Fermentai

Fermentai – aktyviame centre vykstantys procesai, fermentų reguliacija,

kita specifika
Bendri fermentų veikimo principai
Tiriant metilfosfoesterio hidrolizės greitį buvo apskaičiuota, kad hidrolizinio skaidymo greitis be katalizatoriaus Vbe kat yra lygus
1*10-15, pridėjus šarminės fosfatazės jis siekia 1.4*101. Greitis padidėja 1.4* 1016 kartų.

CH3-O-PO3H2 + H2O CH3OH + H3PO4

Fermentas ureazė katalizuoja karbamido hidrolizę iki amoniako ir anglies dioksido. Be fermento hidrolizės reakcijos greičio konstanta lygi
3*10-10 s-1, pridėjus fermento konstanta išauga iki 3*104 s-1. Katalizuojamos reakcijos greitis išauga 1014 kartų, o aktyvacijos energija
sumažėja 84 kJ/mol. Kas sąlygoja tokį didelį cheminės reakcijos greičio išaugimą?

Fermentinės reakcijos pagreitėjimą aiškina nedidelis skaičius faktorių:

•Substratų suartėjimas ir orientacija.
•Pereinamojo būvio stabilizacija
•Bendra rūgštinė-bazinė katalizė.
•Kovalentinė katalizė.
•Metalų jonų katalizė.
•Fermento-substrato komplekso destabilizavimas dėl įtempimo, desolvatacijos ar elektrostatinių efektų. Susidarant fermento
substrato kompleksui, entropija sumažėja.
Substratų suartėjimas
Labai svarbus faktorius didinantis fermentinės reakcijos greitį yra substratų suartėjimas ir orientacija. Kalbant apie fermentų
nekatalizuojamas reakcijas - molekulėms, esant tirpale ar dujinėje fazėje, didėjant reaguojančių molekulių koncentracijai didėja tarpusavio
susidūrimų skaičius ir reakcijos greitis išauga. Fermentai turi specifines substrato molekulių prijungimo vietas, todėl reaguojančios
medžiagos “paimamos” iš tirpalo ir priartinamos viena šalia kitos.
Tirdami suartėjimo efektus fermentinėse reakcijose, chemikai sintetino modelinius substratus ir lygino tarpmolekulinių reakcijų greičius su
atitinkamų ar panašių vidumolekulinių reakcijų greičiais. Tipinis pavyzdys yra p-nitrofenilacetato hidrolizė katalizuojama imidazolo.
H NO 2
H 2O H
N NO 2
N

N
+ + CH 3COOH +
O N
HO
H3C O
k = 35 M-1 min-1
H
N
NO 2 H 2O NO 2
N N
NH +
O HO
-1 O
k = 839 min
O
OH
Tarpmolekulinės antro laipsnio reakcijos (pirmoji) greičio konstanta yra 35 M-1 min-1, o tokio paties tipo intramolekulinės pirmo laipsnio
reakcijos (antroji) greičio konstanta yra 839 min-1. Šių dviejų konstantų santykis lygus: (839 min-1)/(35 M-1 min-1) = 23.9 M. Tai rodo,
kad, norint tarpmolekulinėje reakcijoje pasiekti tokį patį greitį kaip intramolekulinėje reakcijoje - imidazolo koncentracija turėtų
būti 23.9M… o tai yra neįmanoma.
Suartėjimo efektas padidina “efektyvią” substratų koncentraciją, palyginus su esančia tirpale, reakcija vietoje bimolekulinės, tampa
monomolekuline, todėl padidėja ir reakcijos greitis. Didelė efektyvi substrato koncentracija palengvina greitesnį pereinamojo būvio
susidarymą. Šis efektas vadinamas suartėjimo efektu. Efektyvi katalizė reikalauja silpno reaguojančių medžiagų susirišimo su aktyviuoju
centru, nes labai stipri sąveika lėtins katalizę.
Suartėjimo efektas padidina reakcijos greitį iki 10000 kartų, panašus pagreitėjimas pasiekiamas stabilizuojant pereinamąjį būvį.
Substratų orientacija
Labai svarbus veiksnys, greitinantis cheminę reakciją, yra reaguojančių funkcinių grupių atitinkama orientacija erdvėje. Fermentai ne tik
prijungia substratą, bet ir orientuoja substrato molekulės ir aktyviojo centro funkcines grupes. Grupės yra erdvėje orientuojamos taip, kad
susidarytų cheminei reakcijai palankiausios sąlygos - vieni ryšiai pailginami hidrofobinėse kišenėse patalpinant substrato hidrofobinius
fragmentus, kituose ryšiuose padidinamas ar sumažinamas elektronų tankis vandenilinio ryšio, elektrostatinės sąveikos ar π−π sąveikos
dėka.

Pavyzdžiui Thorpo-Ingoldo efektas (gem-dialkil efektas) ženkliai padidina laktonų susidarymo greitį. Konformacinio labilumo
sumažinimas.

