stereospecifiniam surišimui, reikalingi mažiausiai trys sąveikos taškai.
2) dalyvauja laikinų cheminių ryšių su substrato molekulėmis susidaryme, katalizuoja cheminę reakciją. Šios aminorūgščių funkcinės
grupės gali būti protonų ar elektronų donorais ir akceptoriais, sudaryti laikinus kovalentinius ryšius su substrato molekulėmis, stabilizuoti
pereinamąjį būvį.
Fermento aktyviame centre esančios aminorūgštys
Į fermento aktyvų centrą įeina tos aminorūgštys, kurios katalizuoja reakciją ir tos kurios orientuoja substratą
fermento aktyviame centre. Aminorūgščių aktyvių šoninių grupių funkcijos
Aktyvi Krūvis Tipinė Pagrindinės funkcijos
Katalizuojančių reakciją aminorūgščių šoniniai radikalai yra chemiškai Aminorūgštis grupė esant jonizuojamo
aktyvūs, sudaro įvairaus stiprumo ryšius su substrato molekulėmis, pH 7 s grupės pKa
dalyvauja cheminėse reakcijose. Tai gali būti cisteinas (-SH), baltymuose
Aspartatas -COO- -1 4-5 Suriša katijonus, perneša
selenocisteinas (-SeH), serinas (-OH), treoninas (-OH), asparto, glutamo protonus
rūgštys (-COOH), lizinas (-NH2), argininas (-NH2), tirozinas (-OH), Glutamatas -COO- -1 4-5 Suriša katijonus, perneša
histidinas (imidazolo žiedas). protonus
Histidinas Imidazolas 0 6-7 Perneša protonus
Labai svarbų vaidmenį fermento aktyvaus centro susidaryme vaidina Cisteinas -CH2SH 0 8-9,5 Yra nukleofilas, kovalentiškai
prijungia acilgrupę
hidrofobinės aminorūgštys, kurios dalyvauja substrato orentacijoje ir
surišime aktyviame centre, sudaro palankią aplinką vykti cheminei Selenocisteinas -CH2SeH -1 4-5 Yra nukleofilas
reakcijai. Tirozinas Fenolio 0 9,5-10 Sudaro vandenilinius ryšius su
ligandais, gali būti protonų
donoras
Lizinas -NH3+ +1 ~10 Suriša anijonus, perneša
protonus, prijungia
kofaktorius, sudaro tarpinius
junginius
Serinas -OH 0 ~16 Yra nukleofilas, reakcijose
kovalentiškai prijungia acilo
grupę
Treoninas -OH 0 ~16 Yra nukleofilas
Argininas Guanidino +1 ~12 Suriša anijonus

Nors fermentas su substratu dažniausiai susiriša nestipriais nekovalentiniais vandeniliniais, elektrostatiniais, hidrofobiniais ar van der Valso
ryšiais, tačiau neretai substratas jungiasi su reakciją katalizuojančiomis rūgštimis ir kovalentiniu ryšiu (Cys, Sec, Lys).