Fermento funkcija yra orientuoti substrato molekulę ir katalizines funkcines grupes optimaliausiu reakcijai būdu.
Perinamojo būvio stabilizacija
Fermentai padidina cheminės reakcijos greitį stabilizuodami pereinamąjį būvį. Energija, reikalinga iš
fermento-substrato (ES) komplekso susidaryti pereinamojo būvio kompleksui (ES*) yra mažesnė, negu tiesiai
iš substrato gauti pereinamąjį būvį S* nefermentinėse reakcijose. Fermentas ir substratas susijungia silpnais
ryšiais. Jeigu ES kompleksas yra tvirtas, tada energijos sąnaudos iš ES gauti ES* yra žymiai didesnės.
Fermentas turi orientuoti ir surišti substratą tam, kad lengviau susidarytų pereinamoji būsena.
Fermento-substrato surišimo energija neturi būti didelė, priešingu atveju procesas bus stabdomas.
Pagrindinis faktorius didinantis fermento katalizinę galią yra didesnis pereinamosios būsenos (ES*)
susirišimas su aktyviuoju centru, palyginus su prisijungimu substrato ar produkto. Beje stebima
pereinamojo būvio (ES*) stabilizacija lyginant su analogiška nefermentine reakcija.
Įtempimas ir deformacija tai buvo du terminai, kuriais buvo aiškinama fermentinė katalizė. Buvo manoma, kad fermentai kaip ir kieti
katalizatoriai (aktyvuota anglis, Pt ir kiti) katalizuoja reakcijas fiziškai ar elektriškai deformuodami substratus. Perėjimo būvio stabilizacija,
sustiprėjęs ryšys tarp fermento ir substrato pereinamajame būvyje pilniau paaiškina substrato įtempimo ir katalizės reiškinius. Fišeris rakto ir
spynos teorijoje pasiūlė, kad fermentai yra kieti, nelankstūs šablonai ir prisijungia tiktai tam tikrą substratą kaip raktą. Priimtas fermento
specifiškumo ir katalizės aiškinimas detalizuoja, kad raktas yra ne substratas, o pereinamąjame būvyje esantis substratas. Po to kai
fermentas prisijungia substratą jis jį pakeičia ir substratas įgauna pereinamojo būvio struktūrą. Maksimalus ryšių skaičius tarp fermento ir
substrato susidaro tiktai pereinamajame būvyje ES*. Fermento aktyvus centras savo forma ir cheminėmis savybėmis turi būti
komplementarus pereinamajam būviui. Kadangi energijos skirtumas tarp ES ir ES* yra žymiai mažesnis nei tarp S ir S*, todėl kkat
yra didesnė negu kn (nekatalizuojamos reakcijos greičio konstanta).
 Rūgštinė-bazinė katalizė
Rūgštinės-bazinės katalizės metu reakcija pagreitinama kataliziškai pernešant protoną. Ši katalizės rūšis plačiai paplitusi organinėje chemijoje,
dažnai sutinkama fermentinėse reakcijose. Yra du rūgštinės-bazinės fermentinės katalizės tipai:
1) savitoji rūgštinė-bazinė katalizė (specifically acid-base catalysis), kai H+ (H3O+) ar OH- jonų koncentracijos padidėjimas didina
fermentinės reakcijos greitį. Tokiose reakcijose protonai pernešami tarp fermento-substrato komplekso (ES) ir vandens greičiau negu
pereinamoji būsena suskyla į reakcijos produktus. Dažniausiai tokio tipo reakcijose papildoma katalizė protonų donorais ar akceptoriais iš
šoninių aminorūgščių grandinių nevyksta.
2) bendroji rūgštinė-bazinė katalizė (general acid-base catalysis), kai reakciją katalizuoja konkreti rūgštis (ne H3O+) ar bazė (ne OH-)
dažniausiai tai yra aminorūgščių šoniniai radikalai, kai kada vieno iš substratų rūgštinė ar bazinė grupė. Bendroji rūgštinė-bazinė katalizė
vyksta tada, kai protonai yra pernešami pereinamojoje būsenoje (sužatintame fermento-substrato komplekse (ES*). Šią katalizę gerai
iliustruoja p-nitrofenilacetato hidrolizė, kurioje imidazolas veikia kaip bendroji bazė... dažniausiai tuo pačiu ir kaip bendroji rūgštis...
Tokioms reakcijoms palankiausia yra neutrali terpė.
O

H3C C O NO2 + H2 O CH3COOH + HO NO2

p-nitrofenilacetatas p-nitrofenolis

+
O O- H

H3C C O NO2 CH3 C O NO2 CH3COOH + HO NO2

O H

..
O
H H
HN N:

Protono pernaša nuo vandens ant imidazolo, palengvina substrato karbonilinės grupės anglies atomo ataką
hidroksido anijonu. Protono pernaša, vyksta taip, kad susidaro N-H-O-X “tiltelis”, todėl vanduo tampa
„nukleofiliškesnis“ be žymaus hidroksido jonų koncentracijos padidėjimo.
Rūgštinė-bazinė katalizė
Bazei ar protonų akceptoriui žymėti plačiai naudojamas simbolis „B:“. BH+ nurodo konjuguotą rūgštį arba protonų donorą, tuo pačiu tai
yra bendroji rūgštis. Protonų akceptorius paimdamas protoną, dalyvauja S-H, O-H, N-H ir net C-H ryšių suardyme.
Bendroji bazė B: dalyvauja ir kitų cheminių ryšių suardyme, pvz. C-N. Bazė .. -
paima iš substrato protoną taip inicijuodama reakciją, arba paima vandens
X H :B X H B
+

protoną ir generuoja aktyvų OH-, kuris toliau elgiasi kaip bazė arba kaip
nukleofilas.
Bendroji rūgštis BH+ katalizuoja kovalentinio ryšio suirimą
protonizuodama atomą, dalyvaujantį ryšio sudaryme.
Fermento amino rūgšties funkcinė grupė, kaip H+ pernešantis agentas bus
efektyviausia, esant reakcijos terpės pH artimai grupės pKa. Kadangi
histidino imidazolo žiedo pKa artima 7.0, tai histidinas yra labai efektyvus
kaip bendroji bazė ar rūgštis. Daugumos biocheminių reakcijų metu vyksta
rūgštinė-bazinė katalizė. Tai peptidinio ir esterinio ryšio hidrolizė,
tautomerizacija. Aminorūgščių Asp, Glu, His, Cys, Tyr, Lys šoniniai
radikalai dažnai dalyvauja bendroje rūgštinėje-bazinėje katalizėje.
Aminorūgšties liekana Bendra rūgštinė forma Bendra bazinė forma
(protonų donoras) (protonų akceptorius)
Glu, Asp R-COOH R-COO-
Lys, Arg R-NH3+ R-NH2
Cys, Sec R-SH; R-SeH R-S- ; R-Se-
His R R
+
HN NH HN N
-
Ser R-OH R-O
Tyr
-
R OH R O
 Kovalentinė katalizė
Kai kurie fermentai greitina cheminę reakciją, sudarydami tarpinius aktyvius kovalentinį ryšį tarp fermento ir
substrato turinčius junginius. Bendra schema atrodytų taip: AX +Y + Fermentas Fermentas + AY + X
A-Fermentas +X+Y
Dauguma fermentų, katalizuojančių reakcijas kovalentinės katalizės keliu, turi ping-pong kinetinį mechanizmą,
tiesiog antrojo substrato vaidmenį šiuo atveju atlieka Fermentas-substratas kompleksas.

Fermentinės kovalentinės katalizės reakcijos gali būti klasifikuojamos pagal vykstančios reakcijos tipą į elektrofilinio arba nukleofilinio
pobūdžio reakcijas. Nukleofilinės katalizės mechanizmas remiasi fermento katalitiniame centre esančiomis nukleofilinėmis savybėmis
pasižyminčiomis rūgštimis, turinčiomis amino-, karboksi-, hidroksi-, merkapto- grupes ar imidazolo žiedą. Geru tinkamumu kovalentinei
katalizei laikytinos šias dvi sunkiai suderinamas savybes turinčios grupės – aukštą nukleofiliškumą ir galimybę sudaryti lengvai nueinančią
grupę – deja tokiomis savybėmis pasižyminčias šonines grupes turi tik cisteinas ir selenocisteinas. Tačiau nukleofilinė katalizė sėkmingai
vyksta ir su kitomis aminorūgštimis, kodėl?
 Kovalentinė katalizė
Kovalentinės elektrofilinės katalizės metu dažniausiai dalyvauja fermentų kofaktoriai, kurie ir atlieka elektrofilų vaidmenį.
Dažnai pilnas mechanizmas apima tiek nukleofilinės tiek ir elektrofilinės katalizės etapus.

Taigi, būtent aminorūgščių šoniniai radikalai ir kofermentai dalyvauja kovalentinėje

katalizėje. Serininėse, cisteininėse peptidazėse hidroksi- ir merkaptogrupės yra
nukleofilai ir reakcijos metu susidaro tarpiniai kovalentiniai kompleksai būtent su
šiomis aminorūgštimis. Kai kurie kofermentai: tiamindifosfatas, piridoksalfosfatas
funkcionuoja kaip kovalentiniai katalizatoriai.

Fermentai Reaguojanti grupė Kovalentiškai surišamas

fragmentas
1. Chimotripsinas -CH2-OH -CH2-O-CO-R
Elastazė (serinas) (acil-serinas)
Esterazės
Subtilizinas
Tripsinas
2. Fosfoglicerolio aldehido -CH2-SH -CH2-S- CO-R
dehidrogenazė (cisteinas) (acilcisteinas)
Papainas
3. Šarminė fosfatazė CH2-OH -CH2-O-PO32-
(serinas) (fosfoserinas)
Fosfogliukomutazė
4. Fosfogliceromutazė Histidinas Fosfohistidinas
Sukcinil-KoA sintetazės
5. Aldolazė R- R-N=C<
Dekarboksilazės (lizinas) (Šifo bazė)
Aminotransferazės
Fermento-substrato komplekso destabilizavimas
Supaprastintai laisvosios energijos pokyčiais galime atvaizduoti fermentinės
reakcijos eigą (reakcijos koordinatė). Pereinamosios būsenos TS stabilizacija
yra bene pagrindinis fermentinių reakcijų katalizę užtinkrinantis faktorius.
Fermento-substrato kompleksas ES* gali turėti laisvą energiją žemesnę arba
didesnę, jei ši energija didesnė – tokiu atveju turime mažesnę aktyvacijos
energiją, kuri būtina pasiekti pereinamąją būseną (TS). Tas pats ir su
fermentinės reakcijos tarpiniais kovalentiniais kompleksais (I1 ir I2).
Fermento-substrato kompleksas dažnai įgauna tokią konformaciją kur
aktyvaus centro struktūra yra maksimaliai komplementari pereinamąjai
būsenai, net jei tai iškraipo substrato struktūrą.

Kaip jau buvo minėta pagrindinis faktorius yra TS energijos sumažinimas

lyginant su nekatalizuojama reakcija, iš principo kiti reakcijos eigą skatinantys
faktoriai yra susiję su visais reakcijoje dalyvaujančiais tarpiniais kompleksais
ir tarpiniais junginiais. Jei šiems tarpiniams junginiams nebus leidžiama
relaksuoti į lokalius minimumus ir reakcijos eigoje komplekso/tarpinių
junginių struktūros bus įtemptos – reakcijos eiga bus greitesnė ir
reikalaujanti mažesnių energijos sąnaudų. Pavyzdžiui TPP (tiamindifosfato)
kofaktoriaus tiazolio žiedo pakaitai stabiliausiame būvyje yra vienoje
plokštumoje, tačiau fermentas neleidžia pakaitams išsidėstyti plokštumoje
taip destabilizuodamas dalelę.
Metalų jonų vaidmuo fermentų aktyviame centre

Per 30% visų fermentų aktyvumui reikalingi metalų jonai. Metalų fermentai stipriai suriša dažniausiai pereinamųjų metalų Fe2+, Cu2+, Zn2+,
Mn2+, ar Co3+ jonus. Fermentai, kurie silpnai suriša tokius šarminių ar žemės šarminių metalų Na+, K+, Mg2+ ar Ca2+ jonus vadinami metalų
aktyvuojamais fermentais. Metalų jonų vaidmuo fermentinėje katalizėje susijęs su kofaktoriais ir ne tik:

• dalyvauja substrato surišime ir orientavime aktyviame centre,

• dalyvauja oksidacinėse redukcinėse reakcijose,
• būdami katijonais elektrostatiškai stabilizuoja ar ekranuoja neigiamą krūvį,
• stabilizuoja pereinamąjį būvį,
• veikia kaip elektrofiliniai katalizatoriai, koordinuodamiesi su neigiamą krūvį turinčiais elementais didina elektronų deficitą ant kitų
atomų (pvz. karbonilinės grupės deguonies koordinacija). Taip veikia kepenų alkoholio dehidrogenazėje Zn2+ jonas,
• kitas svarbus metalų (Me2+) vaidmuo yra sustiprinti atomų nukleofiliškumą esant neutraliam pH. Koordinuojantis su metalų jonais
didėja nukleofilo rūgštingumas, protonas lengviau disocijuoja.
Aktyviame centre vykstantys procesai
Fermentai naudoja keletą reakcijos greičio didinimo strategijų, pavyzdžiui chimotripsinas dalyvauja rūgštinėje-bazinėje katalizėje, taip pat
fermento aktyviame centre deformuojama substrato struktūra. Šiuo metu žinoma daugelio fermentų erdvinė struktūra, nustatyti aktyvieji
centrai, pasiūlyti veikimo mechanizmai... dažnai net ir ne po vieną mechanizmą kai kuriems fermentams.

Fermento chimotripsino veikimo mechanizmas

Peptidazės katalizuoja peptidinio ryšio hidrolizę baltymuose ar peptiduose. Šiuo metu rekomenduojama proteazes arba proteolizinius
fermentus vadinti peptidazėmis. Jos gali būti endopeptidazės (skaido peptidinius ryšius viduje polipeptidinės grandinės) ar
egzopeptidazės (atskeliančios aminorūgštis nuo grandinės galo) kaip aminopeptidazės (atskelia nuo baltymo N-galo) ar karboksipeptidazės
(atskelia nuo C-galo). Serininės peptidazės yra grupė peptidazių, turinčių panašų veikimo mechanizmą ir erdvinę struktūrą, jų aktyviame
centre yra serino hidroksigrupė. Šiems fermentams priklauso virškinimo fermentai chimotripsinas, tripsinas, elastazė, kurie sintetinami
neaktyvūs kasoje ir aktyvuojami jiems patekus į plonąsias žarnas. Peptidazės hidrolizuoja peptidinius ryšius, tačiau turi skirtingą
specifiškumą.

Endopeptidazė chimotripsinas yra vienas iš serininių peptidazių atstovų, sintetinamas kasoje neaktyvaus profermento chimotripsinogeno
formoje, kuris plonosiose žarnose proteolitinės aktyvacijos metu verčiamas chimotripsinu. Fermentas greitai hidrolizuoja peptidinį ryšį, kai
karbonilgrupė priklauso aromatinėms aminorūgštims (R1 = Phe, Tyr, Trp) ir lėtai ties Leu.
 Fermento chimotripsino veikimo mechanizmas
Fermento aktyviame centre nustatyti 3 aminorūgščių likučiai – His57, Asp102 ir Ser195. Šios trys aminorūgštys yra vadinamos katalizine triada.
Fermento katalizuojamoje peptidinio ryšio hidrolizės reakcijoje galima išskirti dvi stadijas – acilinimą ir deacilinimą. Acilinimo stadijos metu
suardomas peptidinis ryšys gaunami du produktai – ties aromatinių aminorūgščių C-galu susiformuoja esteris (su Ser195), o kitas produktas –
įprastas polipeptidas, kuris prasideda aminorūgštimi sekančia po aromatinės aminorūgšties. Deacilinimo metu, hidrolizuojamas esteris,
susidaro N-galas-aromatinė aminorūgštis produktas ir regeneruojamas fermentas.
acilinimo stadija:
1. Substratas prisijungia prie fermento aktyvaus centro. Substrato
prijungime labai svarbų vaidmenį vaidina aminorūgšties R1 šoninis
radikalas, reakcija vyksta greičiausiai, kai šis radikalas yra aminorūgščių
Phe, Tyr, Trp aromatinis žiedas. Substrato surišimui reikalingos Gly216,
Gly226, Gly189 aminorūgščių liekanos.
2. His57 funkcionuoja kaip bendroji bazė, ji paima protoną nuo Ser195
hidroksigrupės ir padidina deguonies nukleofiliškumą, atiduodama kitą
savo protoną Asp102 molekulės karboksigrupei. Nukleofilinis serino
deguonis atakuoja skaidomo peptidinio ryšio karbonilo anglies atomą,
susidarant tetraedrinei tarpinei dalelei. Susidariusioje dalelėje ryšys tarp
deacilinimo stadija: anglies ir deguonies tampa ilgesniu viengubuoju ryšiu. Tada neigiamą krūvį
1. Acilfermentas, kaip esteris yra lengvai hidrolizuojamas turintis deguonis (oksianijonas) juda į laisvą vietą, vadinamą oksianijono
vandens. Acilfermento hidrolizė prasideda, kai His57 plyšiu, kur sudaro vandenilinius ryšius su peptidinės grandinės
veikiamas Asp102 iš vandens atplešia protoną, o susidaręs aminorūgščių Gly193 ir Ser195 -NH grupėmis.
OH- atakuoja karbonilinę grupę. Susidaro antra tetraedrinė 3. His57 veikia kaip rūgštinis katalizatorius duodamas protoną skaidomo
tarpinė dalelė, kuri stabilizuojama oksianijono plyšyje. peptidinio ryšio azoto atomui ir pasiimdamas kitą protoną nuo Asp102.
2. Toliau His57 veikia kaip rūgštis, jis duoda protoną Ser195 Taip tetraedrinis kompleksas suyra ir susiformuoja esterinis fragmentas –
pasiimdamas kitą protoną nuo Asp102, po to suyra susidaro tarpinis acilfermentas. Nesurištas su fermentu polipeptidas
tetraedrinė tarpinė dalelė ir susidaro antras polipeptidinis pasišalina nuo fermento.
baltymo fragmentas ir regeneruojamas chimotripsinas.
 Kitos serino peptidazės
Jaučio chimotripsinas, jaučio tripsinas ir kiaulės elastazė yra homologiški baltymai, jų pirminės struktūros yra ~40% identiškos ir jų tretinės
struktūros taip pat panašios. Aminorūgščių seka ties serinu aktyviame centre yra vienoda – Gly-Asp-Ser-Gly. His yra erdviškai greta Ser ir
susidaro vandenilinis ryšys tarp histidino imidazolo žiedo ir serino hidroksigrupės. Kitas histidino azoto atomas sudaro vandenilinį ryšį su
asparto karboksigrupe (lygiai taip pat kaip ir nagrinėtame chimotripsine). Serininės peptidazės pasižymi skirtingu substratiniu specifiškumu.
Specifiškumą substratui sąlygoja nedideli pakitimai fermento aktyviojo centro kontaktinėje dalyje, kuri prijungia substratą. Chimotripsinas
greičiausiai katalizuoja peptidinio ryšio hidrolizę ties aromatinėmis aminorūgštimis, todėl kad substratą surišanti sritis sudaryta iš nepolinių
aminorūgščių šoninių radikalų. Tripsinas, substratą surišančioje srityje, turi gilią “specifinę kišenę”, kurioje yra aspartatas suteikiantis
neigiamą krūvį. Tai paaiškina, kodėl tripsinas katalizuoja peptidinio ryšio hidrolizę ties teigiamai įkrautomis lizino ir arginino aminorūgštimis.
Elastazėje, specifinė kišenė sudaryta iš nedidelių, nepolinių radikalų, todėl į ją gali patekti nedidelės aminorūgštys tokios kaip alaninas,
glicinas, valinas. Pavyzdžiui, tripsino molekulėje pakeitus Asp189→Lys189, fermentas praranda specifiškumą bazinėms aminorūgšMms.
 Neserininės peptidazės Panašų veikimo mechanizmą turi ir kitos peptidazės.
Cisteino peptidazės. Papainas, išskirtas iš papaja Carica papaja vaisių yra vienas didelės cisteino (tiolinių) peptidazių šeimos atstovų.
Joms priklauso bromelainas iš ananasų, aktinidinas iš kivi vaisių. Fermento aktyviame centre cisteino siera yra nukleofilas, kuris atakuoja
peptidinį ryšį, šalia išsidėsto histidinas, kuris paima protoną nuo –SH grupės.
Asparto peptidazės. Šiai grupei priklauso skrandžio peptidazės pepsinai ir gastriksinas. Pepsinai
nepasižymi dideliu specifiškumu, tačiau hidrolizuoja peptidinius ryšius tarp hidrofobinių
aminorūgščių. Šių peptidazių aktyviame centre yra dvi asparto rūgšties karboksigrupės. Kai kur
teigiama, kad viena iš šių grupių yra nukleofilas, o kita yra protonų donoras skaidomai grupei.
Fermento karboksipeptidazės veikimo mechanizmas
Karboksipeptidazė A yra egzopeptidazė ją išskiria kasa prokarboksipeptidazės pavidalu. Prokarboksipeptidazė aktyvuojama proteolitinės
aktyvacijos metu. Fermentas katalizuoja peptidinio ryšio hidrolizę, atskeldamas po vieną aminorūgštį nuo polipeptidinės grandinės C
galo. Karboksipeptidazė A aktyviausia, kai galinės aminorūgštys yra aromatinės ar hidrofobinės. Karboksipeptidazė B lengviau
hidrolizuoja peptidinį ryšį, kurį sudaro aminorūgštys turinčios bazinius šoninius radikalus.
Cheminės reakcijos metu hidrolizuojamas peptidinis ryšys. Prie C galinės aminorūgšties (R‘) imino (-NH) grupės prisijungia protonas, o
hidroksigrupė reaguoja su R aminorūgšties karbonilgrupe, susidarant karboksilatui.

Karboksipeptidazė A yra tipiškas Zn fermentas, be to prisijungiant substratui vyksta dideli baltymo molekulės konformaciniai pakitimai.
Molekulės forma yra elipsoidas ir joje randama 38% – α-spiralinių segmentų ir 17% β-struktūrų. Aktyvus centras išsidėstęs baltymo
molekulės paviršiaus įdubime, kur Zn2+ jonas sujungtas koordinaciniais ryšiais su polipeptidinėje grandinėje esančiais His69 ir His196 bei
vandens molekule, kuri koordinuojasi su aminorūgšties Glu72 karboksigrupės deguonies atomu. Prisijungus substrato molekulei, cinkas
koordinacinį ryšį sudaro ir su hidrolizuojamo peptidinio ryšio karbonilo deguonimi.
Pasiūlyti du šio fermento veikimo mechanizmai – nukleofilinis ir klasikinis bendrosios bazinės-rūgštinės katalizės, nors yra „tvirtų įrodymų“
dėl abiejų šių mechanizmų, vis tik labiau tikėtinas antrasis:
1. Cinkas, esantis aktyviame centre, sudaro koordinacinį ryšį su vandens molekule, taip palengvindamas Glu270 atplėšti protoną iš vandens
(ES), tada susiformavus hidroksido ir hidrolizuojamos karbonilinės grupės ryšiui Zn2+ stabilizuoja susidariusį oksianijoną TI ir TS2.
2. Tada oksianijoninė pereinamoji būsena TS2 suyra elektonams pereinant ant C-galinės aminorūgšties aminogrupės, kuriai protoną atiduoda
Glu270. Po to C-galinė aminorūgštis palieka fermento aktyvų centrą.
 Fermento katecholio 1,2-dioksigenazės veikimo mechanizmas
Šis fermentas katalizuoja oksidacinį aromatinio katecholio (ar katecholio fragmentą turinčių junginių) skaidymą iki
nearomatinių organinių junginių (cis, cis-mukoninės rūgšties darinių). Šį fermentą turi keletas organizmų gyvenančių
dirvoje, todėl dažnai šį fermentą turintys organizmai būna vienu iš bioremediacijos elementų valant aromatiniais
junginiais užterštą gruntą.
Šio metalo-fermento veikimo mechanizmas yra toks:
1. Geležies ir baltymo trigonalinės bipiramidės kompleksas, dalyvauja ligandų pasikeitime su substratu ir vietoj
Tyr200 ir hidroksiligando atsistoja katecholio hidroksigrupės.
2. Po to veikiant Arg221 vyksta vieno elektrono pernaša iš aromatinio ciklo ant geležies ir Fe3+ redukuojasi iki Fe2+,
tada susiformavusį radikalą atakuoja deguonies atomas ir susiformuoja papildomas ryšys su geležimi pastarąją
reoksiduojant iki Fe3+.
3. Gautas deguonies surišimo kompleksas persigrupuoja į ciklinį anhidridą, kuris vėliau hidrolizuojamas Tyr200 ir
vandens dėka. Susidaręs cis, cis-mukoninės rūgšties darinys pasišalina iš fermento aktyvaus centro.
 Fermentų aktyvumo reguliacija
Viena iš svarbiausių fermentų savybių yra jų aktyvumo reguliacija, todėl ląstelės metabolizmas yra koordinuotas ir kontroliuojamas.
Priklausomai nuo įvairių reguliatorių, aplinkos sąlygų, nuo substratų ar produktų pertekliaus ar trūkumo, kinta fermento aktyvumas.

Fermentų aktyvumas gali būti reguliuojamas dviem keliais:

A keičiant fermento koncentraciją,
B keičiant fermento aktyvumą

Fermento koncentracija yra keičiama:

1. Keičiant genų raišką reguliuojamas fermento sintezės greitis. Pavyzdžiui E.coli, auginamos terpėje be disacharido
laktozės nesintetina fermento β−galaktozidazės. Praėjus keliom minutėms po laktozės įdėjimo, ekspresuojamas genas ir
prasideda fermento β−galaktozidazės sintezė. Fermentas katalizuoja laktozės hidrolizę iki gliukozės ir galaktozės. Laktozės
koncentracijai sumažėjus, fermento sintezė sustoja.

2. Reguliuojant fermentų degradacijos greitį. Ląstelėje

proteosomų ir kitų proteolitinių fermentų aktyvumas yra
keičiamas, tuo pačiu reguliuojama baltymo gyvenimo
trukmė.

Šiais būdais fermentų aktyvumas kontroliuojamas visuose

organizmuose, tačiau fermentų sintezė ir degradacija yra
lėtas procesas, kuris gali tęstis nuo kelių minučių iki kelių
valandų.
Fermentų aktyvumo reguliacija
Fermentinių reakcijų greita reguliacija vyksta moduliuojant reguliacinius fermentus. Dauguma tokių fermentų katalizuoja metabolinių kelių
pirminius etapus. Reguliacinių fermentų aktyvumas kinta priklausomai nuo aplinkos signalų, tokiu būdu ląstelės ir organizmai gali prisitaikyti
prie kintančių aplinkos sąlygų, keisdamos metabolinių procesų greitį. Reguliacinių fermentų aktyvumas išauga padidėjus atitinkamų substratų
ar sumažėjus produktų koncentracijoms ir atvirkščiai.

Galimi keli reguliacijos būdai:

1. grįžtamoji kovalentinė modifikacija,
2. proteolizinė aktyvacija,
3. alosterinė reguliacija,
4. konkurencinė, nekonkurencinė inhibicija,
5. stimuliacija ar slopinimas atitinkamais reguliaciniais baltymais,

Grįžtamoji kovalentinė modifikacija

Kai kurių fermentų katalizinis aktyvumas yra didinamas arba mažinamas kovalentiškai prijungus prie jų atitinkamas chemines
grupes. Fermentų aktyvumas kinta paveikus ląsteles išoriniais stimulais – hormonais, augimo faktoriais ir kitomis medžiagomis, kurios
keičia antrinių informacijos tarpininkų [cAMP, cGMP, Ca2+, IP3(inizitolio trifosfatas), diacilglicerolio ir kitų] viduląstelinę koncentraciją.
Jie aktyvuoja fermentus, kurie kovalentiškai modifikuoja baltymus. Viena iš plačiausiai paplitusių modifikacijų yra fosforo rūgšties
liekanos prijungimas. Reakciją katalizuoja fermentai baltymo kinazės, kurie perneša galinę fosforo rūgšties liekaną nuo ATP ant
reguliuojamo baltymo. Dažniausiai fosforilinamos aminorūgščių tirozino, serino, treonino hidroksigrupės, kartais histidinas. Fosforilinus
baltymą, vienų fermentų aktyvumas gali padidėti, kitų – sumažėti. Įvedus į baltymo molekulę du neigiamus krūvius atsiranda
papildomi joniniai ryšiai su teigiamai įkrautomis lizino ar arginino aminorūgštimis arba stebimos atostūmio jėgos tarp fosfato ir
glutamato ar aspartato karboksigrupių. Fosforilinus baltymą, gali pakisti jo konformacija arba keistis substrato surišimo su fermento
aktyviuoju centru efektyvumas. Pradinis fermento aktyvumas atstatomas pašalinus fosforo rūgšties liekaną. Fosfoesterinio ryšio hidrolizę
katalizuoja fosfatazės.
Proteolizinė aktyvacija
Yra grupė fermentų, kurie organizme sintetinami neaktyvūs ir yra aktyvuojami hidrolizuojant vieną ar kelis neaktyvaus fermento pirmtako,
vadinamo zimogenu arba profermentu, peptidinius fragmentus. Fragmentai gali būti tiek trumpi susidedantys iš kelių-keliolikos
aminorūgščių, tiek ir daugiau nei 100 aminorūgščių turintys domenai gali būti atskeliami aktyvuojant baltymą. Šie iškerpami fragmentai
paprastai atlieka šias funkcijas: stabilizuoja baltymą, padeda teisingai susisukti į tretinę struktūrą arba padidina tirpumą plazmoje
transportuojant baltymą iki jo veikimo vietos. Šie proteolitinės aktyvacijos reiškiniai plačiai paplitę virškinimo, kraujo krešėjimo
procesuose, programuotos ląstelės žūties atveju, be to, kai kurie hormonai, pvz. insulinas sintetinamas neaktyvaus proinsulino pavidalu ir
aktyvuojamas atskeliant oligopeptidą.
Proteolitinė aktyvacija, skirtingai nuo kitų reguliavimo kelių yra
negrįžtama. Aktyvuojant zimogenus pakinta pirminė baltymo
struktūra, keičiasi ir tretinė.
Tripsinogenas (245 aminorūgštys) yra aktyvuojamas plonosiose žarnose
hormonų kontroliuojamos enteropeptidazės, atskeliant nuo polipeptidinės
grandinės N galo heksapeptidą Val-(Asp)4-Lys. Aktyvus tripsinas gali
katalizuoti tolimesnę tripsinogeno hidrolizę, taigi tripsinogeno aktyvacija
yra autokatalizinė.
Kasoje sintetinamas neaktyvus chimotripsinogenas sudarytas iš vienos
245 aminorūgščių polipeptidinės grandinės, kurios erdvinę struktūrą
palaiko 5 disulfidiniai ryšiai. Patekęs į plonąsias žarnas profermentas yra
aktyvuojamas. Tripsino poveikyje hidrolizuojamas peptidinis ryšys tarp
Arg15 ir Ile16 ir susidaro π-chimotripsinas. Aktyvus π-chimotripsinas
veikia kitą π−chimotripsino molekulę, atskeliami 2 dipeptidai Ser14-Arg15
bei Thr147-Asn148. Taip susidaro subrendusi peptidazė - α-chimotripsinas
Hormonas insulinas irgi proteolizinės aktyvacijos būdu susidaro iš prekursorinio baltymo. Pradžioje nuo
preproinsulino N galo nuskeliamas 23 aminorūgščių signalinis peptidas, reikalingas baltymo pernešimui pro
endoplazminio tinklo membraną ir gauname proinsuliną. Peptidazės pašalina proinsulino molekulės viduje tarp 31 ir
65 aminorūgšties oligopeptidą ir susidaro aktyvus insulinas.
 Alosterinė reguliacija
Alosteriniai baltymai yra tokie baltymai, kurie turi dvi ar daugiau stereospecifiškai skirtingas receptorines sritis. Viena iš jų yra aktyvus
centras ir suriša substratą, kita alosterinė sritis (gr. άλλος kita) suriša reguliatorinę molekulę. Alosterinių fermentų konformacija ir
aktyvumas kinta prijungus atitinkamus aktyvatorius ar slopiklius, kurie vadinami alosteriniais efektoriais (arba alosteriniais moduliatoriais).
Jie jungiasi prie fermento nekovalentiniais ryšiais ir kitoje nei nagrinėjamas fermento aktyvus centras srityje. Alosteriniai fermentai dažnai
sudaryti iš kelių subvienetų, reguliatorinė sritis ir aktyvus centras gali būti skirtinguose subvienetuose. Prisijungęs alosterinis efektorius keičia
baltymo konformaciją, todėl gali keistis fermento giminingumas substratui, gali būti modifikuojamas maksimalus fermentinės reakcijos
greitis arba gali keistis abu parametrai. Efektoriai, kurie mažina fermento aktyvumą vadinami neigiamais efektoriais arba alosteriniais
inhibitoriais, o tie kurie didina fermento aktyvumą – teigiamais efektoriais arba alosteriniais aktyvatoriais
Alosterinių reakcijų efektoriais gali būti ir substratai. Kai efektorius ir substratas yra identiški
jie vadinami homotrofiniais efektoriais. Hemoglobinas yra alosterinis baltymas sudarytas iš
keturių subvienetų. Prisijungus deguonies molekulei prie vieno iš subvienetų, kinta kitų
konformacija ir pagerėja deguonies molekulių surišimas. Deguonis yra homotrofinis
efektorius. Dažnai alosterinis substratas veikia kaip teigiamas efektorius. Substrato molekulė
prisijungusi prie alosterinio centro padidina kito substrato susirišimą su aktyviuoju centru ir
fermento katalizinis aktyvumas padidėja. Šis efektas vadinamas teigiamu homotrofiniu efektu.
 Jeigu efektoriaus struktūra skiriasi nuo substrato struktūros, tada turime heterotrofinį efektorių. Tiriant
Alosterinė reguliacija multifermentinių reakcijų kinetiką dažnai stebima grįžtamo ryšio inhibicija. Šio tipo slopinimu efektyviai
reguliuojamos daugiastadijinės fermentinės reakcijos. Susikaupus galutinio ar tarpinio produkto
didesnėms koncentracijoms, slopinamos pradinės proceso stadijos ir substrato skaidymas sulėtėja ir
ląstelėje nesikaupia tarpiniai metabolitai. Pavaizduoto daugiastadijinio proceso vienas iš
Grįžtamojo ryšio inhibicijos ir alosterinės galutinių reakcijos produktų (E) inhibuoja
reguliacijos pirmieji eksperimentiniai rezultatai buvo fermentą (2), kuris katalizuoja antrą fermentinio
gauti, tiriant fermentą aspartato transkarbamoilazę proceso stadiją, todėl fermentinis procesas šiuo
(ATKazė), kuri katalizuoja karbamoilaspartato keliu nevyksta, taip įgalinamas alternatyvus
susidarymą. Ši reakcija yra pradinė metabolinio metabolizmo kelias.
kelio, kurio metu sintetinami pirimidino nukleotidai,
stadija.
Alosteriškai reguliuojamų fermentų kinetinės kreivės
skiriasi nuo nereguliuojamų.

Daugumai alosterinių fermentų reakcijos greičio

priklausomybė nuo substrato koncentracijos
išreiškiama sigmoidine kreive, o ne hiperbole.
Sigmoidinė priklausomybė atspindi
kooperatyvinę sąveiką tarp atskirų baltymo
subvienetų. Struktūros pakitimai viename
subvienete perduodami kitiem subvienetams,
efektas atsiranda dėl nekovalentinės sąveikos
tarp atskirų subvienetų.
 Alosterinių fermentų veikimo hipotezės
Alosteriškai reguliuojamas fermentas turi mažiausiai vieną substratą, kuriam reakcijos greičio
priklausomybė nuo substrato koncentracijos išreiškiama sigmoidine kreive, o ne hiperbole. Alosteriniam
fermentui fosfofruktokinazei-1 reakcijos greičio priklausomybės nuo ATP koncentracijos grafikas yra
hiperbolinio augimo kreivė, tačiau fruktozės 6-fosfato atžvilgiu gauname sigmoidine kreivę.
Alosterinių baltymų ir fermentų savybes aiškina dvi hipotezės:
darnaus veikimo ir nuoseklaus veikimo.

Darnaus veikimo hipotezę pasiūlė Mono (J.Monod), Vaimanas (J.Wyman) ir Šanže (J.P. Changeux). Jie galvojo,
kad, kad alosteriniai fermentai susideda iš kelių identiškų subvienetų, kurie gali būti dviejose, skirtingose
konformacijose:
1) R konformacija (relaxed-relaksuota), jos giminingumas substratui ir aktyvatoriui yra didelis.
2) T konformacija (tense/taut-įtempta), jos giminingumas substratui mažas, bet suriša slopiklį.
Daroma prielaida, kad molekulės simetrijos išlaikymui subvienetai turi būti toje pačioje konformacijoje arba R
arba T, ir negali būti kartu susijungę RT. Tirpale tarp šių formų nusistovi pusiausvyra, kuri nukreipta į T arba R
formos pusę. Pereinant iš T būvio į R visų subvienetų konformacija keičiasi suderintai.
Esant terpėje nedidelėms substrato koncentracijoms jis jungiasi su R forma. Susidarius substrato ir R formos
kompleksui pusiausvyra pastumiama iš T į R ir padaugėja aktyvių centrų, galinčių surišti substrato molekules.
Tokiu būdu pasireiškia substrato kooperatyvinis poveikis ir stebima sigmoidinė reakcijos greičio priklausomybė
nuo substrato koncentracijos.
Analogiškai aiškinamas alosterinio aktyvatoriaus poveikis. Aktyvatorius stipriau susiriša su R konformacija, ir
fermentas iš T formos pereina į R. Esant didelėm aktyvatoriaus koncentracijoms, visa T forma pereina į R ir
substrato kooperatyvinis efektas sumažėja, nes visas fermentas yra R formoje. Todėl fermentinės reakcijos
greičio priklausomybės nuo substrato koncentracijos grafikas iš sigmoidinės kreivės pereina į hiperbolę.
Alosterinio inhibitoriaus poveikis yra atvirkščias - inhibitorius susijungia tik su T forma ir neleidžia T formai
pereiti į R.
Alosterinių fermentų veikimo hipotezės
Nuoseklaus veikimo modelį pasiūlė Košlandas siekdamas eliminuoti darnaus veikimo modelio trūkumus – pagrindinis iš jų yra tai, kad
atrodo gana nerealistiška tikėtis, kad visi fermento subvienetai keičia konformaciją kartu. Kodėl neturėtų būti skirtumų sąveikaujančių
subvienetų konformacijose. Baltymo molekulėje subvienetai gali būti skirtingose R ir T formose bei trečioje formoje, kuri yra artima tiek R
tiek T formai. Prisijungus substratui prie R formos, keičiasi jo ir greta esančio subvieneto konformacija ir gretima T forma pereina į kitą
konformaciją besiskiriančią tiek nuo T tiek ir nuo R. Jei pastaroji baltymo konformacija geriau suriša substratą nei T konformacija – turime
teigiamą kooperatinį efektą, jei blogiau – neigiamą. Ši hipotezė nereikalauja abiejų subvienetų simetrijos. Šis modelis geriau atitinka
eksperimentinius rezultatus.

Apibendrinant, alosterinę reguliaciją galima suskirstyti į:

Reguliatoriniai baltymai
Fermentų aktyvumas gali būti reguliuojamas prijungiant specifinius baltymus. Prisijungę prie
fermento jie keičia jo aktyvumą.
Pavyzdžiui nuo cAMP priklausoma baltymo kinazė A yra baltyminis fosforilinimo kompleksas
sudarytas iš 2 katalizinių (rausva spalva) ir 2 reguliatorinių subvienetų (melsva spalva). Kai
cAMP lygis yra nedidelis, reguliatorinių subvienetų dimeras prisijungia du vienetus katalizinių
subvienetų ir deaktyvuoja juos. Kai cAMP kiekis išauga, cAMP prisijungia prie reguliatorinių
subvienetų ir taip inicijuoja viso komplekso disociaciją ir taip atstatomas katalizinių subvienetų
aktyvumas.
PCNA (Proliferating cell nuclear antigen) yra baltymų trimerinis kompleksas, kuris veikia kaip DNR
polimerazės procesyvumo faktorius eukariotų ląstelėse. Šis faktorius apgaubia DNR ir veikia kaip
fragmentas pritraukiantis baltymus būtinus DNR replikacijai, pažaidos ištaisymui ir t.t.
Fermentų aktyvumas gali būti reguliuojamas prijungiant specifinius baltymus. Prisijungę prie
fermento jie keičia jo aktyvumą. Ubikvitinas yra vienas iš pažaidos ištaisymą reguliuojančių
baltymų. PCNA ubikvitilinimas ties Lys164 įvyksta, kai replikacija pasiekia pažaidą, šią pažaidą
atpažįsta Rad18 E3 ligazė, kuri sąveikauja su Rad6 E2 ligaze ubikvitilinant PCNA. Ubikvitilinta
PCNA pasitelkia kitas polimerazes pažaidai ištaisyti.
 Izofermentai Glikolizės ciklo fragmentas
Kai kurios to paties tipo reakcijos yra katalizuojamos skirtingų fermentų. Skirtingi fermentai,
katalizuojantys tą pačią cheminę reakciją yra vadinami izofermentais. Daugybinės izofermentų
formos gali skirtis tik viena ar daugiau aminorūgščių, izofermentai atliekantys tą pačią reakciją bet
besiskiriantys savo struktūra gali būti išsidėstę skirtinguose ląstelės erdvės skyriuose, pavyzdžiui
citozolinė (MDH1) ir mitochondrinė (MDH2) malato dehidrogenazės, kurių funkcija beveik
identiška, tačiau aminorūgščių sekos labai skiriasi.

Izofermentai gali skirtis savo elektriniu krūviu, molekuline mase, gali būti
atskiriami elektroforezės, joninės chromatografijos, gel-filtracijos metodais. Jie gali
turėti skirtingas katalizines konstantas KM ir Vmax, skirtingą temperatūrinį
stabilumą, pH optimumą. Izofermentai gali būti skirtingai reguliuojami. Tačiau jie
visada katalizuoja tą pačią cheminę reakciją.

Izofermentų koncentracijos matavimas kraujo

plazmoje plačiai naudojamas medicinoje įvairių
ligų diagnostikoje. Pakitus organo ląstelių
membranų laidumui, izofermentai iš ląstelės
išeina į kraują. Miokardo raumenyje per 5%
kreatino kinazės yra MB izofermentas. Šio
izofermento atsiradimas kraujuje rodo miokardo
pažeidimus.
Tunelinis efektas fermentinėje katalizėje
Tunelinis efektas yra procesas, kurio metu fermentinės reakcijos substratai
ir produktai yra pernešami tarp dviejų baltymų ar domenų aktyviųjų
centrų, molekulėms nepereinant į tirpalą.
Fermentinės reakcijos greitį riboja substrato ir fermento difuzijos greičiai. Tačiau yra
fermentinių reakcijų, kurių greitis viršija difuzijos greitį. Dažniausiai tai yra fermentiniai
kompleksai, katalizuojantys vieną po kitos einančias chemines reakcijas. Tada vieno fermento
produktas tiesiogiai patenka į kito fermento katalizinį centrą be perėjimo į fermentinį kompleksą
supančią terpę.
Karbamoilfosfato sintetazė yra fermentinis kompleksas katalizuojantis gliutamino
virtimą karbamoilfosfatu. Šis fermentinis kompleksas katalizuoja pirmą pirimidino
bazių ir arginino biosintezės stadiją. A2 yra gliutamino amidotransferazės
domenas, kuris A1 komunikacinio domeno dėka perduoda pirmos stadijos
reakcijos produktą sintetazės subvienetams. B ir C regionai turi ATP surišimo
vietas, o D‘ ir D domenai atsakingi už šio fermentinio komplekso asociaciją, be to
D domenas dar turi alosterinės reguliacijos vietą. Intramolekulinis tunelis jungia
visus aktyvius fermento centrus.
Teoriniai pasvarstymai, kaip
fermento (fermentų komplekso)
aplinkos sferos dydis įtakoja tokias
reakcijas gali privesti prie
efektyvesnių multifermentinių
įrankių biotechnologijoje.
Sferos spindulio didinimas ar mažinimas skirtingai įtakos pirmos ir antros fermentinės reakcijos efektyvumą. Spindulio mažinimas didins
pirmos pakopos efektyvumą, tuo tarpu antros pakopos efektyvumą mažins, nes vis didesnė dalis antros pakopos substrato difunduos iš
efektyvaus fermentinio komplekso veikimo zonos.